免疫球蛋白变体及其用途
【专利摘要】本发明涉及免疫球蛋白变体及其用途。本发明提供人源化和嵌合的抗CD20抗体，用于治疗CD20阳性恶性肿瘤和自身免疫病。
【专利说明】免疫球蛋白变体及其用途
[0001]此案是申请日为2003年12月16日、中国申请号为200810174816.0、发明名称为
“免疫球蛋白变体及其用途”的发明申请的分案申请。
【技术领域】
[0002]本发明涉及抗-⑶20抗体及其在治疗B细胞相关疾病中的用途。
【背景技术】
[0003]淋巴细胞是白细胞的几个群体之一；它们特异性地识别和对外部抗原作出反应。淋巴细胞的三种主要类别是B淋巴细胞(B细胞)、T淋巴细胞(T细胞)与自然杀伤(NK)细胞。B淋巴细胞是负责抗体产生与提供体液免疫的细胞。B细胞在骨髓内部成熟并离开骨髓，在它们的细胞表面表达与抗原结合的抗体。当幼稚B细胞首次遇到其膜-结合抗体所特异的抗原时，细胞开始迅速分裂，其后代分化成记忆B细胞与被称为“浆细胞”的效应细胞。记忆B细胞具有较长寿命期限，并且继续表达与最初的母细胞具有相同特异性的膜结合抗体。浆细胞不产生膜结合抗体，但是相反产生分泌形式的抗体。分泌的抗体是体液免疫的主要效应物。
[0004]⑶20抗原(也被称作人B淋巴细胞限制的分化抗原，Bp35)是位于前-B与成熟B淋巴细胞上的疏水跨膜蛋白质，具有分子量大约35kD。J.Biol.Chem.264 (19):11282-11287 (1989);与 Einfeld et al.EMBOJ.7(3):711-717(1988))。该抗原也在超过90%的B细胞非何杰金氏淋巴瘤(NHL)上表达Blood63 (6): 1424-1433 (1984))，但是在造血干细胞、原B细胞、正常浆细胞或者其它正常组织中没有找到(Tedder et al.J.1mmunol.135(2): 973-979 (1985))。CD20 被认为调节细胞周期起始与分化的激活过程中的一个早期步骤。(Tedder et al.，supra),并且可能作为钙离子通道发挥作用(Tedder et al.J.Cell.Biochem.14D: 195 (1990))。
[0005]由于⑶20在B细胞淋巴瘤中的表达，这一抗原已被用作治疗该淋巴瘤的有用的治疗靶向。在美国有超过300，000人患有B细胞NHL，每年有超过56，000个新病例被
诊断。例如，rituximab (RiTUXAX ")抗体被用来治疗具有复发或难治疗的低级或者滤泡的、CD20阳性的B细胞非何杰金氏淋巴瘤，该抗体是遗传改造的针对人CD20抗原的嵌合鼠 / 人单克隆抗体(可从 Genentech, Inc.South San Francisco, California, U.S.购得)。Rituximab是在1998年4月7日发布的美国专利号5，736，137 (Andersonet al.)与在美国专利号5，776，456中被称做“C2B8"的抗体。体外作用机理研究显示RITUXAN?与人补体结合,并且通过补体依赖的细胞毒性(⑶C)溶解淋巴样B细胞系Blood83 (2):435-445 (1994))。另外，它在对抗体依赖的细胞的细胞毒性(ADCC)的分析中具有显著活性。体内临床前研究表明R丨T U X A NT _消减来自猕猴周围血液、淋巴结与骨髓的B细胞，推测是通过补体与细胞介导的过程Blood83(2):435-445(1994))。其它指示NHL治疗的抗⑶20抗体包括鼠抗体ZevalinTM，其与放射性同位素钇9°连接(IDECPharmaceuticals, San Diego, CA),和Bexxar?,其是与I131偶联的另一个完全的鼠的抗体(Corixa, WA)。
[0006]鼠抗体在人类治疗中的使用的一个主要限制之处在于人抗小鼠抗体(HAMA)反应(参见，例如 Miller, R.A.et al.“Monoclonal antibody therapeutic trials inseven patients with T-cell lymphoma，，Blood, 62:988-995，1983;和 Schroff, R.W.，etal.“Human ant1-murine immunoglobulin response in patients receiving monoclonalantibody therapy” Cancer Res.，45:879-885，1985)。即使卩齿齿类动物抗体的可变(V)结构域与人恒定(C)区域融合的嵌合分子仍然能引发显著的免疫反应(HACA，人抗嵌合抗体)Nature (Lond.),314:268-270, 1985)。克服在单克隆抗体的临床利用中的这些限制的一个有效手段是“人源化”鼠抗体或者来自非人物种的抗体。(Jones et al.Nature (Lond), 321:522-525, 1986;Riechman et al., Nature (Lond), 332:323-327, 1988)。
[0007]因此，生产针对CD20抗原的治疗抗体是有利的，该抗体当给药给病人、特别是用于长期治疗时产生最低的或没有抗原性。本发明满足这一及其它需求。本发明提供克服目前治疗性组合物限制性的抗CD20抗体，以及提供额外的好处，这些好处将从下面的详细说明中加以明了。[0008]发明概沭
[0009]本发明提供CD20结合抗体或其功能性片段，以及其在治疗B细胞相关疾病中的用途。这些抗体是单克隆抗体。在特定的实施方式中，结合CD20的抗体是人源化的或者嵌合的。人源化的2H7变体包括在FR中具有氨基酸取代的变体，以及在移植的CDR中具有改变的亲和力成熟变体。在CDR或者FR中取代的氨基酸不局限于在供体或者受体抗体中存在的那些氨基酸。在其它实施方式中，本发明的抗-⑶20抗体更进一步地包含Fe区域的氨基酸残基改变，这些改变导致效应子功能改善，包括增强⑶C和/或ADCC功能与B细胞杀伤(在此也称为B细胞耗尽)。本发明的其它抗-⑶20抗体包括那些具有能改善稳定性的改变的抗体。在一个特殊的【具体实施方式】中，稳定性增加的人源化2H7变体在下面实施例6中加以描述。还提供在体内具有改善的ADCC功能的岩藻糖缺陷的变体。在一个实施方式中，嵌合抗CD20抗体具有鼠可变区与人恒定区。一个像这样的特殊嵌合抗CD20抗体是Rituxan-? (Rituximab;Genentech,Inc.)。
[0010]在本发明的所有抗体组合物和使用方法的一个优选实施方式中，人源化的CD20结合抗体是2H7.V16，具有分别如图6和图7所示的SEQ ID N0.21和22的轻与重链氨基酸序列。当提及在图6、7和8中的多肽序列时，应该理解，形成分泌信号序列的前19个左右氨基酸在成熟多肽中不存在。除了在说明书中指示的氨基酸取代位置之外，基于versionl6的所有其它变体的可变区将具有vl6的氨基酸序列。除非另外指明，2H7变体将具有与vl6相同的轻链。
[0011]本发明提供与人CD20结合的人源化抗体或者其抗原结合片段，其中抗体对体内消减灵长类动物B细胞是有效的，该抗体在H链可变区(Vh)包含至少来自抗人CD20抗体的SEQ ID N0.12的CDR3序列、和人重链亚群(subgroup) III (VhIII)的基本上(substantially)的人共有框架(FR)残基。在一个实施方式中，灵长类动物B细胞来自于人和猕猴。在一个实施方式中，抗体更进一步包含SEQ ID N0.10的H链⑶Rl序列与SEQID N0.11的⑶R2序列。在另一个实施方式中，前述抗体包含SEQ ID N0.4的L链⑶Rl序列、SEQ ID N0.5的CDR2序列、SEQ ID N0.6的CDR3序列，具有人轻链κ亚群I (V κ I)的实质上人共有框架(FR)残基。在一优选实施方案中，'的FR区域在位置46具有供体抗体残基；在一个具体的实施方式中，'的FR2具有leuL46pix)的氨基酸取代(在人κ I共有序列中的Leu换成在m2H7相应位置存在的pro)。Vh区域更进一步在框架的至少氨基酸位置49、71与73上包含供体抗体残基。在一个实施方式中，在Vh中，人重链亚群III的以下FR位置被取代:FR2中的AlaH49Gly ；FR3中的ArgH71Val与AsnH73Lys。在其它实施方式中，人源化抗体的CDR区域更进一步包含氨基酸取代，其中残基既不来自供体抗体也不来自受体抗体。
[0012]前述实施方式的抗体可以包含vl6的SEQ ID N08的Vh序列，如图1B所示。在前面的更进一步的实施方式中，抗体更进一步包含vl6的SEQ ID N02的'序列，如图1A所
/Jn ο
[0013]在其它实施方式中，人源化抗体是2H7.v31，具有SEQ ID N0.21与23的轻与重链氨基酸序列，分别如图6与图8所示；具有如图8所示SEQ ID N0.23的重链氨基酸序列的2H7.v31 ;具有vl6的H链的D56A与N100A与L链的S92A的氨基酸取代的2H7.v96。
[0014]在分开的实施方式中，任何前述实施方式中的抗体更进一步包含在Fe区域中的至少一个氨基酸取代，该取代与衍生它的原始或者亲本抗体相比改善了 ADCC和/或CDC活性，在大多数场合下被比较的亲本抗体是V.16,在其它情况下是Rituxan。具有改善活性的一个象这样的抗体在Fe区域包含S298A/E333A/K334A的三重丙氨酸取代。具有S298A/E333A/K334A取代的一个抗体是具有SEQ ID N0.23的重链氨基酸序列的2H7.v31。同Rituxan比较起来抗体2H7.vll4与2H7.vll5显示ADCC活性改善至少10倍。
[0015]在另一个实施方式中，抗体更进一步包含在Fe区域的至少一个氨基酸取代，该取代同衍生它的亲本抗体比较起来CDC活性降低，衍生它的亲本抗体在大多数情况下是vl6。同vl6比较起来⑶C活性降低的一个象这样的抗体包含在H链中的至少K322A取代。ADCC与CDC活性的比较可以如实施例中所描述的进行分析。
[0016]在一优选实施方式中，本发明的抗体是全长抗体，其中Vh区域连接至人IgG重链恒定区。在优选实施方式中，IgG是人IgGl或者IgG3。
[0017]在一个实施方式中，CD20结合抗体结合至细胞毒性剂。在优选实施方式中，该细胞毒性剂是毒素或者放射性同位素。
[0018]在一个实施方式中，本发明的用于治疗或者诊断用途的抗体在CHO细胞中产生。
[0019]还提供一种组合物，该组合物包含前述实施方式中的任何一个的抗体，以及载体。在一个实施方式中，载体是药学上可以接受的载体。这些组合物可以以制品或者试剂盒提供。
[0020]本发明也提供液体制剂，包含20mg/mL抗体的人源化2H7抗体，IOmM硫酸组氨酸ρΗ5.8，60mg/mL 蔗糖(6%)，0.2mg/mL 聚山梨酸酯 20 (0.02%)。
[0021]本发明也提供分离的核酸，该核酸编码在此所披露的抗体中的任何一种，包括表达抗体的表达载体。
[0022]本发明的另一个方面是包含前述核酸的宿主细胞与产生该抗体的宿主细胞。在后者的一个优选实施方案中，宿主细胞是CHO细胞。提供了产生这些抗体的方法，该方法包含培养产生抗体的宿主细胞，并且从细胞培养物中回收抗体。[0023]本发明的另一方面是一种制品，包括一个容器与包含在其中的组合物，其中组合物包含前述实施方式中的任何一个的抗体。为用来治疗NHL，该制品更进一步包含包装说明书，指示该组合物被用来治疗非何杰金氏淋巴瘤。
[0024]本发明的更进一步的方面是体内在B细胞中诱发程序性细胞死亡的方法，包含将B细胞与前述中的任何的抗体接触，从而杀死B细胞。
[0025]本发明也提供治疗在此所披露的疾病的方法，该方法通过将CD20结合抗体或者其功能性片段给药哺乳动物，例如患该疾病的人类病人，而治疗该疾病。在任何治疗自身免疫病或者CD20阳性癌症的方法中，在一个实施方式中，抗体是2H7.V16，分别具有SEQ IDN0.21与22的轻与重链氨基酸序列，如图6与图7所示。因此，一个实施方式是治疗⑶20阳性癌症的方法，包含给予患该癌症的病人治疗有效量的本发明的人源化CD20结合抗体。在优选实施方式中，CD20阳性癌症是B细胞淋巴瘤或者白血病包括非何杰金氏淋巴瘤(NHL)或者淋巴细胞占优势的何杰金氏病(LPHD)、慢性淋巴细胞性白血病(CLL)或者SLL。在治疗B细胞淋巴瘤或者白血病的方法的实施方式中，抗体以剂量范围大约275-375mg/m2给药。在其它的实施方式中，治疗方法更进一步包含给予病人至少一种化疗剂，在其中对于非何杰金氏淋巴瘤(NHL)而言，化疗剂选自由阿霉素、环磷酰胺、长春新碱与氢化泼尼松(prednisolone)组成的组。[0026]也提供治疗自身免疫病的方法，包含给予病人治疗有效量的前述权利要求中任何一个的人源化CD20结合抗体，该病人患有自身免疫病。自身免疫病选自由下列组成的组:类风湿性关节炎、青少年类风湿性关节炎、系统性红斑狼疮(SLE)、韦格内氏病(Wegener’ sdisease)、炎症性肠病、特发性血小板减少性紫癜(ITP)、血栓性血小板减少性紫癜(TTP)、自身免疫性血小板减少、多发性硬化、牛皮癣、IgA肾病、IgM多神经病、重症肌无力、血管炎、糖尿病、雷诺氏征(Reynaud，s syndrome)、斯耶格仑氏综合症(sjorgen，s syndrome)与肾小球肾炎。当自身免疫病是类风湿性关节炎时，抗体可以与第二治疗剂联合给药，该第二治疗剂优选地是氨甲喋呤。
[0027]在这些治疗方法中，⑶20结合抗体可以单独或者与第二治疗剂结合给药，第二治疗剂例如第二抗体、或者化疗剂或免疫抑制剂。第二抗体可以是结合CD20或者不同B细胞抗原、或者NK或T细胞抗原的抗体。在一个实施方式中，第二抗体是放射性同位素标记的抗CD20抗体。在其它实施方式中，CD20结合抗体偶联至细胞毒性剂，包括毒素或者放射性同位素。
[0028]在另一方面，本发明提供治疗自身免疫病的方法，自身免疫病选自由皮肌炎(Dermatomyositis)、韦格内氏肉芽肿病、ANCA、再生障碍性贫血、自身免疫性溶血性贫血(AIHA)、凝血因子VIII缺乏、甲型血友病、自身免疫性中性白细胞减少、Castleman’s综合症、古德帕斯彻氏综合症(Goodpasture’s syndrome)、实体器官移植排斥、移植物抗宿主疾病(GVhD)、IgM介导的神经病、血栓性血小板减少性紫癜(TTP)、桥本氏甲状腺炎(Hashimoto’s Thyroiditis)、自身免疫性肝炎、淋巴组织间质肺炎(HIV)、闭塞性细支气管炎(非移植)对应的 NSIP (bronchiolitis obliterans (non-transplant) vs.NSIP)、格一巴二氏综合症(Guillain-Barre syndrome)、大血管血管炎、巨细胞(高安氏)动脉炎(giantcell (Takayasu，s)ateritis)、中等血管血管炎(medium vessel vasculitis)、川崎病(Kawasaki’s Disease)、结节性多动脉炎(polyateritis nodosa),包含给予患该疾病的患者治疗有效量的CD20结合抗体。在该方法的一个实施方式中，CD20结合抗体是RiU」Xaiiv3
[0029]本发明还提供分离的核酸,包含称猴(Cynomolgus monkey) 0)20的SEQ ID N0.: 24的核苷酸序列(如图19所示)，或该序列的简并变体。一个实施方式是分离的核酸，包含一序列，该序列编码具有SEQ ID N0.25 (如图20所示)的氨基酸序列的多肽，或具有保守性氨基酸取代的SEQ ID N0.25 (图20)。另一个实施方式是包含前述核酸的载体，包括用来在宿主细胞表达的表达载体。也包括包含该载体的宿主细胞。还提供分离的多肽，该多肽包含猕猴CD20的氨基酸序列(SEQ ID N0.25;图20)。
[0030]本发明涉及:
[0031]1.一种与人CD20结合的人源化抗体或者其抗原结合片段，其中抗体对体内削减灵长类动物B细胞是有效的，该抗体在重链可变区(Vh)至少包含来自抗人CD20抗体的SEQID N0.12的⑶R3序列、和人重链亚群III(VhIII)的基本上的人共有框架(FR)残基。
[0032]2.项I的抗体，所述抗体进一步包含SEQ ID N0.10的重链⑶Rl序列和SEQ IDN0.11 的 CDR2 序列.[0033]3.项2的抗体，进一步包含SEQ ID N0.4的轻链CDRl序列、SEQ ID N0.5的CDR2序列、SEQ ID N0.6的⑶R3序列、和人轻链κ亚群I (Vk I)的基本上的人共有框架(FR)残基。
[0034]4.前述项的抗体，包含SEQ ID N0.8的Vh序列(V16,如图1B所示)。
[0035]5.项4的抗体，进一步包含SEQ ID N0.2的\序列(V16，如图1A所示)。
[0036]6.项3的抗体,其中Vh区域连接至人IgG链恒定区。
[0037]7.项6的抗体，其中人IgG是IgGl或IgG3。
[0038]8.项I的抗体，其中抗体是具有分别为SEQ ID N0.21和22的轻链与重链氨基酸序列的2H7.vl6。
[0039]9.项I的抗体，其中抗体是具有分别为SEQ ID N0.21和23的轻链与重链氨基酸序列的2H7.v31。
[0040]10.项5的抗体，但是具有重链中D56A和N100A、以及轻链中S92A的氨基酸取代(V.96)。
[0041]11.前述项中任一项的抗体，进一步包含在Fe区域中的至少一个氨基酸取代，所述取代增进ADCC和/或⑶C活性。
[0042]12.项11的抗体，其中氨基酸取代是S298A/E333A/K334A。
[0043]13.项12的抗体，其中抗体是具有SEQ ID N0.23的重链氨基酸序列的2H7.v31 (如图8所示)。
[0044]14.项1-10中任一项的抗体，进一步包含在Fe区域中的至少一个氨基酸取代，所述取代降低CDC活性。
[0045]15.项14的抗体，至少包含取代K322A。
[0046]16.项1-10任一项的抗体，其中抗体是2H7.vl 14或2H7.vl 15，所述抗体同Rituxan比较ADCC活性改善至少10倍。
[0047]17.项I的抗体，其中灵长类动物B细胞来自于人类和猕猴。
[0048]18.前述项中任一项的抗体，该抗体偶联至细胞毒药剂。
[0049]19.项18的抗体，其中细胞毒药剂是放射性同位素或毒素。[0050]20.前述项中任一项的抗体，所述抗体在CHO细胞中产生。
[0051]21.一种分离的核酸，其编码前述项中任一项的抗体。
[0052]22.一种表达载体，其编码前述项中任一项的抗体。
[0053]23.一种宿主细胞，其包含项21的核酸。
[0054]24.项23的宿主细胞，所述宿主细胞产生前述项中任一项的抗体。
[0055]25.项24的宿主细胞，所述宿主细胞是CHO细胞。
[0056]26.生产前述项中任一项的抗体的方法，包含培养生产项24的抗体的细胞，并从细胞培养物中回收抗体。
[0057]27.一种组合物，包含项I的抗体和载体。
[0058]28.项27的组合物，其中抗体是2H7.vl6,并且载体是药学上可接受的载体。
[0059]29.一种制品，包含一种容器和包含在其中的组合物，其中该组合物包含前述项中任一项的抗体。
[0060]30.项29的制品，进一步包含包装说明书，所述包装说明书指示该组合物可用于治疗非何杰金氏淋巴瘤。
[0061]31.一种体内 在B细胞中诱导程序性细胞死亡的方法，包含将B细胞与前述项中任一项的抗体接触，从而杀死B细胞。
[0062]32.一种治疗⑶20阳性癌症的方法，包含给予患该癌症的病人治疗有效量的前述项中任一项的人源化⑶20结合抗体。
[0063]33.项32的方法，其中⑶20阳性癌症是B细胞淋巴瘤或白血病。
[0064]34.项33的方法，其中⑶20阳性癌症是非何杰金氏淋巴瘤(NHL)或淋巴细胞占优势的何杰金氏病(LPHD)。
[0065]35.项32的方法，其中癌症是慢性淋巴细胞性白血病或SLL。
[0066]36.项34或35的方法，其中抗体选自2H7.vl6、v31.v96、vll4或vll5，所述抗体具有附图和表中所不的各自氣基酸序列。
[0067]37.项34或35的抗体，其中抗体是具有分别为图6和图7所示SEQ ID N0.21和22的轻链与重链氨基酸序列的2H7.vl6。
[0068]38.项33的方法，其中抗体以大约275_375mg/m2的剂量范围给药。
[0069]39.项32的方法，进一步包含给予病人至少一种化疗剂。
[0070]40.项39的方法，其中癌症是非何杰金氏淋巴瘤(NHL)，并且化疗剂选自阿霉素、环磷酰胺、长春新碱或氢化泼尼松。
[0071]41.一种治疗自身免疫病的方法，包含给予患该自身免疫病的病人治疗有效量的前述项中任何一项的人源化CD20结合抗体。
[0072]42.项41的方法，其中该自身免疫病选自由下列疾病组成的组:类风湿性关节炎、青少年类风湿性关节炎、系统性红斑狼疮(SLE)、韦格内氏病、炎症性肠病、特发性血小板减少性紫癜(ITP)、血栓性血小板减少性紫癜(TTP)、自身免疫性血小板减少、多发性硬化、牛皮癣、IgA肾病、IgM多神经病、重症肌无力、血管炎、糖尿病、雷诺氏症、斯耶格仑氏综合症与肾小球肾炎。
[0073]43.项42的方法，其中自身免疫病是类风湿性关节炎。
[0074]44.项43的方法，进一步包含给予病人第二种治疗剂。[0075]45.项44的方法，其中第二种治疗剂是免疫抑制剂。
[0076]46.项45的方法，其中免疫抑制剂是氨甲喋呤。
[0077]47.一种治疗选自由下列组成的组中的自身免疫病的方法，包含给予患该疾病的患者治疗有效量的CD20结合抗体或其功能性片段:皮肌炎、韦格内氏肉芽肿病、ANCA(包括在血管炎下的)、再生障碍性贫血、自身免疫性溶血性贫血(AIHA)、凝血因子VIII缺乏、甲型血友病、自身免疫性中性白细胞减少、Castleman氏综合症、古德帕斯彻氏综合症、实体器官移植排斥、移植物抗宿主疾病(GVhD)、IgM介导的血栓性血小板减少性紫癜(TTP)、桥本氏甲状腺炎、自身免疫性肝炎、淋巴间质肺炎(HIV)、闭塞性细支气管炎(非移植)对应的NSIP、格一巴二氏综合症、大血管血管炎、巨细胞(高安氏)动脉炎、中等血管血管炎、川崎病和结节性多动脉炎。
[0078]48.项47的方法，其中CD20结合抗体是Riuixan'[0079]49.一种分离的核酸，所述核酸包含猕猴⑶20的SEQ ID N0.: 24的核苷酸序列(如图19所示)，或这一序列的简并性变体。
[0080]50.一种分离的核酸，所述核酸包含编码具有SEQ ID N0.25(如图20所示)、或带有保守氨基酸取代的SEQ ID N0.25(如图20所示)的氨基酸序列的多肽。
[0081]51.—种载体，包含项50的核酸。
[0082]52.项51的载体，其为表达载体，所述表达载体包含与表达调控序列可操作连接的项49的核酸。
[0083]53.—种宿主细胞，包含项50的核酸。
[0084]54.一种分离的多肽，包含猕猴⑶20的SEQ ID N0.25的氨基酸序列(如图20所
示)O
[0085]55.一种液体制剂，包含20mg/mL的人源化2H7抗体、IOmM组氨酸硫酸酯ρΗ5.8、60mg/mL鹿糖、0.2mg/mL聚山梨酸酯20。
【专利附图】
【附图说明】
[0086]图1A是序列比对，比较小鼠2H7 (SEQ ID N0.1)、人源化2H7.vl6变体(SEQ IDN0.2)、和人K轻链亚群I (SEQ ID N0.3)中每一个的轻链可变结构域(V)的氨基酸序列。2H7 和 hu2H7.vl6 的 Vl 的 CDR 如下:CDR1 (SEQ ID N0.4)、CDR2 (SEQ ID N0.5)、与 CDR3 (SEQID N0.6)。
[0087]图1B是序列比对，比较如下来源的Vh序列:鼠2H7(SEQ ID N0.7)、人源化2H7.vl6变体(SEQ ID N0.8)、和重链亚群III的人共有序列(SEQ ID N0.9)。2H7和hu2H7.vl6的Vh 的 CDR 如下:CDR1 (SEQ ID N0.10)、CDR2 (SEQ ID N0.11)、与 CDR3 (SEQ ID N0.12)。
[0088]在图1A与图1B中，每一链的⑶Rl、⑶R2与⑶R3用括号围起来，其两侧为框架区FR1-FR4,如图中所指示。2H7指鼠2H7抗体。两行序列之间的星号表示在两序列之间不同的位置。残基编号根据 Kabat et al., Sequences of Immunological Interest.5thEd.Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md.(1991)，插入物用a、b、c、d、与e表示。
[0089]图2A-2E显示用来构建2H7Fab质粒的噬菌粒pVX4的序列(SEQ ID N0.13)以及CDR移植的抗IFN-α人源化抗体的Fab的轻链(SEQ ID N0.14)与重链(SEQ ID N0.15)的氨基酸序列。
[0090]图3A-3E显示编码嵌合2H7.v6.8Fab的表达质粒的序列(SEQ ID N0.16)。显示轻链(SEQ ID N0.17)与重链(SEQ ID N0.18)的氨基酸序列。
[0091]图4A-4B显示如实施例1中所描述的用于表达免疫球蛋白轻链的质粒pDRl的序列(SEQ ID N019;5391bp)。pDRl包含编码一无关抗体、人源化抗CD3抗体的轻链(Shalabyet al., J.Exp.Med.175:217-225(1992))的序列，其起始和终止密码子以粗体和下划线指
/Jn ο
[0092]图5A-5B显示如实施例1中描写的用于表达免疫球蛋白重链的质粒pDR2的序列(SEQ ID N0.20;6135bp)。pDR2包含一编码无关抗体、人源化抗CD3抗体的重链的序列(Shalaby et al.，上文)，其起始和终止密码子以粗体与下划线指示。
[0093]图6显示2H7.vl6完整轻链的氨基酸序列(SEQ ID N0.21)。DIQ以前的前19个氨基酸是在成熟多肽链中不存在的分泌性信号序列。
[0094]图7显示2H7.vl6完整重链的氨基酸序列(SEQ ID N0.22)。EVQ以前的前19个氨基酸是在成熟多肽链中不存在的分泌性信号序列。将图1B的Vh序列(SEQ ID N0.8)与完整重链序列比对，人Y I恒定区来自于SEQ ID N0.22中的氨基酸位置114-471。
[0095]图8显示2H7.v31完整重链的氨基酸序列(SEQ ID N0.23)。EVQ以前的前19个氨基酸是在成熟多肽链中不存在的分泌性信号序列。轻链与2H7.V16相同(参见图6)。
[0096]图9显示如实施例中 所描述的2H7.vl6与2H7.v73IgG变体的相对稳定性。分析结果校正至孵育前数值，以孵育后的剩余百分比报告。
[0097]图10是一流程图，总结从鼠2H7至直到v75的人源化型式的亚群的氨基酸改变。
[0098]图11是在所有组(结合2H7研究与Rituxan研究)中平均绝对B细胞计数[⑶3_/⑶40+]的总结，如实施例10中所描述。
[0099]图12显示如在实施例11中所描述的在岩藻糖缺陷的2H7变体上代表性ADCC试验的结果。
[0100]图13显示将膜联蛋白V染色以抗体浓度的函数作图的结果。在交联第二抗体存在下，将Ramos细胞用无关IgGl对照抗体(Herceptin;圆形)、Rituximab (方形)、或者rhuMAb2H7.vl6(三角形)处理，用FACS分析。图13-15在实施例13中加以描述。
[0101]图14显示膜联蛋白V与碘丙锭双染色作为抗体浓度的函数作图的结果。在交联第二抗体存在下，将Ramos细胞用无关IgGl对照抗体(I kMX’eplilV.k;圆形)、Rituximab (方形)、或者rhuMAb2H7.vl6 (三角形)处理，用FACS分析。
[0102]图15显示活的、未染色细胞计数(每10个)作为抗体浓度的函数作图。在交联第二抗体存在下，将Ramos细胞用无关IgGl对照抗体(Herceptin?;圆形),Rituximab (方形)、或者rhuMAb2H7.vl6 (三角形)处理，用FACS分析。
[0103]图16、17、18显示如实施例14中所描述的在裸鼠中对Raji细胞肿瘤生长的抑制。动物用 PBS (对照)或者用 Rituxan? 或 rhuMAb2H7.vl6 以 5mg/kg(图 16)、0.5mg/kg(图
17)、或者0.05mg/kg (图18)每周处理(如垂直箭头指示的；n=8只小鼠每组)，共6周。
[0104]图19显示如实施例15中所描述的猕猴⑶20的核苷酸(SEQ ID N0.24)与氨基酸(SEQ ID N0.25)序列。[0105]图20显示猕猴CD20的氨基酸序列(SEQ ID N0.25)。与人CD20不同的残基有下划线，人残基(SEQ ID N0.26)直接在猴残基下标示。猴⑶20的推定胞外结构域以黑体字表不。
[0106]图21显示如在实施例15中所描述的，表达⑶20的猕猴细胞与hu2H7.vl6、.v31与Rituxan的结合。分析抗体结合猕猴⑶20并且取代FITC偶联的鼠2H7与猕猴⑶20结合的能力。
[0107]图22显示类风湿性关节炎临床试验阶段I/II剂量渐增的方案。
[0108]图23显示在CHO细胞中表达2H7.vl6的载体。
[0109]优选实施方案的详细i兑明
[0110]“⑶20〃抗原是一非糖基化的跨膜磷蛋白，具有分子量大约35kD，在来自外周血或淋巴器官的超过90%的B细胞的表面上发现。⑶20在早期前B细胞发育期间表达，并且保持直到浆细胞分化。其在人干细胞、淋巴祖先细胞或者正常浆细胞上没有发现。CD20在正常B细胞以及恶性B细胞上存在。在文献中⑶20的其它名字包括“B淋巴细胞限制的分化抗原”和“Bp35〃。CD20 抗原在例如 Clark 与 Ledbetter, Adv.Can.Res.52:81-149(1989)与Valentine et al.J.Biol.Chem.264(19): 11282-112871989)中描述。
[0111]术语“抗体”以最宽泛的意义使用，并且特别地涵盖单克隆抗体(包括全长单克隆抗体)、多特异性抗体(例如双特异性抗体)、与抗体片段，只要它们显示出所需的生物活性或功能。
[0112]本发明的⑶20结合抗体与人源化⑶20结合抗体的生物活性至少包括抗体与人CD20的结合，更优选与人及其它灵长类动物(包括猕猴、恒河猴、黑猩猩)CD20结合。抗体将以不高于1χ10_8的Kd值结合⑶20，优选地Kd值不高于大约1χ10_9，并且能体内杀死或消减B细胞，优选地当与合适的负对照比较时杀死或者消减至少20%，所述负对照未用这样的抗体处理。B细胞消减可以是ADCC、CDC、细胞程序死亡或者其它机制中一个或多个的结果。在这里的疾病治疗的一些实施方式中，特定的效应子功能或者机制与其它相比可能更需要，并且人源化2H7的某些变体对取得生物学功能例如ADCC是优选的。
[0113]“抗体片段”包含全长抗体的一部分，通常是其抗原结合或可变区。抗体片段的例子包括Fab、Fab’、F(ab’)2、与Fv片段；双抗体；线状抗体(linear antibody);单链抗体分子；和由抗体片段形成的多特异性抗体。
[0114]“Fv”是包含完全抗原识别与结合部位的最小抗体片段。这个片段由一个重链与一个轻链可变区结构域以紧密、非共价联合而形成的二聚物组成。这两个结构域的折叠产生六个高变环(重链与轻链各三个环)，提供抗原结合的氨基酸残基并且赋予抗体抗原结合特异性。然而，即使单个的可变结构域(或者仅仅包含特定于抗原的三个CDR的Fv的一半)具有识别与结合抗原的能力，虽然亲合力比整个结合部位低。
[0115]术语“单克隆抗体”如在这里所使用的指获得自实质上均一的抗体群体的抗体，即构成该群体的单独抗体除了那些可能少量存在的自然发生的突变之外是同一的。单克隆抗体是高度特异性的，针对单一抗原位点。此外，与常规的(多克隆)抗体制备相反——所述常规抗体一般包括针对不同决定簇(表位)的不同抗体一每个单克隆抗体针对抗原上的单一决定簇。修饰语“单克隆”指示抗体的特性为获得自实质上均一群体的抗体，不允许被解释为要求经过任何特定的方法生产抗体。例如，依照本发明使用的单克隆抗体可能是通过Kohler et al.，Nature256:495 (1975)首次描述的杂交瘤方法生产，或可通过重组DNA方法生产(参见，例如，美国专利号4，816，567)。利用例如在Clackson etal., Nature352:624-628 (1991)与 Marks et al.，J.Mol.Biol.222:581-597 (1991)中描述的技术，“单克隆抗体”也可以从噬菌体抗体文库中分离。
[0116]本发明的CD20结合抗体的“功能性片段”是这样一些片段，其保有与其所衍生的完整全长分子相比实质上相同的亲合力结合CD20的能力，并且在经过例如在这里所描述的体外或体内分析而进行的测量中显示生物活性，包括消减B细胞。
[0117]术语“可变”指这一事实，即可变结构域的某些片段在抗体序列中存在广泛差别。V结构域介导抗原结合，并且定义特定的抗体对其特定抗原的特异性。然而，可变性在可变结构域的110个氨基酸跨度内不是均匀分布的。相反，可变区包括相对不变的几段序列称为框架区(FR)，为15-30氨基酸长，其间被极端可变的较短区域分开，称为“高变区”，每个9-12氨基酸长。天然重与轻链的可变结构域每个包含四个FR，基本上采取β片层构型，由三个高变区连接，高变区形成连接环，并且有时候形成β片层结构的一部分。每个链的高变区由FR十分接近地维系在一起，并且与另一链的高变区一起参与抗体的抗原结合部位的形成(参见Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5thEd.Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD.1991))。恒定结构域不直接涉及抗体与抗原的结合，但是显示出各种效应子功能，例如在抗体参与抗体依赖细胞细胞毒性(ADCC)中。
[0118]术语“高变区”当在这里使用时指抗体负责抗原结合的氨基酸残基。高变区通常包括来自“补体决定区”或“CDR” (例如\中大约残基24-34 (LI)、50_56(L2)与89-97 (L3)周围，与 Vh 中大约 31_35B(H1)、50_65(H2)与 95_102(H3)周围(Kabat et al., Sequencesof Proteins of Immunological Interest, 5th Ed.Public Health Service, NationalInstitutes of Healt h, Bethesda, MD.(1991))),和 / 或来自“高变环”的残基(例如 Vl 中残基 26-32(Ll)、50-52(L2)与 91-96 (L3),与 Vh 中 26-32 (HI)、52A_55 (H2)与 96-101 (H3)(Chothia 与 Lesk, J.Mol.Biol.196:901-917(1987))。
[0119]如在此所提到的，“共有序列”或者共有V结构域序列是人工序列，源自对已知人免疫球蛋白可变区序列的氨基酸序列的比较。基于这些比较，制备编码V结构域氨基酸的重组核酸序列，该序列对于源自人和人H链亚群III V结构域的序列是共有的。该共有V序列没有任何已知抗体结合特异性或亲合力。
[0120]“嵌合抗体”(免疫球蛋白)重和/或轻链的一部分与来源于特定的物种或者属于特定的抗体种类或者亚类的抗体的相应序列相同或同源，而链的其余部分与来源于另一个物种或者属于另一个抗体种类或者亚类的抗体的相应序列相同或同源，只要它们显示出该所需生物活性(美国专利号 4，816，567;与 Morrison et al., Proc.Natl.Acad.Sc1.USA81:6851-6855 (1984))。在此所使用的人源化抗体是嵌合抗体的亚群。
[0121]非人(例如，鼠的)抗体的“人源化”形式是嵌合抗体，其包含来源于非人免疫球蛋白的最小序列。在极大程度上，人源化抗体是人免疫球蛋白(受者或受体抗体)，其中受者的高变区残基被来自非人物种(供体抗体)例如小鼠、大鼠、兔或非人类灵长类动物的高变区残基替代，该高变区残基具有所需的特异性、亲合力和能力。在有些情况下，人免疫球蛋白的Fv框架区(FR)残基被相应的非人残基替代。此外，人源化抗体可以包含受者抗体或供体抗体中没有发现的残基。这些修饰被用来更进一步地改善抗体性能例如结合亲合力。一般地，人源化抗体将基本上包含所有至少一个、并且典型地两个可变结构域，其中相当于非人免疫球蛋白的高变环的所有或者基本上所有高变环、以及所有或者基本上所有FR区域是人免疫球蛋白序列的，虽然FR区域可以包括改善结合亲合力的一或多个氨基酸取代。在FR中的这些氨基酸取代的数目在重链中典型地不超过6个，在轻链中不超过3个。人源化抗体任意地也包括免疫球蛋白恒定区(Fe)的至少一部分，典型地是人免疫球蛋白恒定区的至少一部分。详细内容参见 Jones et al.，Nature321:522-525 (1986) ; Reichmannet al., Nature332:323-329 (1988);与 Presta, Curr.0p.Struct.Biol.2:593-596 (1992)。
[0122]抗体“效应子功能”指可归因于抗体Fe区域(天然序列Fe区域或者氨基酸序列变体Fe区域)的那些生物活性，并且随抗体同种型而变化。抗体效应子功能的例子包括:Clq结合与补体依赖的细胞毒；Fc受体结合；抗体依赖的细胞介导的细胞毒性(ADCC);吞噬作用；细胞表面受体(例如B细胞受体)的下调；与B细胞活化。[0123]“抗体依赖的细胞介导的细胞毒性”或“ADCC”指一种细胞毒性形式，其中与存在于某些细胞毒细胞(例如自然杀伤(NK)细胞、嗜中性白细胞与巨噬细胞)上的Fe受体结合的分泌Ig使得这些细胞毒效应细胞特定地与携带抗原的靶细胞结合，并且接着用细胞毒素杀死该靶细胞。抗体“武装”细胞毒细胞，并且对这样的杀伤是绝对需要的。介导ADCC的主要细胞一NK细胞一仅仅表达Fe Y RIII，而单核细胞表达Fe Y R1、Fe Y RII与Fe Y RIII。在造血细胞上的 FcR 表达在 Ravetch 与 Kinet, Annu.Rev.Tmmunol 9:457-92 (1991)第 464页表3中概括。为评估目的分子的ADCC活性，可进行体外ADCC试验，例如在美国专利号5，500，362或5，821，337中描述的。对这样的试验有用的效应细胞包括外周血单核细胞(PBMC)与自然杀伤(NK)细胞。或者或另外地，目的分子的ADCC活性可以体内评估，例如，在例如Clynes et al.PNAS(USA)95:652-656 (1998)中所披露的动物模型中。
[0124]“Fe受体”或者“FcR”描述与抗体Fe区域结合的受体。优选的FcR是天然序列人FcR。此外，优选的FcR是结合IgG抗体的FcR(—个Y受体)，并且包括Fe Y R1、Fe YRI1、与Fe YRIII亚类的受体，包括等位基因变体和这些受体的不同拼接形式。FcyRII受体包括FcyRIIA( “激活受体”)与Fe Y RIIB ( “抑制受体”)，其具有类似氨基酸序列，该氨基酸序列的主要不同在于其细胞质结构域。激活受体Fe Y RIIA在它的细胞质结构域包含免疫受体酪氨酸为基础的激活基序(ITAM)。抑制受体Fe Y RIIB在它的细胞质结构域包含免疫受体酪氨酸为基础的抑制基序(ITIM)。(参见综述M.1n Daeron5 Annu.Rev.1mmunol.15:203-234 (1997))。FcR 在 Ravetch 与 Kinet, Annu.Rev.1mmunol9:457-92(1991);Capel et al., Immunomethods4:25-34 (1994);与 de Haaset al.J.Lab.Clin.Med.126:330-41(1995)中综述。其它的FcR,包括那些将来要被鉴别的FcR，在此包括在术语〃FcR”内。该术语也包括新生儿受体FcRn，其负责将母体IgG转移给胎儿(Guyer et al.J.1mmunol.117:587 (1976)与 Kim et al., J.1mmunol.24:249 (1994))。W000/42072 (Presta)描述抗体变体，其具有改善的或者降低的与FcR结合能力。该专利出版物的内容在这里特别地引入作为参考。也参见，Shields et al.J.Biol.Chem.9(2):6591-6604(2001)。
[0125]“人效应细胞”是表达一或多个FcR并且行使效应子功能的白细胞。优选地，细胞至少表达Fe YRIII并且行使ADCC效应子功能。介导ADCC的人白细胞的例子包括外周血单核细胞(PBMC)、自然杀伤(NK)细胞、单核细胞、细胞毒性T细胞与中性粒细胞，以PBMC与自然杀伤细胞为优选。效应细胞可能从天然来源，例如从血中分离。
[0126]“依赖于补体的细胞毒性”或“⑶C”指补体存在下靶细胞的溶解。通过补体系统的第一组分(Clq)与合适亚类的抗体结合而启动经典补体途径的激活，所述抗体是与其相关抗原结合的。为评估补体激活，可进行⑶C试验，例如如Gazzano-Santoro et al.，J.1mmunol.Methods202:163 (1996)中描写的。
[0127]在美国专利号6，194，551B1与TO99/51642中描述了多肽变体，具有改变的Fe区域氨基酸序列与增加或降低的Clq结合能力。那些专利出版物的内容在此特别地引入作为参考。也参见 Idusogie et al.J.1mmunol.164:4178-4184(2000)。
[0128]IgG中N-糖基化位点在CH2结构域的Asn297。本发明也提供⑶20结合的、人源化抗体组合物，该抗体具有Fe区域，其中组合物中抗体的大约80-100%(并且优选地大约90-99%)包含成熟核心糖结构，该糖结构缺乏岩藻糖，附着于糖蛋白的Fe区域。象这样的组合物在此被证明显示出在与Fe Y RIIIA(F158)结合上的惊人改善，该结合不如FcyRIIIA(V158)与人IgG相互作用有效。因此，在这里的组合物预计优于以前描述的抗⑶20抗体组合物，特别是对于治疗表达Fe Y RIIIA (F158)的病人而言。在正常、健康的非洲裔美国人与白种人中，Fe Y RIIIA(F158)比Fe Y RIIIA(V158)更常见。参见Lehrnbecheret al.Blood94:4220(1999)o本申请更进一步显示Fe Y RIII结合和/或ADCC功能的协同增加，该协同增加源自在此的糖基化作用变异与糖蛋白Fe区域的氨基酸序列修饰的联合。
[0129]“分离的”抗体是已经从它的自然环境的组分中鉴别与分离和/或回收的抗体。其自然环境的污染物组分是将干扰抗体的诊断或治疗使用的物质，并且可包括酶、激素及其它蛋白的或者非蛋白的溶解物。在优选实施方式中，抗体将被纯化至(I)如经过Lowry方法确定的，按重量计算大于抗体的95%，并且最优选按重量计算超过99%，(2)足够获得通过利用转杯测序仪(spinning cup sequenator) N末端或者内部氨基酸序列的至少15个残基的程度，或者(3)在还原或者非还原条件下利用考马斯蓝或优选地银染色在SDS-PAGE下达到均一。分离的抗体包括在重组细胞内部的原位抗体，因为抗体自然环境中的至少一个组分将不存在。然而，一般地，分离的抗体将通过至少一个纯化步骤制备。
[0130]“分离的”核酸分子是从至少一个污染物核酸分子中鉴别与分离的核酸分子，在抗体核酸的天然来源中其一般地与该污染物核酸分子有联系。分离的核酸分子在其形式或环境上与其在自然界中发现时不同。分离的核酸分子因此不同于其在自然细胞中存在的核酸分子。然而，分离的核酸分子包括在通常表达抗体的细胞中加以包含的核酸分子，在该细胞中例如核酸分子位于与自然细胞不同的染色体位置上。
[0131]表示法“控制序列”指在一特定宿主有机体中表达可操作连接的编码序列所需的DNA序列。适于原核生物的控制序列例如包括启动子，任选操纵子序列，以及核糖体结合位点。已知真核细胞利用启动子、聚腺苷酸化信号与增强子。
[0132]当核酸被置于与另一核酸序列的功能性关系时其是“可操作连接的”。例如，如果前序列或分泌性前导序列的DNA作为参与多肽分泌的前蛋白质加以表达，其与多肽的DNA是可操作连接的。如果启动子或者增强子影响序列的转录，其与编码序列是可操作地连接的。或如果核糖体结合位点被置于促进翻译的位置，则其与编码序列是可操作地连接的。一般地，“可操作地连接”指被连接的DNA序列是邻近的，并且在分泌性前导序列的情况下，是邻近的和在阅读状态下。然而，增强子不必是邻近的。连接通过在适宜限制性位点的连接而完成。如果这样的位点不存在，根据通常的做法使用合成寡核苷酸连接物或接头。
[0133]“载体”包括穿梭与表达载体。典型地，质粒构建物包括复制起始点(例如ColEl复制起始点)与选择性标记(例如氨苄青霉素或四环素抗性)，分别用于质粒在细菌中的复制与选择。“表达载体”指一种载体，其包含在细菌或真核细胞中表达本发明的抗体、包括抗体片段所需的控制序列或调控元件。合适的载体在下面披露。
[0134]产生本发明的人源化⑶20结合抗体的细胞包括细菌与真核宿主细胞，其中已经引入编码抗体的核酸。合适的宿主细胞在下面披露。
[0135]用词“标记”当在这里使用时指可检测的化合物或组合物，其直接或间接地与抗体接合。标记可本身是可检测的(例如放射性同位素标记或荧光的标记)或者，在酶促标记的情况下，可以催化可检测的底物化合物或组合物的化学改变。
[0136]“自身免疫病”在此是来自并针对个体自身(自己的)抗原和/或组织的非恶性疾病或紊乱。
[0137]如同在这里使用的，"B细胞消减〃指在药物或者抗体处理之后同像这样的处理以前的水平比较起来在动物或者人中B细胞水平的减少。利用众所周知的试验，例如在实验实施例中描述的试验，测量B细胞水平。B细胞消减可以完全的或者部分的。在一个实施方式中，表达CD20的B细胞消减至少25%。不受任何机制的限制，B细胞消减的可能机制包括ADCC、CDC、细胞程序死亡、钙流的调制或者在前机制中两个或更多的组合。
[0138]术语“细胞 毒性剂”如同在此使用的指一种物质，该物质抑制或防碍细胞功能和/或导致细胞破坏。术语意图包括放射性同位素(例如I131、I125、Y90与Re186)、化疗剂和毒素例如细菌、真菌、植物或动物来源的酶促活性毒素或其片段。
[0139]“化疗剂”是在癌症治疗中有用的化合物。化疗剂实例包括烷化剂，如噻替哌(thiotepa);环膦酰胺(cyclosphamide) (CYTOXAN?);烷基磺酸酯如白消安(busulfan)，英丙舒凡(improsulfan)和哌泊舒凡(piposulfan);氮丙唳如节替哌(benzodopa),卡波醌(carboquone),美妥替哌(meturedopa)和尿烧亚胺(uredopa);氮丙唳和methylameIamine 包括六甲蜜胺(altretamine),三乙撑蜜胺(triethylenemelamine),三亚乙基磷酰胺，三亚乙基硫代磷酰胺和三轻甲基蜜胺(trimethylolomelamine);氮芥(nitrogen mustards)如苯丁酸氮芥，萘氮芥，胆磷酰胺(cholophosphamide),雌氮芥(estramustine),异环磷酰胺(ifosfamide),氮芥(mechlorethamine),盐酸氧氮芥;左旋苯丙氨酸氮芥(melphalan),新氮芥(novembichin),胆留醇苯乙酸氮芥,松龙苯芥(prednimustine)，曲磷胺(trofosfamide)，尿嘧唳氮芥；亚硝基脲(nitrosureas)如亚硝基脲氮芥(carmustine),氯脲菌素(chlorozotocin),福莫司汀(fotemustine),洛莫司汀(1mustine),尼莫司汀(nimustine),雷莫司汀(ranimustine);抗生素如阿克拉霉素，放线菌素，authramycin,重氮丝氨酸，博来霉素，放线菌素C(cactinomycin),加利车霉素(calicheamicin), carabicin,洋红霉素，嗜癌素(carzinophilin),色霉素(chromomycin),放线菌素 D,道诺红菌素(daunorubicin),地托比星(detorubicin), 6-重氮-5-氧-L-正亮氨酸，阿霉素(doxorubicin, Adriamycin),表阿霉素(epirubicin),依索比星(esorubicin),伊达比星(idarubicin),发波霉素(marcel1mycin),丝裂霉素，霉酹酸，诺加霉素(nogalamycin),橄榄霉素(olivomycin),培洛霉素(peplomycin),potfiromycin,嘌呤霉素，三铁阿霉素(quelamycin),罗多比星(rodorubicin),链黑菌素；链脲霉素(streptozocin),杀结核菌素，乌苯美司(ubenimex),净司他丁(zinostatin),佐柔比星(zorubicin);抗代谢药如氨甲蝶呤,5-氟尿嘧唳(5-FU);叶酸类似物如二甲叶酸(denopterin),氨甲蝶呤，丁蝶翼素(pteropterin),三甲曲沙(trimetrexate);嘌呤类似物氟达拉滨(fIudarabine) ,6-巯基嘌呤，硫咪嘌呤，硫鸟嘌呤；嘧唳类似物如安西他滨(ancitabine),阿扎胞苷(azacitidine) ,6-氮尿苷，卡莫氟(carmofur),阿糖胞苷，双脱氧尿苷，多西氟尿唳，依诺他滨(enocitabine),氟尿苷，5-FU ;雄激素类如二甲睾酮，丙酸甲雄烧酮(dromostanolong propionate),环硫雄醇(epitiostanol),美雄氨(mepitiostane),睾内酯(testolactone);抗肾上腺类如氨鲁米特(aminoglutethimide),邻氯苯对氯苯二氯乙烧(mitotane),曲洛司坦(trilostane)；叶酸补充剂如frolinic acid ;醋葡内酯；醒磷酰胺糖苷(aldophosphamide glycoside)；氨基乙酸丙酸(aminolevulinic acid)；安口丫 P定(amsacrine) ；bestrabucil ;比生群(biasntrene);依达曲沙(edatraxate);磷氨氮芥(defofamine);秋水仙胺；地口丫酉昆(diaziquone);依洛尼塞(elfornithine);醋酸轻吡咔唑(elliptinium acetate);依托格鲁(etoglucid);硝酸镓；羟基脲；香燕多糖(Ientinan);氯尼达明(1nidamine)；米托胍腙(mitoguazone);米托蒽醌(mitoxantrone);莫哌达醇(mopidamol) ;二胺硝口丫P定(nitracrine);喷司他丁 (pintostatin) ;phenamet ;吡柔比星(pirarubicin);鬼曰树酸(podophyllinic acid) ;2_ 乙基酰肼；丙卡巴肼(procarbazine) ;PSIC&’；雷佐生(razoxane);西索菲兰(sizofiran);锗螺胺(spirogermanium);细交链孢菌酮酸；三亚胺醌；2，2’，2’三氯三乙胺(trichlorrotriethyIamine);乌拉坦(urethan);长春碱酰胺；达卡巴嗪(dacarbazine);甘露醇氮芥；二溴甘露醇(mitobronitol) ;二溴卫矛醇；溴丙哌嗪(pipobroman) ；gacytosine ;阿拉伯糖苷(“Ara_C”)；塞替哌(thiotepa);紫杉烧(taxoid),如紫杉醇(TAXOL?，Bristol-Myers Squibb Oncology, Princeton, NJ)和doxetaxel ( TAXOTERB?, Rhone-Poulenc Rorer, Antony, France);苯丁酸氮芥；吉西他滨(gemcitabine) ;6_硫代鸟嘌呤；巯基嘌呤；氨甲蝶呤；钼类似物如顺钼和卡钼；钼；鬼臼乙叉式(etoposide) (VP-16);异环磷酰胺；丝裂霉素C ;米托蒽醌；长春新碱；长春花碱；长春瑞宾(vinorelbine);新霉酰氨(navelbine) ;二羟基蒽酮(novantrone);替尼泊式(teniposide);柔红霉素；氨基蝶呤；xeloda ;伊拜膦酸盐(ibandronate) ；CPT-11 ;拓扑异构酶抑制剂RFS2000 ;二氟甲基鸟氨酸(DMFO);维甲酸；esperamicins ；capecitabine ;以及上述任何物质的可药用盐，酸或衍生物。此定义还包括能调节或抑制激素对肿瘤的作用的抗激素制剂，如抗雌激素制剂包括他莫昔芬(tamoxifen),雷洛昔芬(raloxifene),芳香酶抑制剂4 (5)-咪唑,4-羟基他莫昔芬，曲沃昔芬(trioxifene), keoxifene, LY117018,奥那司酮(onapristone),和托瑞米芬(Fareston);和抗雄激素制剂如氟他氨(flutamide),尼鲁米特(nilutamide),bicalutamide,亮丙瑞林(Ieuprolide)和戈舍瑞林(goserelin)；和上述任何物质的可药用盐，酸或衍生物。
[0140] “治疗”或“处理”或“缓和”既指治疗性处理也指预防性或者预防性措施，其中目的是防止或减慢(减弱)所针对的病理情况或紊乱。如果个体根据本发明的方法接受治疗量的本发明的CD20结合抗体后，显示该特定疾病的一或多个体征和症状的可观测的和/或可度量的减少，该个体被成功地“治疗”CD20阳性癌症或自身免疫病。例如，对于癌症来说，癌细胞数目减少或者癌细胞消失；肿瘤体积减小；抑制(即在某种程度上减慢并且优选地停止)肿瘤转移；在某种程度上抑制肿瘤生长；延长症状缓解的时间，和/或在某种程度上减轻与该特定的癌症有联系的一个或多个症状；减低发病率与死亡率，与生命质量的改进等事宜。病人也可以感到疾病征候或症状的减低。治疗可以取得完全响应，定义为所有癌症迹象的消失，或者部分响应，其中肿瘤尺寸减小，优选地超过50%，更优选地超过75%。如果病人病情平稳,也被认为是已治疗的。在一优选实施方式中，在一年之后癌症病人的癌症仍然没有进展，优选地在15个月之后。评估疾病成功治疗与改善的这些参数通过为本领域医师所熟悉的常规程序是容易度量的。
[0141]“治疗有效量”指在个体中有效“治疗”疾病或紊乱的抗体或药物的量。对于癌症，药物治疗有效量可减少癌细胞的数量；减小肿瘤体积；抑制(即在一定程度上减慢并优选停止)癌细胞对周围器官的浸润；抑制(即在一定程度上减慢到并优选停止)肿瘤转移；在一定程度上抑制肿瘤生长；和/或在一定程度上减轻与癌症相关的一种或多种症状。参见前述对“治疗”的定义。
[0142]“慢性”给药指以与急性方式相反的连续方式给药所述药剂，从而在更长的时间内维持最初的治疗效果(活性)。“间歇性”给药是并非不间断地连续进行、而实际上是周期性的治疗。
[0143]本发明的方法与组合物
[0144]本发明提供结合人⑶20、并且优选地也结合其它灵长类动物⑶20的人源化抗体，包含一个重链，该重链包含非人物种抗人CD20抗体(供体抗体)的至少一个、优选地两个或者所有H链CDR，和作为受者抗体的人共有抗体的基本上所有框架残基。供体抗体可以来自于各种的非人 物种，包括小鼠、大鼠、豚鼠、山羊、兔、马、灵长类动物，但是最经常地是小鼠抗体。在这里“基本上所有的”指人源化抗体的受者FR区域可以包括在人共有FR序列中原来不存在的一或多个氨基酸取代。这些FR改变可以包含在受者或供体抗体中未找到的残基。
[0145]在一个实施方式中，供体抗体是鼠抗体，可变区包括图1A与IB所示的H与L链的每一个的CDR与FR序列。在一个特定的实施方式中，人Fab框架的残基相应于人V K亚群1和乂11亚群III的共有序列，这些共有序列分别地如图1A与图1B所示。本发明的人源化2H7抗体具有小鼠供体抗体的H链的至少一个CDR。在一个实施方式中，结合人CD20的人源化2H7抗体包含供体抗体H与L链两者的⑶R。
[0146]在一个全长抗体中，本发明的人源化⑶20结合抗体将包含人源化的可变结构域，该结构域与人免疫球蛋白的恒定结构域连接。在一优选实施方式中，重链恒定区来自人IgG,优选地IgGl或者IgG3。轻链恒定结构域优选地来自人K链。
[0147]除非另外指示，除了在下面的实验实施例中指示的氨基酸取代或改变位置之外，在这里的人源化2H7抗体型式将具有2Η7.vl6轻链(图6，SEQ ID N0.21)与H链(图7，SEQID N0.22)的V与C结构域序列。
[0148]该人源化⑶20结合抗体将至少结合人⑶20，并且优选地结合其它灵长类动物⑶20，例如猿猴(monkey)包括猕猴和恒河猴，与黑猩猩的⑶20。猕猴⑶20的序列在实施例15与图19中披露。[0149]本发明的⑶20结合抗体与人源化⑶20结合抗体的生物活性包括该抗体与人⑶20的结合，更优选与人和灵长类动物(包括猕猴、恒河猴、黑猩猩)CD20结合，其Kd值不高于IxlO-8,优选地Kd值不高于大约lxlO—9，甚至更优选地Kd值不高于大约1x10,，并且能体外或体内杀死或者消减B细胞，优选地当与基线水平或未用这样的抗体处理过的恰当的负对照相比杀死或者消减至少20%。
[0150]B细胞消减的所需水平将取决于疾病。对于治疗CD20阳性癌症来说，也许需要最大限度消减作为本发明的抗CD20抗体目标的B细胞。因此，对于治疗CD20阳性B细胞肿瘤而言，最好对B细胞的消减是足够的，以至少防止疾病的进展，而疾病的进展是本领域熟练医师可以评估的，例如通过监测肿瘤生长(大小)、癌细胞类型的增殖、转移、及该特定癌症的其它体征和症状。优选地，B细胞消减足以防止疾病的进展至少2个月，更优选3个月，甚至更优选4个月，更优选5个月，甚至更优选6或更多个月。在甚至更优选的实施方式中，B细胞消减足以提高症状缓解时间至少6个月，更优选9个月，更优选一年，更优选2年，更优选3年，甚至更优选5年或更多年。在一个最优选实施方式中，B细胞消减足以治疗疾病。在优选实施方案中，在癌症病人中的B细胞消减是治疗以前基线水平的至少大约75和优选地80%、85%、90%、95%、99%并且甚至100%。[0151]对于治疗自身免疫病，也许需要依赖个体病人的疾病和/或病症的严重程度，通过调整⑶20结合抗体的剂量，调制B细胞消减的程度。因此，可以消减B细胞、但不必是完全的。或者，在起始治疗中可能需要总B细胞消减,但在随后治疗中，可能调整剂量以达到仅部分消减。在一个实施方式中，与治疗前的基线水平相比，B细胞消减至少20%，即余留80%或者更少的CD20阳性B细胞。在其它实施方式中，B细胞消减25%、30%、40%、50%、60%、70%或者更多。优选地，B细胞消减足以使疾病进展停顿，更优选缓和在治疗下的特定疾病的体征和症状，甚至更优选治愈疾病。
[0152]本发明还提供双特异性CD20结合抗体，其中抗体的一个臂具有本发明的人源化CD20结合抗体的人源化重与轻链，并且另一个臂具有针对第二抗原的结合特异性的可变区。在特定的实施方式中，第二抗原选自由⑶3、⑶64、⑶32A、⑶16、NKG2D或者其它NK激活配体组成的组。
[0153]同Rituxan (rituximab)比较起来)，vl6显示出ADCC效力增加大约2至5倍，Q)C比Rituxan降低3-4倍。
[0154]抗体产生
[0155]单克隆抗体
[0156]单克隆抗体可用Kohler et al, Nature, 256:495 (1975)首先描述的杂交瘤法制备或通过重组DNA法(美国专利4，816，567)制备。
[0157]在杂交瘤方法中，如上述免疫小鼠或其它适宜的宿主动物，例如仓鼠，来激发产生或能产生特异结合免疫所用蛋白的抗体的淋巴细胞。可选地，所述淋巴细胞可被体外免疫。免疫后，淋巴细胞可被分离并随后使用适宜的融合剂例如聚乙二醇与骨髓瘤细胞系融合，以形成杂交瘤细胞(Goding,单克隆抗体:Principles and Practice, 59-103 页(AcademicPress, 1986))。
[0158]由此制备的杂交瘤细胞被接种于适宜的培养基并在其中生长，该培养基优选包含一种或多种抑制未融合亲代骨髓瘤细胞(也称为融合伴侣)的生长或存活的物质。例如，如果亲代骨髓瘤细胞缺乏次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶(HGPRT或HPRT)，杂交瘤的选择培养基通常包括次黄嘌呤，氨基蝶呤，和胸腺嘧啶(“HAT培养基”)这些抑制HGPRT-缺陷细胞生长的物质。
[0159]优选融合伴侣骨髓瘤细胞为那些能有效融合、支持所选抗体生成细胞以稳定的高水平产生抗体、并对选择未融合亲代的选择培养基敏感的那些融合伴侣骨髓瘤细胞系。优选的骨髓瘤细胞系是鼠骨髓瘤系，如由Salk Institute Cell Distribution Center,San Diego, California USA提供的M0PC-21和MPC-11小鼠肿瘤，和由美国典型培养物保藏中心，Rockville, Maryland USA提供的SP-2或其衍生物，如X63_Ag8_653细胞。也描述了人骨髓瘤和小鼠-人异源骨髓瘤细胞系可用于产生人单克隆抗体[Kozbor，J.1mmunol., 133:3001 (1984);和Brodeur等，单克隆抗体的制备技术和应用(MarcelDekker, Inc., New York 纽约,(1987)) 51-63 页)。
[0160]可在含有生长的杂交瘤细胞的培养基中分析抗所述抗原的单克隆抗体的产生。优选地，杂交瘤细胞所产生的单克隆抗体的结合特异性通过免疫沉淀或通过体外结合试验，如放射免疫分析(RIA)或酶联免疫吸附试验(ELISA)来分析。
[0161]单克隆抗体的结合亲合力可通过,例如Muson等，Anal.Biochem., 107:220 (1980)所述Scatchard分析来测定。
[0162]一旦鉴定出产生具有所需特异性、亲合力和/或活性的抗体的杂交瘤细胞，这些细胞克隆可通过有限稀释进行亚克隆，并通过标准方法(Goding,单克隆抗体！Principlesand Practice, 59-103页(Academic Press, 1986))使其生长。适合此目的的培养基包括例如D-MEM或RPM1-1640培养基。此外，通过例如将细胞腹膜内注射入小鼠中，可以使杂交瘤细胞以动物腹水肿瘤的形式在体内生长。
[0163]上述亚克隆所分泌的单克隆抗体可用经典抗体纯化方法如，例如，亲和层析(例如使用蛋白A或蛋白G琼脂糖)或离子交换层析，羟基磷灰石层析，凝胶电泳，透析等从培养基，腹水或血清中分离。
[0164]使用传统方法(例如通过使用能与编码鼠抗体重链和轻链的基因特异结合的寡核苷酸探针)可轻易分离并测序编码单克隆抗体的DNA。杂交瘤细胞是此DNA的优选来源。一旦分离出该DNA，可以将它置入表达载体中，该载体随后被转染至宿主细胞中例如大肠杆菌细胞，猴COS细胞，中国仓鼠卵巢(CHO)细胞，或不另外生成抗体蛋白的骨髓瘤细胞，从而在重组宿主细胞中合成单克隆抗体。关于在细菌中重组表达编码抗体的DNA的综述文字包括 Skerra et al., Curr.0pinion in Immunol.，5:256-262 (1993)和 Pliickthun, Immunol.Revs.， 130:151-188(1992)。
[0165]在进一步的实施方案中，可从使用McCafferty 等，Nature, 348:552-554(1990)描述的技术产生的抗体噬菌体文库中分离单克隆抗体或抗体片段。Clackson等，Nature, 352:624-628(1991)和 Marks 等，J.Mol.Biol., 222:581-597(1991)分别描述了使用噬菌体文库分离鼠和人抗体。随后的文章描述了通过链改组产生高亲和性(纳米级)人抗体(Marks等，Bio/Technology, 10:779-783 (1992))，以及将组合感染和体内重组作为策略构建非常大的噬菌体文库(Waterhouse 等，Nuc.Acids.Res., 21:2265-2266 (1993))。因此，这些技术是用于分离单克隆抗体的传统单克隆抗体杂交瘤技术的可行(viable)选择。
[0166]也可采用以下方法对编码抗体的DNA进行修饰以产生嵌合或融合抗体多肽:例如，以人重链和轻链恒定区(C1^PCD的序列代替同源小鼠序列(美国专利4，816，567;和Morrison 等,Proc.Natl Acad.Sc1.USA, 81:6851 (1984))，或将免疫球蛋白编码序列与非免疫球蛋白多肽(异源多肽)的完整或部分编码序列融合。非免疫球蛋白多肽序列可取代抗体的恒定区，或它们可取代抗体的一个抗原结合位点的可变区以产生嵌合二价抗体，该抗体包含针对一个抗原的一个抗原结合位点，和具有对不同抗原的特异性的另一抗原结合位点。
[0167]人源化抗体
[0168]使非人抗体人源化的方法已在本领域中描述。优选地，人源化抗体具有一或多个从非人来源引入它的氨基酸残基。这些非人氨基酸残基常称为“引进的”残基，它们通常来自“引进的”可变区。人源化过程基本是按照Winter及其同事(Jones等,Nature, 321:522-525(1986) ；Riechmann 等,Nature, 332:323-327(1988) ；Verhoeyen等，Science, 239:1534-1536(1988))所述，通过高度可变区序列替换人抗体的对应序列来进行。因此，这样的“人源化”抗体是嵌合抗体(美国专利4，816，567)，其中完整人类可变区的很少一部分被非人物种的相应序列取代。实践中，人源化抗体通常是人的抗体，其中有些高变区残基且可能有些FR残基被啮齿动物抗体中类似位点的残基取代。
[0169]当抗体用于人类治疗用途时，选择人源化抗体制备所用的人轻链和重链可变区，对于降低抗原性和HAMA反应(人抗鼠抗体)非常重要。根据所谓的“最适”方法，针对已知人可变区序列的整个文库筛选啮齿类抗体的可变区序列。鉴定与啮齿类V区序列最接近的人V区序列，并且其中的人框架区(FR)作为人源化抗体被接受(Sims etal., J.1mmunol., 151: 2296 (1993) ; Chothia et al.，J.Mol.Biol.，196:901 (1987))。另一种方法使用从具有轻链或重链特定亚群的所有人抗体的共有序列衍生的特定框架区。同样的框架区可被用于几种不同的人源化抗体(Carter等，Proc.Natl.Acad.Sc1.USA, 89:4285 (1992) ; Presta 等，J.1 mmunol., 151:2623 (1993))。
[0170]重要的是，将抗体人源化后保留了对抗原的高结合亲和力和其它有利的生物特性。为达到此目的，在一种优选方法中，通过用亲本序列和人源化序列的三维模型分析亲本序列和各种概念性人源化产物的方法来制备人源化抗体。免疫球蛋白三维模型已有商品，是本领域技术人员所熟悉的。还有用于描述和展示所选候选免疫球蛋白序列可能的三维构象结构的计算机程序。通过检查这些展示结果可分析残基在候选免疫球蛋白序列的功能中可能发挥的作用，即分析能影响候选免疫球蛋白与其抗原结合的能力的残基。通过这种方法，可从受体序列和引进序列中选出FR残基并组合，从而得到所需抗体性质,如对靶抗原的亲和力增加。总之，高变区残基直接并且最主要涉及对抗原结合的影响。
[0171]人源化抗体可以是抗体片段，例如Fab，其可选地与一种或多种细胞毒性制剂偶联以产生免疫偶联物。可选地，人源化抗体可以是全长的抗体，例如全长IgGl抗体。
[0172]人抗体和噬菌体展示方法
[0173]作为人源化的备选，可制备人抗体。例如，现在可以制备转基因动物(如小鼠)，它经过免疫能在缺乏内源性免疫球蛋白生成的情况下产生全套人抗体。例如，已指出在嵌合和胚系(germ-line)突变小鼠中，抗体重链连接区(Jh)基因的纯合缺失导致内源性抗体生成的完全抑制。将人胚系免疫球蛋白基因阵列转移到此胚系突变小鼠中，将导致在抗原攻击的情况下产生人抗体。见例如，Jakobovits等Proc.Natl.Acad.Sc1.USA, 90: 2551 (1993) ; Jakobovits 等，Nature, 362: 255-258 (1993) ; Bruggemann 等，Year in Immun0., 7:33(1993);美国专利 5，545，806，5，569，825，5，591，669 (所有均授予GenPharm);5，545，807;和 TO97/17852.[0174]或者，可用噬菌体展示技术(McCafferty等，自然348:552_553 (1990))从未免疫供体的免疫球蛋白可变(V)区基因库体外产生人类抗体和抗体片段。依据此技术,抗体V区基因在框架内(in-frame)克隆入丝状噬菌体(如M13或fd)主要或次要衣壳蛋白基因，并在噬菌体颗粒的表面展示为功能性抗体片段。因为丝状颗粒包含噬菌体基因组的单链DNA拷贝，根据抗体的功能特点进行的选择也导致对显示这些性质的抗体的编码基因进行选择。因此，噬菌体模仿了 B细胞的部分特点。噬菌体展示可以以多种形式进行；这些综述见例如 Johnson, Kevin S.和 Chiswell, David J., Current Opinion in StructuralBiology3, 564-571 (1993)。可使用V基因节段的多个来源进行噬菌体展示。Clackson等，Nature352,624-628 (1991)从免疫小鼠脾脏来源的V基因小随机组合文库中分离出一批多样的抗-噁唑酮抗体。可基本如 Marks 等，J.Mol.Biol.222:581-597 (1991)，或 Griffith等，EMBO J.12 =725-734(1993)所述，构建未免疫的人类供体的V基因库，并分离针对多种多样抗原(包括自身抗原)的抗体。也见美国专利5，565，332和5，573，905。[0175]如上讨论，人抗体也可通过体外活化的B细胞产生(见美国专利5，567，610和5，229，275)。
[0176]抗体片段
[0177]在特定的情况下，使用抗体片段比整个抗体更有优势。片段的较小体积允许快速清除，并可导致更好地接近实体肿瘤。
[0178]已开发了多种技术用于生产抗体片段。传统上，这些片段通过对完整抗体进行蛋白水解消化来衍生(见例如，Morimoto等，J.Biochem.Biojphys.Methods24:107-117 (1992)和 fcennan 等，Science229:81 (1985))。然而，这些片段现在可通过重组宿主细胞直接生产。Fab, Fv和ScFv抗体片段均可在大肠杆菌中表达并从中分泌，从而使这些片段的大量生产变容易。也可自上述的抗体噬菌体文库分离抗体片段。可选地，Fab’ -SH片段可自大肠杆菌直接回收并利用化学方法偶联形成F(ab’)2片段(Carter等，Bio/TechnologylO: 163-167 (1992))。根据另一方法，F (ab，)2片段可直接从重组宿主细胞培养物中分离。包括补救受体结合表位残基并具有延长的体内半寿期的Fab和F(ab’ )2片段在美国专利5，869，046中描述。熟练技术人员掌握其它产生抗体片段的技术。其它实施方案中，选择的抗体是单链Fv片段(scFv) 0见冊93/16185;美国专利5，571，894;和美国专利5，587，458。Fv和sFv是具有完整结合位点的种类中唯一缺乏恒定区的；因此，其适于在体内应用期间降低非特异结合。可以构建sFv融合蛋白，从而在sFv的氨基或羧基末端融合效应蛋白。见上文的Antibody Engineering, Borrebaeck编辑。抗体片段也可以是“线性抗体”，例如在美国专利5，641，870中描述。此种线型抗体片段可以是单特异或双特异的。
[0179]双特异抗体
[0180]双特异抗体是对至少两种不同表位具有结合特异性的抗体。典型的双特异抗体可结合CD20蛋白质的两种不同表位。其它此种抗体可将CD20结合位点与针对另一蛋白质的结合位点组合。或者，抗CD20臂可以与结合白细胞上触发分子的臂结合，触发分子例如T细胞受体分子(例如CD3)或IgG的Fe受体(Fe y R)例如Fe y RI (CD64)、Fe Y RII (CD32)和Fe yR(CD16)，或NKG2D或其它NK细胞激活配体，以将细胞防御机制针对和定位在CD20表达细胞上。双特异抗体也可用来将细胞毒制剂定位在表达⑶20的细胞上。这些抗体具⑶20臂和结合细胞毒性制剂的臂(例如皂草素(saporin)，抗α -干扰素，长春花生物碱，蓖麻毒蛋白A链，氨甲蝶呤或放射性同位素半抗原)。可以将双特异抗体制备成全长抗体或抗体片段(例如F (ab’) 2双特异抗体)。
[0181]W096/16673描述了双特异性抗ErbB2/抗Fe Y RIII抗体，美国专利5，837，234披露了双特异性抗ErbB2/抗Fe Y RI抗体。在W098/02463中显示双特异性抗ErbB2/Fc α抗体。美国专利5，821，337教导了双特异性抗ErbB2/抗⑶3抗体。
[0182]制备双特异性抗体的方法是本领域已知的。全长双特异性抗体的传统制备是基于两个免疫球蛋白重链-轻链对的共表达，其中这两条链具有不同特异性(Millstein etal, Nature, 305:537-539 (1983))。由于免疫球蛋白重链轻链随机分配，这些杂交瘤(“四链瘤”(quadroma))产生10种不同抗体分子的可能混合物,其中只有一种具有正确的双特异性结构。对所述正确分子的纯化(通常通过亲和层析步骤来进行)非常复杂，且产量很低。类似的方法在 W093/08829 和 Traunecker 等，EMBO J，10:3655-3659 (1991)中披露。
[0183]依据另一不同方法，可将具有所需结合特异性的抗体可变区(抗体-抗原结合位点)与免疫球蛋白恒定区序列融合。该融合优选与包含铰链区、CH2及CH3区的至少一部分的免疫球蛋白重链恒定区融合。优选使含有轻链结合所需位点的第一重链恒定区(CHl)出现在至少在一种融合中。可将编码免疫球蛋白重链融合体，以及必要时，编码免疫球蛋白轻链的DNA插入不同表达载体，共转染至适当宿主细胞。在使用非等比的三种多肽链进行构建以获得所需双特异性抗体最佳产量的实施方案中，这提供调整三种多肽片段的相互比例上的较大灵活性。但也可在至少两种多肽链以等比例表达而获得高产时或所述比例对所需链组合的产量无特 别意义时，将两种或所有三种多肽链的编码序列插入同一表达载体。
[0184]在该方法的一个优选实施方案中，所述双特异性抗体由一条臂上的具有第一结合特异性的杂合免疫球蛋白重链和另一条臂上的杂合免疫球蛋白重链-轻链对(提供第二结合特异性)构成。已发现这种不对称结构有利于从不想要的免疫球蛋白链的混合中分离出所需双特异性化合物，因为只有该双特异性分子的一半存在免疫球蛋白轻链，这使得分离更加容易。此方法公开于1994年3月3日公开的W094/04690中。制备双特异性抗体的进一步细节可以参见，例如 Suresh 等，Methods in Enzymology, 121:210 (1986)。
[0185]根据美国专利5，731，168所述的另一种方法，可改造一对抗体分子之间的界面，使得从重组细胞培养中获得的异二聚体的百分比最大。优选的界面包括CH3结构域的至少一部分。在该方法中，源于第一抗体分子界面上的一条或多条氨基酸小侧链被较大侧链(如酪氨酸或色氨酸)取代。与所述大侧链大小相同或相近的互补“沟”可通过将氨基酸大侧链用小侧链(如丙氨酸或苏氨酸)取代而在第二抗体分子的界面上形成。这提供了一种机制，其使异二聚体的产量比其它不想要的终产物如同型二聚体高。
[0186]双特异性抗体包括交联抗体或“异源偶联的”抗体。例如，可使异源偶联物中的抗体之一与抗生物素蛋白偶联，使另一抗体与生物素偶联。有观点认为，这类抗体可用于将免疫系统细胞导向不想要的细胞(美国专利4，676，980)，也可用于治疗HIV感染(W091/00360,W092/200373,EP03089)。异源偶联抗体可通过任何适当的交联方法制备。适当的交联制剂和多种交联技术为本领域已知，在美国专利4，676，980号中获得。
[0187]从抗体片段制备双特异性抗体的技术已有文献。例如，双特异性抗体可利用化学连接制备。Brennan等，科学229:81(1985)中描述了将完整抗体经蛋白水解切割制备F(ab’)2片段的方法。这些片段在二巯基复合剂亚砷酸钠存在时被还原，从而稳定相邻的巯基，并阻止分子间二硫键的形成。生成的Fab’片段被转化为硫硝基苯甲酸盐(TNB)衍生物。其中一种Fab’ -TNB衍生物经巯基乙胺还原再转化成Fab’ -硫醇，再与等摩尔量的其它Fab’ -TNB衍生物混合形成双特异性抗体。如此产生的双特异性抗体可作为酶的选择性固相化中所用的试剂。[0188]近期的进展促进了 Fab’-SH片段从大肠杆菌的直接回收，该片段可经化学偶联形成双特异性抗体。Shalaby等，J.Exp.Med., 175:217-225 (1992)描述了完全人源化双特异抗体F(ab’)2分子的产生。每一 Fab’片段分别从大肠杆菌中分泌出来，体外直接化学偶联形成双特异性抗体。如此制备的双特异性抗体能与过表达ErbB2受体的细胞和正常人T细胞结合，还能引发人类细胞毒淋巴细胞对人乳腺肿瘤靶向的裂解活性。
[0189]直接从重组细胞培养中制备并分离双特异性抗体片段的多种技术也已有描述。例如，可用亮氨酸拉链制备双特异性抗体。Kostelny等，J.1mmunol., 148 (5): 1547-1553(1992)。将来自Fos和Jun蛋白的亮氨酸拉链肽与两种不同抗体的Fab’部分通过基因融合而连接。使抗体的同二聚体在铰链区被还原成单体，然后被再氧化形成抗体的异二聚体。该方法也可用于制备抗体同二聚体。Hollinger等，Proc.Natl.Acad.Sc1.USA, 90:6444-6448 (1993)所述的“二价抗体”技术提供了另一种制备双特异性抗体片段的方法。所述片段中含有VH，其通过接头与\相连，该接头非常短，使得同一链的两个结构域之间无法配对。因此，同一片段上的Vh和\结构域被迫与另一片段上的互补\和Vh结构域配对，从而形成两个抗原结合位点。此外还报道了另一种用单链Fv(sFv) 二聚体来制备双特异性抗体的策略。见 Gruber 等，J.1mmunol., 152:5368(1994)。
[0190]本发明还涉及二价以上的抗体。例如可制备三特异抗体。Tutt等J.1mmunol.147:60 (1991)。
[0191]多价抗体
[0192]多价抗体比二价抗体更容易被表达与该抗体结合的抗原的细胞内化(和/或异化)。本发明的抗体可以是具有三个或更多个抗原结合位点的多价抗体(例如四价抗体)(它们不是IgM类)，通过使编码所述抗体多肽链的核酸重组表达可轻易制备该抗体。多价抗体可以包含二聚体化结构域和三个或更多个抗原结合位点。优选的二聚体化结构域包括Fe区或铰链区，或由其组成。在本文中，抗体包含一个Fe区和三个或更多个位于Fe区氨基端的抗原结合位点。优选的多价抗体在此包括三到约八个抗原结合位点，或由它们组成，但优选四个抗原结合位点。多价抗体包括至少一条多肽链(并优选两条多肽链)，其中所述多肽链包含两个或多个可变区。例如，多肽链可包含VDl-(Xl)n-VD2-(X2)n-Fc，其中VDl是第一可变区，VD2是第二可变区，Fe是Fe区的一条多肽链，Xl和X2代表氨基酸或多肽，η是O或I。例如，多肽链可包括Vh-CH1-柔韧接头(flexible linker)-Vh-CH1-Fc区链；或Vh-CH1-Vh-CH1-Fc区链。本文的多价抗体优选进一步包含至少两个(优选四个)轻链可变区多肽。例如本文的多价抗体可包含从约两个到约八个轻链可变区多肽。本文的轻链可变区多肽包含轻链可变区以及可选地进一步包含CL结构域。[0193]其它氨基酸修饰
[0194]本发明还涉及对本文所述CD20结合抗体的氨基酸序列修饰。例如，可能希望改进抗体的结合亲和力和/或其它生物学特性。抗CD20抗体的氨基酸序列变体可通过在抗CD20抗体核酸中导入适当的核苷酸改变，或通过肽合成法来制备。所述修饰包括，如该抗CD20抗体的氨基酸序列中的残基缺失，和/或插入和/或取代。可对缺失、插入、和取代进行任意组合以获得最终构建体，只要该最终构建体具有所需特性。氨基酸的变化还可改变抗CD20抗体的翻译后加工,如改变糖基化位点的数目或位置。
[0195]一种鉴别抗⑶20抗体中处于诱变优选位置的特定残基或区域的有效方法是Cunningham和Wells，科学244:1081-1085(1989)所述的“丙氨酸扫描诱变”。这里，鉴定一个残基或一组靶残基(例如，带电的残基如精氨酸、天冬氨酸、组氨酸、赖氨酸和谷氨酸)并用中性或带负电的氨基酸(最优选丙氨酸或多聚丙氨酸)取代，以便影响氨基酸与CD20抗原的相互作用。那些证实对取代具有功能敏感性的氨基酸位置通过在取代点引入进一步的或其它的变体而改进。故，尽管引入氨基酸序列变异的位点是预先决定的，但突变本身不必是预定的。例如，为分析在指定位点处突变的作用，在所述靶密码子或区域实行丙氨酸扫描或随机诱变，并筛选所表达的具有预期活性的抗CD20抗体变体。[0196]氨基酸序列插入包括氨基-和/或羧基-端的融合(其长度从一个残基至包括100个或更多残基的多肽)，以及序列内单个或多个氨基酸残基的插入。末端插入的例子包括带有N-末端甲硫氨酰残基的抗CD20抗体或与细胞毒性多肽融合的抗体。抗CD20抗体分子的其它插入变体包括使该抗CD20抗体的N或C末端与酶(例如ADEPT)或增加该抗体血清半寿期的多肽融合形成的融合体。
[0197]另一类变体是氨基酸取代变体。这些变体使抗CD20抗体分子中至少一个氨基酸残基被不同残基取代。最有兴趣进行取代诱变的位点包括高变区，也可以改变FR。保守取代见表1的“优先取代”栏。如果这些取代引起生物学活性的改变，则可引入表1中“取代举例”栏的更实质性改变，或进一步在下文的氨基酸分类中所述的更实质性改变，并筛选产物。
[0198]氨基酸取代表
[0199]
【权利要求】
1.一种与人CD20结合的人源化抗体或者其抗原结合片段，其中抗体对体内削减灵长类动物B细胞是有效的，该抗体在重链可变区(Vh)至少包含来自抗人CD20抗体的SEQ IDN0.12的⑶R3序列、和人重链亚群III (VhIII)的基本上的人共有框架(FR)残基。
2.一种分离的核酸，其编码前述权利要求中任一项的抗体。
3.—种表达载体,其编码前述权利要求中任一项的抗体。
4.一种宿主细胞,其包含权利要求2的核酸。
5.生产权利要求1的抗体的方法,包含培养生产权利要求4的抗体的细胞，并从细胞培养物中回收抗体。
6.—种组合物，包含权利要求1的抗体和载体。
7.一种制品，包含一种容器和包含在其中的组合物，其中该组合物包含权利要求1的抗体。
8.—种体内在B细胞中诱导程序性细胞死亡的方法，包含将B细胞与权利要求1中的抗体接触，从而杀死B细胞。
9.一种治疗CD20阳性癌症的方法，包含给予患该癌症的病人治疗有效量的权利要求1中的人源化CD20 结合抗体。
10.一种治疗自身免疫病的方法，包含给予患该自身免疫病的病人治疗有效量的前述权利要求中任何一项的人源化CD20结合抗体。
【文档编号】A61KGK103833854SQ201410056459
【公开日】2014年6月4日 申请日期:2003年12月16日 优先权日:2002年12月16日
【发明者】卡梅利亚.W.亚当斯, 安德鲁.C.陈, 克雷格.W.克劳利, 亨利.B.洛曼, 杰拉尔德.R.纳卡马拉, 伦纳德.G.普雷斯塔 申请人:健泰科生物技术公司