高效液相色谱筛选核酸适配体的方法及核酸适配体和应用的制作方法

高效液相色谱筛选核酸适配体的方法及核酸适配体和应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种高效液相色谱筛选核酸适配体的方法及核酸适配体和应用，其中高效液相色谱筛选核酸适配体的方法，包括以下步骤：从随机文库RS36中筛选与多西紫杉醇特异性结合的核酸适体的核酸文库；采用高效液相色谱法筛选核酸文库得到核酸适配体；高效液相色谱法中，固定相为十八烷基硅烷键合硅胶色谱柱；流动相采用水-乙腈梯度洗脱；检测波长为260nm；检测器为二极管阵列检测器。按照高效液相色谱法筛选的核酸适配体具有能够与多西紫杉醇高特异性和高亲和力结合、无免疫原性、能够化学合成、生物相容性好、分子量小、稳定、易于保存等优点，可应用于药物载体、药物分离与纯化、制备多西紫杉醇检测探针或靶点探针等。
【专利说明】高效液相色谱筛选核酸适配体的方法及核酸适配体和应用

【技术领域】
[0001] 本发明涉及生物【技术领域】，具体涉及一种高效液相色谱法筛选核酸适配体的方 法，还涉及高效液相色谱法筛选得到的核酸适配体及核酸适配体的应用。

【背景技术】
[0002] 多西紫杉醇（Docetaxel)属于紫杉醇类抗肿瘤药，主要作用于细胞的微管蛋白从 而干扰细胞有丝分裂，起到抗肿瘤效果，其不良反应主要表现为过敏反应，血小板减少，心 动过速，低血压，神经毒性反应，胃肠道反应以及皮肤毒性反应等。多西紫杉醇水溶性小，市 售药物泰索帝采用吐温-80增溶，乙醇助溶，会增加代谢的肝脏负担并有可能引发过敏反 应、溶血反应等副作用。因此，如何降低泰索帝副作用、提高临床疗效已成为亟待解决的问 题。另外，由于多西紫杉醇的结构特性，使其摩尔吸光系数较低，难以运用简单的低成本光 谱方法进行高灵敏的微量定量分析。
[0003] 核酸适配体（aptamer)是通过指数富集配体的系统进化技术（SELEX)筛选得到 的，能特异结合祀物质的单链寡聚核苷酸（ssDNA或ssRNA)。核酸适配体与抗体功能类似， 但是与抗体相比具有更多的优势，如具有更高的亲和力与特异性，无免疫原性，能够化学合 成，成本低，可进行标记，稳定性好，易于保存等优点。核酸适配体的靶分子更为广泛，包括 金属离子、氨基酸、核酸、多肽、蛋白质等，并能从单一靶标扩展至完整的病毒颗粒及细胞等 复合物靶标。
[0004] 在目前常规的核酸适配体筛选方法中，需要对预富集的核酸文库进行测序，再从 大量的测序结果中挑选出亲和力高、选择性好的核酸适配体序列，这一过程存在耗时长、效 率低、成本高、难以实现自动化的问题。快速挑选多西紫杉醇核酸适配体的方法，将有望提 供一种高通量，低成本挑选多西紫杉醇的核酸适配体的方法。而且此方法也有望拓展于紫 杉醇、喜树碱等其他疏水性小分子药物的核酸适配体序列的挑选。


【发明内容】

[0005] 本发明要解决的技术问题是克服现有技术的不足，提供一种能高通量，低成本筛 选多西紫杉醇核酸适配体的方法，还相应提供了采用高效液相色谱法筛选得到的核酸适配 体，该核酸适配体能够与多西紫杉醇高特异性和高亲和力结合，具有无免疫原性、能够化学 合成、生物相容性好、分子量小、稳定、易于保存等优势，可应用于制备多西紫杉醇检测探 针、多西紫杉醇靶点探针；做为多西紫杉醇药物载体；提高多西紫杉醇的溶解能力；应用于 多西紫杉醇药物分离与纯化、多西紫杉醇药物制备、设计与开发等领域。
[0006] 为解决上述技术问题，本发明提供了一种高效液相色谱筛选核酸适配体的方法， 包括以下步骤：
[0007] (1)从随机文库RS36中筛选与多西紫杉醇特异性结合的核酸适体的核酸文库；随 机文库RS36具有SEQ ID NO. 1所述的核苷酸序列；
[0008] (2)采用高效液相色谱法筛选所述核酸文库得到核酸适配体；所述高效液相色谱 法中，固定相为十八烷基硅烷键合硅胶色谱柱；流动相采用水-乙腈梯度洗脱；检测波长为 260nm ;检测器为二极管阵列检测器。
[0009] 上述的方法，进一步的，所述步骤（2)中步骤（2)中所述高效液相色谱的流动相中 A相为水，B相为乙腈，所述梯度洗脱方法为：
[0010] Omin?5min，流动相为95v/v%的水和5v/v%的乙腈；
[0011] 5min?20min，流动相为95v/v%的水和5v/v%的乙腈勾速梯度改变至85v/v%的 水和15v/v%的乙腈。
[0012] 上述的方法，进一步的，所述步骤（2)中所述十八烷基硅烷键合硅胶色谱柱的柱 温为25°C。
[0013] 上述的方法，进一步的，所述步骤（2)中所述高效液相色谱的进样量为20 μ L。
[0014] 上述的方法，进一步的，所述步骤（1)中采用的5'引物为SEQ ID NO. 4所述的核 苷酸序列；采用的3'引物为SEQ ID NO. 5所述的核苷酸序列。
[0015] 作为一个总的技术构思，本发明还提供了一种上述方法筛选得到的核酸适配体， 所述核酸适配体的核苷酸序列包括以下四种序列中任意一种：
[0016] (I)SEQ ID NO. 2所述的核苷酸序列或SEQ ID NO. 3所述的核苷酸序列；
[0017] (2)与SEQ ID NO. 2所述的核苷酸序列或SEQ ID NO. 3所述的核苷酸序列的同源 性在60%以上的序列；
[0018] (3)与SEQ ID NO. 2所述的核苷酸序列或SEQ ID NO. 3所述的核苷酸序列进行杂 交的序列；
[0019] (4)与SEQ ID NO. 2所述的核苷酸序列或SEQ ID NO. 3所述的核苷酸序列转录的 RNA序列。
[0020] 作为一个总的技术构思，本发明还提供了一种上述的核酸适配体做为多西紫杉醇 药物载体中的应用。
[0021] 作为一个总的技术构思，本发明还提供了一种上述的核酸适配体在提高多西紫杉 醇溶解能力中的应用。
[0022] 作为一个总的技术构思，本发明还提供了一种上述的核酸适配体在制备多西紫杉 醇检测探针、多西紫杉醇靶点探针中的应用。
[0023] 作为一个总的技术构思，本发明还提供了一种上述的核酸适配体在多西紫杉醇药 物分离与纯化中的应用。
[0024] 作为一个总的技术构思，本发明还提供了一种上述的核酸适配体在多西紫杉醇药 物制备、设计与开发中的应用。
[0025] 当本发明的核酸适配体应用于制备多西紫杉醇检测探针、多西紫杉醇靶点探针； 作为多西紫杉醇药物载体，应用于多西紫杉醇药物分离和纯化时，上述的核酸适配体的核 苷酸序列上的某一位置可被磷酸化、氧甲基化、甲基化、氨基化、巯基化或同位素化。
[0026] 同时，上述的核酸适配体的核苷酸序列上还可结合有生物素、地高辛、荧光物质 (如FITC等）、纳米发光材料、聚乙二醇、肽段、蛋白、酶或叶酸标记；甚至连接上放射性和治 疗性物质等。
[0027] 以上不论是经部分取代还是经过修饰后的核苷酸序列，都具有原核酸适配体基本 相同或类似的分子结构、理化性质和功能，都可用于与多西紫杉醇特异性的结合。
[0028] 同时，本发明的核酸适配体的衍生物同样具有原核酸适配体基本相同或类似的分 子结构性质和功能，即都可用于与多西紫杉醇特异性结合。前述的核酸适配体衍生物是上 述所列核酸适配体的核苷酸序列的骨架衍生出的硫代磷酸酯骨架，或者是上述所列核酸适 配体改造成的相应锁核酸或肽核酸。
[0029] 与现有技术相比，本发明的优点在于：
[0030] (1)本发明提供了一种高效液相色谱法筛选核酸适配体的方法，具有仪器要求低、 普适性强、免标记、成本低、可自动化的优点，可以快速地对大量候选序列进行挑选。通过高 效液相色谱仪挑选的核酸适配体在乙腈-水的流动相条件下，以及色谱柱对样品的吸附解 吸平衡，样品处于70bar以上的高压，多西紫杉醇依旧与核酸适配体结合。因此通过高效液 相色谱法获得的多西紫杉醇核酸适配体，对目标分子具有较强亲和力。
[0031] (2)本发明提供的核酸适配体可以高亲和力、高特异性地结合多西紫杉醇，具有稳 定性好、无毒性、易于修饰、且序列长度较短等优点，有利于大规模工业化生产及应用。本发 明的核酸适配体还具有亲水特性，与难溶于水的药物多西紫杉醇结合后，可提高多西紫杉 醇在水中的溶解度，有望在不使用其他助溶剂（如乙醇等）、增溶剂（如吐温等）的情况下， 达到临床应用治疗的目的。
[0032] (3)本发明的核酸适配体具有易于修饰的特性，可以通过修饰信号物质，将多西紫 杉醇的紫外吸收信号转化为其他信号（如荧光等），从而实现多西紫杉醇的高灵敏检测。
[0033] (4)本发明利用核酸适配体与多西紫杉醇的结合特性，有望提高多西紫杉醇的稳 定性、安全性和溶解度，延长药效，减少多西紫杉醇与其他血液内源性物质的结合。选择本 发明的核酸适配体为药物载体结合多西紫杉醇，能够保护药物免受环境影响，可获得适宜 的释药速度，起到作用和缓而持久的药效，并且能够避免因吐温及酒精引起的药物不良反 应。同时，对本发明的核酸适配体进行标记与修饰有利于多西紫杉醇的体内示踪及新药物 的开发等。

【专利附图】

【附图说明】
[0034] 为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例 中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整的描述。
[0035] 图1为本发明实施例2的核酸适配体与多西紫杉醇结合的HPLC图。
[0036] 图2为本发明对比例1的核酸适配体与多西紫杉醇结合的HPLC图。
[0037] 图3为本发明对比例2的核酸适配体与多西紫杉醇结合的HPLC图。
[0038] 图4为本发明实施例2的核酸适配体与多西紫杉醇结合的质谱图。
[0039] 图5为本发明实施例2的核酸适配体与多西紫杉醇结合的圆二色谱图。
[0040] 图6为本发明实施例4中核酸适配体作为多西紫杉醇的药物载体的人乳腺癌 (MCF-7)细胞增殖毒性实验结果数据图。
[0041] 图7为本发明实施例4中核酸适配体作为多西紫杉醇的药物载体的人乳腺癌 (MDA-MB-231)细胞增殖毒性实验结果数据图。
[0042] 图8为本发明实施例5中不同浓度多西紫杉醇在305nm处瑞利散射实验结果数据 图。
[0043] 图9为本发明实施例5中核酸适配体提高多西紫杉醇溶解度，降低其305nm处瑞 利散射实验结果数据图。
[0044] 图10为本发明实施例6中核酸适配体用于检测多西紫杉醇探针的HPLC数据图。

【具体实施方式】
[0045] 以下结合说明书附图和具体优选的实施例对本发明作进一步描述，但并不因此而 限制本发明的保护范围。
[0046] 实施例
[0047] 以下实施例中所采用的材料和仪器均为市售。本实施例的多西紫杉醇为紫 杉烧类抗肿瘤药，其化学名称为5β，20_环氧_1，2α，4,7β，10β，13α -六轻基紫杉 烷-11-烯-9-酮-4,10-二乙酸酯-2-苯甲酸酯-13-[ C R，3< S)-N-苯甲酰-3-苯基 异丝氨酸酯，CAS号为114977-28-5。
[0048] 实施例1 :
[0049] -种HPLC辅助筛选核酸适配体的方法，主要利用微流控芯片进行筛选，具体筛选 过程包括以下步骤：
[0050] (a)优化核酸文库：DNA文库的结构分为五部分：中间是一段26个碱基的固定序 列，用于和固定探针（BDNA)互补杂交；固定序列的两侧是两条DNA手臂，均包括18个碱基 的随机序列和19个碱基的PCR扩增所必须的序列。固定探针是一端标有生物素的与文库 固定序列互补的DNA链，用于文库的固定。
[0051] 随机文库RS36具有SEQ ID NO. 1所述的核苷酸序列，具体为：
[0052] 5 ' -CCGCTTCGCCGTCTCCTAC-NNNNNNNNNNNNNNNNNN-AAAAGTGGGTAGGGCGGGTTGGAAAA-NNNNNNNNNNNNNNNNNN-CGCTCGTCACCCTTCTCCT-3'（注：N 代表 A、T、G、C 中任一碱基）；
[0053] 5'引物具有SEQ ID NO. 4所述的核苷酸序列，具体为：
[0054] 5' -FAM-CCGCTTCGCCGTCTCCTAC-3' ；
[0055] 3'引物具有SEQ ID NO. 5所述的核苷酸序列，具体为：
[0056] 5' -Biotin-AGGAGAAGGGTGACGAGCG-3' ；
[0057] 固定探针具有SEQ ID NO. 6所述的核苷酸序列，具体为：
[0058] 5' -Biotin-TACCGCAAAAAAAAACCAACCCGCCCTACCCAC-3' ；
[0059] (b)初筛：将微流控表面依次修饰生物素化的牛血清白蛋白、亲和素、文库。
[0060] 其中，文库预处理方法：将Inmol文库（约IO14条DNA链）、L 5nmol BDNA溶于 20 μ L的杂交缓冲液（杂交缓冲液的组分为：0. 5mmol/L磷酸缓冲液，10. 5mmol/L NaCl， 15mmol/L MgCl2，pH 6. 8)中，95°C变性lOmin，缓慢冷却至室温，静置3h以上，使文库与 80嫩杂交，然后加入1301^的结合缓冲液（结合缓冲液的组分为 ：100臟〇1/1似(：1，5臟〇1/ 1^1((：1，2111111〇1/1]\%(：1 2，1111111〇/1〇&(：12,20111111〇1/11'1^8-!1(：1，？!17.6)，备用。
[0061] 文库固定方法：首先在室温下将150 μ L、lmg/mL的生物素化的BSA通过注射泵以 1 μ L/min的流速通过芯片，然后用0. Olmol/L的PBS溶液以5 μ L/min的流速冲洗IOmin ; 再以同样的流速通入60 μ L、lmg/mL的亲和素，同样用0. Olmol/L的PBS溶液以5 μ L/min的 流速冲洗l〇〇min。将预处理过的150 μ L的DNA文库（即杂交后的DNA文库）以0. 5 μ L/ min的流速通过修饰过的芯片，用结合缓冲液以5 μ L/min的流速冲洗10min，则完成了文库 在芯片中的固定。然后将目标物多西紫杉醇溶液通入，收集芯片中流出的溶液，得到初筛核 酸文库，其中含有DNA与多西紫杉醇的复合物。
[0062] (c)纯化：将步骤（b)得到的初筛核酸文库进行PCR扩增，扩增产物（即生物素化 的双链DNA)通过链霉亲和素微珠填充的亲和柱进行分离，再通过碱变性解链、脱盐后形成 次一级核酸文库。其中，PCR反应扩增条件为：94°C预变性10min，94°C变性45sec，62°C退 火30sec，72°C延伸30sec，扩增14个循环；72°C延伸7min。采用梯度PCR，以初始核酸文库 作为模版优化退火温度，最终得到退火温度为62°C。而每轮筛选产物的最优扩增轮数都是 经过轮数优化获得的。在轮数优化后，将剩余的文库在相同的条件下扩增。PCR结果均通 过3%琼脂糖凝胶电泳进行验证，染料为SYBR Glod。将PCR后文库进行单链制备，用于下 一轮的筛选，单链制备方法：取50 μ L链霉亲和素微珠加入到I. 5mL EP管中，用0. Olmol/L PBS冲洗3次后加入PCR扩增获得的双链产物，25°C震荡孵育30min后离心去上清；继续用 0· 01mol/L PBS冲洗3次后加入500 μ L 200mmol/L的NaOH，25°C震荡孵育IOmin进行单链 化处理；离心收集上清中游离的单链DNA ;收集产物通过高效液相色谱进行脱盐处理，干燥 浓缩后溶于少量水中，得到次一级核酸文库，用紫外分光光度计进行定量，于_20°C冰箱中 保存。
[0063] (d)循环：以上述得到的次一级核酸文库替代起始核酸文库并重复上述的步骤 (b)?步骤（C)，每次循环时应当重新在微流控芯片中修饰生物素化的牛血清白蛋白及亲 和素，直至得到包含有与多西紫杉醇高亲和力和高特异性结合的核酸适体的核酸文库。
[0064] (e)筛选效率评价：采用荧光法测定筛选效率，即筛选过程中DNA的富集情况。检 测信号是DNA文库的5'端修饰的荧光染料FAM的荧光值。
[0065] 本实施例将预处理过的DNA文库的荧光值设为R)，将修饰文库时流出的溶液（含 有未固定上的文库）的荧光值设为F1，竞争结合时从芯片中收集到的溶液的荧光值设为 F2,则筛选效率计算如下式：筛选效率=F2AR)-F1-F2) X100%。根据这个公式监测每一 轮的筛选效率，筛选效率越高，说明竞争到溶液中的DNA越多，通过筛选效率的测定可以监 测筛选富集情况。当筛选达到平台期时，对文库进行克隆测序，得到核酸适配体的核酸文库 (核酸文库中共有约1〇 14条核酸适配体）。
[0066] 多西紫杉醇为小分子药物，初步推断真正与其结合的碱基应不超过三十个。对测 序结果进行同源性比对，根据文库设计方案，固定序列与PCR引物序列存在于所有序列中 且长度较长，因此对序列两个手臂进行拆分，删去引物部分序列，仅对随机文库部分进行高 效液相色谱法的结合能力考查。
[0067] (f)高效液相色谱法筛选：分别将核酸文库中的核酸适配体进行高效液相色谱筛 选，考察核酸适配体与多西紫杉醇的结合能力。具体的方法为：
[0068] 供试品：配制核酸适配体的终浓度为3 μ M，多西紫杉醇溶液的终浓度为6 μ M，结 合缓冲溶液为 lOOmmol/L NaCl, 5mmol/L KC1，2mmol/L MgCl2, lmmo/L CaCljPl 20mmol/L Tris-HCl的混合溶液，pH 7. 6。
[0069] 色谱条件为：色谱柱采用十八烷基硅烷键合硅胶为填料；流动相为：A :水，B :乙 腈；洗脱条件为：〇min - 5min - 20min，水：95v/v%- 85v/v%- 85v/v%，乙腈：5v/v% -5v/v%- 15v/v% ;流速：lmL/min，检测器：二极管阵列检测器；检测波长：260nm ;柱温： 25°C ;进样量：20yL。
[0070] 实施例2
[0071] -种由实施例1方法筛选得到的多西紫杉醇的核酸适配体1，该核酸适配体1的核 苷酸序列具有SEQ ID NO. 2所述的核苷酸序列，具体为5' -TTGTTTCTCTGTCGATTA-3'。
[0072] 实施例3
[0073] -种由实施例1方法筛选得到的多西紫杉醇的核酸适配体2,该核酸适配体2的核 苷酸序列具有SEQ ID NO. 3所述的核苷酸序列，具体为5' -ATTAGCTGTCTCTTTGTT-3'。
[0074] 上述实施例2和实施例3的核酸适配体的核苷酸序列选自天然存在或人工合成的 序列，或任何其他来源的同样的序列。
[0075] 实施例2和3仅是本发明筛选出的优选核酸适配体，按照本发明的筛选方法，还可 以筛选到具有以下核苷酸序列的核酸适配体：
[0076] (1)与实施例2或3所列核酸适配体的核苷酸序列的同源性在60%以上（例如可 将上述核酸适配体序列删除或增加部分互补的核苷酸）；
[0077] (2)与实施例2或3所列核酸适配体的核苷酸序列进行杂交的序列；
[0078] (3)上述实施例2或3所列核酸适配体的核苷酸序列转录的RNA序列。
[0079] 对比例1
[0080] 一种核酸适配体3,该核酸适配体3的核苷酸序列具有SEQ ID NO. 7所述的核苷酸 序列，具体为 5' -TGCCTTTCTGTTTCTT TG-3'。
[0081] 对比例2
[0082] -种核酸适配体4,该核酸适配体4的核苷酸序列具有SEQ ID NO. 8所述的核苷酸 序列，具体为 5' -CGGAGGTGCCTTTCCTAC-3'。
[0083] 分别将实施例2、对比例1和2的核酸适配体的高效液相色谱图（HPLC)进行分析， 以验证高效液相色谱法筛选核酸适配体的准确性。
[0084] 图1为实施例1的核酸适配体（5, -TTGTTTCTCTGTCGATTA-3'）的HPLC图，由考察 结果图1可知，多西紫杉醇与核酸适配体1存在较强的结合，延长了核酸适配体的保留时 间，使其色谱峰分裂为两个色谱峰。
[0085] 图2为对比例1的核酸适配体（5' -TGCCTTTCTGTTTCTTTG-3'）的HPLC图，由考察 结果图2可知，多西紫杉醇与核酸适配体3存在一定程度结合，使其色谱峰成为肩峰。
[0086] 图3为对比例2的核酸适配体（5, -CGGAGGTGCCTTTCCTAC-3'）的HPLC图，由考察 结果图3可知，多西紫杉醇与核酸适配体4结合能力较弱或不结合，其色谱峰峰形对称无分 裂或肩峰现象。
[0087] 从图1至图3的分析结果可知，通过高效液相色谱仪挑选的核酸适配体在乙 腈-水的流动相条件下，以及色谱柱对样品的吸附解吸平衡，样品处于70bar以上的高压， 多西紫杉醇依旧与核酸适配体结合。因此通过高效液相色谱法获得的多西紫杉醇核酸适配 体，对目标分子具有较强亲和力。
[0088] 为了验证高效液相色谱法筛选核酸适配体的方法的可靠性，本发明同时采用了电 喷雾电离质谱法和圆二色谱法进行验证。
[0089] 考察1 :采用电喷雾电离质谱法，对多西紫杉醇与实施例2的核酸适配体的混合溶 液进行检测。
[0090] 根据原子量表（IUPAC 2007standard atomic weights)，本发明专利提供的核酸 适配体1与多西紫杉醇的复合物分子量为6270. 4。通过电喷雾电离质谱法获得的核酸适配 体1与多西紫杉醇的复合物分子量为6268. 7 (当选择的部分质谱峰放大时，仪器会出现小 幅漂移）。根据第三方检测报告，电喷雾电离质谱法误差为0.03%。因此，测量误差在方法 允许误差范围内，证明本专利提供的核酸适配体1与多西紫杉醇能够以高亲和力结合，结 果见图4。
[0091] 考察2 :采用圆二色谱法对实施例2的核酸适配体I (5'-TTGTTTCTCTGTCGATTA-3'） 结构以及核酸适配体1与多西紫杉醇结合后的构型变化进行表征。
[0092] 固定核酸适配体1的浓度为20 μ M，分别加入终浓度为0 μ M、5 μ M、10 μ M、15 μ M的 多西紫杉醇溶液。缓冲溶液为 100mmol/L NaCl, 5mmol/L KCl,2mmol/L MgCl2, lmmo/L CaCl2 和20mmol/L Tris-HCl的混合溶液，pH 7. 6。结果见图5,由圆二色谱法实验结果可见，核 酸适配体1的圆二色谱图在251nm处的负峰随着多西紫杉醇的浓度增高，角度信号增强，并 且波峰发生约2nm的蓝移。说明多西紫杉醇使核酸适配体1的构型发生变化，以嵌入的方 式与本实施例2所提供的核酸适配体1结合。
[0093] 实施例4
[0094] 一种实施例2的多西紫杉醇的核酸适配体1 (5' -TTGTTTCTCTGTCGATTA-3'）作为 多西紫杉醇的药物载体的应用，具体采用细胞增殖毒性实验法，包括以下步骤：
[0095] 以结合缓冲溶液配制系列浓度的多西紫杉醇及核酸适配体1，缓冲溶液为 100mmol/L NaCl，5mmol/L KC1，2mmol/L MgCl2, lmmo/L CaCl2和 20mmol/L Tris-HCl 的混 合溶液，pH 7.6。选取对数生长期的人乳腺癌（MCF-7)及人乳腺癌（MDA-MB-231)细胞，以 2 X IO4个细胞/孔的浓度接种于96孔细胞培养板内（每孔200 μ L培基），于细胞培养箱中 培育过夜。然后弃掉细胞培养液，用D-Hanks清洗两次，加入50 μ L浓度分别为ΟηΜ，60ηΜ， 300ηΜ，1500ηΜ，3000ηΜ，6000ηΜ的多西紫杉醇及核酸适配体1与多西紫杉醇复合物（复合物 中多西紫杉醇及核酸适配体与多西紫杉醇的摩尔浓度的比例为1 : 1)，再加入250 yL的 含15%小牛血清的1640培基，使多西紫杉醇及核酸适配体1与多西紫杉醇复合物的终浓 度分别为OnM, IOnM, 50nM, 250nM, 500nM和ΙΟΟΟηΜ。将96孔板置于细胞培养箱中37°C、5% CO2条件下培育48h后，每孔加入浓度为5mg/mL的3- (4, 5-二甲基噻唑-2) -2, 5-二苯基四 氮唑溴盐（噻唑蓝，MTT)溶液20 μ L，继续孵育4h，终止培养。弃掉培养上清液，每孔加入 170yL DMSO(二甲基亚砜），震荡孵育10min，使结晶物充分溶解。选定吸收波长为490nm， 使用酶标仪测量各孔的吸光度值，其中多西紫杉醇及核酸适配体1与多西紫杉醇的复合物 浓度为OnM的孔细胞存活率假定为100%，不加细胞的孔细胞存活率假定为0,每个相同的 处理组做5孔。以下列公式计算细胞存活率，结果见图6及图7。
[0096]

【权利要求】
1. 高效液相色谱筛选核酸适配体的方法，其特征在于，包括以下步骤： (1) 从随机文库RS36中筛选与多西紫杉醇特异性结合的核酸适配体的核酸文库；所述 随机文库RS36具有SEQ ID NO. 1所述的核苷酸序列； (2) 采用高效液相色谱法筛选所述核酸文库得到核酸适配体；所述高效液相色谱法 中，固定相为十八烷基硅烷键合硅胶色谱柱；流动相采用水-乙腈梯度洗脱；检测波长为 260nm ;检测器为二极管阵列检测器。
2. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤（2)中所述高效液相色谱的流动 相中A相为水，B相为乙腈，所述梯度洗脱方法为： Omin?5min，流动相为95v/v%的水和5v/v%的乙腈； 5min?20min，流动相为95v/v%的水和5v/v%的乙腈勾速梯度改变至85v/v%的水和 15v/v%的乙腈。
3. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤（2)中所述十八烷基硅烷键合硅 胶色谱柱的柱温为25 °C。
4. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤⑵中所述高效液相色谱的进样 量为20 y L。
5. -种权利要求1至4中任一项所述方法筛选得到的核酸适配体，其特征在于，所述核 酸适配体的核苷酸序列包括以下四种序列中任意一种： (1) SEQ ID NO. 2所述的核苷酸序列或SEQ ID NO. 3所述的核苷酸序列； (2) 与SEQ ID NO. 2所述的核苷酸序列或SEQ ID NO. 3所述的核苷酸序列的同源性在 60%以上的序列； (3) 与SEQ ID NO. 2所述的核苷酸序列或SEQ ID NO. 3所述的核苷酸序列进行杂交的 序列； (4) 与SEQ ID NO. 2所述的核苷酸序列或SEQ ID NO. 3所述的核苷酸序列转录的RNA 序列。
6. -种权利要求5所述的核酸适配体做为多西紫杉醇药物载体中的应用。
7. -种权利要求5所述的核酸适配体在提高多西紫杉醇溶解能力中的应用。
8. -种权利要求5所述的核酸适配体在制备多西紫杉醇检测探针、多西紫杉醇靶点探 针中的应用。
9. 一种权利要求5所述的核酸适配体在多西紫杉醇药物分离与纯化中的应用。
10. -种权利要求5所述的核酸适配体在多西紫杉醇药物制备、设计与开发中的应用。
【文档编号】A61K47/36GK104480114SQ201410852323
【公开日】2015年4月1日 申请日期:2014年12月31日 优先权日:2014年12月31日
【发明者】羊小海, 陈南迪, 王柯敏, 王青, 朱莹 申请人:湖南大学