重组创伤弧菌基因vvhA的迟缓爱德华菌菌蜕及构建的制作方法
【专利摘要】一种重组创伤弧菌基因vvhA的迟缓爱德华菌菌蜕及构建，属于基因工程领域，它包括(1)克隆噬菌PhiX174溶菌基因与创伤弧菌溶细胞素基因vvhA(2)构建溶菌质粒载体p-E-OmpK(3)迟缓爱德华菌的转化和筛选(4)菌脱的获得。本发明构建的表达创伤弧菌溶细胞素基因vvhA免疫保护抗原基因vvhA的重组迟缓爱德华菌菌蜕疫苗，具有对迟缓爱德华菌和创伤弧菌的共同免疫保护效果。
【专利说明】重组创伤弧菌基因 vvhA的迟缓爱德华菌菌蜕及构建
【技术领域】
[0001] 本发明属于基因工程领域，具体地涉及一种展示创伤弧菌溶细胞素基因 vvhA的 重组迟缓爱德华菌菌蜕及构建方法。
【背景技术】
[0002] 细菌菌蜕是通过调控噬菌体PhiX174的裂解基因 E在革兰氏阴性细菌中表达而形 成的无细胞浆和繁殖能力的细菌空壳，包含细菌原有LPS、类脂、肽聚糖等天然的免疫刺激 复合物，无须使用佐剂就能诱导更强的免疫反应。因此，菌蜕不仅可以直接作为疫苗使用， 而且还可作为递呈异源抗原的重组疫苗及作为核酸疫苗甚至药物的递送载体。本发明旨在 建立迟缓爱德华菌菌蜕作为创伤弧菌溶细胞素基因 vvhA的递送载体制备的方法及免疫保 护应用。
【发明内容】
[0003] 本发明要解决的技术问题是提供一种
[0004] 重组创伤弧菌（Vibrio vulnificus)基因 vvhA的迟缓爱德华菌菌脱及构建方法
[0005] 本发明提供一种重组创伤弧菌基因 vvhA的迟缓爱德华菌菌蜕。
[0006] 本发明提供一种重组创伤弧菌基因 VVhA的迟缓爱德华菌菌蜕的构建方法，步骤 如下：
[0007] (1)克隆噬菌PhiX174溶菌基因与创伤弧菌溶细胞素基因 vvhA，所述的噬菌 PhiX174溶菌基因简称E基因，所述的创伤弧菌溶细胞素基因 vvhA简称vvhA基因；
[0008] (2)构建溶菌质粒载体p-E-vvhA
[0009] 根据噬菌体PhiX174溶菌基因和创伤弧菌溶细胞素基因 vvhA的序列设计引物， 上、下游引物末端分别引入限制性酶切位点EcoRI和BamHI，并在E基因下游引物和vvhA 基因上游引物中加上I inker序列；并以人工合成的E基因和vvhA基因为模板分别进行PCR 扩增，回收目的片段，并以纯化后的目的片段为模板，以E基因上游引物和vvhA基因下游引 物进行第二次扩增，将E基因和vvhA基因片段连接到一起，用试剂盒纯化PCR产物得到融 合基因片段E-whA ;用BamHI和EcoRI双酶切融合基因片段E-whA，经0. 8%琼脂糖凝胶 电泳后割胶回收各片段，回收后的片段与经相同双酶切并割胶回收的PBV220大片段连接 转化ToplO感受态细胞，用E基因上游引物和vvhA基因下游引物对转化后培养生长的菌落 进行PCR筛选，所得阳性克隆送公司进行测序鉴定正确后，溶菌质粒载体命名为p-E-vvhA， 并用质粒提取试剂盒提取溶菌质粒载p-E-vvhA ;
[0010] 所述的 E 基因上游引物 EcoRI-E-F :5' GAGGAATTCATGGTACGCTGGACTTTG-3',
[0011] 所述的E基因下游引物Iinker-E-R :5'
[0012] -CTGCCGCCACCGCCGCTTCCGCCACCGCCGCTTCCACCGCCACCCTCCTTCTGCACGTA-3，；
[0013] 所述的vvhA基因上游引物I inker-vvhA-F :
[0014] 5，GTGGCGGTGGAAGCGGCGGTGGCGGAAGCGGCGGTGGCGGCAGCCCATTCGCCAGCAGTTAC-3，
[0015] 所述的vvhA基因下游引物BamHI-vvhA-R :
[0016] 5' -TTAGGGATCCCTAATCGCCTTCCCAATAC-3' ；
[0017] (3)迟缓爱德华菌的转化和筛选
[0018] 按照常规方法制备迟缓爱德华菌感受态细胞，迟缓爱德华菌冰浴lOmin，加入溶菌 质粒载体p-E-vvhA 10 μ L，冰浴30min，42°C热休克90s，冰浴l-2min，加入800 μ L不含抗 生素的胰蛋白胨大豆肉汤培养基液体培养基，28°C 80?lOOrpm/min振荡培养45min-lh， 12, OOO X g离心lmin，去部分上清，剩余40-50 μ L上清液重悬沉淀，重悬沉淀后的液体均匀 涂布于含终浓度为l〇〇ug/ml氨苄青霉素的胰酪胨大豆肉汤琼脂培养基平板上，28°C培养 过夜，所得阳性克隆即含溶菌质粒载体P-E-vvhA的迟缓爱德华菌；
[0019] (4)菌脱的获得
[0020] 将上述步骤转化筛选后的含溶菌质粒载体P-E-vvhA的迟缓爱德华菌接种在含 终浓度为l〇〇ug/ml氨苄青霉素的胰蛋白胨大豆肉汤培养基中，28°C、180rpm过夜震荡培 养，然后按照1 :1〇〇的体积比转接于含终浓度为l〇〇ug/ml氨苄青霉素的胰蛋白胨大豆肉汤 培养基中，28°C震荡培养至所述培养液的吸光值0D_nm达0. 3-0. 4后进行42°C培养，以诱 导E基因和vvhA基因表达，42°C培养诱导5小时后，离心收集菌体，用ddH20、PBS洗后收集 菌体，g卩菌蜕。
[0021] 进一步，所述步骤（2)的PCR扩增反应体系为：
[0022]
【权利要求】
1. 一种重组创伤弧菌基因vvhA的迟缓爱德华菌菌蜕。
2. 根据权利要求1所述的一种重组创伤弧菌基因vvhA的迟缓爱德华菌菌蜕的构建方 法，其特征在于它的步骤如下： (1) 克隆噬菌PhiX174溶菌基因与创伤弧菌溶细胞素基因whA，所述的噬菌PhiX174 溶菌基因简称E基因，所述的创伤弧菌溶细胞素基因vvhA简称vvhA基因； (2) 构建溶菌质粒载体p-E-vvhA 根据噬菌体PhiX174溶菌基因和创伤弧菌溶细胞素基因vvhA的序列设计引物，上、下 游引物末端分别引入限制性酶切位点EcoRI和BamHI，并在E基因下游引物和vvhA基因上 游引物中加上I inker序列；并以人工合成的E基因和vvhA基因为模板分别进行PCR扩 增，回收目的片段，并以纯化后的目的片段为模板，以E基因上游引物和vvhA基因下游引物 进行第二次扩增，将E基因和vvhA基因片段连接到一起，用试剂盒纯化PCR产物得到融合 基因片段E-whA ;用BamHI和EcoRI双酶切融合基因片段E-whA，经0. 8%琼脂糖凝胶电 泳后割胶回收各片段，回收后的片段与经相同双酶切并割胶回收的PBV220大片段连接转 化ToplO感受态细胞，用E基因上游引物和vvhA基因下游引物对转化后培养生长的菌落进 行PCR筛选，所得阳性克隆送公司进行测序鉴定正确后，溶菌质粒载体命名为p-E-vvhA，并 用质粒提取试剂盒提取溶菌质粒载p-E-vvhA ; 所述的 E 基因上游引物 EcoRI-E-F :5' GAGGAATTCATGGTACGCTGGACTTTG-3', 所述的E基因下游引物I inker-E-R :5' -CTGCCGCCACCGCCGCTTCCGCCACCGCCGCTTCCACCGCCACCCTCCTTCTGCACGTA-3' ； 所述的vvhA基因上游引物I inker-vvhA-F : 5. GTGGCGGTGGAAGCGGCGGTGGCGGAAGCGGCGGTGGCGGCAGCCCATTCGCCAGCAGTTAC-3 ' ； 所述的vvhA基因下游引物BamHI-vvhA-R : 5' -TTAGGGATCCCTAATCGCCTTCCCAATAC-3' ； (3) 迟缓爱德华菌的转化和筛选 按照常规方法制备迟缓爱德华菌感受态细胞，迟缓爱德华菌冰浴IOmin,加入溶菌质 粒载体P-E-vvhA 10 ii L，冰浴30min，42°C热休克90s，冰浴l-2min，加入800 ii L不含抗 生素的胰蛋白胨大豆肉汤培养基液体培养基，28°C 80?lOOrpm/min振荡培养45min-lh， 12, OOO X g离心lmin，去部分上清，剩余40-50 ii L上清液重悬沉淀，重悬沉淀后的液体均匀 涂布于含终浓度为lOOug/ml氨苄青霉素的胰酪胨大豆肉汤琼脂培养基平板上，28°C培养 过夜，所得阳性克隆即含溶菌质粒载体P-E-vvhA的迟缓爱德华菌； (4) 菌脱的获得 将上述步骤转化筛选后的含溶菌质粒载体P-E-vvhA的迟缓爱德华菌接种在含终浓度 为lOOug/ml氨苄青霉素的胰蛋白胨大豆肉汤培养基中，28°C、180rpm过夜震荡培养，然后 按照1 :1〇〇的体积比转接于含终浓度为lOOug/ml氨苄青霉素的胰蛋白胨大豆肉汤培养基 中，28°C震荡培养至所述培养液的吸光值0D 6(l(lnm达0. 3-0. 4后进行42°C培养，以诱导E基 因和vvhA基因表达，42°C培养诱导5小时后，离心收集菌体，用ddH20、PBS洗涤收集菌体， 即菌蜕。
3. 根据权利要求2所述的一种重组创伤弧菌基因vvhA的迟缓爱德华菌菌蜕的构建方 法，其特征在于所述步骤（2)的PCR扩增反应体系为：
4. 根据权利要求2所述的一种重组创伤弧菌基因vvhA的迟缓爱德华菌菌蜕的构建方 法，其特征在于所述步骤（2)的PCR扩增条件：95°C 5min ;94°C lmin，68°C 4min，共30个循 环；72°C IOmin ;用I %琼脂糖凝胶分离并回收相应的目的片段，各取I y L作模板，以E基因 上游引物和vvhA基因下游引物进行第二次扩增，将E基因和vvhA基因片段连接到一起，并 用试剂盒纯化PCR产物。
5. 根据权利要求2-4任何一项所述构建的重组创伤弧菌基因vvhA的迟缓爱德华菌菌 蜕。
【文档编号】A61P31/04GK104498524SQ201410853242
【公开日】2015年4月8日 申请日期:2014年12月31日 优先权日:2014年12月31日
【发明者】王雪鹏, 闫茂仓 申请人:山东农业大学, 浙江省海洋水产养殖研究所