一种急性粒细胞白血病治疗靶标及其用途
【专利摘要】本发明涉及一种急性粒细胞白血病治疗靶标及其用途。本发明公开了Shp2蛋白作为急性粒细胞白血病治疗靶标在制备治疗急性粒细胞白血病的药物中的应用。本发明首次发现并证实shp2的抑制能有效遏制急性粒系白血病的发生发展，能够作为重要的临床治疗靶点，可以带来巨大的社会经济利益。
【专利说明】一种急性粒细胞白血病治疗靶标及其用途
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种急性粒细胞白血病治疗靶标及其用途。
【背景技术】
[0002]在我国恶性肿瘤致死率中，白血病在儿童及35岁以下成人中居首位，在男性和女性中分别为第8位。急性粒细胞白血病是最多见的白血病类型，而且发病几率随年龄增高呈上升趋势。随着我国老龄化程度的加剧，急性粒细胞白血病将成为危害中老年的重大恶性疾病。目前国内外急性粒细胞白血病的治疗仍然主要运用化疗或者骨髓移植术。
[0003]在60岁以下的急性粒细胞白血病病人中，蒽环类抗生素(与阿糖胞苷联合诱导治疗能使70%左右的病人进入宽缓期，但即使运用高剂量阿糖胞苷或者骨髓移植术，50%的宽缓期病人白血病仍会复发。在60岁以上的老年患者中，同样的联合疗法也只能使50%的病人进入宽缓期，而其中大部分的患者(85%)在化疗后2至3年内将会复发。而且随着年龄增长，很多老年人无法忍受化疗药物所带来的副作用，不能进行高剂量的化疗，这些老年患者的生存期只有四个月左右。也就是说，在目前的治疗方案下，60岁以下的患者5年无疾病存活率为35%，60以上老年患者则低为7.25%左右。过去的二十年内，鲜有治疗急性粒细胞白血病的新药问世，通过优化化疗药物剂量的临床试验也都没有取得很好的结果。
[0004]目前癌症治疗仍以外科切除、放疗和化疗为主。放、化疗通过抑制细胞分裂增殖来达到杀死肿瘤细胞的目的，没有特定靶点，因此毒副作用很大。分子靶向药物作为新一代的肿瘤药物，能够特异性阻断肿瘤细胞中异常激活的信号通路或肿瘤血管生成，与传统放化疗相比更高效、副作用更小。因此有效靶点的发现是癌症研究和治疗的重大需求。肿瘤的发生发展往往与肿瘤特异表达的基因有关，这些肿瘤细胞高表达的蛋白，如果是有功能的，可能可以成为治疗靶标；也可以采用该受体的激动剂或拮抗剂，促进或抑制受体活性和功能，从而影响肿瘤的生长、增殖和迁移。蛋白的磷酸化和去磷酸化是由磷酸激酶和磷酸酶精确调控的可逆过程，在骨髓细胞增殖，分化，凋亡，迁移等一系列生物功能中起着不可或缺的重要作用。聚焦肿瘤组织特异突变或高表达的磷酸激酶和磷酸酶并以之为治疗靶点是一种被人们认为有希望并且有效的寻找治疗肿瘤新药物的手段。例如，第一个上市的靶向药物伊马替尼(imatinib，商品名为格列卫)特异性针对BCR/ABL靶点，革命性的改变了慢性髓系白血病的治疗手段。2013年5月美国食品药品局又批准了针对MEK的靶向药物trametinib用于黑色素的治疗。
[0005]Shp2蛋白是由PTPNll基因编码的非受体蛋白酪氨酸磷酸酶。近期的研究表明，生殖细胞中PTPNll基因的突变见于50%的奴南式综合征(Noonan Syndrome)病人中。血液异常的病征如肝脾肿大，幼年型粒单核细胞白血病(juvenile myelomonocytic leukemia,JMML)在奴南式综合 征中常见。体细胞PTPNll基因的突变率在非奴南式综合征的幼年型粒单核细胞白血病中高达35%，在儿童急性粒细胞白血病中为4%，骨髓增生异常综合征(myelodysplastic syndrome,MDS)中为10%,在急性淋巴细胞白血病中占7%。除此之外，PTPNll基因突变也与多种染色体异常(比如llq23，多系白血病基因MLL)相关。Shp2蛋白结构上由氨基端的两个SH2结构域，蛋白酪氨酸磷酸酶(PTP)结构域和羧基端的脯氨酸富集的超二级结构组成。在无细胞外刺激的情况下，氨基端SH2结构域与PTP结构域形成分子内相互作用，使Shp2蛋白构象处于静息状态从而抑制磷酸酶的活性。在外界刺激，譬如生长激素，生长因子等的刺激下，细胞表面的受体磷酸激酶活化，其胞内结构域自我磷酸化后，Shp2的氨基端SH2结构域与受体磷酸激酶结合改变了蛋白构象，PTP结构域暴露出来，Shp2的磷酸酶活性即被瞬间激活。Shp2氨基端SH2结构域上的突变，遏制了蛋白本身的活性调控，而使Shp2—直处于激活状态。实验证明，虽然成年人白血病患者中PTPNll基因突变的比例较低，但PTPNll基因的表达量以及Shp2蛋白的活性显著性的高于正常血液细胞。Shp2在粒细胞前体细胞以及幼稚细胞中活性最高，其酶活随着细胞分化而降低。更为重要的是，在急性粒细胞白血病细胞中，Shp2活性与细胞增殖速度呈正相关性。
【发明内容】
[0006]本发明的目的是提供一种急性粒细胞白血病治疗靶标及其用途。
[0007]为了达到上述目的，本发明提供了 Shp2蛋白作为急性粒细胞白血病治疗靶标在制备治疗急性粒细胞白血病的药物中的应用。
[0008]本发明还提供了一种用于治疗急性粒细胞白血病的药物，其特征在于，含有能够抑制Shp2蛋白表达的组分。
[0009]本发明通过一系列的体外和体内实验证实拮抗shp2能够有效抑制急性粒系白血病细胞的增值，遏制小鼠体内急性粒系白血病的发生和恶化。基于实验结果，本发明提出，蛋白磷酸酶Shp2可作 为治疗急性粒细胞白血病的一个新靶点。
[0010]PTEN是一个已知的抑癌基因，在造血系统中敲除该基因能诱发小鼠在5天内患良性粒细胞增殖疾病，并在4到6周内恶化成急性粒细胞白血病。本发明利用了 PTEN基因敲除小鼠和PTEN基因干扰技术建立了急性粒细胞白血病的体内与体外模型。本发明的实验显示:用siRNA干扰Shp2的表达能有效抑制急性粒细胞白血病细胞系K562的体外增殖，抑癌基因PTEN的表达阻断后K562细胞增殖显著加快，而干扰Shp2基因表达能使细胞增殖恢复到对照组水平；小鼠体内敲除Shp2能使PTEN缺失小鼠的外周血白细胞，粒细胞和单核细胞均恢复到正常对照组范围，外周血中用Grl抗体特异标记的粒细胞也在双基因敲除小鼠中较PTEN敲除小鼠明显下降；Shp2敲除有效降低了 PTEN缺失骨髓中Grl+Macl+粒细胞前体细胞数量；通过多抗体标记的流式细胞技术进一步表明敲除Shp2的抑癌作用来源于降低PTEN缺失粒系/单核系祖细胞(gran微升ocyte/monocyte progenitors, GMPs)的增殖。肿瘤细胞对脾脏和肝脏的浸润在急性粒细胞白血病患者中颇为常见，这一现象也见于PTEN基因敲除小鼠中，Shp2敲除能部分重建正常的脾脏白髓和红髓结构，并且抑制粒系肿瘤细胞对肝脏的浸润。
[0011]与现有技术相比，本发明的有益效果是:
[0012]本发明首次发现并证实shp2的抑制能有效遏制急性粒系白血病的发生发展，能够作为重要的临床治疗靶点，可以带来巨大的社会经济利益。
【专利附图】
【附图说明】
[0013]图1为抑制肿瘤细胞增殖实验结果图；[0014]图2为小鼠外周血的采集和全血分析结果图；
[0015]图3为外周血的流式细胞染色和检测结果图；
[0016]图4为骨髓中粒细胞前体细胞的流式细胞染色和检测结果图；
[0017]图5为骨髓中的粒系/单核系祖细胞的流式细胞染色和检测结果图；
[0018]图6为苏木精-伊红染色图；
[0019]图7为氯乙酸酯酶染色图；
[0020]图中，***表示p〈0.001, **表示p〈0.01, *表示p〈0.05,实验结果表示为平均值土 S.E.M。
【具体实施方式】
[0021 ] 下面结合实施例来具体说明本发明。
[0022]实施例1:抑制肿瘤细胞增殖实验
[0023]实验材料:K562细胞系(从美国ATCC牛物牛物标准品咨源中心购买)，血球计数板,lonza nucleofecto电转染试剂盒(从Lonza公司购买),siShp2寡聚核苷酸(从Qiagen公司购买)、siPTEN寡聚核苷酸(从Qiagen公司购买)及对照寡聚核苷酸(从Qiagen公司购买)。
[0024]实验步骤:
[0025]I)将siShp2寡聚核苷酸和siPTEN寡聚核苷酸分别溶于无RNA酶的去离子水，至终浓度为20nM。
[0026]2)按lonza nucleofecto电转染试剂盒的使用说明，将siShp2寡聚核苷酸、siPTEN寡聚核苷酸电转至培养的K562细胞系细胞，每个反应孔的细胞数量为IO6个，加入20nM寡聚核苷酸18ul。
[0027]3)电转后，细胞放置细胞培养箱中继续培养，每24小时计数一次，统计数据，绘制细胞生长曲线，检测细胞的增殖情况。
[0028]实验结果如图1所示，干扰Shp2的表达能有效抑制急性粒系白血病细胞系K562的体外增殖。干扰PTEN基因表达能提高K562的细胞增殖，而同时干扰PTEN和Shp2的表达能使K562增殖速度恢复到对照组水平。
[0029]实施例2:小鼠外周血的采集和全血分析
[0030]实验材料:野生型BL6/C57小鼠、pten敲除型小鼠、shp2敲除型小鼠、shp2和pten双基因敲除小鼠，每种小鼠各5只。其中，野生型BL6/C57小鼠和pten敲除型小鼠购买自美国jackson lab公司，shp2敲除型小鼠为自行构建,详细构建方法记载在文献Proc NatlAcad Sci U S A.2004November9 ； 101 (45):16064-16069 中。shp2 和 pten 双基因敲除小鼠是由pten敲除型小鼠和shp2敲除型小鼠杂交获得。
[0031]实验方法:
[0032]1)从小鼠眼窝处采血200微升，收集至含EDTA抗凝剂的采血管中。
[0033]2) 4小时内用Hemavet动物外周血分析仪分析外周血全血指标。
[0034]3)数据统计。
[0035]实验结果如图2所示，小鼠体内敲除Shp2能使PTEN基因缺失小鼠自发急性粒系白血病动物模型中的外周血白细胞(WBC)，粒细胞(GRA)、淋巴细胞(LYM)和单核细胞(MON)均恢复到正常对照组范围。
[0036]实施例3:外周血的流式细胞染色和检测
[0037]实验材料:野生型BL6/C57小鼠、shp2敲除型小鼠、pten敲除型小鼠、shp2和pten双基因敲除小鼠，，每种小鼠各5只，各小鼠的来源与实施例2相同。流式细胞染色的抗体:FITC 偶联的 Grl (RB6-8C5)抗体(购自 eBioscience)。红细胞裂解液(1.5M NH4Cl, IOOmMNaHCO3, IOmM EDTA 二钠，ρΗ7.4)。染色液(含2%小牛血清的PBS溶液)。
[0038]实验方法:
[0039]I)从小鼠眼窝处采血200微升，收集至含EDTA抗凝剂的采血管中。
[0040]2) 5倍体积的红细胞裂解液悬浮外周血，室温放置10分钟裂解红细胞，添加5倍体积的生理盐水，以3000转/分的速度离心10分钟后弃上清。
[0041]3)用染色液悬浮细胞至浓度107/ml，加入抗体至终浓度为2ug/ml，在4°C冰箱中避光孵育30分钟。
[0042]4)洗涤细胞两次。用500微升PBS缓冲液(pH=7.4)重悬细胞后上机检测。
[0043]实验结果如图3所示，表明小鼠体内敲除Shp2能使PTEN缺失小鼠自发急性粒系白血病动物模型中的外周血中用Grl抗体特异标记的恶性增殖的粒细胞数量明显下降。
[0044]实施例4:骨髓中粒细胞前体细胞的流式细胞染色和检测
[0045]实验材料:野生型BL6/C57小鼠、shp2敲除型小鼠、pten敲除型小鼠、shp2和Pten双基因敲除小鼠，每种小鼠各5只，各小鼠的来源与实施例2相同。流式细胞染色的抗体有=FITC偶联的Grl (RB6-8C5)抗体，PE偶联的Macl (M1/70)抗体(以上抗体都是从eBioscience 订购的)。红细胞裂解液(1.5M NH4Cl, IOOmM NaHCO3, IOmM EDTA二钠，ρΗ7.4)。染色液(含2%小牛血清的PBS溶液)。8微米细胞筛(从BD公司购买)
[0046]实验方法:
[0047]I)断头处死小鼠，取出大腿胫骨和腓骨，碾钵碾碎，生理盐水冲洗出骨髓细胞，反复吹打后，用8微米细胞筛过滤，制作单细胞悬液，离心弃上清。
[0048]2)红细胞裂解液悬浮骨髓细胞，室温放置10分钟裂解红细胞，添加5倍体积的生理盐水，离心弃上清。
[0049]3)用染色液悬浮细胞至浓度107/ml，加入两种抗体至每种抗体的终浓度为2ug/ml，于4°C冰箱中避光孵育30分钟。
[0050]4)洗涤细胞两次。用500微升PBS缓冲液(pH=7.4)重悬细胞后上机检测。
[0051]实验结果如图4所示，表明小鼠体内敲除Shp2能使PTEN缺失小鼠自发急性粒系白血病动物模型中的骨髓中恶性增值的Grl+Macl+粒细胞前体细胞数量显著降低。
[0052]实施例5:骨髓中的粒系/单核系祖细胞的流式细胞染色和检测
[0053]实验材料:野生型BL6/C57小鼠、shp2敲除型小鼠、pten敲除型小鼠、shp2和pten双基因敲除小鼠，每种小鼠各5只，各小鼠的来源与实施例2相同。流式细胞染色的抗体有:lineage抗体包括生物素标记的抗鼠CD3(145_2C11)、CD45R/B220 (RA3-6B2)、CDllb (Ml/70)、TER-119、Ly-6G (RB6-8C5)、CD4 (L3T4)、CD8 (CD8b, Ly_3)，链霉亲合素偶联的 APC-efluo780 (eBioscience);其他抗体包括抗鼠 FcgR-PE (93)，c-Kit-PE_CY5 (2B8)，Scal-FITC，CD34-APC (以上抗体都是从eBioscience订购的)。红细胞裂解液(1.5M NH4Cl,IOOmM NaHCO3, IOmM EDTA 二钠，ρΗ7.4)。染色液(含 2% 小牛血清的 PBS 溶液)。[0054]实验方法:
[0055]I)断头处死小鼠，取出大腿胫骨和腓骨，碾钵碾碎，生理盐水冲洗出骨髓细胞，反复吹打后，用8微米细胞筛过滤，制作单细胞悬液，离心弃上清。
[0056]2)红细胞裂解液悬浮骨髓细胞，室温放置10分钟裂解红细胞，添加5倍体积的生理盐水，离心弃上清。
[0057]3)用染色液悬浮细胞至浓度107/ml,力卩入lineage、FcgR-PE(93),c-Kit-PE-CY5(2B8), Scal-FITC，CD34-APC)抗体至每种抗体的终浓度为 2ug/ml，在 4°C冰箱中避光孵育30分钟。
[0058]4)洗涤细胞两次。用500微升PBS缓冲液(pH=7.4)重悬细胞后上机检测。
[0059]5)每管/孔加入100微升稀释好的链霉亲合素偶联的APC-efluo780(用染色液(含2%小牛血清的PBS(pH=7.4)溶液稀释成2微克/微升)后，在4°C冰箱中避光孵育30分钟。洗涤细胞两次。之后用500微升PBS缓冲液(pH=7.4)重悬细胞，并上机检测。
[0060]实验结果如图5所示，表明小鼠体内敲除Shp2能使PTEN缺失小鼠自发急性粒系白血病动物模型骨髓中显著升高的粒系/单核系祖细胞(Lin—Sca-rKit+FcgRhira34+骨髓细胞亚群)恢复到正常对照组水平。
[0061]实施例6 苏木精-伊红染色(hematoxylin-eosin staining)
[0062]实验材料:野 生型BL6/C57小鼠、pten敲除型小鼠、shp2敲除型小鼠、shp2和pten双基因敲除小鼠，每种小鼠各5只，各小鼠的来源与实施例2相同。
[0063]实验方法:
[0064](I)断头处死小鼠，剖开腹腔，取出脾脏，生理盐水冲洗，并将其修切成小块组织；
[0065](2)将组织用4% PFA固定液固定12小时，用PBS缓冲液洗三次，每次10分钟；
[0066](3)用石蜡包埋组织；
[0067](4)将包埋后的组织上切片机切片，用蒸馏水将切片贴于干净无油的玻片上，在酒精灯上略烤，使切片展平，将贴好的切片于室温老化3天。
[0068](5)将切片在二甲苯中脱蜡5分钟，移入二甲苯和纯酒精(I: I)混合液中5分钟，依次移入100%、95%、85%和70%酒精，各级酒精分别为5分钟。最后经蒸馏水转入染液。
[0069](5)用苏木精染液染色10分钟。水洗玻片上的多余染液，1%盐酸酒精分化液(70%酒精配制)分色片刻。镜检控制，直至细胞核及核内染色质清晰为止，约数10秒钟。流水冲洗15分钟(或者在碳酸锂饱和液中短时间碱化或蓝化，即细胞核呈蓝色)。蒸馏水短洗。
[0070](6) 0.5%伊红染液染色5分钟，若着色困难，可在每100毫升染液中加入2滴冰醋酸，使易着色且不易脱色。
[0071](7)依次经70%、85%、95%、100%酒精脱水，各级酒精脱水2分钟。
[0072](8)用二甲苯透明(二次)，共约10分钟。
[0073](9)封片:擦去切片周围多余的二甲苯，切勿干涸，迅速滴加适量中性树胶，再加盖玻片封固。
[0074](10)镜下观察拍照。
[0075]实验结果如图6所示，表明PTEN基因敲除小鼠肿瘤细胞对脾脏浸润并破坏正常的脾脏结构。小鼠体内敲除Shp2能使PTEN缺失小鼠自发急性粒系白血病动物模型中的脾脏组织学结构部分恢复了正常的白髓和红髓结构。
[0076]实施例7:氯乙酸酯酶染色(chloroacetate esterase)图
[0077]实验材料:野生型BL6/C57小鼠、shp2敲除型小鼠、pten敲除型小鼠、shp2和pten双基因敲除小鼠，每种小鼠各5只。氯乙酸酯酶染色试剂盒(Sigma公司，Naphthol AS-DChloroacetate (Specific Esterase) Kit,货号 91C)。
[0078]实验方法:
[0079]I)断头处死小鼠，剖开腹腔，取出肝脏，生理盐水冲洗，将其修切成小块；
[0080]2)将组织用4% PFA固定液固定12小时，用PBS缓冲液洗三次，每次10分钟；
[0081]3)按照实施例6中步骤(3)-(5)的方法用石蜡包埋、切片、脱蜡；
[0082]4)依据氯乙酸酯酶染色试剂盒的实验步骤进行氯乙酸酯酶染色。
[0083]5)按照实施例6中步骤(7)-(9)中的方法脱水、透明、封片。
[0084]6)镜下观察拍照。
[0085]实验结果如图7所示，表明PTEN基因敲除小鼠肿瘤细胞对肝脏的浸润，小鼠体内敲除Shp2抑制了 PTEN缺失小鼠自发急性粒系白血病动物模型中的粒系肿瘤细胞对肝脏的浸润。
【权利要求】
1.Shp2蛋白作为急性粒细胞白血病治疗靶标在制备治疗急性粒细胞白血病的药物中的应用。
2.一种用于治疗急性粒细胞白血病的药物，其特征在于，含有能够抑制Shp2蛋白表达的组分。
【文档编号】A61K45/00GK103893762SQ201410078403
【公开日】2014年7月2日 申请日期:2014年3月5日 优先权日:2014年3月5日
【发明者】朱鹤 申请人:上海交通大学医学院附属仁济医院