放射性核素标记的新型生长抑素类似物分子探针及其应用的制作方法
【专利摘要】本发明提供了一种放射性核素标记的新型生长抑素类似物分子探针及其应用，属于放射性药物标记和核医学【技术领域】。本发明以双功能螯合剂偶联环状多肽帕瑞肽(Pasireotide)，再以放射性核素对其进行标记得到放射性核素标记的神经内分泌肿瘤特异性生长抑素类似物的放射性分子探针，其能够与肿瘤表达的生长抑素受体(SSTR)结合，通过核医学手段能够准确定位SSTR阳性的肿瘤组织，达到疾病靶向分子影像诊断、治疗的目的。本发明所合成的分子探针对SSTR有更高的亲和力和功能活性，有望成为具良好前景的生长抑素类似物显像剂及肿瘤治疗剂。
【专利说明】放射性核素标记的新型生长抑素类似物分子探针及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及放射性药物标记和核医学【技术领域】，特别是涉及一种放射性核素标记 的分子探针及其应用。
【背景技术】
[0002] 随着核医学的发展，分子影像特别是正电子发射计算机断层显像（PET)的应用 在肿瘤诊断和治疗方面显示出了巨大的潜能和优势。神经内分泌肿瘤是一组起源于肽能 神经元和神经内分泌细胞的异质性肿瘤，大多数神经内分泌肿瘤细胞表达生长抑素受体 (SSTR)，目前正电子放射性核素 68Ga标记生长抑素类似物用于神经内分泌肿瘤显像在临床 上应用广泛，其有助于肿瘤的早期诊断及预后评估等。 mLu的半衰期为6. 7天，不仅发射 β_射线，同时还发射γ射线，其在核医学治疗领域的药物研宄非常广泛。采用放射性核素 mLu标记生长抑素类似物对SSTR阳性肿瘤的治疗有非常积极的意义。
[0003] 生长抑素在中枢内分泌系统和脑外组织分布广泛，是调节组织内外分泌的重要环 肽激素家族，通过与靶细胞的SSTR(即SSTR1-5)结合发挥作用。肿瘤细胞组织上常有一些 SSTR的过度表达，如在神经内分泌肿瘤（胃肠胰神经内分泌肿瘤、垂体瘤、嗜铬细胞瘤等） 和神经系统肿瘤（神经母细胞瘤、脑膜瘤等）中都有SSTR的过表达。研宄表明生长抑素及 其类似物具有抗肿瘤活性，不仅能阻滞肿瘤细胞周期，诱导肿瘤细胞调亡，还能抑制肿瘤血 管生成并拮抗其促肿瘤生长的作用。
[0004] 经典的生长抑素类似物如奥曲肽（Octreotide)和兰乐肽（Lanreotide)等其已广 泛用于神经内分泌肿瘤、甲状腺癌、胃肠道肿瘤等生长抑素阳性肿瘤的诊断和治疗。然而 这两种类似物在临床应用上也有局限性，文献中报道奥曲肽只对SSTR2有较高的亲和力， 对SSTR1、3、4、5亲和力不高，然而有约30% SSTR阳性表达肿瘤表达非SSTR2,而是表达 SSTR1、3、4、5受体，用奥曲肽生长抑素受体显像可能会造成这些肿瘤诊断漏诊。临床大样本 调查也显示奥曲肽生长抑素显像的阳性诊断率仅约70%，奥曲肽的单一显像结果使本领域 需要制备更加广谱的更好的生长抑素类似物用于SSTR阳性肿瘤的诊断和治疗。
[0005] 从多肽结构来看，帕瑞肽（Pasireotide)整体结构是一个大的十八碳酰胺环，与 奥曲肽的二巯基结构相比，必然表现出更好的整体结构稳定性，且没有裸露的酚羟基或者 醇羟基，进一步保证了其化学结构的稳定性。研宄报道帕瑞肽是一种代谢稳定、与SSTR亲 和力更高的生长抑素类似物，其对诊断和治疗生长抑素阳性肿瘤有更有效的效果。帕瑞肽 不仅对SSTR2有较好的亲和力，其与SSTR1、3、5的亲和力分别超过奥曲肽的30倍、5倍和 39倍，且其SSTR1、3、5的功能活性表达分别超过奥曲肽的30倍、11倍和158倍。帕瑞肽在 治疗库欣病、肢端肥大症、无功能性垂体腺瘤、神经内分泌肿瘤及其它SSTR过表达的实体 瘤方面都比奥曲肽和兰乐肽更加有效。放射性核素标记的帕瑞肽的放化合成，为开发生长 抑素类似物用于SSTR阳性肿瘤诊断和治疗奠定了基础。
【发明内容】
[0006] 本发明的第一个目的在于提供一种放射性核素标记的新型生长抑素类似物分子 探针。
[0007] 本发明的第二个目的在于提供放射性核素标记的新型生长抑素类似物分子探针 在生长抑素受体高表达肿瘤诊断及治疗中的应用。
[0008] 本发明提供的放射性核素标记的分子探针，其是以双功能螯合剂偶联环状多肽帕 瑞肽，再以放射性核素对其进行标记得到。
[0009] 所述双功能螯合剂为NCS-Bz-DOTA、NCS-Bz-DTPA或NCS-Bz-NOTA ;所述环状多肽 帕瑞肽为环二氨基乙基氨基甲酰[HyPro-Phg-D-Trp-Lys-Tyr(Bzl)-Phe]。
[0010] 所述放射性核素选自68Ga，177Lu，18F， 64Cu，99nTc或mIn。本发明提供了上述分子探 针在制备神经内分泌肿瘤诊断显像剂中的应用。
[0011] 本发明提供了上述分子探针在制备神经内分泌肿瘤生长抑素受体高表达靶向治 疗药物中的应用。
[0012] 本发明还提供了制备上述核素标记的分子探针的方法，含有以下步骤：
[0013] (1)对生长抑素类似物帕瑞肽（Pasireotide)进行BCA修饰；所述的BCA修饰 为保留其中1个含正丁胺结构的基因，对另外1个短链的伯胺进行蛋白修饰，用BCA中 的NCS-Bz-DOTA、NCS-Bz-DTPA或NCS-Bz-NOTA进行修饰，得到标记前体DOTA-帕瑞肽、 DTPA-帕瑞肽或NOTA-帕瑞肽；
[0014] (2)应用放射性核素对DOTA-帕瑞肽进行标记，所述放射性核素选自68Ga， mLu， 18F，64Cu，99niTc 或 mIn。
[0015] 上述方法中，当放射性核素为68Ga时，制备方法为：对制备得到的DOTA-帕瑞肽进 行 68Ga核素的标记，向浓度为5mg/mL的2 μ L标记前体DOTA-帕瑞肽中顺序加入19. 5 μ L 1111〇1/1的似4(3,92.51^9的6863(：13洗脱液，80?110°〇反应15-301^11，标记率小于90%时， 用S印-pak C18柱分离纯化，得到68Ga-DOTA-帕瑞肽。
[0016] 优选地，100°C反应 20min。
[0017] 所述用Sep-pak C18柱分离纯化的方法为，Sep-pak柱用5mL无水乙醇和5mL高 纯水活化，之后用3mL生理盐水洗脱出放射性杂质，用0. 8mL 80 %乙醇洗脱出目标化合物 68Ga-DOTA-帕瑞肽，用HPLC测定标记率及放射化学纯度，结果显示制得的 68Ga-DOTA-帕瑞 肽放射化学纯度大于95%。
[0018] 当放射性核素为mLu时，制备方法为：对制备得到的DOTA-帕瑞肽进行 mLi!核 素的标记，取I. OmL浓度为0· 05mol/L的盐酸溶液，加入65 μ L lmol/L的NaAc，调节pH至 4. 0,作为反应的NaAc缓冲液，取出200 μ L上述缓冲液，向其中顺序加入2 μ L浓度为5mg/ mL的标记前体DOTA-帕瑞肽、14. 8MBq的mLuCV冼脱液，80?110°C反应15-30min，得到 mLu-DOTA-帕瑞肽。若标记率小于90 %时，用S印-pak C18柱分离纯化，得到mLu-DOTA-帕 瑞肽。优选地，l〇〇°C反应20min。
[0019] Sep-pak柱用5mL无水乙醇和5mL高纯水活化，之后用3mL生理盐水洗脱出放射性 杂质，用0. 8mL 80 %乙醇洗脱出目标化合物mLu-DOTA-帕瑞肽，用HPLC测定标记率及放射 化学纯度，结果显示制得的 mLu-DOTA-帕瑞肽放射化学纯度大于95%。
[0020] 本发明还提供了一种用于诊断生长抑素受体高表达肿瘤的显像剂，其含有本发明 所述的放射性核素标记的分子探针。
[0021] 本发明提供了一种用于生物靶向治疗生长抑素受体高表达肿瘤的药物，其含有本 发明所述的放射性核素标记的分子探针。
[0022] 68Ga-DOTA-帕瑞肽的体外稳定性显示，其在PBS、NaAc和5% HSA中2h时间内均能 保持良好的稳定性，Radio-HPLC检测其放化纯度保持在95%以上。
[0023] 68Ga-DOTA-帕瑞肽的PET显像显示，68Ga-DOTA-帕瑞肽能够准确定位SSTR阳性肿 瘤，并在HT29荷结肠癌裸鼠肿瘤部位的摄取随着时间的延长而增加。
[0024] 借由上述技术方案，本发明放射性核素标记的分子探针至少具有下列优点及有 益效果：其能够与肿瘤表达的生长抑素受体（SSTR)结合，通过核医学手段能够准确定位 SSTR阳性的肿瘤组织，达到疾病靶向分子影像诊断、治疗的目的。本发明通过放射性核素 对DOTA-帕瑞肽、DTPA-帕瑞肽或NOTA-帕瑞肽等标记前体进行标记的各种优化条件的筛 选，确定了最佳的条件参数，即标记前体的总质量：发明人经过反复实验发现标记前体的最 佳质量为 〇· Olmg (2 μ LX 5mg/mL = 0· Olmg)，分别对应 19. 5 μ L lmol/L 的 NaAc，92. 5MBq 的 686&(：13洗脱液和200 μ L配制的NaAc缓冲液，14. 8MBq的17111(：13洗脱液时，能够实现标记 效率的最大化，对于上述定量的放射性核素，当标记前体质量小于〇. Olmg时，标记效率降 低，当标记前体质量大于〇. Olmg时，标记效率不明显增高，但由于标记前体成本较高，这必 然会增加本发明的成本，导致不必要的浪费，因此从标记率和节约成本两方面考虑，本发明 确定了上述标记放射性核素的标记前体最佳质量为〇. Olmg。本发明所合成的分子探针对 SSTR有更高的亲和力和功能活性，可用于SSTR阳性肿瘤的定位诊断和核医学显像，有望成 为具良好前景的生长抑素类似物显像剂及肿瘤治疗剂。
【专利附图】
【附图说明】
[0025] 图I. mLu-DOTA-帕瑞肽在正常小白鼠中的体内分布图。
[0026] 图2.68Ga-DOTA-帕瑞肽在正常小白鼠中的体内分布图。
[0027] 图3.68Ga-DOTA-帕瑞肽标记化合物的体外稳定性分析图。
[0028] 图4.在人结肠癌（HT29)种植的BALB/c裸鼠静脉注射18. 5MBq68Ga-D0TA_帕瑞肽 的PET显像图，其中A图为注射68Ga-DOTA-帕瑞肽后2h显像，B图为4h显像，C图为空白 对照显像。白色箭头所示方向为肿瘤。显示生长抑素受体阳性肿瘤对 68Ga-DOTA-帕瑞肽有 较高的摄取，并且随着时间延长，摄取量增加。
【具体实施方式】
[0029] 以下实施例进一步说明本发明的内容，但不应理解为对本发明的限制。在不背离 本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明 的范围。
[0030] 若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。
[0031] 实施例1
[0032] (1)对生长抑素类似物帕瑞肽进行BCA修饰，保留其中1个含正丁胺结构的基因， 对另外1个短链的伯胺进行多肽修饰，用苄基异硫氰-1，4,7-三氮杂环九烷-1，4,7-三羧 酸（NCS-Bz-DOTA)或 NCS-Bz-DTPA，NCS-Bz-NOTA 等双功能螯合剂修饰后，进行 68GaOV2 = 68min ; β +: I. 9MeV)或 mLu(T1/2= 6. 7d ; β _:0· 497MeV)等放射性放射性核素显像。形成 SSTR靶向分子探针，可以进行神经内分泌肿瘤的诊断、治疗等研宄。
[0033] (2)前述的68Ga标记新型生长抑素类似物及其制备方法，向2 yL的标记前体 DOTA-帕瑞肽（5mg/mL)中顺序加入 19. 5 yL NaAc(ImoVL)，92. 5MBq 的 68GaCV冼脱液， 100°C反应20min，标记率小于90%时，用Sep-pak C18柱分离纯化，Sep-pak柱用5mL无水 乙醇和5mL高纯水活化，之后用3mL生理盐水洗脱出放射性杂质，用0. 8mL 80 %乙醇洗脱出 目标化合物68Ga-DOTA-帕瑞肽，用HPLC测定标记率及放射化学纯度。
[0034] (3)前述的mLu标记新型生长抑素类似物及其制备方法，取I. OmL HCl (0. 05mol/ U加入到65 μ L的NaAc (lmol/L)中，调节pH至4. 0左右，作为反应的NaAc缓冲液，取出 200 μ L上述缓冲液，向其中顺序加入2 μ L的标记前体DOTA-帕瑞肽（5mg/mL)，14. 8MBq 的1771^1(：13洗脱液，100°〇反应201^11，标记率小于90%时，用3印-? &1^(：18柱分离纯化， Sep-pak柱用5mL无水乙醇和5mL高纯水活化，之后用3mL生理盐水洗脱出放射性杂质，用 0. 8mL80 %乙醇洗脱出目标化合物mLu-DOTA-帕瑞肽，用HPLC测定标记率及放射化学纯 度。
[0035] (4)标记率的测定采用高效液相色谱分析（HPLC)分析，分析条件：YMC-Pack ODS-A柱，l.OmL/min ;0. 1%三氟乙酸（TFA)水溶液（A)，0. 1%三氟乙酸（TFA)乙腈溶液 (C) ;0-10min (C) :20%-80 %。结果显示68Ga-DOTA-帕瑞肽标记率大于65%，放化纯度大 于95% ;mLu-D0TA-帕瑞肽标记率及放射化学纯度均大于95%。
[0036] (5) mLu-DOTA-帕瑞肽在正常小白鼠体内的分布实验，取25g左右的BALB/c小白 鼠，尾静脉注射I. 13MBq/200 μ L的mLu-DOTA-帕瑞肽，分别于0. 5h，3h，24h处死。分别取 血、心、肝、脾、肾、肺、胃、小肠、大肠、肌肉、骨、脑测定其放射性计数及相应的重量，经过衰 减校正，计算％ ID/g，具体结果见图1。
[0037] (6) 68Ga-DOTA-帕瑞肽在正常小白鼠中的体内分布，取18g左右的KM小白鼠，尾静 脉注射I. llMBq/200 μ L的68Ga-DOTA-帕瑞肽，分别于0· 5h，I. 5h，4h处死。分别取血、心、 肝、脾、肾、肺、胃、小肠、大肠、肌肉、骨、脑测定其放射性计数及相应的重量，经过衰减校正， 计算％ ID/g，具体结果见图2。
[0038] (7)68Ga-DOTA-帕瑞肽标记化合物的体外稳定性分析，分别取20 μ L(I. 3MBq)分 离样品 68Ga-DOTA-帕瑞肽加入到 300 yL PBS(pH = 7. 4)和 300 yL 0· lmol/L NaAc(pH =5. 5)缓冲溶液中，置于室温30°C条件下孵育，在1〇11^11，3〇1^11，111和211时分别取出 25 μ L，30 μ L，40 μ L，55 μ L溶液进行Radio-HPLC监测；配置5 %人血清（HSA)溶液，分别 向 ImL 5 % HSA 中加入 50 μ L (3. 25MBq，IOmin 稳定性），60 μ L (3. 9MBq，30min 稳定性）， 80 μ L (5. 2MBq，Ih稳定性），100 μ L (6. 5MBq，2h稳定性）分离样品68Ga-DOTA-帕瑞肽，于室 温30°C条件下孵育。分别于10min，30min，Ih和2h时向其中加入ImL乙腈沉降蛋白，离心 得300 μ L上清液，分别取60 μ L进行Radio-HPLC监测。具体结果见图3。稳定性结果表明 68Ga-DOTA-帕瑞肽在120min时间内分别在NaAc、HSA和PBS溶液中都保持较好的稳定性， 放化纯度都大于94%。
[0039] (8) 68Ga-DOTA-帕瑞肽在动物体内的PET显像图，取右上肢腋下种植人结肠癌HT29 细胞的BALB/c裸鼠（10周龄），肿瘤直径I. 0-2. 0cm，通过尾静脉注射12. 95MBq的分离后 标记产物68Ga-DOTA-帕瑞肽0. 3mL，分别于注射后2h和4h进行PET显像。Block对照组裸 鼠则是在通过尾静脉注射入相同放射性活度的68Ga-DOTA-帕瑞肽和100 μ L奥曲肽（IOmg/ mL)，4h时进行显像。显像前将裸鼠在Summit AS-1-000-7小动物麻醉系统中用混有3% (体积分数）异氟烷的氧气麻醉，显像过程中维持含1% (体积分数）异氟烷的氧气麻醉， 显像时间为15min。具体结果见图4。
[0040] 结果表明放射性核素68Ga标记的帕瑞肽放化纯度很高并具有较好的体外稳定性， Micro-PET显像结果显示生长抑素受体阳性肿瘤对68Ga-DOTA-帕瑞肽有较高的摄取，并且 随着时间延长，摄取量增加。放射性核素 mLu标记的帕瑞肽有较高的标记率和放化纯度，为 生长抑素受体阳性肿瘤治疗提供较好的基础。其余放射性核素包括 18F，64Cu，99nTc，mIn的 标记及生物学评价也取得了与上述 68Ga、mLu类似的效果。
[0041] 虽然，上文已经用一般性说明、【具体实施方式】及试验，对本发明作了详尽的描述， 但在本发明基础上，可以对之做出一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见 的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的 范围。
【权利要求】
1. 放射性核素标记的新型生长抑素类似物分子探针，其特征在于，其是以双功能螯合 剂偶联环状多肽帕瑞肽，再以放射性核素对其进行标记得到。
2. 如权利要求1所述的分子探针，其特征在于，所述双功能螯合剂为NCS-Bz-DOTA、 NCS-Bz-DTPA或NCS-Bz-NOTA ;所述环状多肽帕瑞肽为生长抑素类似物，其化学名为环二氨 基乙基氨基甲酰。
3. 如权利要求1所述的分子探针，其特征在于，所述放射性核素选自68Ga，177Lu，18F，
4. 权利要求1-3任一所述的分子探针在制备神经内分泌肿瘤诊断显像剂中的应用。
5. 权利要求1-3任一所述的分子探针在制备神经内分泌肿瘤生长抑素受体高表达靶 向治疗药物中的应用。
6. 制备权利要求1-3任一所述的分子探针的方法，其特征在于，含有以下步骤： (1)对生长抑素类似物帕瑞肽进行BCA修饰；所述的BCA修饰为保留其中1个含正丁胺 结构的基因，对另外1个短链的伯胺进行蛋白修饰，用BCA中的NCS-Bz-DOTA、NCS-Bz-DTPA 或NCS-Bz-NOTA进行修饰，得到标记前体D0TA-帕瑞肽、DTPA-帕瑞肽或N0TA-帕瑞肽； ⑵应用放射性核素对标记前体进行标记，所述放射性核素选自68Ga，mLu，18F， 64Cu， "mTc 或 mIn。
7. 如权利要求6所述的方法，其特征在于，放射性核素为68Ga时，制备方法为：向浓度 为5mg/mL的2 y L标记前体D0TA-帕瑞肽中顺序加入19. 5 y L lmol/L的NaAc，92. 5MBq的68GaCV冼脱液，80?110°C反应15-30min，标记率小于90%时，用S印-pak C18柱分离纯 化，得到68Ga-D0TA-帕瑞肽。
8. 如权利要求6所述的方法，其特征在于，放射性核素为177Lu时，制备方法为：取 1. OmL浓度为0? 05mol/L的盐酸溶液，加入65 y L lmol/L的NaAc，调节pH至4. 0,作为反应 的NaAc缓冲液，取出200 y L上述缓冲液，向其中顺序加入2 y L浓度为5mg/mL的标记前体 D0TA-帕瑞肽中 14. 8MBq 的 1771^13洗脱液，80 ?110°C反应 15-30min，得到 mLu-D0TA-帕 瑞肽。
9. 一种用于诊断生长抑素受体高表达肿瘤的显像剂，其特征在于，含有权利要求1-3 任一所述的分子探针。
10. -种用于生物靶向治疗生长抑素受体高表达肿瘤的药物，其特征在于，含有权利要 求1-3任一所述的分子探针。
【文档编号】A61K49/00GK104491890SQ201410676582
【公开日】2015年4月8日 申请日期:2014年11月21日 优先权日:2014年11月21日
【发明者】杨志, 刘菲, 朱华 申请人:北京肿瘤医院