一种h9n2亚型禽流感灭活疫苗的生产方法及其制品的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种H9N2亚型禽流感灭活疫苗的生产方法及其制品，属于H9N2亚型禽流感灭活疫苗的生产及应用领域。本发明公开了一种H9N2亚型禽流感灭活疫苗的生产方法，包括：(1)利用细胞工厂培养MDCK细胞；(2)接种H9N2亚型禽流感病毒，在细胞工厂中增殖病毒；其中，所述H9N2亚型禽流感病毒微生物保藏编号为：CGMCC No.9325；(3)收获病毒，制备灭活疫苗。免疫保护实验表明，本发明方法生产的H9N2亚型禽流感灭活疫苗保护率达100％，且各时间点细胞毒免疫组的抗体水平均比胚毒免疫组高，抗体水平上升也较快。本发明方法生产的病毒液能用于制备预防或治疗H9N2亚型禽流感药物或试剂。CGMCC No. 93252014.06.20
【专利说明】一种H9N2亚型禽流感灭活疫苗的生产方法及其制品
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种H9N2亚型禽流感灭活疫苗的生产方法，尤其涉及一种利用细胞 工厂生产H9N2亚型禽流感灭活疫苗的方法，还涉及该生产方法制备得到的H9N2亚型禽流 感灭活疫苗及其在制备预防或治疗H9N2亚型禽流感药物或试剂中的用途，属于H9N2亚型 禽流感灭活疫苗的生产及应用【技术领域】。
【背景技术】
[0002] 禽流行性感冒（Avain Influenza, Al)，简称禽流感，是由A型流感病毒引起的一 种禽类（包括家禽和野禽）的感染和/或疾病综合征，主要引起禽类的全身性或呼吸系统 性疾病，被世界动物卫生组织确立为A类传染病。H9N2亚型禽流感属于低致病性禽流感，发 病率高，但死亡率低。虽然该亚型禽流感病毒对禽群呈低致病力，主要临床表现仅为轻度呼 吸道症状，但由于易与其他致病微生物发生协同作用，造成继发感染，从而引起了禽群的高 发病率和致死率，对各国养禽业的危害也很大。
[0003] 过去中国一直通过鸡胚培养生产禽流感疫苗。由于鸡胚生产流感疫苗需要消耗大 量鸡胚，生产周期长，易污染，不易于控制，而且每只受精鸡蛋一次只能注射一个病毒菌株， 因此这种生产方法效率很低，不利于应对大规模的流感爆发。
[0004] 以哺乳动物细胞为基质制备疫苗具有无外源因子污染、易于规模化生产、能较好 的维持病毒抗原稳定等优点。细胞工厂培养技术可用于如疫苗、单克隆抗体或生物制药等 工业规模生产，具有低污染风险，节省空间等优点。但是，至今尚无利用细胞工厂生产H9N2 亚型禽流感灭活疫苗的报道。
【发明内容】
[0005] 本发明所要解决的技术问题是提供一种利用细胞工厂生产H9N2亚型禽流感灭活 疫苗的方法，在使用细胞培养方法的同时生产出高滴度的病毒，满足免疫生产要求，即避免 生物安全的隐患又克服了疫苗的大量生产受制于鸡胚的供应。
[0006] 本发明所要解决的技术问题是通过以下技术方案来实现的：
[0007] 本发明首先分离了一株H9N2亚型禽流感病毒（Avain Influenza Virus)NJ13-8 毒株。
[0008] 本发明将分离的H9N2亚型禽流感病毒NJ13-8毒株提交专利认可的机构进行保 藏，其微生物保藏编号为：CGMCC No. 9325;分类命名为：禽流感病毒。保藏单位：中国微生 物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；保藏时间是2014年6月20日；保藏地址：中国北 京朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所。
[0009] 本发明分离的病毒NJ13-8毒株在MDCK细胞增殖良好，表明该毒株对MDCK细胞具 有高度适应性。
[0010] 在此基础上，本发明进一步提供了一种H9N2亚型禽流感灭活疫苗的生产方法，包 括以下步骤：（1)利用细胞工厂培养MDCK细胞；（2)接种H9N2亚型禽流感病毒，在细胞工厂 中增殖病毒；其中，所述H9N2亚型禽流感病毒毒株的微生物保藏编号为：CGMCC No. 9325 ; (3)收获病毒液，制备灭活疫苗。
[0011] 其中，步骤（1)培养MDCK细胞至细胞密度达0.8X IO5细胞/ml。
[0012] 步骤（2)中H9N2亚型禽流感病毒按病毒感染复数MOI = 0. 8进行接种；在细胞 工厂中增殖病毒，病毒维持液为不含血清的DMEM ;优选的，病毒维持液中加入终浓度1. 0% BSA 和 2. 0 μ g/ml 的 TPCK-胰酶；37°C 培养 60-72h。
[0013] 步骤（3)中灭活疫苗的制备包括，将病毒液5000r/min离心30min，取上清；加入 灭活剂甲醛溶液，其终浓度为病毒液上清总量的0.2% ;37°C灭活24h。将灭活的病毒上清 液与进口油佐剂按照体积比1 :3混合乳化后，即可用于动物免疫。
[0014] 本发明方法生产的H9N2亚型禽流感灭活疫苗可实现对H9N2亚型禽流感的有效防 治。
[0015] 本发明利用细胞工厂生产H9N2亚型禽流感灭活疫苗的方法适用于任何一种可以 获得的H9N2亚型禽流感病毒毒株。
[0016] 本发明还提供了所述生产方法制备得到的H9N2亚型禽流感灭活疫苗。安全性检 验试验证明，本发明方法制备的禽流感灭活疫苗对鸡只安全。
[0017] 本发明还提供了所述的H9N2亚型禽流感灭活疫苗在制备预防或治疗禽流感药物 或试剂中的用途。
[0018] 免疫保护实验表明，本发明方法生产的H9N2亚型禽流感灭活疫苗与国内2个厂家 生产的H9亚型禽流感疫苗预防禽流感的效果相比，攻毒后，本发明方法生产的H9N2亚型禽 流感灭活疫苗免疫组的保护率达100%，明显优于2个同类型产品免疫组，可实现对H9N2亚 型禽流感的有效防治。
[0019] 本发明利用细胞工厂生产的H9N2亚型禽流感灭活疫苗与鸡胚培养病毒制备的灭 活疫苗免疫效果比较证明，在各个时间点细胞毒免疫组的抗体水平均要比胚毒免疫组高， 抗体水平上升也较快。
[0020] 本发明对禽流感病毒在细胞工厂中的增殖条件进行了优化，综合考虑细胞密度、 病毒感染复数（MOI)、TPCK-胰酶浓度、BSA浓度和病毒培养时间五个因素对禽流感病毒 (AIV)增殖的影响，比较AIV病毒血凝价（HA)在不同增殖条件下的差异。
[0021] 结果表明，H9N2亚型AIV病毒在细胞工厂中增殖的最佳条件为：细胞密度 0.8X IO5细胞/ml ;AIV病毒按MOI = 0.8进行接种；病毒维持液中含1.0% BSA ;同时含 2. 0 μ g/ml的TPCK-胰酶；37°C培养60-72h，生产出高滴度的病毒，最高血凝价达lllog2。
[0022] 由于多数禽流感病毒入侵细胞过程中需要使用少量胰酶，而血清中含有胰酶抑制 物，因此在接种和繁殖禽流感病毒过程中不添加血清；本发明在病毒维持液中加入1. 〇% BSA，保持了胰酶的活性，明显的提高了禽流感病毒滴度，生产出高滴度的病毒，满足免疫生 产要求。
[0023] 本发明的技术方案与现有技术相比，具有以下有益效果：
[0024] 本发明应用细胞工厂技术生产H9N2亚型禽流感疫苗，首先避免了采用鸡胚的病 毒繁殖方法，既避免了生物安全隐患的问题，又克服了疫苗的大量生产受制于鸡胚的供应， 节省培养空间、减少污染风险、缩短操作时间；另外，本发明提供的细胞工厂培养病毒的方 法中，细胞密度为〇. 8 X IO5细胞/ml，按MOI = 0. 8接种病毒，并在病毒维持液中加入I. 0 % BSA和2. O μ g/ml的TPCK-胰酶增殖病毒，生产出高滴度的病毒，最高血凝价达11 log2,用 于H9N2亚型禽流感灭活疫苗的制备，满足免疫生产要求。
[0025] 本发明所渉及到的术语定义
[0026] 除非另外定义，否则本文所用的所有技术及科学术语都具有与本发明所属领域的 普通技术人员通常所了解相同的含义。
[0027] 术语"疫苗"意指将病原微生物（如细菌、立克次氏体、病毒等）及其代谢产物，经 过人工减毒、灭活或利用基因工程等方法制成的用于预防传染病的自动免疫制剂。
[0028] 术语"佐剂"意指非特异性免疫增强剂，当与抗原一起注射或预先注入机体时，可 增强机体对抗原的免疫应答或改变免疫应答类型。
[0029] 术语"抗体"意指机体的免疫系统在抗原刺激下，由B淋巴细胞或记忆细胞增殖分 化成的浆细胞所产生的、可与相应抗原发生特异性结合的免疫球蛋白。
[0030] 术语"病毒滴度"意指病毒的毒力或毒价，衡量病毒滴度的单位有最小致死量 (MLD)、最小感染量（MID)和半数致死量（LD 5tl),其中以LD5tl最常用，它是指在一定时间内能 使半数试验动物致死的病毒量；然而，病毒对试验动物的致病作用不一定都以死亡为标志， 例如以感染发病作指标，则可以半数感染量（ID 5tl)测定；此外，当试验的材料是鸡胚时则用 鸡胚半数致死量（ELD5tl)或鸡胚半数感染量（EID 5tl)表示；试验的材料是细胞时则用组织细 胞培养半数感染量（TCID5tl)表示。
【专利附图】
【附图说明】
[0031] 图1为细胞工厂上MDCK细胞的生长情况；其中，A为12h MDCK细胞形态；B为24h MDCK细胞形态；C为48h MDCK细胞形态。
【具体实施方式】
[0032] 下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而 更为清楚。但是应理解所述实施例仅是范例性的，不对本发明的范围构成任何限制。本领 域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节 和形式进行修改或替换，但这些修改或替换均落入本发明的保护范围。
[0033] 1、实验材料
[0034] 禽流感灭活疫苗（H9亚型，F株）购自乾元浩生物股份有限公司郑州生物药厂；禽 流感灭活疫苗（H9亚型，SD696株）购自扬州威克生物工程有限公司；MDCK细胞由哈尔滨兽 医研究所提供。
[0035] DMEM培养基购自Gibco公司；进口胎牛血清购自Hyclone JPCK-胰酶购自 Washington公司；Nunc EasyFill细胞工厂（10层，培养面积6320cm2,工作容量2000ml)购 自 Thermo Fisher。
[0036] 实施例I H9N2亚型禽流感病毒NJ13-8株的分离与鉴定
[0037] 1、实验方法
[0038] I. 1病毒的分离
[0039] 2013年从江苏省南京某养鸡场发病送检死亡病鸡中采集肺脏和肝脏，剪碎，按1 : 5加入灭菌生理盐水，无菌研钵研磨后，反复冻融3次，经3000r/min离心15min，取上清液， 备用。
[0040] 将上述病料上清液通过0.22 μ m-次性滤器除菌，经尿囊腔接种10日龄SPF鸡 胚，每枚鸡胚接种〇. lml，共接种5枚。37°C孵育；弃去24h内死胚，无菌收集24-120h死亡 鸡胚尿囊液，_70°C保存备用。
[0041] 病毒分离后需要在SPF鸡胚上进行3次终点有限稀释克隆纯化，即每一次均取最 高稀释度有血凝价的鸡胚尿囊液作为下一次传代纯化的种毒，如此经三次纯化后，以KT 4 稀释接种9-11日龄SPF胚，72h后收取鸡胚尿囊液，经菌检证明无污染，分装于小管中作为 种毒，贮存于_70°C。
[0042] 1. 2分离病毒株的鉴定
[0043] I. 2. 1血清学鉴定
[0044] 将无菌收集的鸡胚尿囊液以1.0%鸡红细胞悬液采用β -微量法进行HA试验， 以HA价>41og2为试验阳性。对有血凝性的胚液进行HI (血凝抑制试验）。分别用禽流感 (H9)标准阳性血清、禽流感（H5)标准阳性血清、鸡新城疫及鸡产蛋下降综合征阳性血清进 行抑制试验。
[0045] I. 2. 2RT - PCR 鉴定
[0046] 根据GenBank已发表的H9N2毒株的基因序列，用Primer 5. 0软件设计分别针对 HA (血凝素基因 ）、NA (神经氨酸酶基因）的两对引物，对分离毒株进行RT - PCR鉴定。
[0047] 通用引物：5，-AGCRAAAGCAGG-3，；
[0048] HA基因扩增引物：
[0049] 上游引物 5' -AGCRAAAGCAGGGGAATTTCACAAC-3' ；
[0050] 下游引物 5' -AGTAGAAACAAGGGTGTTTTTGCCAA-3，。
[0051] NA基因扩增引物：
[0052] 上游引物 5' -AGCRAAAGCAGGAGTAAAAATGAAT-3';
[0053] 下游引物 5' -AGTAGAAACAAGGAGTTTTTTCTAAAA-3，。
[0054] PCR 反应体系：25mmol/L MgCl2L 5 μ 1，10XEX Taq DNA 聚合酶 buffer 2. 5 μ 1， 2.5臟〇1/1(1阶132 4 14父了&9〇嫩聚合酶0.25 4 1，灭菌!120 14 4 1，上、下游引物25口111〇1/ μ I 1 μ I，反转录产物/阳性、阴性对照2. 75 μ I，总体积25 μ 1。
[0055] PCR 反应程序：94°C 3min，然后进入循环 94°C 30s，52°C 30s，72°C 90s，30 个循环， 于72°C延伸10min，4°C保存。
[0056] 2、实验结果
[0057] 2. 1病毒分离
[0058] 病料上清液经过4代鸡胚培养后，HA血凝价逐渐稳定，鸡胚死亡数开始增长，胚体 病变逐渐明显。种毒经适当稀释后，接种SPF鸡胚尿囊腔，收集接种后24_72h鸡胚的尿囊 液，-70°C保存备用。
[0059] 2. 2病毒的鉴定
[0060] 2. 2. 1血清学鉴定
[0061] 血清学鉴定结果见表1，表明：分离病毒尿囊液的血凝性只被禽流感（H9)标准阳 性血清抑制，不能被鸡新城疫、鸡产蛋下降综合征、禽流感（H5)标准阳性血清所抑制，说明 分离病毒为H9亚型禽流感病毒。
[0062] 表IHI试验结果
[0063]
【权利要求】
1. 一种H9N2亚型禽流感灭活疫苗的生产方法，其特征在于，包括以下步骤：（1)利用细 胞工厂培养MDCK细胞；（2)接种H9N2亚型禽流感病毒，在细胞工厂中增殖病毒；其中，所述 H9N2亚型禽流感病毒毒株的微生物保藏编号为：CGMCC No. 9325; (3)收获病毒液，制备灭 活疫苗。
2. 按照权利要求1所述的生产方法，其特征在于：步骤（1)中培养MDCK细胞至细胞密 度为0.8X105细胞/ml。
3. 按照权利要求1所述的生产方法，其特征在于：步骤（2)H9N2亚型禽流感病毒按病 毒感染复数M0I = 0. 8进行接种。
4. 按照权利要求1所述的生产方法，其特征在于：步骤（2)在细胞工厂中增殖病毒， 病毒维持液为不添加血清的DMEM ;其中，病毒维持液中加入终浓度1. 0% BSA ;37°C培养 60-72h。
5. 按照权利要求4所述的生产方法，其特征在于：步骤（2)中病毒维持液中还含有 2. 0 ii g/ml 的 TPCK-胰酶。
6. 按照权利要求1所述的生产方法，其特征在于，步骤（3)中制备灭活疫苗包括：将病 毒液5000r/min离心30min，取上清；加入灭活剂甲醛溶液，其终浓度为病毒液上清总量的 0.2% ;加入佐剂，混合乳化后，即得。
7. 按照权利要求6所述的生产方法，其特征在于：步骤（3)中病毒液上清于37°C灭活 24h。
8. 按照权利要求6所述的生产方法，其特征在于，步骤（3)中将灭活的病毒上清液与进 口油佐剂按照体积比1 :3混合乳化后，即得。
9. 权利要求1-8任何一项所述生产方法制备得到的H9N2亚型禽流感灭活疫苗。
10. 权利要求9所述的H9N2亚型禽流感灭活疫苗在制备预防或治疗H9N2亚型禽流感 的药物或试剂中的用途。
【文档编号】A61P31/16GK104338127SQ201410529744
【公开日】2015年2月11日 申请日期:2014年10月9日 优先权日:2014年10月9日
【发明者】李银, 刘宇卓, 李彥伟, 滕颖, 黄欣梅, 赵冬敏, 韩凯凯, 杨婧 申请人:江苏省农业科学院