一种血清 5 型副猪嗜血杆菌疫苗株及其应用的制作方法
【专利摘要】本发明涉及一种血清5型副猪嗜血杆菌疫苗株，其分类命名为副猪嗜血杆菌(Haemophi lus parasuis)，菌株名称为JSYZ10，已保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号：CCTCC NO：M 2014260，保藏日期：2014年6月15日；还涉及了所述的血清5型副猪嗜血杆菌疫苗株在制备副猪嗜血杆菌灭活疫苗中的应用。本发明的血清5型副猪嗜血杆菌JSYZ10株生物学稳定，对仔猪具有很强的致病性，灭活后接种仔猪，具有很好的免疫原性。将其作为疫苗候选株制成的单价疫苗安全性好，能够对仔猪产生较高的抗体，持续期长，具有很好的免疫效力，能够抵抗同型野毒株的攻击。免疫后猪群发病率和死亡率明显降低，减少猪场的经济损失，其免疫效果达到或优于市场上现有商品化疫苗。
CCTCC NO:M 2014260
20140615
【专利说明】一种血清5型副猪嗜血杆菌疫苗株及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及兽医生物制品中副猪嗜血杆菌灭活疫苗领域，特别是涉及一种血清5 型副猪嗜血杆菌疫苗株，还涉及该疫苗株在制备灭活疫苗中的应用以及制备灭活疫苗的方 法。
【背景技术】
[0002] 副猪嗜血杆菌（Haemophilus parasuis，HPS)是一种G-球杆菌，是猪的一种条件 性病原菌，可引起副猪嗜血杆菌病。该病于1910年由德国学者Glasser首先报道，现已在 全世界范围内广泛分布。目前，副猪嗜血杆菌感染是引起猪场仔猪高死亡率的主要病因之 一。该病目前给中国猪群带来很大威胁，随着猪繁殖与呼吸综合征（PRRS，蓝耳病）的流行， 副猪嗜血杆菌病给猪群造成的损失比以往更为严重。副猪嗜血杆菌只感染猪，具有很强的 宿主特异性，可以影响2周龄?4月龄的猪，主要在断奶前后和保育舍阶段发病，发病率一 般为10 %?15%，严重时死亡率可达50%。
[0003] Hps是一种细小杆菌，在显微镜下呈多形态，非溶血性，不运动，无芽孢，无鞭 毛，革兰氏阴性。新分离的菌株多呈球杆状或双球状，有时可呈短链状，在陈旧培养物中 多呈多形态，有长杆状和丝状。Hps培养条件严格，生长依赖烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD 或V因子），不需要X因子。目前认为胰蛋白胨大豆琼脂（TSA培养基）和胰蛋白胨大豆 (TSB)培养基是最适培养基。在添加了 NAD和血清的TSA培养基上生长的菌落呈圆形，隆 起，表面光滑，边缘整齐，灰白色半透明，针尖大小。
[0004] 副猪嗜血杆菌至少有15种血清型，但临床分离菌中约20%无法定型。不同血清 型的毒力不同，其中血清1、5、10、12、13、14型毒力最强，2、4、8、15型具有中等毒力，3、6、7、 9、11型不能引起临床感染。从世界范围内看，血清4、5、12、13型最为流行，日本、德国、 美国、西班牙、加拿大和中国以血清4型和5型最常见，澳大利亚和丹麦分离的菌株主要为 血清5型和13型，但最新的研宄结果表明，危害北美各猪场的Hps流行血清型发生了改 变，在美国的猪场中血清型5不再广泛流行，而以血清4型（39% )和不能分型的分离株 (27%)最为流行。HPS在我国普遍流行，目前，在河北、河南、湖北、安徽、上海、广东、江西、 江苏等省市均有HPS病的发生报道。我国当前Hps流行的优势血清型主要为4、5、12、13型。
[0005] 目前以副猪嗜血杆菌病为代表的细菌病对养猪业的危害正日益加重，从而导致大 量使用抗生素进行治疗，结果导致细菌耐药性不断增强，耐药菌株不断出现，尤其是副猪嗜 血杆菌，非常容易耐药，导致治疗效果不好，从而养殖户加大抗生素用量，造成恶性循环。研 宄表明，用同血清型的菌株制成的灭活疫苗能够有效抵抗野毒株的感染，是预防和控制副 猪嗜血杆菌病最有效的措施。近年来，国内也开展了灭活疫苗的研宄，显示了很好的防治效 果。因此，在了解本我国主要流行菌的血清型的基础上，采用灭活疫苗进行接种，可以有效 预防本病的发生。同一血清型的Hps毒力可能不同，免疫原性也不同，所以，筛选一株毒力 强、免疫原性好的菌株是制备Hps灭活疫苗的关键，也是预防控制本病的重中之重。
【发明内容】
[0006] 本发明所要解决的技术问题是提供一种血清5型副猪嗜血杆菌疫苗株（JSYZ10)， 该菌株是一株强毒株，具有很好的免疫原性，利用该菌株可以制备出效果良好的副猪嗜血 杆菌灭活疫苗。
[0007] 本发明解决上述技术问题的技术方案如下：一种血清5型副猪嗜血杆菌疫苗株， 其分类命名为副猪嗜血杆菌（Haemophilus parasuis)，菌株名称为JSYZ10,已保藏于中国 典型培养物保藏中心，地址：中国武汉、武汉大学，保藏编号：CCTCC NO :M 2014260,保藏日 期：2014年6月15日。
[0008] 该菌株由2010年10月在江苏省扬州市一猪场发病猪分离获得的，具有较强的毒 力和很好的免疫原性。经琼脂凝胶扩散试验证明，该菌株为血清5型。
[0009] 利用该菌株通过常规方法制成不同佐剂的灭活疫苗，佐剂可以是白油佐剂、铝胶 佐剂或206佐剂中的一种，分别得到的白油佐剂灭活疫苗含菌量为2. 5 X 109CFU/mL、铝胶 佐剂灭活疫苗含菌量为2. OX 109CFU/mL、206佐剂灭活疫苗含菌量为2. 5X 109CFU/mL，可 预防由血清5型副猪嗜血杆菌引起的副猪嗜血杆菌病。从而表明，该菌株是一株具有很好 免疫原性。
[0010] 本发明还提供了一种副猪嗜血杆菌灭活疫苗的制备方法，包括以下步骤：
[0011] ⑴菌种选择血清5型副猪嗜血杆菌分离株JSYZ10,已保藏于中国典型培养物保 藏中心，地址：中国武汉、武汉大学，保藏编号：CCTCC N0:M2014260,保藏日期：2014年6月 15日；
[0012] (2)生产种子的制备，取冻干的JSYZ10株，加无菌生理盐水溶解后，划线接种于 TSA培养基上，37°C培养24h，挑取三个典型菌落，分别接种到3. OmLTSB液体培养基中，37°C 振荡培养20?22h，收获培养物，进行纯粹性检验，合格后按1 %比例接种到TSB液体培养 基中（即加入TSB液体培养基体积1 %的液体菌种），37°C振荡培养20?22h，收获培养物， 进行纯粹性检验，检验合格后，作为生产种子，置4°C，保存不超过1日；
[0013] (3)疫苗菌液的制备，取新鲜制备的生产种子，按1%比例接种到含有TSB培养基 的发酵罐中，37°C振荡培养20?22h，收获并取样，进行纯粹性检验，并测量菌液0D值，每 批疫苗菌液应无杂菌生长，且活菌数达到2. OX 109CFU/mL ;
[0014] (4)菌液的灭活，向检验合格的菌液中加入质量分数为10%的甲醛溶液，使甲醛 最终的质量浓度百分比为〇. 2%，于37°C灭活18h，每3?4h摇动一次；
[0015] (5)灭活疫苗的制备，将灭活检验合格的菌液采用常规方法制备成白油佐剂灭活 疫苗、错胶佐剂灭活疫苗或206佐剂灭活疫苗。
[0016] 上述步骤中的纯粹性检验按现行《中华人民共和国兽药典》附录进行。
[0017] 本发明的有益效果是：本发明的血清5型副猪嗜血杆菌JSYZ10株生物学稳定，对 仔猪具有很强的致病性，灭活后接种仔猪，具有很好的免疫原性。将其作为疫苗候选株制成 的单价疫苗安全性好，能够对仔猪产生较高的抗体，持续期长，具有很好的免疫效力，能够 抵抗同型野毒株的攻击。免疫后猪群发病率和死亡率明显降低，减少猪场的经济损失，其免 疫效果达到或优于市场上现有商品化疫苗。
【具体实施方式】
[0018] 以下对本发明的原理和特征进行描述，所举实例只用于解释本发明，并非用于限 定本发明的范围。
[0019] 实施例1 :血清5型副猪嗜血杆菌的分离、鉴定及生物学特性 [0020] 一、副猪嗜血杆菌的分离
[0021] 1、培养基的配制
[0022] (l)TSA的配制，向1000mL蒸馏水中加入TSA 40g，充分溶解后，经过121°C 30min 高压灭菌后，放置室温，待温度降至50°C左右，分别向TSA中添加灭活的犊牛血清和NAD (烟 酰胺二嘌呤），使血清和NAD最终的质量浓度百分比分别达到5%和0. 01%，然后倒入一次 性平皿中，待冷却凝固后，包装放置4°C备用。TSA平皿在4°C中保存最好不要超过30日，以 免平皿中的培养基干固，影响效果。
[0023] (2)TSB的配制，向1000mL蒸馏水中加入TSB 30g，充分溶解后，经过121°C 30min 高压灭菌后，放置室温，待温度降至50°C左右，分别向TSB中添加灭活的犊牛血清和NAD (烟 酰胺二嘌呤），使血清和NAD最终的质量浓度百分比分别达到5%和0. 01 %，放置4°C备用。 TSB平皿在4°C中保存最好不要超过30日，以免影响培养效果。
[0024] 2、病原菌的分离
[0025] 2010年10月，在江苏省扬州市某大型养猪场出现临床疑似副猪嗜血杆菌污染的 病猪，解剖后，表现出胸膜炎、心包炎、关节肿胀。用无菌接种环从疑似病猪新鲜的心包积 液、关节液中取样，在TSA培养基（含质量浓度百分比5 %血清和0. 001 %的NAD)上划线接 种，37°C培养24h?48h。挑取单个半透明隆起的小菌落，在TSA固体培养基上采取分区划 线法，进行2次单菌落纯化培养，直至无任何杂菌为止。
[0026] 二、副猪嗜血杆菌的鉴定
[0027] 1、镜检
[0028] 挑取上述纯化培养的单菌落在事先滴有生理盐水的载玻片上涂菌，按照常规革兰 氏染色法进行染色，在光学显微镜观察。在显微镜下可见，细菌为革兰氏阴性细小杆菌，具 有多种不同的形态，从单个的球杆菌到长的、细长的、甚至有细丝状的菌体。
[0029] 2、NAD依赖性试验
[0030] 用接种环挑取上述纯化的单菌落，水平划线于无NAD的TSA平皿上，同时挑取金黄 色葡萄球菌垂直于水平划线，37°C培养24h?48h，观察是否出现"卫星生长现象"，即在葡 萄球菌苔附近的的菌落较大，远侧的菌落较小甚至没有菌落存在。如果为副猪嗜血杆菌应 该出现"卫星生长现象"。
[0031] 3、生化鉴定试验
[0032] 挑取分离纯化的疑似副猪嗜血杆菌的单菌落，水平划线于TSA培养基上，于37°C 培养14h?16h，然后分别接种含NAD的微量生化管，于37°C培养48h，结果为发酵半乳糖、 葡萄糖、麦芽糖、果糖、和木糖，不发酵蔗糖和甘露醇。硝酸盐还原试验、接触酶试验阳性，吲 哚试验、脲酶试验、氧化酶试验阴性。生化结果表明该菌符合副猪嗜血杆菌的生化特征。
[0033] 4、16S rRNA基因序列测定与分析
[0034] (1)引物设计，参照Olveira S等发表的副猪嗜血杆菌16S rRNA基因序列设计引 物。
[0035] 上游引物：5' -GGC TTC GTC ACC CTC TGT-3'
[0036] 下游引物：5' -GTG ATG AGG AAG GGT GGT GT-3'
[0037] PCR引物由宝生物工程（大连）有限公司合成。
[0038] (2)细菌DNA模板的制备，将待检菌株菌液12000r/min离心3min，弃去上清液后， 用无菌DEPC水悬浮，在振荡器上祸旋lmin，于沸水中水浴20min，取出后置于-20°C冰箱中 冻结。冻融后12000r/min离心lmin，上清液即为模板DNA。
[0039] (3) PCR的扩增，以菌液DNA为模板，反应体系（50 y 1)如表1所示：
[0040] 表1 PCR扩增反应体系
[0041]
【权利要求】
1. 一种血清5型副猪嗜血杆菌疫苗株，其特征在于，其分类命名为副猪嗜血杆菌 (Haemophilus parasuis)，菌株名称为JSYZ10,已保藏于位于中国武汉的中国典型培养物 保藏中心，保藏编号：CCTCC NO :M 2014260,保藏日期：2014年6月15日。
2. -种如权利要求1所述血清5型副猪嗜血杆菌疫苗株在制备副猪嗜血杆菌灭活疫苗 中的应用。
3. 根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述副猪嗜血杆菌灭活疫苗为白油佐剂 灭活疫苗、铝胶佐剂灭活疫苗或206佐剂灭活疫苗。
4. 根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述白油佐剂灭活疫苗中含菌量为 2. 5X109CFU/mL〇
5. 根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述铝胶佐剂灭活疫苗中含菌量为 2. 0X109CFU/mL〇
6. 根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述206佐剂灭活疫苗中含菌量为 2. 5X109CFU/mL〇
7. -种副猪嗜血杆菌灭活疫苗的制备方法，其特征在于，包括以下步骤： (1) 菌种选择血清5型副猪嗜血杆菌分离株JSYZ10,已保藏于中国典型培养物保藏中 心，地址：中国武汉、武汉大学，保藏编号：CCTCC N0:M2014260,保藏日期：2014年6月15 曰； (2) 生产种子的制备，取冻干的JSYZ10株，加无菌生理盐水溶解后，划线接种于TSA培 养基上，37°C培养24h，挑取三个典型菌落，分别接种到3. OmLTSB液体培养基中，37°C振荡 培养20?22h，收获培养物，进行纯粹性检验，合格后按1 %比例接种到TSB液体培养基中， 37°C振荡培养20?22h，收获培养物，进行纯粹性检验，检验合格后，作为生产种子，置4°C， 保存不超过1日； (3) 疫苗菌液的制备，取新鲜制备的生产种子，按1 %比例接种到含有TSB培养基的发 酵罐中，37 °C振荡培养20?22h，收获并取样，进行纯粹性检验，并测量菌液0D值，每批疫苗 菌液应无杂菌生长，且活菌数达到2. OX 109CFU/mL ; (4) 菌液的灭活，向检验合格的菌液中加入质量分数为10%的甲醛溶液，使甲醛最终 的质量浓度百分比为〇. 2%，于37°C灭活18h，每3?4h摇动一次； (5) 灭活疫苗的制备，将灭活检验合格的菌液采用常规方法制备成白油佐剂灭活疫苗、 错胶佐剂灭活疫苗或206佐剂灭活疫苗。
【文档编号】A61P31/04GK104450557SQ201410529882
【公开日】2015年3月25日 申请日期:2014年10月9日 优先权日:2014年10月9日
【发明者】范娟, 傅元华, 潘杰, 王绍军, 迟强伟 申请人:扬州优邦生物制药有限公司