利用g蛋白偶联受体和相关组合物的筛选方法

利用g蛋白偶联受体和相关组合物的筛选方法
【专利摘要】本发明涉及利用G蛋白偶联受体和相关组合物的筛选方法，其提供了用于GPCR的筛选方法，其基于以下发现：当未结合于G蛋白时，受体激动剂对于GPCR(如甲状旁腺激素受体)的亲和力与其间激动剂有效的时间长度有关，而与它的药物动力学特性无关。本发明还提供了PTH和PTHrP来源的多肽。
【专利说明】利用G蛋白偶联受体和相关组合物的筛选方法
[0001]本申请是申请日为2008年8月I日的题为“利用G蛋白偶联受体和相关组合物的筛选方法”的中国专利申请N0.200880101180.5的分案申请
[0002]关于联邦政府资助研究的陈述
[0003]本发明是在美国政府支持下在由国家卫生研究所授予的资助号DK11794下作出的。政府对本发明具有一定权利。

【背景技术】
[0004]通常，本发明涉及一种具有长或短寿命活性(prolonged or short-livedactivity)的G蛋白偶联受体(GPCR)的激动剂(agonists)的筛选方法。更具体地说，本发明涉及甲状旁腺(PTH)激素或PTH相关蛋白(PTHrP)配体类似物，与PTH(1_34)相比，其对于PTH受体(PTHR)具有更长或更短寿命的活性。本发明还涉及利用本发明的方法鉴定的PTHR配体以及这样的配体在治疗疾病中的应用。
[0005]GPCR是较大组的膜受体，其响应于通过激动剂进行的激活作用来激活G蛋白，其本身接着引起至少一种信号级联的激活，如环AMP/蛋白激酶A级联。该较大组的受体存在于从细菌到人类的生物中，并且涉及，例如，激素、神经元、以及嗅觉信号转导。
[0006]甲状旁腺激素受体(PTHR)是PTH和PTH相关蛋白(PTHrP)的内源性受体，然而每种配体具有不同的生物学功能。PTH调节钙和磷酸盐稳态(体内稳态)并作为腺分泌的内分泌激素作用于骨和肾脏中的靶细胞。PTH还主要通过它对位于肾近端小管(PT)细胞中的钠依赖性磷酸盐转运蛋白(NaP1-1Ia和NaP1-1Ic)的作用来减少无机磷酸盐(Pi)的重吸收。PTHrP调节在发育组织中的细胞增殖和分化程序，以及被分泌并以旁分泌方式在组织原基中起作用(Kronenberg, H.M.Ann.N.Y.Acad.Sc1.1068:1-13 (2006))。
[0007]PTH和PTHrP在它们的氨基末端(残基1-14)信号区(signaling domains)是最同源的(8个氨基酸同一性)，并且在它们的14-34个结合域呈现中等同源性(3个同一性)。通常推测，PTH和PTHrP的完全活性(残基1_34)部分经由基本相同的机制与PTHR相互作用(Caulfield et al., Endocrinologyl27:83-87 (1990) ；Abou-Samra et al., Endocrinologyl25:2215_2217(1989))。认为该机制包括两个主要成分(components):配体的羧基末端结合域与受体的氨基末端胞外(N)域之间的相互作用，以及配体的氨基末端信号区(signaling domains)与受体的近膜(J)区之间的相互作用，其包含胞内环和7个跨膜螺旋(Hoare et al., J.B1l.Chem276:7741-7753 (2001) ；Castro et al., Proc.Natl.Acad.Sc1.USA102:16084-16089 (2005) ；ffitelsberger et al., B1chemistry45:2027-2034 (2006)；Shimizu et al., J.B1l.Chem.280:1797-1807(2005) ；Gensure et al., B1chem.B1phys.Res.Commun.328:666-678(2005))。然而,两种配体所使用的结合的确切机制不同的程度(如果有的话)仍有待确定。
[0008]在人类中，PTH(1-34)具有有力的骨合成代谢效应，并且诱导骨矿质密度(bone mineral density)和骨强度的显著增加。确实，现在重组人PTH(1_34)被认为是用于骨质疏松症的最有效的治疗方法之一(Tashjian and Gagel, J.Bone Miner.Res21:354-365 (2006))。重要的是,必须以脉冲(搏动)方式(例如，每日一次皮下注射)来给予hPTH(l_34),以便实现它的成骨效应(骨形成效应,bone-forming effects)。在更长期给予的情况下，与持续输液泵机制一样，PTH(1-34)会对骨施加净分解代谢效应，这是由于相对于由成骨细胞介导的成骨反应，由破骨细胞介导的骨吸收(骨再吸收)反应具有更大的激活作用。因此在骨中PTH受体暴露于PTH配体的持续时间是由所述配体实现的总的骨形成反应的关键决定因素，因而是其治疗骨质疏松症的效力的关键决定因素。
[0009]临床研究已表明，PTHrP(1-36)在人类中还可以增加骨矿质密度，并且可以达到与ΡΤΗ(1-34)大约相同的程度，虽然需要更高的剂量(Horwitz et al., J.Endocrinol.Metab.88:569-575(2003))。重要的是，甚至在这样的更高剂量下，PTHrP (1_36)也并不刺激有害的骨吸收和高血钙反应，而相同剂量的ΡΤΗ(1-34)则预期会发生这种情况(Horwitzet al., J.Endocrinol.Metab.88:569-575 (2003) ；Horwitz et al.,J.Bone Miner.Res.20:1792-1803(2005) ；Horwitz et al., Osteoporosis Int.17:225-230 (2006))。两种肽的生物活性的差异并不仅是由于药物代谢动力学(pharamacokinetics)的差异。利用稳态输注法进行的两种肽的直接比较表明，就刺激1，25-(0H)2维生素D3的肾合成而言，与 PTH(1_34)相比，PTHrP(1-36)是显著更少有效的(Horwitz et al., J.Bone.Mineral.Research.20:1792-1803(2005))。
[0010]除骨质疏松症以外，hPTH(l-34)还显示出可以有效治疗PTH缺乏的病症，即甲状旁腺功能减退。因而，PTH(1-34)显示为是骨化三醇治疗的安全和有效的备选方案并且能够保持正常的血清钙水平而没有在甲状旁腺功能减退患者中的高钙尿症(Winer etal., J.Clin.Endocrinol.Metab.88:4214-4220 (2003))。该妝必须被每日注射至少两次，并且作者认识到该疾病需要长效ΡΤΗ(1-34)类似物(Winer et al., J.Clin.Endocrinol.Metab.88:4214-4220(2003))。
[0011]因此，本【技术领域】需要这样的PTH或PTHrP类似物，与ΡΤΗ(1-34)相比，其对PTH受体具有更长或更短效的作用。还需要这样的测定(分析)，其使得可以区分长效与短效的PTH 肽。


【发明内容】

[0012]按照经典的GPCR理论，可以区分两种形式的G蛋白偶联受体:形式(RG)，其结合于G蛋白，以及形式(R)，其未结合于G蛋白。GPCR信号需要受体直接激活G蛋白，即，必须形成RG状态，并且通过激动剂配体(agonist ligand)的结合可以诱导这种RG形成。激动剂配体的结合可以诱导或稳定RG状态，并且相互地，RG状态可以稳定激动剂的高亲和结合。在结合GTP或非水解的GTP类似物(如GTP Y S)以后，受体偶联G蛋白将从该受体解离，弓丨起该受体回复到低亲和状态。现在认识到，一些GPCR如PTHR可以形成新的状态(R°)，其甚至在有GTP Y S存在的情况下，由此甚至当G蛋白很可能未结合受体时也可以以高亲合力结合某些激动剂配体。通常，在细胞中GPCR处于RG、R、或R°状态的比例可以根据细胞类型和条件而变化。由于这些原因，先前关于评估配体与GPCR的结合的工作通常并不明确区分RG、R、或Rtl状态。本发明的发明人研究了 PTH受体，一种示例性的GPCR，已发现，与以较低亲和力结合于R°的配体相比，以高亲和力结合于R°状态(除RG状态以外)的配体具有更长的活性半衰期，并且这种长期活性并不依赖于配体体内的生物利用度或药代动力学。因此，短期作用的激动剂对于受体的R°形式具有更低的亲和力。基于该发现，本发明提供了用于鉴定长效或短效GPCR激动剂的方法，以及利用本发明的方法鉴定的肽激动剂。
[0013]在第一方面，本发明提供了一种用于确定候选化合物是否是G蛋白偶联受体(GPCR)的长效激动剂的方法。该方法包括(a)使GPCR与该化合物接触，其中GPCR具有RG形式，(b)测量该化合物对于GPCR的RG形式的亲和力，(c)使GPCR与该化合物接触，其中GPCR具有R°形式，以及(d)测量该化合物对于GPCR的R°形式的亲和力，其中以下化合物被鉴定为GPCR的长效激动剂，所述化合物(i)具有的对于GPCR的RG形式的亲和力是对GPCR的内源性激动剂的亲和力的至少1% (例如，5%、10%、25%、30%、50%、60%、75%、90%、100%,125%,150%,200%,150%,300%,400%,500%,750%,^； 1000% )，以及(ii)与内源性激动剂相比，对于GPCR的R°形式具有更大的亲和力(例如，I %、5 %、10 %、25 %、50 %、100%、200%、500%、1000%、2000%、5000%、或 10，000% )。该方法可以进一步包括以下步骤(e)将候选化合物给予动物，以及(f)测量动物对所述化合物的至少一种生理反应。受体可以是人类受体。GPCR可以是促胰液素家族受体(例如，PTH/PTHrP受体如人PTH/PTHrP受体)。当受体涉及钙稳态或转运时，测量步骤(b)或(f)可以通过测量细胞内或血钙水平来进行。对于任何GPCR，可以利用竞争性结合测定(结合分析)来进行亲和测量步骤(b)或步骤(d)。竞争性结合测定可以使用这样的配体，其对于GPCR的RG形式是特异性的或对于GPCR的R°形式是特异性的。可以利用延迟cAMP测定来进行测量步骤(b)(例如，如本文描述的)。可以利用非水解核苷酸类似物(例如，GTP YS)来富集GPCR的Rtl形式。可以利用显性负G蛋白来富集GPCR的RG形式。受体可以在细胞上或在膜中。候选化合物可以包括肽或可以来自化学库或天然产物库。
[0014]在另一个方面，本发明还涉及一种用于确定候选化合物是否是G蛋白偶联受体(GPCR)的短效激动剂的方法。该方法包括(a)使GPCR与该化合物接触，其中GPCR具有RG形式，(b)测量该化合物对GPCR的RG形式的亲和力，(c)使GPCR与该化合物接触，其中GPCR具有R°形式；以及(d)测量该化合物对GPCR的R°形式的亲和力，其中以下化合物被鉴定为GPCR的短效激动剂，所述化合物(i)具有的对于GPCR的RG形式的亲和力是对GPCR的内源性激动剂的亲和力的至少 1% (例如，5%、10%、25%、30%、50%、60%、75%、90%、100%、125%、150%、200%、150%、300%、400%、500%、750%、或 1000% )，以及(ii)与内源性激动剂相比，对于GPCR的Rci形式具有更低亲和力(例如，99%、95%、90%、85%、75%、65%、55%,50%,40%,30%,25%,15%,10%,5%,1%>0.5%,0.1%,0.05%,0.01%,0.005%,0.001%,0.0005%、或0.0001% )。该受体可以是人类受体。该方法可以进一步包括以下步骤:(e)将候选化合物给予动物，以及(f)测量动物对该化合物的至少一种生理反应。GPCR可以是促胰液素家族受体(例如，PTH/PTHrP受体如人PTH/PTHrP受体)。当受体涉及钙稳态或转运时，可以通过测量细胞内钙水平来进行测量步骤(b)。对于任何GPCR，可以利用竞争性结合测定(例如，利用对于GPCR的RG形式是特异性的或对于其R°形式是特异性的配体)来进行测量步骤(b)或步骤(d)。可以利用延迟cAMP测定来进行测量步骤(b)。在某些实施方式中，可以利用非水解核苷酸类似物(例如，GTP Y S)来富集GPCR的R°形式。可以利用显性负G蛋白来富集GPCR的RG形式。受体可以在细胞上或在膜中。候选化合物可以包括肽或可以来自化学库或天然产物库。
[0015] 在另一个方面，本发明涉及一种对于PTH Rtl具有低亲和力(例如，以及对于RG具有高亲和力)的多肽。该多肽可以是短效激动剂或者可以是RG选择性性的。相对于野生型PTH或PTHrP序列，该多肽可以具有通过取代、缺失和/或添加一个或多个(例如，2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个)氨基酸加以修饰的氨基酸序列。该多肽可以具有在位置5处的组氨酸或在位置20、23、24、或28处的丙氨酸。该多肽可以是Ala23-PTH(1_34)、Ala23-PTHrP (1-36)、His5-PTH(1-34)、His5-PTHrP (1-36)、或其片段。该多肽可以选自由在图26B的表中那些鉴定为RG选择性的任何多肽组成的组。该多肽可以被配制用于药物给予(例如，如本文中所描述的)或可以被纯化。
[0016]本发明还涉及一种用于在受治疗者中治疗骨质疏松症的方法，该方法包括以足以治疗骨质疏松症的量将前述方面的多肽、RG选择性多肽(例如，那些本文描述的多肽)、本文描述的作为长效激动剂的多肽、或本文描述的任何多肽、或其药用形式给予需要其的受治疗者。本发明还涉及一种用于在受治疗者中治疗骨折修复、骨软化、关节炎、血小板减少、甲状旁腺功能减退或高磷酸盐血症或增加干细胞转移(stem cell mobilizat1n)的方法，该方法包括以足以治疗疾病或病症或增加干细胞转移的量将先前方面的多肽或本文描述的任何多肽、或其药用形式给予受治疗者。多肽或其药用形式可以皮下、静脉内、鼻内、经肺(transpulmonariIy)、经皮、或口服给予。
[0017]在另一个方面，本发明涉及一种多肽(PTH类似物或PTH衍生物)，其结合PTH受体并且对于PTH受体R°形式具有高亲和力。相对于野生型PTH或PTHrP序列，该多肽可以具有通过取代、缺失和/或添加一个或多个氨基酸而修饰的氨基酸序列。该多肽还可以在位置19处具有精氨酸或在位置5处具有异亮氨酸。该多肽可以是Ala1-Aib3MPTHaiShAla1-Aib3DM]PTH(1-34)、或Ile5-PTHrP(1-36)。该多肽可以选自由图26B中的具有小于或等于2.9nM或7.9nM的IC50的任何肽、以及I5_hPTHrP (1-36) (#1208)(基于图26B的数据)组成的组。该多肽可以被配制用于药物给予(例如，如本文描述的)或者可以被纯化。
[0018]本发明还涉及一种通过以足以治疗疾病或病症的量将先前方面的多肽、本文描述的R°选择性多肽、本文描述的作为长效激动剂的多肽、或本文描述的任何多肽、或其药用形式给予需要其的受治疗者而用于在该受治疗者中治疗选自由甲状旁腺功能减退、高磷酸盐血症、瘤样钙质沉着(瘤样钙化症,tumoral calcinosis)、以及骨质疏松症组成的组中的疾病或病症的方法。本发明还涉及一种用于治疗需要骨折修复，或患有骨软化、关节炎、血小板减少，或需要干细胞转移的受治疗者的方法受治疗者，所述方法包括以足以修复骨折、治疗疾病、或转移干细胞的量将先前方面的多肽或本文描述的任何多肽、或其药用形式给予所述受治疗者。该多肽或其药物组合物可以皮下、静脉内、鼻内、经肺、经皮、以及口服给予。
[0019]本发明还涉及一种PTH或PTHrP多肽，相对于野生型PTH或PTHrP序列，其具有通过取代、缺失和/或添加一个或多个氨基酸而修饰的氨基酸序列。该多肽可以具有在位置19处的精氨酸或在位置5处的异亮氨酸。该多肽可以选自由以下组成的组:
[0020]AVAEIQLMHQRGKSIQDLRRRFFLHHLIAEIHTAE1:M-PTH(1-11)/PTHrP(12-36)OH ；
[0021]AVAEIQLMHQRAKffIQDLRRRFFLHHLIAEIHTAE1:M-PTH(1-14)/PTHrP(15-36)OH ；
[0022]AVAEIQLMHQRAKffLNSMRRRFFLHHLIAEIHTAE1:M-PTH(1-18)/PTHrP(19-36)OH ；
[0023]SVSEHQLMHNLGKHIQDLRRRFFLHHLIAEIHTAE1: [Η5] -hPTH (1-14) /PTHrP (15-36) OH ；
[0024]AVAEIQLMHQRAKffLNSMRRVEffLRKKLQDVHNF: [R19]，M-hPTH (1-34) OH ；
[0025] SVSEIQLMHNLGKHIQDLERRFFLHHLIAEIHTAE1: [E19] -hPTH (1-14) /PTHrP (15-36) OH ；
[0026]AVAEI QLMHQRAKff I QDLERRFFLHHL IAEIHTAE1: [E19], Μ-hPTH (1-14) /PTHrP (15-36)OH;以及
[0027]AVAEIQLMHQRAKffLNSMERVEffLRKKLQDVHNF: [E19]，M-hPTH(l_34) OH。该多肽可以具有在位置5处的组氨酸。该多肽可以由以下化学式之一来表示=Ala1, Aib3[M]PTH(1-28)、Ala23PTH、以及Ile5-PTHrP11该多肽可以选自由下述组成的组:
[0028]AVAEHQLMHQRAKffLNSMERVEffLRKKLQDVHNF: [H5，E19]，M-PTH (1-34)；
[0029]AVAEHQLMHQRAKffIQDLERRFFLHHLIAEIHTAE1: [H5，E19]，M-hPTH(l_14) /PTHrP (15-36)；
[0030]SVSEIQLMHNLGKHLNSMERVEFLHHLIAEIHTAE1:hPTH(1-22)/PTHrP(23-36)；
[0031 ] SVSEIQLMHNLGKHLNSMERVEffLRKKLQDIHTAE1:PTH(1-30)/PTHrP(31-36)；
[0032]AVAEIQLMHQRAKffLNSMERVEALRKKLQDVHNF: [A23, E19]，M-PTH (1-34)；以及
[0033]AVAEIQLMHQRAKffLNSMRRVEALRKKLQDVHNF [A23]，M-PTH (1-34)。该多肽可以用于任何治疗方法或任何组合物(例如，本文描述的药物组合物)中。
[0034]在另一个方面，本发明涉及一种这样的多肽，其中所述多肽包括具有以下化学式的氨基酸序列或包括基本上相同于由以下化学式限定的氨基酸序列的氨基酸序列:
[0035]Xl-Val-X2-Glu-His-Gln-Lys-Met-HiS-X3-X4-X5-X6-X7,
[0036]其中:
[0037]Xl 是 Ser、Ala、Gly、或 α -螺旋稳定残基(稳定化残基，stabilizing residue)(例如，Aib)；
[0038]X2是Ser、Ala、或α -螺旋稳定残基(例如，Aib)；
[0039]Χ3 是 Asn、Ala、Glu、Val、Asp、或 Gln ；
[0040]X4 是 Val、Ala、Trp> lie、Met、Lys、Arg、Leu、或 Har ；
[0041]X5 是 Gly、His、Arg、Ala、或 a -螺旋稳定残基(例如，Aib)；
[0042]X6 是 Lys、Gin、Leu、His、Trp、Ala、Arg、或 a -螺旋稳定残基(例如，Aib);以及
[0043]X7 是 Arg、Leu、Phe、Trp、His、或 a -螺旋稳定残基(例如，Aib)；
[0044]或其包含氨基酸1-10、1-11、1_12、或1-13的片段，或其药用盐。a -螺旋稳定残基可以是，例如，非编码氨基酸如(2-氨基异丁酸)、ACPC (1-氨基环丙基羧酸)、DEG (二乙基甘氨酸)、或1-氨基环戊烷羧酸。在一些实施方式中，相对于对应的野生型PTH序列，氨基酸序列具有1、2、3、4、5、6、7、或8个取代。在一些实施方式中，多肽包括在Xl处的Ala、Gly、或α -螺旋稳定残基(例如，Aib);在Χ2处的Ala或α -螺旋稳定残基(例如，Aib)；在 Χ3 处的 Ala、Glu、Val、Asp、或 Gln ;在 X4 处的 Val、Ala、Trp、Ile、Met、Lys、Arg、或 Har ；在X5处的His、Arg、Ala、或α -螺旋稳定残基(例如,Aib);在Χ6处的Gln、Leu、His、Trp、Ala、Arg、或α -螺旋稳定残基(例如，Aib);在Χ7处的Arg、Leu、Phe、Trp、或α -螺旋稳定残基(例如，Aib);或其组合。在任何这些实施方式中，该多肽可以具有长度少于100、50、36、34、30、25、或20(例如，10-14个氨基酸)的氨基酸序列。在一些实施方式中，该多肽的长度为21、20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、或10个氨基酸。该多肽可以是包括药用载体的组合物的一部分。
[0045]在另一个方面，本发明涉及一种这样的多肽，其包括以下化学式的氨基酸序列或包括基本上相同于由以下化学式限定的氨基酸序列的氨基酸序列:
[0046]Xl-Val-X2-Glu-X3-Gln-Leu-Met-His-X4-X5-X6-X7-X8-Leu-Asn-Ser-Met-Glu-X
9-Val-Glu-X10-Xll-Arg-Lys-Lys-X12,
[0047]其中:
[0048]Xl是Ser、Ala、或α -螺旋稳定残基(例如，Aib)；
[0049]Χ2是Ser、Ala、或α -螺旋稳定残基(例如，Aib)；
[0050]Χ3 是 Ile 或 His;
[0051]X4 是 Asn、Glu、Val、Asp、或 Gln ;
[0052]X5 是 Val、Ala、Trp> lie、Met、Lys、Arg、Leu、或 Har ；
[0053]X6 是 Gly、His、Arg、或 Ala ;
[0054]X7 是 Lys> Gin、Leu、His、Trp、Ala 或 Arg ；
[0055]X8 是 Arg、Leu、Phe、Trp> His、或 Ser ；
[0056]X9 是 Arg 或 Ala ；
[0057]XlO 是 Trp、Ala 或 Phe ;
[0058]Xll 是 Leu 或 Ala ;以及
[0059]X12 是 Leu 或 Ala;
[0060]并且其中氨基酸序列包括选自由位置X3处的His、位置X9处的Ala、位置XlO处的Ala、位置Xll处的Ala、以及位置X12处的Ala组成的组中的氨基酸中的至少一种；包括所述氨基酸序列的氨基酸1-24、1-25、1-26、或1_27的片段，或其药用盐。该多肽可以以低亲和力结合于PTH受体的R°形式(例如，以高亲和力结合于PTH受体的RG形式)。该多肽可以是RG选择性的或可以是受体的短效激动剂。相对于对应的野生型序列，该多肽可以包括1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、或更多个取代。在一些实施方式中，该多肽包括在Xl处的Ala或α-螺旋稳定残基(例如，Aib);在乂2处的Ala或α -螺旋稳定残基(例如，Aib);在父3处的 His ;在 Χ4 处的 Glu、Val、Asp、或 Gln ;在 X5 处的 Val、Ala、Trp> lie、Met、Lys、Arg、或 Har ;在 X6 处的 His、Arg、或 Ala ;在 X7 处的 Gin、Leu、His、Trp、Ala、或 Arg ;在 X8 处的Arg、Leu、Phe、Trp、或 Ser ;在 X9 处的 Ala ;在 XlO 处的 Ala 或 Phe ;在 Xll 处的 Ala ;在处X12的Ala ;或其组合。该多肽的长度可以少于100、75、60、50、40、36、34、33、32、31、30、29、或 28 个氨基酸。该多肽的长度可以是 24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、或40个氨基酸(例如，长度为24-28个氨基酸)。在一些实施方式中，X9、X10、X11、或X12中的至少一个(例如，2、3、或4个)是丙氨酸。
[0061]在另一个方面，本发明涉及一种这样的多肽，其包括以下化学式的氨基酸序列，或基本上相同于由以下化学式限定的氨基酸序列:
[0062]Xl-Val-X2-Glu-1le-Gln-Leu-Met-His-X3-X4-X5-X6-X7-Leu-Asn-Ser-Met-Arg-Arg-Val-Glu-Trp-Leu-Arg-Lys-Lys-Leu,
[0063]其中:
[0064]Xl 是 Ser、Ala、或 Aib ；
[0065]X2 是 Ser、Ala、或 Aib ；
[0066]X3 是 Asn、Glu、Val、Asp、或 Gln ；
[0067]X4 是 Val、Ala、Trp、lie、Met、Lys、Arg、或 Leu ；
[0068] X5 是 Gly、His、Arg、或 Ala ；
[0069]X6 是 Lys> Gin、Leu、His、Trp、Ala、或 Arg ；以及
[0070]X7 是 Arg、Leu、Phe、Trp> His、或 Ser,
[0071]或其包含所述氨基酸序列的氨基酸1-24、1-25、1-26、或1_27的片段，或其药用盐。该多肽可以是R°选择性的或可以是长效PTH激动剂。上述氨基酸序列可以包含1、2、
3、4、5、6、7、8、9、10、或更多个取代(例如，相对于野生型PTH序列，在上述任何位置)。在一些实施方式中，该多肽包括在Xl处的Ala或Aib ;在乂2处的Ala或Aib ;在乂3处的Glu、Val、Asp、或 Gln ;在 X4 处的 Val、Ala、Trp> lie、Met、Lys、或 Arg ;在 X5 处的 His、Arg、或Ala ;在 X6 处的 Gln、Leu、His、Trp、Ala、或 Arg ;在 X7 处的 Arg、Leu、Phe、Trp、或 Ser ;或它们的组合。该多肽的长度可以少于100、75、60、50、40、36、34、33、32、31、30、29、或28个氨基酸。该多肽的长度可以是 24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、或 40 个氨基酸(例如，长度为24-28个氨基酸)。该多肽可以是在具有药用载体的组合物中。
[0072]在另一个方面，本发明涉及一种这样的多肽，其包括具有下式的氨基酸序列或基本上相同于由该式限定的多肽的氨基酸序列:
[0073]Ala-Val-Ser-Glu-His-Glu-Leu-Leu-His-Asp-Lys-Gly-Lys-Ser-1le-Gln-Asp-X1-Arg-Arg-Arg-X2-Phe-Leu-X3-X4-Leu-1le-X5-X6-X7-X8-X9-X10-Glu-1le
[0074]其中:
[0075]Xl 是 Leu> Ala、Ser> Met、Phe、或 Glu ；
[0076]X2 是 Phe、Ala、Ser> Leu、Asn、Trp> Glu、或 Lys ；
[0077]X3 是 His、Leu、Arg、Lys> Trp> lie、或 Phe ；
[0078]X4 是 His、Ala、Ser> Asn、Lys、或 Arg ；
[0079]X5 是 Ala、Gly、Ser> Asn、Gin、Trp> Glu、或 Lys ；
[0080]X6 是 Glu、Gly、Ser> Leu、Asn、Asp、Lys、或 Ala ；
[0081]X7 是 lie、Leu、Val、Lys、或 Ala ;
[0082]X8 是 His 或 Ala;
[0083]X9 是 Thr、Asn、或 Ala ;以及
[0084]XlO 是 Ala 或 Phe，
[0085]或其包含所述氨基酸序列的氨基酸1-24、1-25、1-26、1-27、1-28、1-29、1-30、1-31、1-32、1-33、1-34、或1_35的片段，并且其中所述多肽包括至少一个氨基酸取代(与对应的野生型PTHrP序列或其片段相比)；或其药用盐。该多肽可以以低亲和力结合于PTH受体的R°形式(例如，以高亲和力结合于PTH受体的RG形式)。该多肽可以是RG选择性的或可以是PTH受体的短效激动剂。相对于对应的野生型PTHrP序列，该多肽可以包括1、2、3、
4、5、6、7、8、9、10、或更多个取代。在一些实施方式中，该多肽具有在Xl处的Ala、Ser、Met、Phe、或 Glu ;在 X2 处的 Ala、Ser、Leu、Asn、Trp、Glu、或 Lys ;在 X3 处的 Leu、Arg、Lys、Trp、lie、或 Phe ;在 X4 处的 Ala、Ser、Asn、Lys、或 Arg ;在 X5 处的 Gly、Ser、Asn、Gin、Trp、Glu、或 Lys ;在 X6 处的 Gly、Ser> Leu、Asn、Asp、Lys、或 Ala ;在 X7 处的 Leu、Val、Lys、或 Ala ；在X8处的Ala ;在X9处的Asn或Ala ;在XlO处的Phe ;或它们的组合。在特定实施方式中，该多肽具有在Xl处的Ala或Glu、在X2处的Ala、在X3处的Leu、在X4处的Lys、或它们的组合。该多肽的长度可以少于100、75、60、50、40、36、34、33、32、31、30、29、或28个氨基酸。该多肽的长度可以是 24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、或 40 个氨基酸(例如，长度为28-36个氨基酸)。该多肽可以具有自由羟基或在其C端被酰胺化。该多肽可以包括选自表1的氨基酸序列，或基本上相同于这样的序列的序列。该多肽可以在具有药用载体的组合物中。
[0086]表1
[0087]

【权利要求】
1.一种多肽、或其药用盐，结合PTH受体并且对于所述PTH受体的R°形式具有高亲和力，包含式PTH(1-X)/PTHrP (Y-36)，其中X是11-30的整数而Y是X+1，其中所述PTH(1-X)表示人PTH序列的氨基酸I至X而所述PTHrP (Y-36)表示人PTHrP序列的氨基酸Y至36，且其中所述多肽可选地包括以下突变中的一个或多个:位置I处的Ala ;位置3处的Ala或Aib ;位置5处的His ;位置10处的Gln ;位置11处的Arg或高精氨酸；位置12处的Ala ；位置14处的Trp ；以及位置19处的Arg或Glu。
2.根据权利要求1所述的多肽，其中所述多肽在位置I和12处具有Ala;在位置3处具有Ala或Aib ;在位置10处具有Gln ;在位置11处具有Arg或高精氨酸；在位置14处具有Trp ；以及在位置19处具有Arg。
3.根据权利要求2所述的多肽，其中所述多肽在位置1、3和12处具有Ala;在位置10处具有Gln ;在位置11和19处具有Arg ；以及在位置14处具有Trp。
4.根据权利要求1所述的多肽，其中所述多肽是M-PTH(1-14)/PTHrP(15-36) (#1161)。
5.根据权利要求1所述的多肽，其中所述多肽是M-PTH(1-18)/PTHrP(19-36) (#1163)。
6.根据权利要求1所述的多肽，其中所述多肽是M-PTH(1-17)/PTHrP(18-36) (#1162)。
7.根据权利要求1所述的多肽，其中所述多肽是M-PTH(1-11)/PTHrP(12-36) (#1160)。
8.根据权利 要求1所述的多肽，其中所述多肽具有羟基基团或在其C端被酰胺化。
9.一种药物组合物，包括权利要求1-8所述的多肽和药用载体。
10.一种用于治疗受治疗者体内的疾病或病症的方法，所述疾病或病症选自由甲状旁腺功能减退、高磷酸盐血症、瘤样钙质沉着、以及骨质疏松症组成的组，所述方法包括以足以治疗所述疾病或病症的量将权利要求1-9中任一项所述的多肽给予需要其的受治疗者。
11.一种用于治疗需要骨折修复、或患有骨软化、关节炎、血小板减少、或需要干细胞转移的受治疗者的方法，包括以足以修复所述骨折、治疗所述疾病、或转移干细胞的量将权利要求1-9中任一项所述的多肽给予所述受治疗者。
12.根据权利要求10或11所述的方法，其中，给予的途径选自由皮下、静脉内、鼻内、经肺、经皮、以及口服组成的组。
13.一种核酸，包括编码权利要求1-8中任一项所述的多肽的序列。
14.根据权利要求13所述的核酸，可操作性地连接于启动子。
15.—种载体,包括权利要求13所述的核酸。
16.—种细胞,包括权利要求15所述的载体。
17.一种制备多肽的方法，包括在表达所述多肽的条件下生长权利要求16所述的细胞。
【文档编号】A61P13/12GK104072606SQ201410242852
【公开日】2014年10月1日 申请日期:2008年8月1日 优先权日:2007年8月1日
【发明者】托马斯·J·加德拉, 约翰·T·波茨, 清水胜, 市川文彦, 哈拉尔德·朱佩内尔, 冈崎诚 申请人:总医院有限公司, 中外制药株式会社