重组鸭病毒性肠炎病毒、制备方法和应用的制作方法
【专利摘要】本发明提供重组鸭病毒性肠炎病毒、制备方法和应用，属于动物医学的疫苗领域。本发明禽流感病毒血凝素基因，其核苷酸序列为SEQ ID NO:1的第1437至3131位核苷酸。本发明重组鸭病毒性肠炎病毒，是在鸭病毒性肠炎病毒基因组的LORF11和UL55基因之间的间隔区中插入了含所述禽流感病毒血凝素基因的表达盒。本发明禽流感病毒血凝素基因，作为疫苗活性成分，能达到较好的交叉保护效果。本发明重组鸭病毒性肠炎病毒，可以稳定高效表达禽流感病毒血凝素基因，病毒稳定、生长良好，制备的活疫苗，对鸭瘟和禽流感的保护效力较高，产生了较高的禽流感抗体，且抗体持续期较长。
【专利说明】重组鸭病毒性肠炎病毒、制备方法和应用
[0001]
【技术领域】
[0002]本发明属于动物医学的疫苗领域，具体涉及重组鸭病毒性肠炎病毒、制备方法和应用。
【背景技术】
[0003]鸭瘟首次报道见于二十世纪初，目前全世界大多数养鸭国家都有此病的报道，由鸭瘟病毒(又称鸭病毒性肠炎病毒)引起，其发病率和死亡率可达100 %，鸭瘟病毒会在鸭的三叉神经节形成持续感染，鸭瘟弱毒活疫苗被广泛用于鸭瘟的免疫预防，能有效阻止发病。
[0004]禽流感(H5N1)是鸭和鸡的一种主要传染病，不仅是当前威胁全世界家禽业养殖安全的最重要的传染病之一，而且对人类的致死率极高，对人类公共卫生安全构成严重威胁。对家禽业禽流感的防控措施，部分国家和地区采取以病原净化为主的方法，如欧盟大多数国家，取得了较好的效果。我国对家禽业禽流感(H5N1)的防控采取以强制免疫为主的综合性防制措施，有效控制了该病在我国家禽中的传播势头。以鸭为主的水禽是禽流感的重要携带和储藏宿主，在禽流感(H5N1)病毒的传播和变异过程中扮演着重要角色，因此，鸭的禽流感(H5N1)的防制是该病防控的关键。我国目前对家禽强制免疫采用的是全病毒灭活疫苗，此疫苗虽然具有安全性好等优点，但在实践应用中亦表现出如下几个方面的不足之处，一，灭活疫苗在生产中要进行大规模的病毒培养，存在扩散病毒的生物安全性隐患。二，其免疫力产生较慢，且在注射局部形成肿块，对于生产周期较短的速生型肉禽的应用受到限制。三，灭活疫苗虽可以产生高效的体液免疫，但细胞免疫力不足，无法将病毒彻底清除出机体，从而可能形成隐性感染。尤其是灭活疫苗对鸭的免疫原性差，免疫效果不佳。
【发明内容】
[0005]本发明的目的是提供禽流感病毒血凝素基因，该基因表达产物作为疫苗活性成分，能达到较好的交叉保护效果。
[0006]本发明的另一目的是提供重组鸭病毒性肠炎病毒，可以稳定高效表达禽流感病毒血凝素基因，病毒稳定、生长良好。
[0007]本发明的另一目的是提供所述重组鸭病毒性肠炎病毒的构建方法，该方法简单、效率高。
[0008]本发明的再一目的是提供以所述重组鸭病毒性肠炎病毒为活性成分的活疫苗，该活疫苗接种后，对鸭瘟和禽流感的保护效力较高，产生了较高的禽流感抗体，且抗体持续期较长。
[0009]本发明的目的采用如下技术方案实现。
[0010]本发明提供禽流感病毒血凝素基因，其核苷酸序列为SEQ ID N0:1的第1437至3131位核苷酸。
[0011]本发明还提供重组鸭病毒性肠炎病毒，在鸭病毒性肠炎病毒基因组的LORFll和UL55基因之间的间隔区中插入了含有权利要求1所述禽流感病毒血凝素基因的表达盒。
[0012]优选的技术方案中，所述表达盒中的启动子为pMCMV IE启动子。
[0013]优选的技术方案中，所述表达盒替换了 UL55与LORFll基因之间的间隔区第263至291位的核苷酸片段。
[0014]本发明还提供所述重组鸭病毒性肠炎病毒的构建方法，采用同源重组方法将含有所述禽流感病毒血凝素基因的表达盒插入鸭病毒性肠炎病毒基因组的LORFll和UL55基因之间的间隔区。
[0015]在本发明中，含有所述禽流感病毒血凝素基因的表达盒插入鸭病毒性肠炎病毒的方法包括如下步骤:
(I)确定鸭病毒性肠炎病毒基因组的UL55与LORFll基因之间的间隔区中待替换片段，分别扩增待替换片段上游和下游的核苷酸片段，得到上游同源臂和下游同源臂；将表达绿色荧光蛋白的表达盒和表达权利要求1所述基因的表达盒分别插入上游同源臂和下游同源臂之间，分别得到同源重组片段A和同源重组片段B ；
(2 )鸭病毒性肠炎病毒的基因组DNA与同源重组片段A进行同源重组，挑选在紫外光下发出绿色荧光的重组病毒，获得重组病毒C ；
(3 )同源重组片段B与重组病毒C的基因组DNA进行同源重组，挑选在紫外光下不能发出绿色荧光的重组病毒，得到携带有禽流感病毒血凝素基因表达盒的重组鸭病毒性肠炎病毒。
[0016]本发明还提供以所述重组鸭病毒性肠炎病毒为活性成分的活疫苗。
[0017]表达禽流感病毒血凝素(HA)基因的重组鸭病毒性肠炎病毒的原始毒株可以是鸭病毒性肠炎病毒鸡胚化弱毒株或其他鸭病毒性肠炎病毒弱毒株或经人工基因工程改造的毒株及强毒株。
[0018]本发明以所述重组鸭病毒性肠炎病毒(DEV-H5 ULwf株)为活性成分的活疫苗，用于鸭瘟病毒和禽流感病毒引起的鸭、鹅和番鸭及野鸭等雁形目禽类传染病的免疫预防和鸡的禽流感的免疫预防。
[0019]本发明活疫苗，是以所述重组鸭病毒性肠炎病毒DEV-H5 ULwf株作为种毒，参照鸭病毒性肠炎活疫苗的生产工艺进行生产。本发明活疫苗内可以加入免疫佐剂与疫苗赋形剂等，本领域技术人员可以容易地进行生产。
[0020]本发明经过优化的禽流感病毒血凝素基因的表达产物作为疫苗活性成分，能达到较好的交叉保护效果。
[0021]本发明通过在鸭病毒性肠炎病毒基因组中插入了禽流感病毒血凝素基因表达盒，获得了重组鸭病毒性肠炎病毒。该重组鸭病毒性肠炎病毒能稳定高效表达禽流感病毒血凝素基因，病毒稳定、生长良好。
[0022]本发明重组鸭病毒性肠炎病毒的构建方法简单、效率高。
[0023]本发明以所述重组鸭病毒性肠炎病毒为活性成分的活疫苗，接种鸡和鸭后，安全性好，对鸭瘟和禽流感的保护效力均非常高，尤其是产生了较高、且持续期较长的禽流感抗体。
【专利附图】
【附图说明】
[0024]图1、GFP基因转移载体的结构简图。
[0025]图2、GFP重组鸭病毒性肠炎病毒rDEV-GFP蚀斑荧光照片。
[0026]图3、禽流感病毒血凝素(HA)基因表达盒示意图。
[0027]图4、重组病毒DEV-H5 ULwf株表达HA的间接免疫荧光图。
[0028]图5、重组病毒DEV-H5 ULwf株生长特性曲线图，其中DEV C-KCE是鸭病毒性肠炎病毒鸡胚化弱毒株C-KCE株的缩写。
[0029]图6、重组病毒DEV-H5 ULwf株免疫商品鸭后对鸭瘟的保护效力图。
[0030]图7、重组病毒DEV-H5 ULwf株免疫商品鸡诱导产生的抗禽流感病毒(H5) HI抗体效价水平图。
【具体实施方式】
[0031]以下通过具体实施例进一步说明本发明，但本发明的范围和精神并不限于所列实施例。
[0032]重组菌pHA2 corr ,德国柏林自由大学惠赠，公开于文献-,Recons ti tu ti on ofMarek's disease virus serotype I (MDV~1) from DNA cloned as a bacterialar ti fi cial chromosome and charac teri za ti on of a glycopro tein B—nega ti veMDV-1 mutant.Schumacher D，Tischer BK，Fuchs W，Osterrieder N.J Virol.2000Dec; 74 (23): 11088-98。
[0033]鸭病毒性肠炎病毒鸡胚化弱毒株C-KCE株(缩写为鸭瘟鸡胚化弱毒株C-KCE株)，公开文献:Li, Y., B.Huang, et al.(2009)."Molecular characterizat1n of thegenome of duck enteritis virus.Virology 391(2): 151-161。
[0034]实施例1、GFP转移载体质粒的构建
1.获得GFP表达盒
GFP表达盒是绿色突光蛋白(green fluorescent protein)的表达盒,序列如SEQ IDNO: 2所示。GFP表达盒含有pHCMV启动子、绿色荧光蛋白基因GFP和终止序列。以重组菌pHA2 corr 的 DNA 为模板，以 Primer GFP-UL55 F 和 Primer GFP-UL55 R 为引物，采用梯度PCR方法扩增GFP表达盒。
[0035]Primer GFP-UL55 F (SEQ ID N0:4): 5’ -TATCCCGGGTTAACCGGGCTGCATCCGAT-3’；
Primer GFP-UL55 R (SEQ ID NO:5): 5’ -ATACCCGGGCGAAGTTATGCGGCCATTTA-3’。
[0036]梯度PCR 方法的反应体系为:10 X PCR Buffer 5 μ L、dNTPs (2.5 mM each)4μ L, Mg2+(25 mM) 3 μ L，上、下游引物(10 pmol/μ L )各 2yL、ExTaq 酶 0.5μ L、DNA模板2yL,dd H2O 31.51^(?0?试剂来自了&1?1以公司)。梯度PCR方法的反应条件:94°C预变性 3 min ；94°C 变性 30 sec, 52°C 退火 40sec,72°C 延伸 lmin40 sec,循环 10 次；然后94°C变性30 sec, 600C退火40sec，72°C延伸lmin40 sec，循环27次；最后72°C延伸10 min。反应结束后取PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，扩增得到长度约为1500bp的片段，回收后备用。经测序发现该片段长度为1536bp，序列如SEQ ID N0:3所示。
[0037]2.获得上、下游同源臂
鸭瘟鸡胚化弱毒株C-KCE株L0RF11和UL55基因之间的间隔区序列如SEQ ID N0:3所示。选择该间隔区第263至291位的核苷酸片段为待替换片段。上、下游同源臂的设计:自间隔区的第263位核苷酸至上游长度为1llbp的序列为上游同源臂H1，自间隔区的第291位核苷酸至下游长度为1039bp的序列为下游同源臂H2。
[0038]以鸭瘟鸡胚化弱毒株C-KCE株的基因组DNA为模板，分别扩增上游同源臂Hl和下游同源臂H2。扩增上游同源臂的引物为Primer UL55 Hl F和Primer UL55 Hl R，扩增下游同源臂的引物为Primer UL55 H2 F和Primer UL55 H2 R。
[0039]Primer UL55 Hl F (SEQ ID NO:6): 5’ -CTAGAGCTCCGCTAATAAATAGTAACGCC-3，；
Primer UL55 Hl R (SEQ ID NO:7): 5’ -TATCCCGGGTATTACCCAAATACCCTGTT-3’ ；
Primer UL55 H2 F (SEQ ID NO:8): 5’ - ATACCCGGGAATTGTCCTAGCTTGTTCAG-3’ ；
Primer UL55 H2 R (SEQ ID NO:9): 5’ -CGGAAGCTTTCTCGTGTCAGTTAAAGGTA-3’。
[0040]上游同源臂Hl和下游同源臂H2的PCR反应体系和条件相同。PCR反应体系为:10 X PCR Buffer 5 μ L、dNTPs (2.5 mM each) 4μ L, Mg2+(25 mM) 3 μ L，上、下游引物(10pmol/ μ L )各 2 μ L、ExTaq 酶 0.5 μ L ,DNA 模板 2 μ L，dd H2O 31.5 μ L (PCR 试剂来自Takara公司XPCR反应条件:94°C 预变性3 min ；94°C 变性30 sec，52°C 退火40sec，72°C延伸 IminlO sec，循环 10 次；然后 94°C 变性 30 sec, 60°C 退火 40sec，72°C 延伸 IminlOsec，循环27次；最后72°C延伸10 min。
[0041]PCR反应结束后，取PCR产物琼脂糖凝胶，得到长度约lOOO-llOObp的扩增片段，分别回收上、下游同源臂PCR扩增片段。
[0042]将上游同源臂Hl的PCR扩增片段与PUC19质粒，分别应用Sac I与Sma I限制性内切酶进行双酶切(酶切试剂来自TaKaRa公司)。酶切体系为:Sac I I μ L, Sma IlyL,10ΧΤ Buffer I μ L, 100 X BSA 0.2 μ L, DNA I μ g,加水补足体积至 20 μ L。酶切反应在37°C作用I小时，反应结束后进行电泳回收。再应用T4连接酶(TaKaRa公司)连接。连接体系为:T4连接酶lyL，1XBuffer I μ L，pUC19质粒酶切产物2yL(200ng)，上游同源臂Hl酶切产物5 μ L (500ng),加水补足体积至10 μ L。连接体系在4°C过夜，获得含上游同源臂的重组质粒PUC19-H1 (DEV UL55)，再转化感受态细胞DH5a。
[0043]将下游同源臂H2的PCR扩增片段和重组质粒pUC19-Hl (DEV UL55)，分别应用SmaI与Hind III限制性内切酶进行双酶切，酶切试剂来自TaKaRa公司。酶切体系为:HindIII I μ L, Sma IlyL, 10XT Buffer I μ L, 100XBSA, 0.2 μ L, DNA I μ g,加水补足体积至20yL。酶切体系在37°C作用I小时，反应结束后进行电泳回收。再应用T4连接酶连接，连接试剂来自TaKaRa公司。连接体系为:T4连接酶I μ L，10Χ Buffer I μ L，PUC19-H1 (DEV UL55)酶切产物 2μ L (200ng),上游同源臂 Η2 酶切产物 5yL (500ng),加水补足体积至10 μ L。连接体系在4°C过夜，获得含上、下游同源臂的质粒pUC19-Hl-H2(DEV UL55)，再转化感受态细胞DH5 α。
[0044]3.构建GFP基因转移载体
将GFP表达盒与pUC19-Hl-H2(DEV UL55)质粒分别应用Sma I限制性内切酶进行酶切，酶切试剂来自TaKaRa公司。酶切体系为:Sma I I μ L, 10ΧΤ Buffer 2 μ L, 100XBSA0.2 μ L, DNA I μ g,加水补足体积至20 μ L。酶切体系37°C作用I小时，反应结束后进行电泳回收。再应用T4连接酶进行连接。连接体系为:T4连接酶lyL，10X Buffer I μ L，PUC19-H1-H2 (DEV UL55)酶切产物 2 μ L (200ng)，GFP 表达盒酶切产物 5yL(500ng),加水补足体积至?ο μ L。连接体系在4°C过夜，连接产物为GFP基因转移载体pDEV_GFP (UL55)(图1)。将GFP基因转移载体pDEV-GFP(UL55)转化感受态细胞DH5 α，获得含质粒的阳性重组菌。最后通过基因测序验证所获得的转移载体pDEV-GFP(UL55)是正确的克隆。
[0045]实施例2、GFP重组鸭病毒性肠炎病毒的获得与鉴定
取9?10日龄SPF鸡胚，按照常规方法制备和培养原代及次代鸡胚成纤维细胞(Primary chicken embryo fibroblasts, CEF)。取鸭痕鸡胚化弱毒株 C-KCE 株按感染复数为0.05 (Multiplicity of infect1n, MOI)接种单层鸡胚成纤维细胞，培养约72 h,待95%细胞出现病变时收取细胞，按照常规方法提取病变细胞中病毒DNA，经凝胶扫描仪进行DNA定量，调整DNA浓度至0.1?0.2 μ8/μ?。用碱裂解法从重组菌中提取转移载体pDEV-GFP (UL55)的DNA ,应用Eppendorf B1photometer仪进行定量(或琼脂糖电泳测量法定量)，调整浓度为700 ng/^L。按照常规磷酸钙转染法进行转染，将5 μδpDEV-GFP (UL55)的DNA与2 μδ鸭瘟鸡胚化弱毒株C-KCE株的DNA共转染原代CEF进行同源重组，次日吸除培养液，加入含10%胎牛血清的甲基纤维素培养基(北京绿源)覆盖，继续培养24-48 h，在波长为488nm紫外光激发下寻找发出绿色荧光的重组鸭病毒性肠炎病毒蚀斑(图2)，挑取绿色荧光的蚀斑接种新鲜的CEF，如此重复数个循环，直至病毒纯化成功，获得GFP重组鸭病毒性肠炎病毒，命名为rDEV-GFP株。
[0046]实施例3、禽流感病毒血凝素(HA)基因表达盒及其转移载体的构建
1.获得禽流感病毒血凝素(HA)基因
将2010年以来在GenBank上公开发表的H5N1型禽流感的血凝素(HA)基因序列，采用MEGA软件进行多重序列比对获得一致性序列。一致性序列每个位点的碱基取出现在HA序列同一位点处的四种碱基(A、C、G、T)中频率最大的。去除一致性序列中HAl与HA2片段之间的碱性氨基酸裂解位点，然后参照新近流行的2.3.2.1谱系的H5N1型禽流感病毒血凝素(HA)基因序列(GenBank: AB700635.1; JN986881.1; JN986882.1; JN646713.1;JN646716.1; HQ020376.1; CY098758.1; JF975561.1;)，优化设计得到本发明禽流感病毒血凝素(HA)基因，序列为SEQ ID No:1中第1437位至3131位核苷酸。HA基因表达盒的pMCMV IE启动子为公开发表的小鼠巨细胞病毒全基因序列(GenBank:⑶305914.1)的第184336至182946位的核苷酸序列的互补序列。由上述pMCMV IE启动子、禽流感病毒血凝素HA基因及终止信号序列组成了禽流感病毒血凝素(HA)基因表达盒(SEQ ID No:l)，结构示意图如图3所示。禽流感病毒血凝素(HA)基因表达盒经人工合成而得。
[0047]以人工合成的禽流感病毒血凝素(HA)基因表达盒DNA为模板，以Primer HAcassette F和Primer HA cassette R引物,采用梯度PCR方法扩增禽流感病毒血凝素(HA)基因表达盒。
[0048]Primer HA cassette F (SEQ ID NO:10): 5’-TATCCCGGGAACTCCGCCCGTTTTATGAC-3，；
Primer HA cassette R (SEQ ID NO:11): 5’-ATACCCGGGTTGTCGACTCTAGAGGATCC-3’。
[0049]梯度PCR 方法的反应体系为:10 X PCR Buffer 5 μ L、dNTPs (2.5 mM each) 4μ L,Mg2+(25 mM) 3μ L，上、下游引物(10 pmol/μ L)各 2 μ UExTaq 酶 0.5yL、DNA 模板 2 μ L,dd H2O 31.5yL (PCR试剂来自Takara公司)。反应程序:94°C预变性3 min ；94°C变性30 sec, 480C 退火 40sec，72°C 延伸 3min40 sec，循环 10 次；然后 94°C 变性 30 sec, 58°C退火40sec，72°C延伸3min40 sec，循环27次；最后72°C延伸10 min。
[0050]反应结束后，取PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，扩增片段长度为3357bp，回收扩增片段。将扩增片段与pUC19-Hl-H2(DEV UL55)质粒DNA分别应用Sma I限制性内切酶进行酶切，应用T4连接酶进行连接，获得禽流感病毒血凝素(HA)基因转移载体pDEV-Ηδ (UL55)。最后通过基因测序验证所获得的转移载体pDEV_H5 (UL55)是正确的克隆。将pDEV-H5 (UL55)转化感受态细胞DH5 α，获得重组细胞。
[0051]实施例4、禽流感病毒血凝素(HA)基因重组鸭病毒性肠炎病毒的获得与鉴定
按照常规方法制备和培养原代及次代CEF，细胞长成单层后，取GFP基因重组鸭病毒性肠炎病毒rDEV-GFP株按感染复数为0.05接种细胞，培养约72 h，待95%细胞出现病变时收取细胞，按照常规方法提取病变细胞中病毒DNA，调整DNA浓度至0.1?0.2 μ8/μ?。用碱裂解法从重组细胞中提取禽流感病毒血凝素HA基因转移载体pDEV-H5 (UL55)，调整DNA浓度至700 ng/^L。按照常规磷酸钙转染法进行转染，将5 μg pDEV_H5 (UL55)的DNA与2Kg GFP基因重组鸭病毒性肠炎病毒rDEV-GFP株的DNA共转染原代CEF进行同源重组。次日吸除培养液，加入含10%胎牛血清甲基纤维素培养基覆盖，继续培养24-48 h后，在波长为488nm紫外光激发下寻找不发出绿色荧光的重组鸭病毒性肠炎病毒蚀斑，挑取不发出绿色荧光的蚀斑接种新鲜CEF，如此重复数个循环，直至病毒纯化成功，获得禽流感病毒血凝素(HA)基因重组鸭病毒性肠炎病毒DEV-H5 ULwf株。提取DEV-H5 ULwf株的DNA，按实施例 3 方法，应用 Primer HA cassette F 和 Primer HA cassette R 进行 PCR 扩增 HA 表达盒，测序验证结果表明所插入序列与合成序列一致。
[0052]实施例5、重组鸭病毒性肠炎病毒DEV-H5 ULwf株表达HA基因的检测
应用间接免疫突光试验(Indirect Immunofluorescence test, IIF)检测重组病毒DEV-H5 ULwf株株表达HA基因的情况。采用96孔板培养CEF，待细胞长成单层，取重组病毒DEV-H5 ULwf株,按每孔50?100个蚀斑形成单位(Plaque Forming Unit, PFU)的量接种，培养48?72小时，对培养物应用2%多聚甲醛进行固定处理后，首先加入H5N1禽流感血凝素HA的小鼠源单克隆抗体(金斯瑞)进行反应，然后加入带绿色荧光标记的羊抗鼠二抗(Alexa488, Invitrogen)进行反应,在波长为488nm紫外光激发下观察蚀斑是否发出绿色荧光，同时设鸭瘟鸡胚化弱毒株C-KCE株为对照。结果表明重组病毒DEV-H5 ULwf株的蚀斑能检测到发出荧光的蚀斑(图4)，而鸭瘟鸡胚化弱毒株C-KCE株的蚀斑不发出绿色荧光，说明DEV-H5 ULwf株中插入的HA基因表达盒能高效表达HA抗原。
[0053]实施例6、重组病毒DEV-H5 ULwf株的生长特性
取重组病毒DEV-H5 ULwf株与未本毒鸭痕鸡胚化弱毒株C-KCE株,进行多步法生长动力学检测。按0.01的病毒感染复数(multiplicity of infect1n, MOI)，将两种病毒分另Ij接种于长成单层的原代或次代CEF，在感染前和感染后的6h，12h，24h，36h，48h和72h小时检测培养物上清中和细胞结合性病毒的效价TCID5tlt5培养物上清中病毒滴度的测定(文献I:Wang Jj Osterrieder N.Generat1n of an infect1us clone of duck enteritisvirus and generat1n of a vectored DEV expressing hemagglutinin of H5N1 avianinfluenza virus[J].Virus Research, 2011 159(1): 23-31.):在指定的时间点取0.1mL的上清样品，375G离心5分钟取上清进行检测。细胞结合性病毒的滴度测定(检测方法参考文献I):在指定的时间点将感染细胞的上清吸除，用PBS洗涤两次后加入ImL营养液，将感染细胞刮下经3次冻融后375G离心5分钟取上清进行检测。病毒滴度的检测与计算方法(检测方法参考文献I):采取10倍稀释法，接种CEF吸附2小时后吸出病毒液，加入新鲜的培养液，培养7天后观察结果，所有试验重复3次，按Reed和Muench法计算TCID5(I。结果如图5，可以看出重组病毒DEV-H5 ULwf株与亲本毒生长特性一致，禽流感病毒血凝素(HA)基因表达盒替换LORFll和UL55基因之间的间隔区第263至291位的核苷酸片段，不影响病毒的生长、繁殖。
[0054]实施例7、重组病毒DEV-H5 ULwf株的稳定性
将重组病毒DEV-H5 ULwf株在CEF上连续传代40代后，对第40代的重组病毒进行禽流感病毒血凝素HA基因表达盒的PCR检测，测定序列，同时采用间接免疫荧光试验检测其HA的表达情况。PCR检测按实施例3相同的方法，反应结束后进行电泳，可在紫外灯照射下观察到长度3357bp的扩增片段，回收后进行序列测定，结果表明与传代前完全一致。按实施例5相同的方法进行间接免疫荧光试验，检测重组病毒DEV-H5 ULwf株表达HA的情况，结果表明重组病毒蚀斑能100%检测到特异性荧光。以上结果表明重组病毒DEV-H5 ULwf株能在CEF上稳定传代40代以上，其外源基因不发生丢失或变异，说明重组病毒具有较好的稳定性。
[0055]实施例8、重组病毒DEV-H5 ULwf株对鸭的安全性和免疫效力
取重组病毒DEV-H5 ULwf株种毒，按0.01 MOI接种于长成单层的原代或次代CEF，培养基为含10%胎牛血清，100U/mL青霉素和100U/mL链霉素的EMEM (B1chrom公司)。在感染后的72h小时收毒，将上清和细胞培养物一起进行3次冻融，然后375G离心5分钟，取上清液作为重组病毒DEV-H5 ULwf株毒液，分装后置_70°C保存，并标定病毒的TCID5(I。TCID50是 1(Γ6 34/0.ImL0
[0056]取重组病毒DEV-H5 ULwf株毒液，按每羽份16 TCID5tl量，肌肉接种I日龄健康商品鸭10只，同时设10只相同日龄的鸭只为对照，观察鸭只精神，饮食和发病与死亡情况，至接种后14天。结果表明对照鸭只和接种鸭只精神正常，饮食正常，无发病和死亡，安全性
100% O
[0057]取重组病毒DEV-H5 ULwf株毒液，按每羽份16 TCID50量，肌肉接种4?5周龄健康商品鸭10只，在接种后3天、3周和6周应用1000MLD的鸭瘟病毒强毒AV1221株病毒液(来自中国兽医监察所的标准强毒)进行攻毒保护试验。结果表明重组病毒DEV-H5 ULwf株接种后3天、3周和6周对鸭瘟病毒强毒攻击的保护率均为100% (图6)。
[0058]实施例9、重组病毒DEV-H5 ULwf株对鸡的安全性和免疫效力
取重组病毒DEV-H5 ULwf株毒液，按每羽份16 TCID50量，肌肉接种4飞周龄健康商品蛋鸡10只，观察鸡只精神，饮食和发病与死亡情况；另外，在接种前和接种后1、2、3、4、5和6周采血分离血清，检测其抗禽流感病毒(Η5) HI抗体效价(试剂盒来自哈尔滨维科生物技术开发公司)。设鸭瘟鸡胚化弱毒株C-KCE株活疫苗免疫组为对照。结果表明，重组病毒DEV-H5 ULwf株免疫组和C-KCE株活疫苗免疫组的SPF鸡均无发病与死亡，精神和饮食均正常，接种后2周，DEV-H5 ULwf株免疫组禽流感(Η5) HI效价平均值达到41og2，达到合格线以上，到4周时达到峰值8.1log2 (图7)，C-KCE株活疫苗免疫组未检出HI抗体。抗体合格线是41og2。
【权利要求】
1.禽流感病毒血凝素基因，其核苷酸序列为SEQID NO:1的第1437至3131位核苷酸。
2.重组鸭病毒性肠炎病毒,在鸭病毒性肠炎病毒基因组的LORFll和UL55基因之间的间隔区中插入了含有权利要求1所述基因的表达盒。
3.根据权利要求2所述重组鸭病毒性肠炎病毒，其特征在于所述表达盒中的启动子为pMCMV IE启动子。
4.根据权利要求2或3所述重组鸭病毒性肠炎病毒，其特征在于所述表达盒替换了UL55与LORFll基因之间的间隔区第263至291位的核苷酸片段。
5.权利要求2所述重组鸭病毒性肠炎病毒的构建方法，采用同源重组方法将含有权利要求I所述基因的表达盒插入鸭病毒性肠炎病毒基因组的LORFll和UL55基因之间的间隔区。
6.根据权利要求5所述重组鸭病毒性肠炎病毒的构建方法，其特征在于含有权利要求1所述基因的表达盒插入鸭病毒性肠炎病毒的方法包括如下步骤: (1)确定鸭病毒性肠炎病毒基因组的UL55与LORFll基因之间的间隔区中待替换片段，分别扩增待替换片段上游和下游的核苷酸片段，得到上游同源臂和下游同源臂；将表达绿色荧光蛋白的表达盒和表达权利要求1所述基因的表达盒分别插入上游同源臂和下游同源臂之间，分别得到同源重组片段A和同源重组片段B ； (2)鸭病毒性肠炎病毒的基因组DNA与同源重组片段A进行同源重组，挑选在紫外光下发出绿色荧光的重组病毒，获得重组病毒C ； (3 )同源重组片段B与重组病毒C的基因组DNA进行同源重组，挑选在紫外光下不能发出绿色荧光的重组病毒，得到携带有禽流感病毒血凝素基因表达盒的重组鸭病毒性肠炎病毒。
7.以权利要求之1-6所述重组鸭病毒性肠炎病毒为活性成分的活疫苗。
【文档编号】A61K39/145GK104357460SQ201410627072
【公开日】2015年2月18日 申请日期:2014年11月10日 优先权日:2014年11月10日
【发明者】王继春, 许梦微, 王志胜, 乔永峰, 侯继波 申请人:江苏省农业科学院