microRNA-29a在制备抑制神经胶质瘤侵袭和转移药物中的应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了microRNA-29a在制备治疗胶质瘤药物中的应用。Transwell实验显示microRNA-29a可以有效抑制胶质瘤细胞的迁移和侵袭。这些结果表明microRNA-29a可用于制备抑制神经胶质瘤侵袭和转移药物。本发明为胶质瘤的治疗提供了新的方向。
【专利说明】micr〇RNA-29a在制备抑制神经胶质瘤侵袭和转移药物中 的应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物医学材料【技术领域】，具体涉及micr〇RNA-29a在制备抑制神经胶 质瘤侵袭和转移药物中的应用。
【背景技术】
[0002] 神经胶质瘤简称胶质瘤，也称为胶质细胞瘤，是最常见的原发性中枢神经系统肿 瘤，约占所有颅内原发肿瘤的一半，广义是指所有神经上皮来源的肿瘤，狭义是指源于各类 胶质细胞的肿瘤。根据世界卫生组织（WHO) 1999年的分类方案分为星形细胞瘤、少支胶质 瘤、室管膜瘤、混合性胶质瘤、脉络丛瘤、来源不肯定的神经上皮组织瘤、神经元及神经元神 经胶质混合瘤、松果体实质肿瘤、胚胎性肿瘤、神经母细胞瘤肿瘤。神经胶质瘤是最常见的 颅内肿瘤，约占45%。目前我国胶质瘤发病率正逐年上升，但常规的手术治疗及放化疗的疗 效并不理想，且患者随着病理级别增高病程缩短、死亡率增高。另外，胶质瘤不容易早期发 现，自出现症状至就诊时间一般多为数月甚至数年。
[0003] MicroRNAs (miRNAs)是在真核生物中发现的一类内源性的具有调控功能的非编 码RNA，其大小长约20?25个核苷酸。成熟的miRNAs是由较长的初级转录物经过一系列 核酸酶的剪切加工而产生的，随后组装进RNA诱导的沉默复合体（RNA-induced silencing complex，RISC)，通过碱基互补配对的方式识别靶mRNA，并根据互补程度的不同指导沉默复 合体降解靶mRNA或者阻遏靶mRNA的翻译。最近的研究表明miRNA参与各种各样的调节途 径，包括发育、病毒防御、造血过程、器官形成、细胞增殖和凋亡、脂肪代谢等等。
[0004] 最近的研究发现，miRNA表达与多种癌症相关，大约50 %得到注解的miRNAs在基 因组上定位于与肿瘤相关的脆性位点（fragile site)。这说明miRNAs在肿瘤发生过程中 起至关重要的作用，这些miRNAs所起的作用类似于抑癌基因和癌基因的功能，有研究人员 将 miRNA 命名为 "oncomirs"。
[0005] 已经有研究认为miRNA可以作为一种潜在的肿瘤早期发现和诊断的标记物，而且 miRNA在血清、血楽、尿液等体液中是稳定的，使得其作为肿瘤标记物的可能性又进一步加 大，而且随着目前技术的进步，miRNA检测技术越来越方便、快捷和价格低廉。
[0006] 在已经报道的miRNA当中，microRNA-29的高表达已经被认为与某些肿瘤的发生 发展相关，比如与结直肠癌，其灵敏度和精确度分别是69.0 %和89. 1 % (Huang Z，Huang D, Ni S, Peng Z, Sheng W, Du X(2010)Plasma microRNAs are promising novel biomarkers for early detection of colorectal cancer. Int J Cancer J Int Cancer 127 (I):118-126. doi :10. 1002/ijc. 25007)。再比如在急性白血病中，microRNA-29的高表达与其发生 发展相关，其灵敏度和优化之后的精确度分别为86. 7%和95.0% (Wang F et al.，2012. miR_29a and miR-142_3p downregulation and diagnostic implication in human acute myeloid leukemia. Mol Biol R印 39 (3) :2713 - 2722. doi :10. 1007/sll033-011-1026-5)。
[0007] 但是由于肿瘤发生、发展的组织特异性，在另外一些肿瘤当中出现了 microRNA-29 家族低表达的情况，在这些肿瘤当中，肿瘤的发生发展是与microRNA-29家族的低表达相 关的，这些肿瘤包括肝癌（SU et al..MicroRNA_101，down-regulated in hepatocellular carcinoma, promotes apoptosis and suppresses tumorigenicity. Cancer Res 2009 ； 69:1135-1142.)、乳腺癌（Iorio MV, et al. MicroRNA gene expression deregulation in human breast cancer. Cancer Res 2005;65:7065-7070·)、慢性白血病（Pekarsky Y，et al.Tell expression in chronic lymphocytic leukemia is regulated by miR_29and miR-181. Cancer Res 2006 ；66:11590 - 11593.)〇
[0008] 尤其是在白血病当中，急性和慢性白血病中microRNA-29家族扮演了截然相反的 角色。因此，在特定的肿瘤当中microRNA-29家族扮演的角色如何，没有现成的答案、也无 法由其他肿瘤的结果给出教导和启示，需要深入的开展特异性的研究。
[0009] 本发明发现在神经胶质瘤中，microRNA-29家族显著低表达，血中miR-29家族的 水平可以作为生物标记物来筛查和诊断神经胶质瘤；血中miR-29家族的水平也可以作为 生物标记物来对神经胶质瘤患者进行分期。因此，如果提高mic r〇RNA-29a的水平是否能够 抑制神经胶质瘤侵袭和转移将成为治疗神经胶质瘤创新性手段。
【发明内容】
[0010] 本发明的目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供m i croRNA-29a在制备抑制 神经胶质瘤侵袭和转移药物中的应用。
[0011] 本发明的目的通过下述技术方案实现：
[0012] Transwell实验显不microRNA_29a可以显著抑制人胶质瘤细胞的迁移和侵袭。这 些结果表明microRNA_29a可以有效抑制神经胶质瘤侵袭和转移。因此microRNA_29a可用 于胶质瘤转移患者的治疗，用于制备抑制胶质瘤侵袭和转移药物。
[0013] 一种治疗胶质瘤药，包含microRNA_29a ;其中，microRNA_29a序列 为：UAGCAGCGGGAACA⑶UCUGCAG。
[0014] 本发明相对于现有技术具有如下优点和效果：
[0015] (I)本发明发现了 micr〇RNA-29a可以降低胶质瘤细胞的迁移和侵袭。
[0016] (2)microRNA-29a为内源性RNA，目前在动物体内miRNA的生物合成过程已经得到 了较为详尽的诠释，具有无刺激，今后作为新型药物用于抑制胶质瘤的侵袭和转移的临床 治疗。
[0017] 本发明为胶质瘤的侵袭和转移治疗提供了新的方向。
【专利附图】
【附图说明】
[0018] 图1与内参microRNA-24的水平相比的血清miR-29家族的归一化水平
[0019] Control指正常人群，WHO I-II指早期神经胶质瘤患者，WHO III-IV指晚期神 经胶质瘤患者。显著性差异含义为，P〈0.05，*P〈0.01，〃P〈0.005。早期患者（WHO I-Π )与正常（Control)比较〃 Ρ〈0·01，为极显著性差异。晚期患者（WHO III-IV)与正 常（Control)比较〃 w Ρ〈0· 005,为极显著性差异。早期患者（WHO I-II)与晚期患者（WHO III-IV)比较+Ρ〈0. 05,为显著性差异。
[0020] 图2神经胶质瘤患者血清miR-29家族的ROC曲线（Receiver operating characteristic curves，ROC curves)及曲线下面积（areas under the curve, AUC)图中 显示了早期患者（WHO 1-11)、晚期患者（WHO III-IV)和所有患者（WHO I-IV)的ROC曲线、 曲线下面积、灵敏度（Sensitivity)和准确度（Specificity)。
【具体实施方式】
[0021] 下面结合实施例及附图对本发明做进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限 于此。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。
[0022] 实施例1临床血清标本microRNA-29家族的表达与神经胶质瘤发病的相关性研 究
[0023] -、材料与标本收集描述
[0024] 神经胶质瘤患者血清标本收集至来自临床的处于不同分期的神经胶质瘤患者， 合计83例。正常人群的血清标本收集至来自正常健康人群，合计69例。神经胶质瘤的 诊断是通过组织病理学或者磁共振成像来确认的，标准是基于WHO的分类；神经胶质瘤的 分期是根据 WHO 和 TNM 的分类标准（Sobin LH, Fleming ID, 1997. TNM classification of malignant tumors, fifth edition(1997). Union Internationale contre Ie cancer and the American joint committee on cancer. Cancer 80 (9) : 1803 - 1804)。神经胶质瘤患 者在取血之前没有经过外科手术、化疗或者放疗等任何抗肿瘤方面的治疗。每个样本用 PAXgene Blood RNA tubes (BD Biosciences, Basel, Switzerland)合计收集 IOml 血液。
[0025] 二、样品处理和RNA提取
[0026] 血液在凝血之后，在500 X g、4摄氏度下离心60分钟之后取上层血清保存于-80摄 氏度下备用。血清中的 RNA通过MiRNeasy Kit (Qiagen GmbH, Hombrechtikon, Switzerland) 按照说明书操作步骤进行提取和纯化。
[0027] 三、定量 PCR
[0028] 定量 PCR 实验参照 W Wei 等人的方法（Wei W, et al. · miR-29 targets Akt3to reduce proliferation and facilitate differentiation of myoblasts in skeletal muscle development. Cell Death and Disease(2013)4, e668 ；doi:10.1038/ cddis. 2013. 184)。血清中 microRNA-29 家族表达的高低通过 Ct 值（Cycle threshold)来 评估，计算方法是2_ΛΛα。本实验中microRNA-24作为内参，microRNA-29家族的Ct值通 过内参microRNA-24的量来归一化。每个样本做三个重复实验。
[0029] 四、统计分析方法
[0030] 显著性差异用 t 检验（student，s t test)、Mann - Whitney 检验（Mann - Whitney test)和 x 检验（xtest)。ROC 曲线（Receiver operating characteristic curves，ROC curves)及曲线下面积（areas under the curve，AUC)被用作为预测miR-29家族在神经胶 质瘤中标记物的指标。优化的灵敏度和精确度根据检验前概率（pre-test probability) 和由ROC获得的值比（cost ratio)来计算获得。所用的统计软件为SPSS 19. 0,当P值小 于0. 05时认为显著。
[0031] 五、实验结果
[0032] l、miR-29家族在早晚等各期神经胶质瘤患者及正常人群中的表达
[0033] 如图1所示，与内参microRNA-24的水平相比的血清miR-29家族的归一化水平在 所有神经胶质瘤组和正常人群组之间都有显著性差异（p〈0. 01)。而且晚期患者组和正常人 群组之间有极显著性差异（P〈〇. 005)。再比较早期患者和晚期患者组，组间也有显著差异 (Ρ〈0· 05)。
[0034] 2、神经胶质瘤中miR-29家族的水平作为生物标记物的预测值
[0035] 不同分期的神经胶质瘤患者血清miR-29家族作为生物标记物的预测表现通过 ROC曲线（图2)可知。所有阶段（I-IV期）的神经胶质瘤患者血清miR-29家族作为生物 标记物的预测表现是中等的，其AUC为0. 74(95% CI，0. 67 - 0. 82)，优化的灵敏度和准确 度分别为68. 5%和77. 3%。晚期患者血清miR-29家族作为生物标记物的预测表现是最佳 的，AUC高达0. 81 (95% Cl, 0. 73 - 0. 89)。早期患者血清miR-29家族作为生物标记物的预 测表现尚可，AUC 为 0· 66(95% Cl, 0· 58 - 0· 76)。
[0036] 六、结论
[0037] 1、血中miR-29家族的水平可以作为生物标记物来筛查和诊断神经胶质瘤；
[0038] 2、血中miR-29家族的水平可以作为生物标记物来对神经胶质瘤患者进行分期。
[0039] 实施例2 microRNA_29a对胶质瘤细胞增殖的影响
[0040] 采用MTT法检测细胞增殖能力，筛选细胞株为人胶质瘤细胞系U87、U251、U373、 A172、SHG44、U118 和 U138。
[0041] 以转染随机序列 miR-NC (Negative Control, NC)为对照组，以转染 microRNA_29a mimics (microRNA_29a模拟物）为实验组。microRNA_29a模拟物和随机序列均由广州锐博 生物技术公司设计并合成（microRNA-29a mimics 序列为 "UAGCACCAUCUGAAAUCGGUUA"）。
[0042] (I)接种细胞：将对数生长期的人胶质瘤细胞系U87、U251、U373、A172、SHG44、 Ul 18和U138,用含10% (v/v)胎牛血清的DMEM培养基配成单个细胞悬液，以每孔6000个 细胞接种到96孔细胞培养板中，每孔体积100 μ L。
[0043] (2)培养细胞和转染：待12h后细胞贴壁，转染50nmol microRNA-29a mimics或 NC，每组重复6个孔，置37°C、5% CO2条件下培养24h。。
[0044] 细胞转染具体步骤如下：接种细胞12h后，待细胞融合度达到80%左右 时进行转染。将miRNA用optl-DMEM稀释于1.5mL Ep中，轻敲管壁混匀；将适量的 Lipofectamine2000 (Invitrogen公司）稀释于另一 I. 5mL Ep管中，轻敲管壁混勻；室温静 置10分钟，将两管轻柔混合均匀，室温静置25分钟。同时将细胞用PBS (0. 01M，pH 7. 4)洗 三次，再加入上述混合液并补充一定量opt 1-DMEM，培养箱培养6h后，用PBS冲洗细胞三遍， 换用含10% (v/v)胎牛血清的DMEM培养基培养。
[0045] (3)呈色：每孔加20 μ L MTT溶液（5mg/mL)，继续孵育4小时，终止培养，小心吸 弃培养孔内上清；每孔加150 μ L DMS0,振荡10分钟，使结晶物充分溶解。
[0046] (4)比色：酶标仪测定490nm处各孔的光吸收值（0D值），计算细胞的增殖抑制率： 抑制率（％) = (1-处理组平均OD值/空白组平均OD值）X100%，结果见表1。
[0047] 表I microRNA-29a对7种胶质瘤细胞的体外增殖抑制作用
[0048]
【权利要求】
1. micr〇RNA-29a在制备抑制神经胶质瘤侵袭或者转移药物中的应用。
2. 如权利要求1所述的microRNA-29a在制备抑制神经胶质瘤侵袭或者转移药物中的 应用，其特征为micr〇RNA-29a抑制神经胶质瘤细胞的迁移。
3. 如权利要求1所述的microRNA-29a在制备抑制神经胶质瘤侵袭或者转移药物中的 应用，其特征为micr〇RNA-29a抑制神经胶质瘤细胞的侵袭。
4. 如权利要求2-3任意一项所述的microRNA-29a在制备抑制神经胶质瘤侵袭或者转 移药物中的应用，其特征为所述神经胶质瘤细胞为U87、U251、U373、A172、SHG44、U118或者 U138。
【文档编号】A61K48/00GK104306997SQ201410621523
【公开日】2015年1月28日 申请日期:2014年11月6日 优先权日:2014年11月6日
【发明者】吴俊华, 江春平 申请人:南京大学