用于治疗Leber遗传性视神经病变的重组腺相关病毒-NADH脱氢酶亚单位4基因全长以及药剂的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种用于治疗Leber遗传性视神经病变的重组腺相关病毒-NADH脱氢酶亚单位4基因全长以及药剂，该基因全长，核苷酸序列SEQ ID NO：1所示，其中，该核苷酸序列全长为3824bp，其由CAG启动子序列、带Cox10的线粒体定位序列的ND4的编码序列和长度为625bp的UTR。将药剂注入眼玻璃体腔中，用于治疗Leber遗传性视神经病变，本发明的药剂注射到玻璃体腔，能够在玻璃体腔内保持活力，并高效转染到视神经细胞，该蛋白N前端的信号肽，定向引导该蛋白进入线粒体，成熟的ND4蛋白进入线粒体发挥作用。因此，药物能有效地治疗Leber遗传性视神经病变。
【专利说明】用于治疗Leber遗传性视神经病变的重组腺相关病 毒-NADH脱氢酶亚单位4基因全长以及药剂
【技术领域】
[0001] 本发明涉及基因工程【技术领域】，具体地指一种用于治疗Leber遗传性视神经病变 的重组腺相关病毒-NADH脱氢酶亚单位4基因全长以及药剂。
【背景技术】
[0002] Leber 遗传性视神经病变（Leber，s hereditary optic neuropathy，LH0N)是由 于线粒体基因突变所致的疾病，Leber遗传性视神经病变是世界公认的青少年致盲眼病之 一，本病好发于青中年男性，临床表现为双眼同时或先后急性或亚急性无痛性视力减退，同 时可伴有中心视野缺损及色觉障碍。
[0003] 学者已确认有20多个线粒体突变位点导致LH0N的发生，包括11778位点、14484 位点、3460位点、3490位点等等。其中111778位点突变最常见，占我国LH0N的89. 2%，且 预后最差，很多患者双眼视力在〇. 1 -下，11778位点突变会导致ND4蛋白功能受损，ND4蛋 白功能下降可以降低电子流动效率影响酶的活性从而减少视神经细胞ATP的产生，细胞逐 渐凋亡，从而导致患者发生LHON。LH0N目前尚无方法治疗，随着基因治疗的发展，LH0N的基 因治疗成为可能，我们前期研究了腺相关病毒-NADH脱氢酶亚单位4 (AAV2-ND4)。将ND4导 入视神经，代替因为突变而导致受损的ND4蛋白，治疗LH0N。但在实践中我们发现：前期研 究的这个AAV2-ND4转染效率较低，达不到治疗的目的：由于AAV2-ND4需要注射到眼睛的玻 璃体腔内，转染到视神经，但眼睛的玻璃体腔注射量有限，最多能够注射〇. lml，剂量非常 小，导致转染到视神经的正常ND4非常少，如果增加AAV-ND4的浓度，会引起机体的免疫反 应，反复给药也会因为免疫反应而没有作用。因此最佳办法是提高AAV2-ND4的转染效率。
【发明内容】
[0004] 本发明所要解决的技术问题就是提供一种用于治疗Leber遗传性视神经病变的 重组NADH脱氢酶亚单位4基因全长以及药剂。
[0005] 为解决上述技术问题，本发明提供的一种用于治疗Leber遗传性视神经病变的重 组NADH脱氢酶亚单位4基因全长，核苷酸序列SEQ ID N0 :1所示，其中，该核苷酸序列全长 为3824bp，其由CAG启动子序列、带CoxlO的线粒体定位序列的ND4的编码序列和长度为 625bp 的 UTR。
[0006] 本发明还提供了一种含有重组NADH脱氢酶亚单位4基因的腺相关病毒载体，该载 体命名为 AAV2-CAG-ND4。
[0007] 其CoxlO和长度为625bp的UTR目的是保证AAV2导入的ND4蛋白进入到线粒体内 发挥正常的生理作用，在ND4的前后增加两个序列分别是线粒体靶向序列，将它设计在ND4 序列的前面，其作用是引导AAV2转染到细胞核的翻译成的ND4蛋白进入线粒体。N0 :4是 非编码序列，设计在ND4蛋白的后面，其作用是稳定线粒体靶向序列和ND4的表达。此前的 非编码序列都是1400个碱基，不便于包装到AAV2,我们将这个序列缩短到625个碱基，既能 保证ND4的稳定性，又能提高AAV2-ND4的包装效率，提高出毒率。能够在视网膜视神经节 细胞高效表达ND4蛋白。其目的是保证ND4蛋白在视神经高效表达，达到治疗Leber遗传 性视神经病变作用。
[0008] 使用CAG启动子代替普通的CMV启动子，提高了 AAV2-CAG-ND4在玻璃体腔的转染 效率，达到注射小剂量能治疗Leber遗传性视神经病变的效果，符合眼玻璃体腔注射小量， 高效的要求。
[0009] 其中，NADH脱氢酶亚单位4基因（ND4)序列，以汉人的线粒体基因序列为基础，其 在Genebank的序列号是AY963573. 2。我们对这个序列进行修改，使新的基因序列在细胞核 里编码的ND4蛋白序列与AY963573. 2在线粒体内编码的ND4蛋白完全相同。其核苷酸序 列SEQ ID N0 :2所示。修改方法如下：
【权利要求】
1. 一种用于治疗Leber遗传性视神经病变的重组NADH脱氢酶亚单位4基因全长，核 苷酸序列SEQ ID NO :1所示，其中，该核苷酸序列全长为3824bp，其由CAG启动子序列、带 CoxlO的线粒体定位序列的ND4的编码序列和长度为625bp的UTR。
2. 含有权利要求1所述重组NADH脱氢酶亚单位4基因的腺相关病毒载体，该载体命名 为 AAV2-CAG-ND4。
3. 用于获得权利要求1所述重组NADH脱氢酶亚单位4基因全长的引物对，其特征在 于：所述引物对为： 正向引物 IF: 5 ' -ATCTCCGCACACTCTCTCCTCA-3 '， 反向引物 1R: 5 ' -GAGGAAAACCCGGTAATGATGTC-3 '。
4. 一种权利要求1或3所述重组NADH脱氢酶亚单位4基因的获得方法，其特征在于： 以具有重组NADH脱氢酶亚单位4基因的腺相关病毒载体全基因组DNA为模板，采用以下引 物对： 正向引物 1F:5' -ATCTCCGCACACTCTCTCCTCA-3' 反向引物 1R: 5 ' -GAGGAAAACCCGGTAATGATGTC-3 ' 进行PCR扩增，其所获得的重组NADH脱氢酶亚单位4基因为SEQ IDN0. 1。
5. -种权利要求2所述的载体在制备用于治疗Leber遗传性视神经病变的药剂中的应 用，其特征在于：将含有AAV2-CAG-ND4的药剂注入眼玻璃体腔中，用于治疗Leber遗传性视 神经病变。
6. -种权利要求5所述的药剂，其特征在于：所述药剂中，AAV2-CAG-ND4含量：有效 量控制在每一毫升药剂中含有1011的AAV2-CAG-ND4,其中，所述药剂还包括辅料，其中， a，a-海藻糖二水合物含量为0.5?1.5%、盐酸组氨酸一水合物含量为0.05?0.2% ; 聚山梨醇酯20含量为0. 5?2%。
【文档编号】A61P25/02GK104450747SQ201410491726
【公开日】2015年3月25日 申请日期:2014年9月23日 优先权日:2014年9月23日
【发明者】李斌 申请人:李斌