含纺锤体驱动蛋白（KSP）的抗体药物偶联物（ADC）的制作方法

本发明涉及纺锤体驱动蛋白抑制剂的结合体活性物质偶联物（ADC）、这些ADC的活性代谢物、制备这些ADC的方法、这些ADC用于治疗和/或预防疾病的用途和这些ADC用于制备治疗和/或预防疾病，特别是过度增生和/或血管生成疾病，例如癌症的药剂的用途。此类治疗可作为单一疗法或与其它药剂或其它治疗措施联合进行。

癌症是多种多样的组织的不受控细胞生长的后果。在许多情况下，新的细胞渗透到现有组织中（浸润性生长）或它们转移到远端器官中。癌症发生在多种多样的器官中并通常具有组织特异性病程。术语癌症作为通用术语因此描述各种器官、组织和细胞类型的大量确定疾病。

肿瘤在初期可任选通过手术和放射治疗措施除去。转移的肿瘤通常只能用化疗药物姑息治疗。此处的目标是实现改善生活质量和延长寿命的最佳组合。

结合体蛋白质与一个或多个活性物质分子的偶联物是已知的，特别是以所谓的“抗体药物偶联物”（ADC）的形式，其中抗肿瘤相关抗原的内化抗体经连接单元（“连接体”）共价连接到细胞毒性剂上。在将ADC引入肿瘤细胞中和该偶联物随后离解后，在肿瘤细胞内释放细胞毒性剂本身或由其形成的细胞毒性代谢物并可在其内直接和选择性展现其作用。由此，不同于传统化疗，可将对正常组织的损伤保持在明显较窄的界限内 [参见例如J. M. Lambert, Curr. Opin. Pharmacol.5, 543-549 (2005)；A. M. Wu和P. D. Senter, Nat. Biotechnol.23, 1137-1146 (2005)；P. D. Senter、Curr. Opin. Chem. Biol.13, 235-244 (2009)；L. Ducry和B. Stump, Bioconjugate Chem.21, 5-13 (2010)]。因此，WO2012/171020描述了ADC，其中多个毒簇分子经聚合连接体连接到抗体上。作为可能的毒簇，WO2012/171020尤其提到物质SB 743921、SB 715992（Ispinesib）、MK-0371、AZD8477、AZ3146和ARRY-520。

最后提到的物质是所谓的纺锤体驱动蛋白抑制剂。纺锤体驱动蛋白（KSP，也称作Eg5、HsEg5、KNSL1或KIF11）是双极有丝分裂纺锤体发挥作用所必需的驱动蛋白样马达蛋白。KSP的抑制导致有丝分裂阻滞并经较长时间导致细胞凋亡（Tao等人, Cancer Cell 2005 Jul 8(1), 39-59）。在最早的细胞穿透KSP抑制剂Monastrol发现后，KSP抑制剂已确立为一类新型化疗药物（Mayer等人, Science 286: 971-974, 1999），且它们是许多专利申请的主题（例如WO2006/044825；WO2006/002236；WO2005/051922；WO2006/060737；WO03/060064；WO03/040979；和WO03/049527）。但是，由于KSP仅在有丝分裂期间的短时期内展现其作用，KSP抑制剂在这些初期必须以足够高的浓度存在。

发明概述

在这一背景下，本发明的一个目的是提供在以相对低的浓度给药后可展现细胞凋亡作用并因此有益于癌症治疗的物质。

为实现这一目的，本发明提供结合体或其衍生物与一个或多个活性物质分子的偶联物，其中所述活性物质分子是经连接体L连接到结合体上的纺锤体驱动蛋白抑制剂（KSP抑制剂）。该结合体优选是结合体蛋白质或肽，特别优选人、人源化或嵌合单克隆抗体或其抗原结合片段，特别是抗-TWEAKR抗体或其抗原结合片段或抗-EGFR抗体或其抗原结合片段。特别优选的是特异性结合到TWEAKR（SEQ ID NO:169）的位置47中的氨基酸D（D47）上的抗-TWEAKR抗体，特别是抗-TWEAKR抗体TPP-2090或抗-EGFR抗体西妥昔单抗或尼妥珠单抗。

本发明人已经发现如何可将结合体连接到KSP抑制剂上以实现上述目的的许多可能方式。

根据本发明，该纺锤体驱动蛋白抑制剂可具有下示亚结构I(sub)：

其中

#a代表与所述分子剩余部分的键；

R^1a代表H或-(CH₂)_0-3Z，其中Z代表-H、卤素、-OY³、-SY³、-NHY³、-CO-NY¹Y²或-CO-OY³，

其中Y¹和Y²彼此独立地代表H、NH₂、-(CH₂CH₂O)_0-3-(CH₂)_0-3Z'（例如-(CH₂)_0-3Z'）或-CH(CH₂W)Z'，且Y³代表H或-(CH₂)_0-3Z'，其中Z'代表H、SO₃H、NH₂、COOH、-NH-CO-CH₂-CH₂-CH(NH₂)COOH或-(CO-NH-CHY⁴)_1-3COOH，其中W代表H或OH，其中Y⁴彼此独立地代表任选被–NHCONH₂取代的直链或支化的C_1-6-烷基，或代表任选被–NH₂取代的芳基或苄基；

R^2a和R^4a彼此独立地代表H、-CO-CHY⁴-NHY⁵或-(CH₂)_0-3Z，或R^2a和R^4a一起（形成吡咯烷环）代表–CH₂-CHR¹⁰-或-CHR¹⁰-CH₂-，其中R¹⁰代表H、NH₂、COOH、SO₃H、SH或OH，且其中Z代表-H、-OY³、-SY³、-NHY³、-CO-NY¹Y²或-CO-OY³，

其中Y¹和Y²彼此独立地代表H、NH₂或-(CH₂)_0-3Z'，且Y³代表H或-(CH₂)_0-3Z'，其中Z'代表H、SO₃H、NH₂或COOH；

其中Y⁴彼此独立地代表任选被–NHCONH₂取代的直链或支化的C_1-6-烷基，或代表任选被–NH₂取代的芳基或苄基，且Y⁵代表H或–CO-CHY⁶-NH₂，其中Y⁶代表直链或支化的C_1-6-烷基。

根据本发明，该纺锤体驱动蛋白抑制剂可通过取代R^1a、R^2a、R^4a或R¹⁰处的氢原子经连接体连接到结合体上。

连接到这种结合体上的KSP抑制剂（或多种KSP抑制剂，因为通常多于一种KSP抑制剂连接到结合体上）优选是下式(Ia)或(IIa)的化合物：

式(Ia)，及其盐、溶剂合物和溶剂合物的盐:

其中

R^1a代表H、-MOD或-(CH₂)_0-3Z，其中Z代表-H、卤素、-OY³、-SY³、-NHY³、-CO-NY¹Y²或-CO-OY³，

其中Y¹和Y²彼此独立地代表H、NH₂、-(CH₂CH₂O)_0-3-(CH₂)_0-3Z'（例如-(CH₂)_0-3Z'）或-CH(CH₂W)Z'，且Y³代表H或-(CH₂)_0-3Z'，其中Z'代表H、SO₃H、NH₂、COOH、-NH-CO-CH₂-CH₂-CH(NH₂)COOH或-(CO-NH-CHY⁴)_1-3COOH，其中W代表H或OH，

其中Y⁴彼此独立地代表任选被–NHCONH₂取代的直链或支化的C_1-6-烷基，或代表任选被–NH₂取代的芳基或苄基；

R^2a和R^4a彼此独立地代表H、-CO-CHY⁴-NHY⁵或-(CH₂)_0-3Z，或R^2a和R^4a一起（形成吡咯烷环）代表–CH₂-CHR¹⁰-或-CHR¹⁰-CH₂-，其中R¹⁰代表H、SO₃H、NH₂、COOH、SH或OH，

其中Z代表-H、卤素、-OY³、-SY³、NHY³、-CO-NY¹Y²或-CO-OY³，

其中Y¹和Y²彼此独立地代表H、NH₂或-(CH₂)_0-3Z'，且Y³代表H或-(CH₂)_0-3Z'，其中Z'代表H、SO₃H、NH₂或COOH；

其中Y⁴彼此独立地代表任选被–NHCONH₂取代的直链或支化的C_1-6烷基，或代表任选被–NH₂取代的芳基或苄基，且Y⁵代表H或–CO-CHY⁶-NH₂，其中Y⁶代表直链或支化的C_1-6-烷基；

R^3a代表–MOD或任选取代的烷基、环烷基、芳基、杂芳基、杂烷基或杂环烷基，

优选C_1-10-烷基、C_6-10-芳基或C_6-10-芳烷基、C_5-10-杂烷基、C_1-10-烷基-O-C_6-10-芳基或C_5-10-杂环烷基，其可被1-3个–OH基团、1-3个卤素原子、1-3个卤代烷基（各自具有1-3个卤素原子）、1-3个O-烷基、1-3个–SH基团、1-3个-S-烷基、1-3个-O-CO-烷基、1-3个-O-CO-NH-烷基、1-3个-NH-CO-烷基、1-3个-NH-CO-NH-烷基、1-3个-S(O)_n-烷基、1-3个-SO₂-NH-烷基、1-3个-NH-烷基、1-3个-N(烷基)₂基团、1-3个-NH₂基团或1-3个-(CH₂)_0-3Z基团取代，其中Z代表-H、卤素、-OY³、-SY³、-NHY³、-CO-NY¹Y²或-CO-OY³，其中Y¹和Y²彼此独立地代表H、NH₂或-(CH₂)_0-3Z'，且Y³代表H、-(CH₂)_0-3-CH(NHCOCH₃)Z'、-(CH₂)_0-3-CH(NH₂)Z'或-(CH₂)_0-3Z'，其中Z'代表H、SO₃H、NH₂或COOH（其中“烷基”优选代表C_1-10-烷基）；

R^8a代表C_1-10-烷基或–(CH₂)_0-2-(HZ²)，其中HZ²代表具有最多2个选自N、O和S的杂原子的4-至7元杂环；

HZ代表可被选自卤素、可任选被卤素取代的C_1-10-烷基、C_6-10-芳基或C_6-10-芳烷基的一个或多个取代基取代的单环或双环杂环；

其中–MOD代表–(NR¹⁰)n-(G1)o-G2-H，其中

R¹⁰代表H或C₁-C₃-烷基；

G1代表–NHCO-、-CONH-或（其中，如果G1代表–NHCO-或，则R¹⁰不代表NH₂）；

n是0或1；

o是0或1；且

G2代表直链和/或支化的烃基，其具有1至10个碳原子并可被基团-O-、-S-、-SO-、SO₂、-NR^y-、-NR^yCO-、CONR^y-、-NR^yNR^y-、-SO₂NR^yNR^y-、-CONR^yNR^y-（其中R^y代表H、苯基、C₁-C₁₀-烷基、C₂-C₁₀-烯基或C₂-C₁₀-炔基，它们各自可被-NHCONH₂、-COOH、-OH、-NH₂、NH-CNNH₂、磺酰胺、砜、亚砜或磺酸取代）、-CO-、-CR^x=N-O-（其中Rx代表H、C₁-C₃-烷基或苯基）的一个或多个中断一次或多次，其中如果存在烃链包括侧链，其可被-NHCONH₂、-COOH、-OH、-NH₂、NH-CNNH₂、磺酰胺、砜、亚砜或磺酸取代，其中基团–MOD优选具有至少一个基团-COOH；

其中所述纺锤体驱动蛋白抑制剂通过取代R^1a、R^2a、R^3a、R^4a、R^8a或R¹⁰处的氢原子或任选经由HZ的取代基之一，特别经由R^1a、R^2a、R^3a、R^4a或R¹⁰连接到连接体上。

式(IIa)，及其盐、溶剂合物和溶剂合物的盐:

其中

X₁代表N，X₂代表N且X₃代表C；或

X₁代表N，X₂代表C且X₃代表N；或

X₁代表CH或CF，X₂代表C且X₃代表N；或

X₁代表NH，X₂代表C且X₃代表C；或

X₁代表CH，X₂代表N且X₃代表C

（其中X₁代表CH，X₂代表C且X₃代表N是优选的）；

R¹代表H、–L-#1、–MOD或-(CH₂)_0-3Z，其中Z代表-H、-NHY³、-OY³、-SY³、卤素、-CO-NY¹Y²或-CO-OY³，

其中Y¹和Y²彼此独立地代表H、NH₂、-(CH₂CH₂O)_0-3-(CH₂)_0-3Z'（例如-(CH₂)_0-3Z'）或-CH(CH₂W)Z'，且Y³代表H或-(CH₂)_0-3Z'，其中Z'代表H、NH₂、SO₃H、COOH、-NH-CO-CH₂-CH₂-CH(NH₂)COOH或-(CO-NH-CHY⁴)_1-3COOH，其中W代表H或OH，

其中Y⁴彼此独立地代表任选被–NHCONH₂取代的直链或支化的C_1-6-烷基，或代表任选被–NH₂取代的芳基或苄基；

R²代表–L-#1、H、-MOD、-CO-CHY⁴-NHY⁵或-(CH₂)_0-3Z，或R²和R⁴一起（形成吡咯烷环）代表–CH₂-CHR¹⁰-或-CHR¹⁰-CH₂-，其中R¹⁰代表L-#1、H、NH₂、SO₃H、COOH、SH或OH；

其中Z代表-H、卤素、-OY³、-SY³、NHY³、-CO-NY¹Y²或-CO-OY³，

其中Y¹和Y²彼此独立地代表H、NH₂或-(CH₂)_0-3Z'，且Y³代表H或-(CH₂)_0-3Z'，其中Z'代表H、SO₃H、NH₂或COOH；

其中Y⁴彼此独立地代表任选被–NHCONH₂取代的直链或支化的C_1-6烷基，或代表任选被–NH₂取代的芳基或苄基，且Y⁵代表H或–CO-CHY⁶-NH₂，其中Y⁶代表直链或支化的C_1-6-烷基；

R⁴代表–L-#1、H、-CO-CHY⁴-NHY⁵或-(CH₂)_0-3Z，

其中Z代表-H、卤素、-OY³、-SY³、NHY³、-CO-NY¹Y²或-CO-OY³，

其中Y¹和Y²彼此独立地代表H、NH₂或-(CH₂)_0-3Z'，且Y³代表H或-(CH₂)_0-3Z'，其中Z'代表H、SO₃H、NH₂或COOH；

其中Y⁴彼此独立地代表任选被–NHCONH₂取代的直链或支化的C_1-6烷基，或代表任选被–NH₂取代的芳基或苄基，且Y⁵代表H或–CO-CHY⁶-NH₂，其中Y⁶代表直链或支化的C_1-6-烷基；

或R²和R⁴一起（形成吡咯烷环）代表–CH₂-CHR¹⁰-或-CHR¹⁰-CH₂-，其中R¹⁰代表L-#1、H、NH₂、SO₃H、COOH、SH或OH；

A代表CO、SO、SO₂、SO₂NH或CNNH；

R³代表–L-#1、-MOD或任选取代的烷基、环烷基、芳基、杂芳基、杂烷基、杂环烷基，优选–L-#1或C_1-10-烷基、C_6-10-芳基或C_6-10-芳烷基、C_5-10-杂烷基、C_1-10-烷基-O-C_6-10-芳基或C_5-10-杂环烷基，其可被1-3个–OH基团、1-3个卤素原子、1-3个卤代烷基（各自具有1-3个卤素原子）、1-3个O-烷基、1-3个–SH基团、1-3个-S-烷基、1-3个-O-CO-烷基、1-3个-O-CO-NH-烷基、1-3个-NH-CO-烷基、1-3个-NH-CO-NH-烷基、1-3个-S(O)_n-烷基、1-3个-SO₂-NH-烷基、1-3个-NH-烷基、1-3个-N(烷基)₂基团、1-3个-NH₂基团或1-3个-(CH₂)_0-3Z基团取代，其中Z代表-H、卤素、-OY³、-SY³、-NHY³、-CO-NY¹Y²或-CO-OY³，其中Y¹和Y²彼此独立地代表H、NH₂或-(CH₂)_0-3Z'，且Y³代表H、-(CH₂)_0-3-CH(NHCOCH₃)Z'、-(CH₂)_0-3-CH(NH₂)Z'或-(CH₂)_0-3Z'，其中Z'代表H、SO₃H、NH₂或COOH（其中“烷基”优选代表C_1-10-烷基）；

R⁵代表–L-#1、H、NH₂、NO₂、卤素（特别是F、Cl、Br）、-CN、CF₃、-OCF₃、-CH₂F、-CH₂F、SH或-(CH₂)_0-3Z，其中Z代表-H、-OY³、-SY³、卤素、NHY³、-CO-NY¹Y²或-CO-OY³，

其中Y¹和Y²彼此独立地代表H、NH₂或-(CH₂)_0-3Z'，且Y³代表H或-(CH₂)_0-3Z'，其中Z'代表H、SO₃H、NH₂或COOH；

R⁶和R⁷彼此独立地代表H、氰基、（任选氟代的）C_1-10-烷基、（任选氟代的）C_2-10-烯基、（任选氟代的）C_2-10-炔基、羟基、NO₂、NH₂、COOH或卤素（特别是F、Cl、Br），

R⁸代表（任选氟代的）C_1-10-烷基、（任选氟代的）C_2-10-烯基、（任选氟代的）C_2-10-炔基、（任选氟代的）C_4-10-环烷基或–(CH₂)_0-2-(HZ²)，其中HZ²代表具有最多2个选自N、O和S的杂原子的4-至7元杂环，其中这些基团的每个可被–OH、CO₂H或NH₂或–L-#1取代；

其中取代基R¹、R²、R³、R⁴、R⁵、R⁸和R¹⁰之一或无一代表或（在R⁸的情况下）含有–L-#1，

L代表连接体且#1代表与所述结合体或其衍生物的键，

其中–MOD代表–(NR¹⁰)n-(G1)o-G2-H，其中

R¹⁰代表H或C₁-C₃-烷基；

G1代表–NHCO-、-CONH-或（其中，如果G1代表–NHCO-或，则R¹⁰不代表NH₂）；

n是0或1；

o是0或1；且

G2代表直链和/或支化的烃基，其具有1至10个碳原子并可被基团-O-、-S-、-SO-、SO₂、-NR^y-、-NR^yCO-、CONR^y-、-NR^yNR^y-、-SO₂NR^yNR^y-、-CONR^yNR^y-（其中R^y代表H、苯基、C₁-C₁₀-烷基、C₂-C₁₀-烯基或C₂-C₁₀-炔基，它们各自可被-NHCONH₂、-COOH、-OH、-NH₂、NH-CNNH₂、磺酰胺、砜、亚砜或磺酸取代）、-CO-、-CR^x=N-O-（其中Rx代表H、C₁-C₃-烷基或苯基）的一个或多个中断一次或多次，其中如果存在烃链包括侧链，其可被-NHCONH₂、-COOH、-OH、-NH₂、NH-CNNH₂、磺酰胺、砜、亚砜或磺酸取代，其中基团–MOD优选具有至少一个基团-COOH。

本发明的偶联物可具有化学不稳定连接体、酶不稳定连接体或稳定连接体。特别优选的是稳定连接体和可被组织蛋白酶裂解的连接体。

本发明还提供制备本发明的偶联物的方法以及用于该制备的前体和中间体。

本发明的偶联物的制备通常包含括下列步骤：

(i) 制备任选带有保护基并具有能够偶联到所述结合体上的反应性基团的连接体前体；

(ii) 所述连接体前体偶联到低分子量KSP抑制剂（优选为具有亚结构I(sub)，特别优选为式(Ia)，特别为式(IIa)的KSP抑制剂，其中在这些式中还没有连向连接体的键）的任选带有保护基的衍生物上，以产生任选带有保护基的反应性KSP抑制剂/连接体偶联物；

(iii) 除去所述KSP抑制剂/连接体偶联物中任选存在的保护基，和

(iv) 所述结合体偶联到所述KSP抑制剂/连接体偶联物上，以产生根据本发明的结合体/KSP抑制剂偶联物。

也可以在构造任选受保护的KSP抑制剂/连接体前体偶联物之后进行反应性基团的连接。

根据连接体，琥珀酰亚胺连接的ADC在偶联后可根据图式26转化成具有有利的稳定性状况的开链琥珀酰胺。

如上所示，可通过亚结构I(sub)中的R^1a、R^2a、R^4a或R¹⁰、式(Ia)中的R^1a、R^2a、R^3a、R^4a、R^8a或R¹⁰或式(IIa)中的R¹、R²、R³、R⁴、R⁵、R⁸或R¹⁰处的氢原子被连接体取代使连接体前体偶联到低分子量KSP抑制剂上。在偶联前的合成步骤中，任选存在的官能团也可能以受保护形式存在。在偶联步骤前，通过肽化学的已知方法除去这些保护基。偶联可通过如实施例中的图式7至31中示例性显示的各种途径化学进行。特别地，任选可以改性要偶联到连接体上的低分子量KSP抑制剂，例如通过引入保护基或离去基以促进取代。

本发明特别提供可任选偶联到结合体上的新型低分子量KSP抑制剂。这些KSP抑制剂或它们的结合体偶联物具有下列通式(IIIa)及其盐、溶剂合物和溶剂合物的盐：

其中

X₁代表N，X₂代表N且X₃代表C；或

X₁代表N，X₂代表C且X₃代表N；或

X₁代表CH或CF，X₂代表C且X₃代表N；或

X₁代表NH，X₂代表C且X₃代表C；或

X₁代表CH，X₂代表N且X₃代表C（其中X₁代表CH，X₂代表C且X₃代表N是优选的）；

R¹代表H、–L-BINDER、–MOD或-(CH₂)_0-3Z，其中Z代表-H、-NHY³、-OY³、-SY³、卤素、-CO-NY¹Y²或-CO-OY³，

其中Y¹和Y²彼此独立地代表H、NH₂、-(CH₂CH₂O)_0-3-(CH₂)_0-3Z'（例如-(CH₂)_0-3Z'）或-CH(CH₂W)Z'，且Y³代表H或-(CH₂)_0-3Z'，其中Z'代表H、NH₂、SO₃H、COOH、-NH-CO-CH₂-CH₂-CH(NH₂)COOH或-(CO-NH-CHY⁴)_1-3COOH，其中W代表H或OH，

其中Y⁴彼此独立地代表任选被–NHCONH₂取代的直链或支化的C_1-6-烷基，或代表任选被–NH₂取代的芳基或苄基；

R²代表–L-BINDER、H、-MOD、-CO-CHY⁴-NHY⁵或-(CH₂)_0-3Z，或R²和R⁴一起（形成吡咯烷环）代表–CH₂-CHR¹⁰-或-CHR¹⁰-CH₂-，其中R¹⁰代表L-#1、H、NH₂、SO₃H、COOH、SH或OH；

其中Z代表-H、卤素、-OY³、-SY³、NHY³、-CO-NY¹Y²或-CO-OY³，

其中Y¹和Y²彼此独立地代表H、NH₂或-(CH₂)_0-3Z'，且Y³代表H或-(CH₂)_0-3Z'，其中Z'代表H、SO₃H、NH₂或COOH；

其中Y⁴彼此独立地代表任选被–NHCONH₂取代的直链或支化的C_1-6烷基，或代表任选被–NH₂取代的芳基或苄基，且Y⁵代表H或–CO-CHY⁶-NH₂，其中Y⁶代表直链或支化的C_1-6-烷基；

R⁴代表–L-BINDER、H、-CO-CHY⁴-NHY⁵或-(CH₂)_0-3Z，

其中Z代表-H、卤素、-OY³、-SY³、NHY³、-CO-NY¹Y²或-CO-OY³，

其中Y¹和Y²彼此独立地代表H、NH₂或-(CH₂)_0-3Z'，且Y³代表H或-(CH₂)_0-3Z'，其中Z'代表H、SO₃H、NH₂或COOH；

其中Y⁴彼此独立地代表任选被–NHCONH₂取代的直链或支化的C_1-6烷基，或代表任选被–NH₂取代的芳基或苄基，且Y⁵代表H或–CO-CHY⁶-NH₂，其中Y⁶代表直链或支化的C_1-6-烷基；

或R²和R⁴一起（形成吡咯烷环）代表–CH₂-CHR¹⁰-或-CHR¹⁰-CH₂-，其中R¹⁰代表–L-BINDER、H、NH₂、SO₃H、COOH、SH或OH；

A代表CO、SO、SO₂、SO₂NH或CNNH；

R³代表–L-BINDER、-MOD或任选取代的烷基、环烷基、芳基、杂芳基、杂烷基、杂环烷基，优选–L-BINDER或C_1-10-烷基、C_6-10-芳基或C_6-10-芳烷基、C_5-10-杂烷基、C_1-10-烷基-O-C_6-10-芳基或C_5-10-杂环烷基，其可被1-3个–OH基团、1-3个卤素原子、1-3个卤代烷基（各自具有1-3个卤素原子）、1-3个O-烷基、1-3个–SH基团、1-3个-S-烷基、1-3个-O-CO-烷基、1-3个-O-CO-NH-烷基、1-3个-NH-CO-烷基、1-3个-NH-CO-NH-烷基、1-3个-S(O)_n-烷基、1-3个-SO₂-NH-烷基、1-3个-NH-烷基、1-3个-N(烷基)₂基团、1-3个-NH₂基团或1-3个-(CH₂)_0-3Z基团取代，其中Z代表-H、卤素、-OY³、-SY³、-NHY³、-CO-NY¹Y²或-CO-OY³，其中Y¹和Y²彼此独立地代表H、NH₂或-(CH₂)_0-3Z'，且Y³代表H、-(CH₂)_0-3-CH(NHCOCH₃)Z'、-(CH₂)_0-3-CH(NH₂)Z'或-(CH₂)_0-3Z'，其中Z'代表H、SO₃H、NH₂或COOH（其中“烷基”优选代表C_1-10-烷基）；

R⁵代表–L-BINDER、H、NH₂、NO₂、卤素（特别是F、Cl、Br）、-CN、CF₃、-OCF₃、-CH₂F、-CH₂F、SH或-(CH₂)_0-3Z，其中Z代表-H、-OY³、-SY³、卤素、NHY³、-CO-NY¹Y²或-CO-OY³，

其中Y¹和Y²彼此独立地代表H、NH₂或-(CH₂)_0-3Z'，且Y³代表H或-(CH₂)_0-3Z'，其中Z'代表H、SO₃H、NH₂或COOH；

R⁸代表（任选氟代的）C_1-10-烷基、（任选氟代的）C_2-10-烯基、（任选氟代的）C_2-10-炔基、（任选氟代的）C_4-10-环烷基或–(CH₂)_0-2-(HZ²)，其中HZ²代表具有最多2个选自N、O和S的杂原子的4-至7元杂环（优选氧杂环丁烷），其中这些基团的每个可被–OH、CO₂H或NH₂或–L-BINDER取代；

其中L代表连接体且BINDER代表结合体或其衍生物，其中所述结合体可任选连接到多个活性物质分子上，

其中R¹、R²、R³、R⁴、R⁵、R⁸和R¹⁰的最多一个代表-L-结合体；

R⁶和R⁷彼此独立地代表H、氰基、（任选氟代的）C_1-10-烷基、（任选氟代的）C_2-10-烯基、（任选氟代的）C_2-10-炔基、羟基、NO₂、NH₂、COOH或卤素（特别是F、Cl、Br），

其中–MOD代表–(NR¹⁰)n-(G1)o-G2-H，其中

R¹⁰代表H或C₁-C₃-烷基；

G1代表–NHCO-、-CONH-或（其中，如果G1代表–NHCO-或，则R¹⁰不代表NH₂）；

n是0或1；

o是0或1；且

G2代表直链和/或支化的烃基，其具有1至10个碳原子并可被基团-O-、-S-、-SO-、SO₂、-NR^y-、-NR^yCO-、CONR^y-、-NR^yNR^y-、-SO₂NR^yNR^y-、-CONR^yNR^y-（其中R^y代表H、苯基、C₁-C₁₀-烷基、C₂-C₁₀-烯基或C₂-C₁₀-炔基，它们各自可被-NHCONH₂、-COOH、-OH、-NH₂、NH-CNNH₂、磺酰胺、砜、亚砜或磺酸取代）、-CO-、-CR^x=N-O-（其中Rx代表H、C₁-C₃-烷基或苯基）的一个或多个中断一次或多次，其中如果存在烃链包括侧链，其可被-NHCONH₂、-COOH、-OH、-NH₂、NH-CNNH₂、磺酰胺、砜、亚砜或磺酸取代，其中基团–MOD优选具有至少一个基团-COOH。

附图描述

图1: 各种物种的TWEAKR富含半胱氨酸结构域（氨基酸34至68）的比对。（数字显示包括信号序列的全长构建体中的氨基酸位置；SEQ ID NO: 169）。

图2: A – TWEAKR（SEQ ID NO: 169）的结构的示意图。该图显示包括富含半胱氨酸结构域（36-67）的胞外域（氨基酸28-80）（SEQ ID NO: 168）、跨膜域 – TM（81-101）和胞内域（102-129）。TPP-2202 – 完整胞外域（28-80），融合到hIgG1的Fc结构域上。TPP-2203 – 具有N-和C-端截断的胞外域（34-68），融合到hIgG1的Fc结构域上。二硫桥Cys36-Cys49、Cys52-Cys67和Cys55-Cys64由黑条标示。在N-末端和C-末端，TPP-2203含有分别比未修饰的富含半胱氨酸结构域多两个氨基酸和多一个氨基酸以确保适当折叠。TPP-1984 – 具有C-端截断的胞外域（28-68），融合到HIS6标签上。所有三个构建体表现出与根据本发明的抗体和PDL-192（TPP-1104）的可比拟的结合。P4A8（TPP-1324）仅结合到全长胞外域（TPP-2202）上。

B – 胞外域的氨基酸序列：已经公开，氨基酸64对TWEAK配体结合是必不可少的；且如此处确定，氨基酸47对根据本发明的抗体的结合是必不可少的。

图3: TWEAKR胞外域与抗体和参考抗体的相互作用。显示具有TWEAKR-Fc融合蛋白涂层（TPP-2202, 1 µg/ml）并具有0.08 µg/ml（空白条）和0.03 µ/ml（实心条）生物素化IgG作为可溶性结合配对物的ELISA的结果。使用链霉亲和素-HRP和Amplex Red底物进行检测。Y是"ELISA信号强度 [Rfu]"；X是"受试抗体构建体"：a是"TPP-2090"；b是"TPP-2084"；c是"PDL-192(TPP-1104)"；d是"P4A8(TPP-1324)"；e是"P3G5(TPP-2195)"；f是"136.1(TPP-2194)"；h是"ITEM1"；i是"ITEM4"；j是小鼠同型对照；k是人同型对照。检查的所有抗体在80 ng/ml浓度下表现出饱和结合。

图4: TWEAKR的富含半胱氨酸结构域与根据本发明的抗体和参考抗体的相互作用。显示具有TWEAKR (34-68)-Fc融合蛋白涂层（TPP-2203, 1 µg/ml）和0.08 µg/ml（空白条）和0.3 µ/ml（实心条）生物素化IgG作为可溶性结合配对物的ELISA的结果。使用链霉亲和素-HRP和Amplex Red底物进行检测。X是"受试抗体构建体"：a是"TPP-2090"；b是"TPP-2084"；c是"PDL-192(TPP-1104)"；d是"P4A8(TPP-1324)"；e是"P3G5(TPP-2195)"；f是"136.1(TPP-2194)"；h是"ITEM1"；i是"ITEM4"；j是小鼠同型对照；k是人同型对照。检查的所有抗体在80 ng/ml浓度下表现出饱和结合。

图5: TWEAKR（28-68）与根据本发明的抗体和参考抗体的相互作用。显示具有TWEAKR (28-68)-HIS涂层（TTP-1984, 1 µg/ml）和0.08 µg/ml（空白条）和0.3 µ/ml（实心条）生物素化IgG作为可溶性结合配对物的ELISA的结果。使用链霉亲和素-HRP和Amplex Red底物进行检测。X是"受试抗体构建体"：a是"TPP-2090"；b是"TPP-2084"；c是"PDL-192(TPP-1104)"；d是"P4A8(TPP-1324)"；e是"P3G5(TPP-2195)"；f是"136.1(TPP-2194)"；h是"ITEM1"；i是"ITEM4"；j是小鼠同型对照；k是人同型对照。检查的所有抗体在80 ng/ml浓度下表现出饱和结合。

图6: A – 富含半胱氨酸结构域的丙氨酸扫描。分析TWEAKR(34-68)-Fc的突变蛋白的PDL-192(TPP-1104) (X)-和TPP-2090 (Y)-结合。在HEK293细胞（黑色菱形）中表达S37A、R38A、S40A、W42A、S43A、D45A、D47A、K48A、D51A、S54A、R56A、R58A、P59A、H60A、S61A、D62A、F63A和L65A突变蛋白。涂布PFL192(TPP-1104)和TPP-2090（1 µg/ml）并添加HEK293发酵液的8倍稀释上清液用于TWEAKR蛋白质结合。X是" PDL-192/TTP-1104相互作用的ELISA强度 [Rfu]", Y是"TPP-2090相互作用的ELISA强度 [Rfu]"。TPP-2090 (Y)表现出降低的对D74A-TWEAKR突变蛋白的结合（封闭框），且PDL-192(TPP-1104) (X)表现出降低的与R56A的结合（虚线框）。

B – Y是"通过野生型结合信号标准化的以%计的结合 [%]"，1是"TPP-2090"；2是"PDL-192(TPP-1104)"；3是"P4A8(TPP-1324)". (1 µg/ml)，TWEAKR变体以250 ng/ml添加，经由抗-HIS HRP检测。与野生型构建体相比，TTP-2090表现出小于5%结合。

图7: 如Pellegrini等人（FEBS 280:1818-1829）公开的TWEAKR胞外域的NMR结构。TWEAK结合依赖于L46（Pellegrini等人），TTP-2090结合依赖于D47，且PDL-192结合到R56上。PDL-192结合到TWEAK配体结合位点的对面，TPP-2090直接结合到TWEAK配体位点上。

发明详述

本发明提供结合体或其衍生物与一个或多个活性物质分子的偶联物，其中该活性物质分子是经连接体L连接到结合体上的纺锤体驱动蛋白抑制剂（KSP抑制剂）。

本发明的偶联物可由下列通式表示

其中BINDER代表结合体，优选抗体，L代表连接体，KSP代表KSP抑制剂，m代表1至2，优选1的数值，且n代表1至50，优选1.2至20，特别优选2至8的数值。在此，m是每连接体的KSP抑制剂数量且n是每BINDER的KSP抑制剂/连接体偶联物数量的平均值。该偶联物中存在的所有KSP的总和因此是m和n的乘积。KSP-L优选具有上示式(I)或(II)。该结合体优选是结合体肽或蛋白质，例如抗体。此外，该连接体优选连接到结合体肽或蛋白质或其衍生物的不同氨基酸上。特别优选结合到结合体的不同半胱氨酸残基上。

下面描述可根据本发明使用的结合体、可根据本发明使用的KSP抑制剂和可根据本发明使用的连接体，它们可以无限制地结合使用。特别地，在每种情况下被表示为优选或特别优选的结合体可以与在每种情况下被表示为优选或特别优选的KSP抑制剂组合使用，任选与在每种情况下被表示为优选或特别优选的连接体组合使用。

KSP抑制剂和它们的结合体偶联物

低分子量KSP抑制剂例如从WO2006/044825；WO2006/002236；WO2005/051922；WO2006/060737；WO03/060064；WO03/040979；和WO03/049527中获知。

通常，KSP抑制剂具有下列亚结构I(sub)：

其中

#a代表与所述分子剩余部分的键；

R^1a代表H或-(CH₂)_0-3Z，其中Z代表-H、卤素、NHY³、-CO-NY¹Y²或-CO-OY³，

其中Y¹和Y²彼此独立地代表H、NH₂、-(CH₂CH₂O)_0-3-(CH₂)_0-3Z'（例如-(CH₂)_0-3Z'）或-CH(CH₂W)Z'，且Y³代表H或-(CH₂)_0-3Z'，其中Z'代表H、SO₃H、NH₂、COOH、-NH-CO-CH₂-CH₂-CH(NH₂)COOH或-(CO-NH-CHY⁴)_1-3COOH，其中W代表H或OH，

其中Y⁴彼此独立地代表任选被–NHCONH₂取代的直链或支化的C_1-6-烷基，或代表任选被–NH₂取代的芳基或苄基；

R^2a和R^4a彼此独立地代表H、-CO-CHY⁴-NHY⁵或-(CH₂)_0-3Z，或R^2a和R^4a一起（形成吡咯烷环）代表–CH₂-CHR¹⁰-或-CHR¹⁰-CH₂-，其中R¹⁰代表H、NH₂、COOH、SO₃H、SH或OH，

其中Z代表-H、-OY³、-SY³、NHY³、-CO-NY¹Y²或-CO-OY³，

其中Y¹和Y²彼此独立地代表H、NH²或-(CH₂)_0-3Z'，且Y³代表H或-(CH₂)_0-3Z'，其中Z'代表H、SO₃H、NH₂或COOH，

其中Y⁴彼此独立地代表任选被–NHCONH₂取代的直链或支化的C_1-6-烷基，或代表任选被–NH₂取代的芳基或苄基，且Y⁵代表H或–CO-CHY⁶-NH₂，其中Y⁶代表直链或支化的C_1-6-烷基。

特别常遇到下列亚结构II(sub)

其中#a、R^1a、R^2a、R^4a具有与I(sub)中相同的含义且R^12a和R^13a代表H或R^12a和R^13a一起（形成哌啶环）代表–CH₂-CHR¹⁰-或-CHR¹⁰-CH₂-，其中R¹⁰代表H、NH₂、COOH、SO₃H、SH或OH；

其中Z代表-H、-OY³、-SY³、NHY³、-CO-NY¹Y²或-CO-OY³，

其中Y¹和Y²彼此独立地代表H、NH₂或-(CH₂CH₂O)_0-3-(CH₂)_0-3Z'（例如-(CH₂)_0-3Z'），且Y³代表H或-(CH₂)_0-3Z'，其中Z'代表H、SO₃H、NH₂、COOH或-(CO-NH-CHY⁴)_1-3COOH，其中Y⁴彼此独立地代表任选被–NHCONH₂取代的直链或支化的C_1-6-烷基，或代表任选被–NH₂取代的芳基或苄基。

特别地，许多KSP抑制剂具有亚结构II(sub)，其中R^1a、R^2a、R^4a、R^12a和R^13a代表H。

根据本发明，可以使用亚结构I(sub)或亚结构II(sub)的KSP抑制剂。根据本发明使用的KSP抑制剂还包括例如伊斯平斯（Cytokinetics/GSK）、MK-0731（Merck）、AZD4877（AstraZeneca）、ARRY-520（Array BioPharma）和ARQ 621（ArQule）。

根据本发明优选的KSP抑制剂具有下列基本结构及其盐、溶剂合物和溶剂合物的盐：

式(I):

其中

R^1a代表H、-MOD或-(CH₂)_0-3Z，其中Z代表-H、卤素、-OY³、-SY³、-NHY³、-CO-NY¹Y²或-CO-OY³，

其中Y¹和Y²彼此独立地代表H、NH₂、-(CH₂CH₂O)_0-3-(CH₂)_0-3Z'（例如-(CH₂)_0-3Z'）或-CH(CH₂W)Z'，且Y³代表H或-(CH₂)_0-3Z'，其中Z'代表H、SO₃H、NH₂、COOH、-NH-CO-CH₂-CH₂-CH(NH₂)COOH或-(CO-NH-CHY⁴)_1-3COOH，其中W代表H或OH，

其中Y⁴彼此独立地代表任选被–NHCONH₂取代的直链或支化的C_1-6-烷基，或代表任选被–NH₂取代的芳基或苄基；

R^2a和R^4a彼此独立地代表H、-CO-CHY⁴-NHY⁵或-(CH₂)_0-3Z，或R^2a和R^4a一起（形成吡咯烷环）代表–CH₂-CHR¹⁰-或-CHR¹⁰-CH₂-，其中R¹⁰代表H、SO₃H、NH₂、COOH、SH或OH，

其中Z代表-H、卤素、-OY³、-SY³、NHY³、-CO-NY¹Y²或-CO-OY³，

其中Y₁和Y₂彼此独立地代表H、NH₂或-(CH₂)_0-3Z'，且Y³代表H或-(CH₂)_0-3Z'，其中Z'代表H、SO₃H、NH₂或COOH；

其中Y⁴彼此独立地代表任选被–NHCONH₂取代的直链或支化的C_1-6-烷基，或代表任选被–NH₂取代的芳基或苄基，且Y⁵代表H或–CO-CHY⁶-NH₂，其中Y⁶代表直链或支化的C_1-6-烷基，

R^3a代表–MOD或任选取代的烷基、环烷基、芳基、杂芳基、杂烷基或杂环烷基，

优选C_1-10-烷基、C_6-10-芳基或C_6-10-芳烷基、C_5-10-杂烷基、C_1-10-烷基-O-C_6-10-芳基或C_5-10-杂环烷基，其可被1-3个–OH基团、1-3个卤素原子、1-3个卤代烷基（各自具有1-3个卤素原子）、1-3个O-烷基、1-3个–SH基团、1-3个-S-烷基、1-3个-O-CO-烷基、1-3个-O-CO-NH-烷基、1-3个-NH-CO-烷基、1-3个-NH-CO-NH-烷基、1-3个-S(O)_n-烷基、1-3个-SO₂-NH-烷基、1-3个-NH-烷基、1-3个-N(烷基)₂基团、1-3个-NH₂基团或1-3个-(CH₂)_0-3Z基团取代，其中Z代表-H、卤素、-OY³、-SY³、-NHY³、-CO-NY¹Y²或-CO-OY³，其中Y¹和Y²彼此独立地代表H、NH₂或-(CH₂)_0-3Z'，且Y³代表H、-(CH₂)_0-3-CH(NHCOCH₃)Z'、-(CH₂)_0-3-CH(NH₂)Z'或-(CH₂)_0-3Z'，其中Z'代表H、SO₃H、NH₂或COOH（其中“烷基”优选代表C_1-10-烷基)；

R^8a代表C_1-10-烷基；

HZ代表可被选自卤素、可任选被卤素取代的C_1-10-烷基、C_6-10-芳基或C_6-10-芳烷基的一个或多个取代基取代的单环或双环杂环；

其中–MOD代表–(NR¹⁰)n-(G1)o-G2-H，其中

R¹⁰代表H或C₁-C₃-烷基；

G1代表–NHCO-、-CONH-或（其中，如果G1代表–NHCO-或，则R¹⁰不代表NH₂）；

n是0或1；

o是0或1；且

G2代表直链和/或支化的烃基，其具有1至10个碳原子并可被基团-O-、-S-、-SO-、SO₂、-NR^y-、-NR^yCO-、CONR^y-、-NR^yNR^y-、-SO₂NR^yNR^y-、-CONR^yNR^y-（其中R^y代表H、苯基、C₁-C₁₀-烷基、C₂-C₁₀-烯基或C₂-C₁₀-炔基，它们各自可被-NHCONH₂、-COOH、-OH、-NH₂、NH-CNNH₂、磺酰胺、砜、亚砜或磺酸取代）、-CO-、-CR^x=N-O-（其中Rx代表H、C₁-C₃-烷基或苯基）的一个或多个中断一次或多次，其中如果存在烃链包括侧链，其可被-NHCONH₂、-COOH、-OH、-NH₂、NH-CNNH₂、磺酰胺、砜、亚砜或磺酸取代，其中基团–MOD优选具有至少一个基团-COOH。

根据本发明，此类纺锤体驱动蛋白抑制剂可通过取代R^1a、R^2a、R^3a、R^4a、R^8a或R¹⁰处的氢原子或任选经由HZ的取代基之一，特别经由R^1a、R^2a、R^3a、R^4a或R¹⁰连接到连接体上。

式(I)的取代基优选具有下列含义，其中这些优选含义优选互相组合。

R^1a优选代表H或-(CH₂)_0-3Z，其中Z代表-H、卤素、-OY³、-SY³、-NHY³、-CO-NY¹Y²或-CO-OY³，

其中Y¹和Y²彼此独立地代表H、NH₂、-(CH₂CH₂O)_0-3-(CH₂)_0-3Z'（例如-(CH₂)_0-3Z'）或-CH(CH₂W)Z'，且Y³代表H或-(CH₂)_0-3Z'，其中Z'代表H、SO₃H、NH₂、COOH、-NH-CO-CH₂-CH₂-CH(NH₂)COOH或-(CO-NH-CHY⁴)_1-3COOH，其中W代表H或OH，

其中Y⁴彼此独立地代表任选被–NHCONH₂取代的直链或支化的C_1-6-烷基，或代表任选被–NH₂取代的芳基或苄基；

R^2a和R^4a彼此独立地优选代表H、-COCHY⁴-NHY⁵或-(CH₂)_0-3Z，或R^2a和R^4a一起（形成吡咯烷环）代表–CH₂-CHR¹⁰-或-CHR¹⁰-CH²-，其中R¹⁰代表H、SO₃H、NH₂、COOH、SH或OH，

其中Z代表-H、卤素、-OY³、-SY³、NHY³、-CO-NY¹Y²或-CO-OY³，

其中Y¹和Y²彼此独立地代表H、NH₂或-(CH²)_0-3Z'，且Y³代表H或-(CH₂)_0-3Z'，其中Z'代表H、SO₃H、NH₂或COOH，其中Y⁴彼此独立地代表任选被–NHCONH₂取代的直链或支化的C_1-6-烷基，或代表任选被–NH₂取代的芳基或苄基，且Y⁵代表H或–CO-CHY⁶-NH₂，其中Y⁶代表直链或支化的C_1-6-烷基。

R³优选代表任选取代的烷基、芳基、杂芳基、杂烷基、杂环烷基，优选–L-#1或C_1-10-烷基、C_6-10-芳基或C_6-10-芳烷基、C_5-10-杂烷基、C_1-10-烷基-O-C_6-10-芳基或C_5-10-杂环烷基，其可被1-3个–OH基团、1-3个卤素原子、1-3个卤代烷基（各自具有1-3个卤素原子）、1-3个O-烷基、1-3个–SH基团、1-3个-S-烷基、1-3个-O-CO-烷基、1-3个-O-CO-NH-烷基、1-3个-NH-CO-烷基、1-3个-NH-CO-NH-烷基、1-3个-S(O)_n-烷基、1-3个-SO₂-NH-烷基、1-3个-NH-烷基、1-3个-N(烷基)₂基团、1-3个-NH₂基团或1-3个-(CH₂)_0-3Z基团取代，其中Z代表-H、卤素、-OY³、-SY³、-NHY³、-CO-NY¹Y²或-CO-OY³，其中Y¹和Y²彼此独立地代表H、NH₂或-(CH₂)_0-3Z'，且Y³代表H、-(CH₂)_0-3-CH(NHCOCH₃)Z'、-(CH₂)_0-3-CH(NH₂)Z'或-(CH₂)_0-3Z'，其中Z'代表H、SO₃H、NH₂或COOH（其中“烷基”优选代表C_1-10-烷基）。

R^8a优选代表C_1-10-烷基。

HZ优选代表可被选自卤素、可任选被卤素取代的C_1-10-烷基、C_6-10-芳基或C_6-10-芳烷基的一个或多个取代基取代的单环或双环杂环。

C_1-10-烷基在本发明中（即在上式中以及在下式中）代表具有1至10个碳原子的直链或支化的烷基。可作为优选提到的实例是：甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、1-甲基丙基和叔丁基。

C_6-10-芳基-在本发明中代表单环或双环芳族碳环，例如苯基和萘基。

C_6-10-芳烷基在本发明中代表C1-C4-烷基连接到其上的单环芳族碳环，例如苯基。示例性C_6-10-芳烷基是苄基。

C_5-10-杂芳基在本发明中代表具有总共6至10个环原子的单环或双环芳族杂环，其中该一个或多个环含有一个或两个选自N、O、S、SO和SO₂的环杂原子并经环碳原子或任选环氮原子连接。可提到的实例是吡啶基、呋喃基、嘧啶基、咪唑基、噻吩基、苯硫基、异噁唑基、异噻唑基、1,2,3-噁二唑基、呋咱基、1,2,3-三唑基、1,2,4-三唑基、哒嗪基、吡咯基、三嗪基、吲哚基、喹啉基、喹唑啉基、1,3-苯并二氧戊环基、异吲哚基、吲唑基、1H-吡唑并[3,4-d]嘧啶基、苯并三唑基、异喹啉基、噌啉基（Sinolinyl）、酞嗪基、蝶啶基、萘啶基、苯并咪唑啉基、苯并噻唑啉基、苯并噁唑啉基、3,4-亚甲基二氧基苯基和苯并[6]呋喃基。

单环或双环杂环在本发明中代表具有总共5至10个环碳原子的单环或双环杂环，其中该一个或多个环含有一至三个选自N、O、S、SO和SO₂的环杂原子并经环碳原子或任选环氮原子连接。可提到的实例是哌啶基、吡咯啉基、吗啉基、3,4-亚甲基二氧基苯基和四氢呋喃基。

卤素原子在本发明中代表F、Cl、Br或I。

通过亚结构I(sub)或亚结构II(sub)中的R^1a、R^2a、R^4a或R¹⁰或式(I)中的HZ处的R^1a、R^2a、R^3a、R^4a、R^8a或R¹⁰处的氢原子的取代，式(I)的化合物可以以普通技术人员已知的方式连接到连接体上。特别优选在R^1a、R^2a、R^3a、R^4a处或在由R^2a和R^4a形成的吡咯烷环处发生氢原子的取代。这种偶联可通过如实施例中的图式7至31中示例性显示的各种途径化学进行。特别地，任选可以改性要偶联到连接体上的低分子量KSP抑制剂，例如通过引入保护基或离去基以促进取代（以使在该反应中，所述离去基而非氢原子被连接体取代）。由此获得的KSP抑制剂 – 连接体分子（其中该连接体具有用于偶联到结合体上的反应性基团）可随后与结合体反应以产生根据本发明的结合体偶联物。在实验部分中，通过大量实施例以示例性方式例示这一程序。

R^1a优选是H、-COOH、-CONHNH₂、-(CH₂)_1-3NH₂、-CONZ''(CH₂)_1-3 NH₂和–CONZ''CH₂COOH，其中Z''代表H或NH₂。

R^2a和R^4a优选是H，或R^2a和R^4a一起（形成吡咯烷环）代表CH₂-CHR¹⁰-或-CHR¹⁰-CH₂-，其中R¹⁰代表H。

R^3a优选是C_1-10-烷基-，其可被–OH、O-烷基、SH、S-烷基、O-CO-烷基、O-CO-NH-烷基、NH-CO-烷基、NH-CO-NH-烷基、S(O)_n-烷基、SO₂-NH-烷基、NH-烷基、N(烷基)₂或NH₂取代（其中烷基优选为C_1-3-烷基）。

R^8a优选是支化的C_1-5-烷基，优选甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、1-甲基丙基和叔丁基。

HZ优选是可被选自卤素、可任选被卤素取代的C_1-10-烷基、C_6-10-芳基或C_6-10-芳烷基的一个或多个取代基取代的单环或双环杂环。

HZ特别优选是取代的吡咯、吡唑、咪唑、喹唑啉或二氢喹唑啉，其在邻位（相对于含R1a等的取代基）被任选取代的苄基取代。此外，该取代的吡咯、吡唑、咪唑或喹唑啉可优选被氧代基（在二氢喹唑啉的情况下）或被1或2个卤素原子取代的苯基取代。HZ特别优选是取代的吡咯。

优选使用的KSP抑制剂是伊斯平斯。另一优选的KSP抑制剂是Arry-520。

其它特别优选的化合物具有下式(IIa)或(II)：

式(IIa)，及其盐、溶剂合物和溶剂合物的盐:

其中

X₁代表N，X₂代表N且X₃代表C；或

X₁代表N，X₂代表C且X₃代表N；或

X₁代表CH或CF，X₂代表C且X₃代表N；或

X₁代表NH，X₂代表C且X₃代表C；或

X₁代表CH或CF，X₂代表N且X₃代表C；

（其中X₁代表CH，X₂代表C且X₃代表N是优选的）；

R¹代表H、–L-#1、–MOD或-(CH₂)_0-3Z，其中Z代表-H、-NHY³、-OY³、-SY³、卤素、-CO-NY¹Y²或-CO-OY³，

其中Y¹和Y²彼此独立地代表H、NH₂、-(CH₂CH₂O)_0-3-(CH₂)_0-3Z'（例如-(CH₂)_0-3Z'）或-CH(CH₂W)Z'，且Y³代表H或-(CH₂)_0-3Z'，其中Z'代表H、NH₂、SO₃H、COOH、-NH-CO-CH₂-CH₂-CH(NH₂)COOH或-(CO-NH-CHY⁴)_1-3COOH，其中W代表H或OH，

其中Y⁴彼此独立地代表任选被–NHCONH₂取代的直链或支化的C_1-6-烷基，或代表任选被–NH₂取代的芳基或苄基；

R²代表–L-#1、H、-MOD、-CO-CHY⁴-NHY⁵或-(CH₂)_0-3Z，

其中Z代表-H、卤素、-OY³、-SY³、NHY³、-CO-NY¹Y²或-CO-OY³，

其中Y¹和Y²彼此独立地代表H、NH₂或-(CH₂)_0-3Z'，且Y³代表H或-(CH₂)_0-3Z'，其中Z'代表H、SO₃H、NH₂或COOH；

其中Y⁴彼此独立地代表任选被–NHCONH₂取代的直链或支化的C_1-6烷基，或代表任选被–NH₂取代的芳基或苄基，且Y⁵代表H或–CO-CHY⁶-NH₂，其中Y⁶代表直链或支化的C_1-6-烷基；

R⁴代表–L-#1、H、-CO-CHY⁴-NHY⁵或-(CH₂)_0-3Z，

其中Z代表-H、卤素、-OY³、-SY³、NHY³、-CO-NY¹Y²或-CO-OY³，

其中Y¹和Y²彼此独立地代表H、NH₂或-(CH₂)_0-3Z'，且Y³代表H或-(CH₂)_0-3Z'，其中Z'代表H、SO₃H、NH₂或COOH；

其中Y⁴彼此独立地代表任选被–NHCONH₂取代的直链或支化的C_1-6烷基，或代表任选被–NH₂取代的芳基或苄基，且Y⁵代表H或–CO-CHY⁶-NH₂，其中Y⁶代表直链或支化的C_1-6-烷基；

或R²和R⁴一起（形成吡咯烷环）代表–CH₂-CHR¹⁰-或-CHR¹⁰-CH₂-，其中R¹⁰代表L-#1、H、NH₂、SO₃H、COOH、SH或OH；

A代表CO、SO、SO₂、SO₂NH或CNNH；

R³代表–L-#1、-MOD或任选取代的烷基、环烷基、芳基、杂芳基、杂烷基、杂环烷基，优选C_1-10-烷基、C_6-10-芳基或C_6-10-芳烷基、C_5-10-杂烷基、C_1-10-烷基-O-C_6-10-芳基或C_5-10-杂环烷基，其可被1-3个–OH基团、1-3个卤素原子、1-3个卤代烷基（各自具有1-3个卤素原子）、1-3个O-烷基、1-3个–SH基团、1-3个-S-烷基、1-3个-O-CO-烷基、1-3个-O-CO-NH-烷基、1-3个-NH-CO-烷基、1-3个-NH-CO-NH-烷基、1-3个-S(O)_n-烷基、1-3个-SO₂-NH-烷基、1-3个-NH-烷基、1-3个-N(烷基)₂基团、1-3个-NH((CH₂CH₂O)_1-20H)基团、1-3个-NH₂基团或1-3个-(CH₂)_0-3Z基团取代，其中Z代表-H、卤素、-OY³、-SY³、-NHY³、-CO-NY¹Y²或-CO-OY³，其中Y¹和Y²彼此独立地代表H、NH₂或-(CH₂)_0-3Z'，且Y³代表H、-(CH₂)_0-3-CH(NHCOCH₃)Z'、-(CH₂)_0-3-CH(NH₂)Z'或-(CH₂)_0-3Z'，其中Z'代表H、SO₃H、NH₂或COOH（其中“烷基”优选是C_1-10-烷基）；

R⁵代表–L-#1、H、-MOD、NH₂、NO₂、卤素（特别是F、Cl、Br）、-CN、CF₃、-OCF₃、-CH₂F、-CH₂F、SH或-(CH₂)_0-3Z，其中Z代表-H、-OY³、-SY³、卤素、NHY³、-CO-NY¹Y²或-CO-OY³，

其中Y¹和Y²彼此独立地代表H、NH₂或-(CH₂)_0-3Z'，且Y³代表H或-(CH₂)_0-3Z'，其中Z'代表H、SO₃H、NH₂或COOH；

R⁶和R⁷彼此独立地代表H、氰基、（任选氟代的）C_1-10-烷基、（任选氟代的）C_2-10-烯基、（任选氟代的）C_2-10-炔基、羟基、NO₂、NH₂、COOH或卤素（特别是F、Cl、Br），

R⁸代表（任选氟代的）C_1-10-烷基、（任选氟代的）C_2-10-烯基、（任选氟代的）C_2-10-炔基、（任选氟代的）C_4-10-环烷基或–(CH₂)_0-2-(HZ²)，其中HZ²代表具有最多2个选自N、O和S的杂原子的4-至7元杂环（优选氧杂环丁烷），其中这些基团的每个可被–OH、CO₂H或NH₂或L-#1取代；

其中取代基R¹、R²、R³、R⁴、R⁵、R⁸和R¹⁰之一或无一代表（或在R⁸的情况下含有）–L-#1，

L代表连接体且#1代表与所述结合体或其衍生物的键，

R⁹代表H、F、CH₃、CF₃、CH₂F或CHF₂；

其中–MOD代表–(NR¹⁰)_n-(G1)_o-G2-H，其中

R¹⁰代表H或C₁-C₃-烷基；

G1代表–NHCO-、-CONH-或（其中，如果G1代表–NHCO-或，则R¹⁰不代表NH₂）；

n是0或1；

o是0或1；且

G2代表直链和/或支化的烃基，其具有1至10个碳原子并可被基团-O-、-S-、-SO-、SO₂、-NR^y-、-NR^yCO-、CONR^y-、-NR^yNR^y-、-SO₂NR^yNR^y-、-CONR^yNR^y-（其中R^y代表H、苯基、C₁-C₁₀-烷基、C₂-C₁₀-烯基或C₂-C₁₀-炔基，它们各自可被-NHCONH₂、-COOH、-OH、-NH₂、NH-CNNH₂、磺酰胺、砜、亚砜或磺酸取代）、-CO-、-CR^x=N-O-（其中Rx代表H、C₁-C₃-烷基或苯基）的一个或多个中断一次或多次，其中如果存在烃链包括侧链，其可被-NHCONH₂、-COOH、-OH、-NH₂、NH-CNNH₂、磺酰胺、砜、亚砜或磺酸取代，其中基团–MOD优选具有至少一个基团-COOH。

式(II)，及其盐、溶剂合物和溶剂合物的盐:

其中

X₁代表N，X₂代表N且X₃代表C；或

X₁代表N，X₂代表C且X₃代表N；或

X₁代表CH或CF，X₂代表C且X₃代表N；或

X₁代表NH，X₂代表C且X₃代表C；或

X₁代表CH，X₂代表N且X₃代表C

R¹代表H、–L-#1或-(CH₂)_0-3Z，其中Z代表-H、-NHY³、-OY³、-SY³、卤素、-CO-NY¹Y²或-CO-OY³，

其中Y¹和Y²彼此独立地代表H、NH₂、-(CH₂CH₂O)_0-3-(CH₂)_0-3Z'（例如-(CH₂)_0-3Z'）或-CH(CH₂W)Z'，且Y³代表H或-(CH₂)_0-3Z'，其中Z'代表H、NH₂、SO₃H、COOH、-NH-CO-CH₂-CH₂-CH(NH₂)COOH或-(CO-NH-CHY⁴)_1-3COOH，其中W代表H或OH；

其中Y⁴彼此独立地代表任选被–NHCONH₂取代的直链或支化的C_1-6-烷基，或代表任选被–NH₂取代的芳基或苄基；

R²和R⁴彼此独立地代表H、–L-#1、-CO-CHY⁴-NHY⁵或-(CH₂)_0-3Z，或R²和R⁴一起（形成吡咯烷环）代表–CH₂-CHR¹⁰-或-CHR¹⁰-CH₂-，其中R¹⁰代表H、–L-#1、NH₂、SO₃H、COOH、SH或OH，

其中Z代表-H、卤素、-OY³、-SY³、NHY³、-CO-NY¹Y²或-CO-OY³，

其中Y¹和Y²彼此独立地代表H、NH₂或-(CH₂)_0-3Z'，且Y³代表H或-(CH₂)_0-3Z'，其中Z'代表H、SO₃H、NH₂或COOH；

其中Y⁴彼此独立地代表任选被–NHCONH₂取代的直链或支化的C_1-6-烷基或代表任选被–NH₂取代的芳基或苄基，其中Y⁴彼此独立地代表任选被–NHCONH₂取代的直链或支化的C_1-6-烷基或代表任选被–NH₂取代的芳基或苄基，且Y⁵代表H或–CO-CHY⁶-NH₂，其中Y⁶代表直链或支化的C_1-6-烷基；

A代表CO、SO、SO₂、SO₂NH或CNNH；

R³代表任选取代的烷基、芳基、杂芳基、杂烷基、杂环烷基，优选–L-#1或C_1-10-烷基、C_6-10-芳基或C_6-10-芳烷基、C_5-10-杂烷基、C_1-10-烷基-O-C_6-10-芳基或C_5-10-杂环烷基，其可被1-3个–OH基团、1-3个卤素原子、1-3个卤代烷基（各自具有1-3个卤素原子）、1-3个O-烷基、1-3个–SH基团、1-3个-S-烷基、1-3个-O-CO-烷基、1-3个-O-CO-NH-烷基、1-3个-NH-CO-烷基、1-3个-NH-CO-NH-烷基、1-3个-S(O)_n-烷基、1-3个-SO₂-NH-烷基、1-3个-NH-烷基、1-3个-N(烷基)₂基团、1-3个-NH₂基团或1-3个-(CH₂)_0-3Z基团取代，其中Z代表-H、卤素、-OY³、-SY³、-NHY³、-CO-NY¹Y²或-CO-OY³，其中Y¹和Y²彼此独立地代表H、NH₂或-(CH₂)_0-3Z'，且Y³代表H、-(CH₂)_0-3-CH(NHCOCH₃)Z'、-(CH₂)_0-3-CH(NH₂)Z'或-(CH₂)_0-3Z'，其中Z'代表H、SO₃H、NH₂或COOH（其中“烷基”优选代表C_1-10-烷基）；

R⁵代表H、F、NH₂、NO₂、卤素、SH或-(CH₂)_0-3Z，其中Z代表-H、卤素、-OY³、-SY³、NHY³、-CO-NY¹Y²或-CO-OY³，

其中Y¹和Y²彼此独立地代表H、NH₂或-(CH₂)_0-3Z'，且Y³代表H或-(CH₂)_0-3Z'，其中Z'代表H、SO₃H、NH₂或COOH；

R⁶和R⁷彼此独立地代表H、氰基、（任选氟代的）C_1-10-烷基、（任选氟代的）C_2-10-烯基、（任选氟代的）C_2-10-炔基、羟基或卤素，

R⁸代表（任选氟代的）C_1-10-烷基、（任选氟代的）C_4-10-环烷基或任选取代的氧杂环丁烷；且

R⁹代表H、F、CH₃、CF₃、CH₂F或CHF₂。

通过以普通技术人员已知的方式取代R¹、R²、R³、R⁴、R⁵或R⁸处或由R²和R⁴形成的吡咯烷环(R¹⁰)处的氢原子，可以将其中取代基R¹、R²、R³、R⁴、R⁵、R⁸和R¹⁰无一代表–L-#1的式(IIa)或(II)的化合物连接到连接体上。这产生式(IIa)或(II)的偶联物，其中取代基R¹、R²、R³、R⁴、R⁵、R⁸或R¹⁰之一代表–L-#1，L代表连接体且#1代表与结合体或其衍生物的键。如果根据式(IIa)或(II)的KSP抑制剂与结合体偶联，取代基R¹、R²、R³、R⁴、R⁵、R⁸或R¹⁰之一因此代表–L-#1，其中L代表连接体且#1代表与结合体或其衍生物的键。即在偶联物的情况中取代基R¹、R²、R³、R⁴、R⁵、R⁸和R¹⁰之一代表–L-#1，其中–L-#1连接到结合体，例如抗体上。特别优选地，取代基R¹和R³之一代表–L-#1。该结合体优选是人、人源化或嵌合单克隆抗体或其抗原结合片段，特别是抗-TWEAKR抗体或其抗原结合片段或抗-EGFR抗体或其抗原结合片段。特别优选的是特异性结合到TWEAKR（SEQ ID NO:169）的位置47中的氨基酸D（D47）上的抗-TWEAKR抗体，特别是抗-TWEAKR抗体TPP-2090或抗-EGFR抗体西妥昔单抗或尼妥珠单抗。

基团–L-#3也可以代替–L-#1存在于该化合物中，其中L代表连接体且#3代表用于结合到结合体或其衍生物上的反应性基团。包含–L-#3的化合物是与结合体或其衍生物反应的反应性化合物。#3优选是与氨基或硫醇基团反应以形成共价键，优选与蛋白质中的半胱氨酸残基反应的基团。蛋白质中的半胱氨酸残基可以天然存在于该蛋白质中，通过生物化学方法引入，或优选通过结合体的二硫化物的预先还原而生成。

下述式(IIa)或(II)的化合物特别优选，其中取代基R¹、R²、R³、R⁴、R⁵和R¹⁰之一代表–L-#1且其中

X¹代表N，X₂代表N且X₃代表C；

X₁代表CH或CF，X₂代表C且X₃代表N；

X₁代表NH，X₂代表C且X₃代表C；或

X₁代表CH，X₂代表N且X₃代表C，

特别是其中X₁代表N，X₂代表N且X₃代表C；或X₁代表CH，X₂代表C且X₃代表N的那些。特别优选的是其中X₁代表CH，X₂代表C且X₃代表N的化合物。

对于A，优选的是CO（羰基）。

R¹优选是–L-#1、H、-COOH、-CONHNH₂、-(CH₂)_1-3NH₂、-CONZ''(CH₂)_1-3 NH₂和–CONZ''CH₂COOH，其中Z''代表H或NH₂。

R²和R⁴优选是H、–L-#1，或R²和R⁴一起（形成吡咯烷环）代表CH₂-CHR¹⁰-或-CHR¹⁰-CH₂-，其中R¹⁰代表H或–L-#1。

R³优选是–L-#1或C_1-10-烷基-，其可任选被–OH、O-烷基、SH、S-烷基、O-CO-烷基、O-CO-NH-烷基、NH-CO-烷基、NH-CO-NH-烷基、S(O)_n-烷基、SO₂-NH-烷基、NH-烷基、N(烷基)₂或NH₂取代（其中烷基优选是C_1-3-烷基）。

R⁵优选是–L-#1、H或F。

R⁶和R⁷彼此独立地优选为H、（任选氟代的）C_1-3-烷基、（任选氟代的）C_2-4-烯基、（任选氟代的）C_2-4-炔基、羟基或卤素，

R⁸优选是支化的C_1-5-烷基，特别是式–C(CH₃)₂-(CH₂)_0-2 –R_y的基团，其中R_y代表–H、–OH、CO₂H、NH₂或–L-#1。特别优选的是式–C(CH₃)₂-(CH₂) –R_y的基团，其中R_y代表–H或–L-#1。

R⁹优选是H或F。

特别优选的是下述式(IIa)或(II)的化合物，其中取代基R¹、R²、R³、R⁴、R⁵、R⁸和R¹⁰无一或之一代表–L-#1，且

其中

X₁代表N，X₂代表N且X₃代表C；

X₁代表CH或CF，X₂代表C且X₃代表N；

X₁代表NH，X₂代表C且X₃代表C；或

X₁代表CH，X₂代表N且X₃代表C

A代表CO（羰基）；

R¹代表H、-COOH、-CONHNH₂、-(CH₂)_1-3NH₂、-CONZ''(CH₂)_1-3 NH₂和–CONZ''CH₂COOH，其中Z''代表H或NH₂；

R²和R⁴代表H或R²和R⁴一起（形成吡咯烷环）代表-CH₂-CHR¹⁰-或–CHR¹⁰-CH₂-，其中R¹⁰代表H或–L-#1；

R³代表可被卤素（特别是F）或任选氟代的C_1-3-烷基单取代或多取代的苯基，或代表可任选被–OY⁴、-SY⁴、-O-CO-Y⁴、-O-CO-NH-Y⁴、NH-CO-Y⁴、-NH-CO-NH-Y⁴、S(O)_n-Y⁴（其中n代表0、1或2）、-SO₂-NH-Y⁴、NH-Y⁴或N(Y⁴)₂取代的任选氟代的C_1-10-烷基，其中Y⁴代表H、苯基（任选被卤素（特别是F）或任选氟代的C_1-3-烷基单取代或多取代）或烷基（其中该烷基可被–OH、-COOH和/或-NHCO-C_1-3-烷基取代，且其中烷基优选代表C_1-3-烷基）；

其中R³特别优选可被–OH、O-烷基、SH、S-烷基、O-CO-烷基、O-CO-NH-烷基、NH-CO-烷基、NH-CO-NH-烷基、S(O)_n-烷基、SO₂-NH-烷基、NH-烷基、N(烷基)₂或NH₂取代（其中烷基优选是指C_1-3-烷基）

R⁵代表H或F；

R⁶和R⁷彼此独立地代表H、（任选氟代的）C_1-3-烷基、（任选氟代的）C_2-4-烯基、（任选氟代的）C_2-4-炔基、羟基或卤素；

R⁸代表支化的C_1-5-烷基；且

R⁹代表H或F。

此外，优选的是（独自或组合）

●R¹代表–L-#1、COOH或H,

● R²和R⁴彼此独立地代表–L-#1或H或R²和R⁴一起（形成吡咯烷环）代表–CH₂-CHR¹⁰-或–CHR¹⁰-CH₂-，其中R¹⁰代表H或–L-#1，

●A代表CO，

●R³代表-(CH₂)OH、-CH(CH₃)OH、-CH₂SCH₂CH(COOH)NHCOCH₃、-CH(CH₃)OCH₃、可被1-3个卤素原子、1-3个氨基或1-3个烷基（可任选卤代）取代的苯基，或代表–L-#1，

●R⁵代表–L-#1或H,

●R⁶和R⁷彼此独立地代表H、C_1-3-烷基或卤素；R⁶和R⁷特别代表F；

●R⁸代表C_1-4-烷基（优选叔丁基）；和/或

●R⁹代表H，

●其中取代基R¹、R²、R³、R⁴、R⁵和R¹⁰之一代表–L-#1。

另外，根据本发明优选的是

●R¹代表–L-#1、COOH或H，

●R²和R⁴彼此独立地代表–L-#1或H或R²和R⁴一起（形成吡咯烷环）代表–CH₂-CHR¹⁰-或–CHR¹⁰-CH₂-，其中R¹⁰代表H或–L-#1，

●A代表CO，

●R³代表-(CH₂)OH、-CH(CH₃)OH、-CH₂SCH₂CH(COOH)NHCOCH₃、-CH(CH₃)OCH₃、可被1-3个卤素原子、1-3个氨基或1-3个烷基（可任选卤代）取代的苯基，或代表–L-#1，

●R⁵代表–L-#1或H，

●R⁶和R⁷彼此独立地代表H、C_1-3-烷基或卤素；R⁶和R⁷特别代表F；

●R⁸代表C_1-4-烷基（优选叔丁基）；且

●R⁹代表H，

●其中取代基R¹、R²、R³、R⁴、R⁵和R¹⁰之一代表–L-#1。

其它特别优选的化合物具有下式(IIIa)或(III)及其盐、溶剂合物和溶剂合物的盐：

式(IIIa):

其中

X₁代表N，X₂代表N且X₃代表C；或

X₁代表N，X₂代表C且X₃代表N；或

X₁代表CH或CF，X₂代表C且X₃代表N；或

X₁代表NH，X₂代表C且X₃代表C；或

X₁代表CH，X₂代表N且X₃代表C

（其中X₁代表CH，X₂代表C且X₃代表N是优选的）；

R¹代表H、–L-BINDER、–MOD或-(CH₂)_0-3Z，其中Z代表-H、-NHY³、-OY³、-SY³、卤素、-CO-NY¹Y²或-CO-OY³，

其中Y¹和Y²彼此独立地代表H、NH₂、-(CH₂CH₂O)_0-3-(CH₂)_0-3Z'（例如-(CH₂)_0-3Z'）或-CH(CH₂W)Z'，且Y³代表H或-(CH₃)_0-3Z'，其中Z'代表H、NH₂、SO₃H、-COOH、-NH-CO-CH₂-CH₂-CH(NH₂)COOH或-(CO-NH-CHY⁴)_1-3COOH，其中W代表H或OH，

其中Y⁴彼此独立地代表任选被–NHCONH₂取代的直链或支化的C_1-6-烷基，或代表任选被–NH₂取代的芳基或苄基；

R²代表H、-L-BINDER、-MOD、-CO-CHY⁴-NHY⁵或-(CH₂)_0-3Z，其中Y⁴彼此独立地代表任选被–NHCONH₂取代的直链或支化的C_1-6烷基，或代表任选被–NH₂取代的芳基或苄基，且Y⁵代表H或–CO-CHY⁶-NH₂，其中Y⁶代表直链或支化的C_1-6-烷基；

其中Z代表-H、卤素、-OY³、-SY³、NHY³、-CO-NY¹Y²或-CO-OY³，

其中Y¹和Y²彼此独立地代表H、NH₂或-(CH₂)_0-3Z'，且Y³代表H或-(CH₂)_0-3Z'，其中Z'代表H、SO₃H、NH₂或COOH；

R⁴代表H、-L-BINDER、-CO-CHY⁴-NHY⁵或-(CH₂)_0-3Z，

其中Z代表-H、卤素、-OY³、-SY³、NHY³、-CO-NY¹Y²或-CO-OY³，

其中Y¹和Y²彼此独立地代表H、NH₂或-(CH₂)_0-3Z'，且Y³代表H或-(CH₂)_0-3Z'，其中Z'代表H、SO₃H、NH₂或COOH；

其中Y⁴彼此独立地代表任选被–NHCONH₂取代的直链或支化的C_1-6烷基，或代表任选被–NH₂取代的芳基或苄基，且Y⁵代表H或–CO-CHY⁶-NH₂，其中Y⁶代表直链或支化的C_1-6-烷基；

或R²和R⁴一起（形成吡咯烷环）代表–CH₂-CHR¹⁰-或-CHR¹⁰-CH₂-，其中R¹⁰代表-L-BINDER、H、NH₂、SO₃H、COOH、SH或OH；

A代表CO、SO、SO₂、SO₂NH或CNNH；

R³代表-L-BINDER、-MOD或任选取代的烷基、环烷基、芳基、杂芳基、杂烷基、杂环烷基，优选–L-#1或C_1-10-烷基、C_6-10-芳基或C_6-10-芳烷基、C_5-10-杂烷基、C_1-10-烷基-O-C_6-10-芳基或C_5-10-杂环烷基，其可被1-3个–OH基团、1-3个卤素原子、1-3个卤代烷基（各自具有1-3个卤素原子）、1-3个O-烷基、1-3个–SH基团、1-3个-S-烷基、1-3个-O-CO-烷基、1-3个-O-CO-NH-烷基、1-3个-NH-CO-烷基、1-3个-NH-CO-NH-烷基、1-3个-S(O)_n-烷基、1-3个-SO₂-NH-烷基、1-3个-NH-烷基、1-3个-N(烷基)₂基团、1-3个-NH₂基团或1-3个-(CH₂)_0-3Z基团取代，其中Z代表-H、卤素、-OY³、-SY³、-NHY³、-CO-NY¹Y²或-CO-OY³，其中Y¹和Y²彼此独立地代表H、NH₂或-(CH₂)_0-3Z'，且Y³代表H、-(CH₂)_0-3-CH(NHCOCH₃)Z'、-(CH₂)_0-3-CH(NH₂)Z'或-(CH₂)_0-3Z'，其中Z'代表H、SO₃H、NH₂或COOH（其中“烷基”优选代表C_1-10-烷基）；

R⁵代表–L-BINDER、H、NH₂、NO₂、卤素（特别是F、Cl、Br）、-CN、CF₃、-OCF₃、-CH₂F、-CH₂F、SH或-(CH₂)_0-3Z，其中Z代表-H、-OY³、-SY³、卤素、NHY³、-CO-NY¹Y²或-CO-OY³，

其中Y¹和Y²彼此独立地代表H、NH₂或-(CH₂)_0-3Z'，且Y³代表H或-(CH₂)_0-3Z'，其中Z'代表H、SO₃H、NH₂或COOH；

R⁶和R⁷彼此独立地代表H、氰基、（任选氟代的）C_1-10-烷基、（任选氟代的）C_2-10-烯基、（任选氟代的）C_2-10-炔基、羟基、NO₂、NH₂、COOH或卤素（特别是F、Cl、Br），

R⁸代表（任选氟代的）C_1-10-烷基、（任选氟代的）C_2-10-烯基、（任选氟代的）C_2-10-炔基、（任选氟代的）C_4-10-环烷基或–(CH₂)_0-2-(HZ²)，其中HZ²代表具有最多2个选自N、O和S的杂原子的4-至7元杂环，其中这些基团的每个可被–OH、CO₂H或NH₂或–L-BINDER取代；

R⁹代表H、F、CH₃、CF₃、CH₂F或CHF₂；

其中–MOD代表–(NR¹⁰)_n-(G1)_o-G2-H，其中

R¹⁰代表H或C₁-C₃-烷基；

G1代表–NHCO-、-CONH-或（其中，如果G1代表–NHCO-或，则R¹⁰不代表NH₂）；

n是0或1；

o是0或1；且

G2代表直链和/或支化的烃基，其具有1至10个碳原子并可被基团-O-、-S-、-SO-、SO₂、-NR^y-、-NR^yCO-、CONR^y-、-NR^yNR^y-、-SO₂NR^yNR^y-、-CONR^yNR^y-（其中R^y代表H、苯基、C₁-C₁₀-烷基、C₂-C₁₀-烯基或C₂-C₁₀-炔基，它们各自可被-NHCONH₂、-COOH、-OH、-NH₂、NH-CNNH₂、磺酰胺、砜、亚砜或磺酸取代）、-CO-、-CR^x=N-O-（其中Rx代表H、C₁-C₃-烷基或苯基）的一个或多个中断一次或多次，其中如果存在烃链包括侧链，其可被-NHCONH₂、-COOH、-OH、-NH₂、NH-CNNH₂、磺酰胺、砜、亚砜或磺酸取代，其中基团–MOD优选具有至少一个基团-COOH。

在式(IIIa)的KSP抑制剂的结合体偶联物的情况下，R¹、R²、R³、R⁴、R⁵、R⁸和R¹⁰的最多一个代表（代替上文给出的条件之一）可代表-L-BINDER，其中L代表连接体且BINDER代表结合体或其衍生物，其中该结合体可任选连接到多个活性物质分子上。

式(III)及其盐、溶剂合物和溶剂合物的盐:

其中

X₁代表N，X₂代表N且X₃代表C，或X₁代表CH，X₂代表C且X₃代表N，或X₁代表NH，X₂代表C且X₃代表C，或X₁代表CH，X₂代表N且X₃代表C；

R1代表–L-BINDER、H或-(CH₂)_0-3Z，其中Z代表-H、-NHY³、-OY³、-SY³、卤素、-CO-NY¹Y²或-CO-OY³，

其中Y¹和Y²彼此独立地代表H、NH₂、-(CH₂CH₂O)_0-3-(CH₂)_0-3Z'或-CH(CH₂W)Z'，且Y³代表H或-(CH₂)_0-3Z'，其中Z'代表H、NH₂、SO₃H、COOH、-NH-CO-CH₂-CH₂-CH(NH₂)COOH或-(CO-NH-CHY⁴)_1-3COOH；其中W代表H或OH；

其中Y⁴彼此独立地代表任选被–NHCONH₂取代的直链或支化的C_1-6-烷基，或代表任选被–NH₂取代的芳基或苄基；

R²和R⁴彼此独立地代表–L-BINDER、H、-CO-CHY⁴-NHY⁵或-(CH₂)_0-3Z，或R²和R⁴一起（形成吡咯烷环）代表–CH₂-CHR¹⁰-或-CHR¹⁰-CH₂-，其中R¹⁰代表L-#1、H、NH₂、SO₃H、COOH、SH或OH，

其中Z代表-H、卤素、-OY³、-SY³、NHY³、-CO-NY¹Y²或-CO-OY³，

其中Y¹和Y²彼此独立地代表H、NH₂或-(CH₂)_0-3Z'，且Y³代表H或-(CH₂)_0-3Z'，其中Z'代表H、SO₃H、NH₂或COOH；

其中Y⁴彼此独立地代表任选被–NHCONH₂取代的直链或支化的C_1-6烷基，或代表任选被–NH₂取代的芳基或苄基，且Y⁵代表H或–CO-CHY⁶-NH₂，其中Y⁶代表直链或支化的C_1-6-烷基；

A代表CO、SO、SO₂、SO₂NH或CNNH；

R³代表–L-BINDER或任选取代的烷基、芳基、杂芳基、杂烷基、杂环烷基，优选–L-#1或C_1-10-烷基、C_6-10-芳基或C_6-10-芳烷基、C_5-10-杂烷基、C_1-10-烷基-O-C_6-10-芳基或C_5-10-杂环烷基，其可被1-3个–OH基团、1-3个卤素原子、1-3个卤代烷基（各自具有1-3个卤素原子）、1-3个O-烷基、1-3个–SH基团、1-3个-S-烷基、1-3个-O-CO-烷基、1-3个-O-CO-NH-烷基、1-3个-NH-CO-烷基、1-3个-NH-CO-NH-烷基、1-3个-S(O)_n-烷基、1-3个-SO₂-NH-烷基、1-3个-NH-烷基、1-3个-N(烷基)₂基团、1-3个-NH₂基团或1-3个-(CH₂)_0-3Z基团取代，其中Z代表-H、卤素、-OY³、-SY³、-NHY³、-CO-NY¹Y²或-CO-OY³，其中Y¹和Y²彼此独立地代表H、NH₂或-(CH₂)_0-3Z'，且Y³代表H、-(CH₂)_0-3-CH(NHCOCH₃)Z'、-(CH₂)_0-3-CH(NH₂)Z'或-(CH₂)_0-3Z'，其中Z'代表H、SO₃H、NH₂或COOH（其中“烷基”优选代表C_1-10-烷基）；

R⁵代表–L-BINDER、H、F、NH₂、NO₂、卤素、SH或-(CH₂)_0-3Z，其中Z代表-H、卤素、-OY³、-SY³、-NHY³、-CO-NY¹Y²或-CO-OY³，

其中Y¹和Y²彼此独立地代表H、NH₂或-(CH₂)_0-3Z'，且Y³代表H或-(CH₂)_0-3Z'，其中Z'代表H、SO₃H、NH₂或COOH；

其中L代表连接体且BINDER代表结合体或其衍生物，其中所述结合体可任选连接到多个活性物质分子上，

R⁶和R⁷彼此独立地代表H、氰基、（任选氟代的）C_1-10-烷基、（任选氟代的）C_2-10-烯基、（任选氟代的）C_2-10-炔基、羟基或卤素，

R⁸代表（任选氟代的）C_1-10-烷基、（任选氟代的）C_4-10-环烷基或任选取代的氧杂环丁烷；且

R⁹代表H、F、CH₃、CF₃、CH₂F或CHF₂。

此外，根据本发明优选的是下列KSP抑制剂和它们的结合体偶联物：

式(IIIb):

其中X₁、X₂、X₃具有与式(IIIa)或(III)中相同的含义（其中优选X₁代表CH，X₂代表C且X₃代表N），R¹、R²、R⁴、R⁵、R⁶、R⁷、R⁸和R⁹具有与式(IIIa)或(III)中相同的含义，A代表CO，B代表单键、–O-CH₂–或–CH₂-O-且R²⁰代表NH₂、F、CF₃或CH₃，且n代表0、1或2。

式(IIIc):

其中X₁、X₂、X₃具有与式(IIIa)或(III)中相同的含义（其中优选X₁代表CH，X₂代表C且X₃代表N），A、R¹、R³、R⁶、R⁷、R⁸和R⁹具有与式(IIIa)或(III)中相同的含义，A优选代表CO且R³代表–CH₂OH、-CH₂OCH₃、CH(CH₃)OH或CH(CH₃)OCH₃。

式(IIId):

其中X₁、X₂、X₃具有与式(IIIa)或(III)中相同的含义（其中优选X₁代表CH，X₂代表C且X₃代表N）、A、R³、R⁶、R⁷、R⁸和R⁹具有与式(IIIa)或(III)中相同的含义，其中A优选代表CO且R³代表–CH₂-S_x-(CH₂)_0-4-CHY⁵-COOH，其中x是0或1且Y⁵代表H或NHY⁶，其中Y⁶代表H或-COCH₃。

式(IIIe):

其中X₁代表CH，X₂代表C且X₃代表N，A、R³、R⁶、R⁷、R⁸和R⁹具有与式(IIIa)或(III)中相同的含义且R¹代表-L–BINDER。

此外，优选的是，在式(III)、(IIIa)、(IIIb)、(IIIc)、(IIId)和(IIIe)的化合物中（独自或组合）：

●Z代表Cl或Br；

●R¹代表-(CH₂)_0-3Z，其中Z代表-CO-NY¹Y²，其中Y²代表-(CH₂CH₂O)_0-3-(CH₂)_0-3Z'，且Y¹代表H、NH₂或-(CH₂CH₂O)_0-3-(CH₂)_0-3Z'；

●Y¹代表H，Y²代表-(CH₂CH₂O)₃-CH₂CH₂Z'且Z'代表–COOH；

●Y¹代表H，Y²代表-CH₂CH₂Z'且Z'代表-(CONHCHY⁴)₂COOH；

●Y¹代表H，Y²代表-CH₂CH₂Z'，Z'代表-(CONHCHY⁴)₂COOH且Y⁴之一代表异丙基，另一个代表–(CH₂)₃-NHCONH₂；

●Y¹代表H，Y²代表-CH₂CH₂Z'，Z'代表-(CONHCHY⁴)₂COOH且Y⁴之一代表–CH₃，另一个代表–(CH₂)₃-NHCONH₂；

●Y⁴代表任选被–NHCONH₂取代的直链或支化的C_1-6-烷基；

● 至少一个Y⁴代表选自异丙基和–CH₃；

●Y¹代表H，Y²代表-CH₂CH₂Z'，Z'代表-CONHCHY⁴COOH且Y⁴代表任选被–NH₂取代的芳基或苄基；

●Y⁴代表氨基苄基；

●R²代表–(CH₂)_0-3Z且Z代表–SY³；

●R⁴代表-CO-CHY⁴-NHY⁵且Y⁵代表H；

●R⁴代表-CO-CHY⁴-NHY⁵且Y⁵代表–CO-CHY⁶-NH₂；

●Y⁴代表任选被–NHCONH₂取代的直链或支化的C_1-6-烷基。

此外，优选的是，式(IIa)或(IIIa)中的R¹、R²或R³代表-MOD，特别是R⁴代表–L-#1或–L-BINDER（特别是–L是可裂解连接体，其直接在–N-R⁴或–N—L-#1或–L-BINDER处裂解，以使R⁴或L被H替代）。

特别优选地，R³代表-MOD且R¹或R⁴代表–L-#1或–L-BINDER，

其中–MOD代表–(NR¹⁰)_n-(G1)_o-G2-H，其中

R¹⁰代表H或C₁-C₃-烷基；

G1代表–NHCO-、-CONH-或（其中，如果G1代表–NHCO-或，则R¹⁰不代表NH₂）；

n是0或1；

o是0或1；且

G2代表直链和/或支化的烃基，其具有1至10个碳原子并可被基团-O-、-S-、-SO-、SO₂、-NR^y-、-NR^yCO-、CONR^y-、-NR^yNR^y-、-SO₂NR^yNR^y-、-CONR^yNR^y-（其中R^y代表H、苯基、C₁-C₁₀-烷基、C₂-C₁₀-烯基或C₂-C₁₀-炔基，它们各自可被-NHCONH₂、-COOH、-OH、-NH₂、NH-CNNH₂、磺酰胺、砜、亚砜或磺酸取代）、-CO-、-CR^x=N-O-（其中Rx代表H、C₁-C₃-烷基或苯基）的一个或多个中断一次或多次，其中如果存在烃链包括侧链，其可被-NHCONH₂、-COOH、-OH、-NH₂、NH-CNNH₂、磺酰胺、砜、亚砜或磺酸取代，其中基团–MOD优选具有至少一个基团-COOH；

特别优选地，基团–MOD具有（优选末端的）–COOH基团，例如在甜菜碱基团中。基团–MOD优选具有式–CH₂-S_x-(CH₂)_0-4-CHY⁵-COOH，其中x是0或1，且Y⁵代表H或NHY⁶，其中Y⁶代表H或-COCH₃。

其它特别优选的化合物具有下式(IV)及其盐、溶剂合物和溶剂合物的盐：

其中

X₁代表N，X₂代表C且X₃代表N；

R¹代表–L-BINDER、H或-(CH₂)_0-3Z，其中Z代表-H、-NHY³、-OY³、-SY³、卤素、-CO-NY¹Y²或-CO-OY³，

其中Y¹和Y²彼此独立地代表H、NH₂、-(CH₂CH₂O)_0-3-(CH₂)_0-3Z'或-CH(CH₂W)Z'，且Y³代表H或-(CH₂)_0-3Z'，其中Z'代表H、NH₂、SO₃H、COOH、-NH-CO-CH₂-CH₂-CH(NH₂)COOH或-(CO-NH-CHY⁴)_1-3COOH；

其中Y⁴彼此独立地代表任选被-NHCONH₂取代的直链或支化的C_1-6-烷基，或代表任选被–NH₂取代的芳基或苄基；

R²和R⁴彼此独立地代表–L-BINDER、H、-CO-CHY⁴-NHY⁵或-(CH₂)_0-3Z，或R²和R⁴一起（形成吡咯烷环）代表–CH₂-CHR¹⁰-或-CHR¹⁰-CH₂-，其中R¹⁰代表L-#1、H、NH₂、SO₃H、COOH、SH或OH，

其中Z代表-H、卤素、-OY³、-SY³、NHY³、-CO-NY¹Y²或-CO-OY³，

其中Y¹和Y²彼此独立地代表H、NH₂或-(CH₂)_0-3Z'，且Y³代表H或-(CH₂)_0-3Z'，其中Z'代表H、SO₃H、NH₂或COOH；

其中Y⁴彼此独立地代表任选被–NHCONH₂取代的直链或支化的C_1-6烷基，或代表任选被–NH₂取代的芳基或苄基，且Y⁵代表H或–CO-CHY⁶-NH₂，其中Y⁶代表直链或支化的C_1-6-烷基；

A代表CO、SO、SO₂、SO₂NH或CNNH；

R³代表–L-BINDER、任选取代的烷基、芳基、杂芳基、杂烷基、杂环烷基或–CH₂-S_x-(CH₂)_0-4-CHY⁵-COOH，其中x是0或1，且Y⁵代表H或NHY⁶，其中Y⁶代表H或-COCH₃，优选–L-BINDER或C_1-10-烷基、C_6-10-芳基或C_6-10-芳烷基、C_5-10-杂烷基、C_1-10-烷基-O-C_6-10-芳基或C_5-10-杂环烷基，其可被1-3个–OH基团、1-3个卤素原子、1-3个卤代烷基（各自具有1-3个卤素原子）、1-3个O-烷基、1-3个–SH基团、1-3个-S-烷基、1-3个-O-CO-烷基、1-3个-O-CO-NH-烷基、1-3个-NH-CO-烷基、1-3个-NH-CO-NH-烷基、1-3个-S(O)_n-烷基、1-3个-SO₂-NH-烷基、1-3个-NH-烷基、1-3个-N(烷基)₂基团、1-3个-NH₂基团或1-3个-(CH₂)_0-3Z基团取代，其中Z代表-H、卤素、-OY³、-SY³、-NHY³、-CO-NY¹Y²或-CO-OY³，其中Y¹和Y²彼此独立地代表H、NH₂或-(CH₂)_0-3Z'，且Y³代表H、-(CH₂)_0-3-CH(NHCOCH₃)Z'、-(CH₂)_0-3-CH(NH₂)Z'或-(CH₂)_0-3Z'，其中Z'代表H、SO₃H、NH₂或COOH（其中“烷基”优选代表C_1-10-烷基）；

R⁵代表–L-BINDER、H、F、NH₂、NO₂、卤素、SH或-(CH₂)_0-3Z，其中Z代表-H、卤素、-OY³、-SY³、-NHY³、-CO-NY¹Y²或-CO-OY³，

其中Y¹和Y²彼此独立地代表H、NH₂或-(CH₂)_0-3Z'，且Y³代表H或-(CH₂)_0-3Z'，其中Z'代表H、SO₃H、NH₂或COOH；

其中L代表连接体且BINDER代表结合体或其衍生物，其中所述结合体可任选连接到多个活性物质分子上，

R⁶和R⁷彼此独立地代表H、氰基、（任选氟代的）C_1-10-烷基、（任选氟代的）C_2-10-烯基、（任选氟代的）C_2-10-炔基、羟基或卤素，

R⁸代表（任选氟代的）C_1-10-烷基、（任选氟代的）C_4-10-环烷基或任选取代的氧杂环丁烷；且

R⁹代表H、F、CH₃、CF₃、CH₂F或CHF₂；

条件是R¹、R²和R⁴不同时代表H。

此外，优选的是（独自或组合），在式(IIa)、(II)、(III)、(IIIa)、(IIIb)、(IIIc)、(IIId)、(IIIe)或(IV)中：

●Z代表Cl或Br；

●R¹代表-(CH₂)_0-3Z，其中Z代表-CO-NY¹Y²，其中Y²代表-(CH₂CH₂O)_0-3-(CH₂)_0-3Z'且Y¹代表H、NH₂或-(CH₂CH₂O)_0-3-(CH₂)_0-3Z'；

●Y¹代表H，Y²代表-(CH₂CH₂O)₃-CH₂CH₂Z'且Z'代表–COOH；

●Y¹代表H，Y²代表-CH₂CH₂Z'且Z'代表-(CONHCHY⁴)₂COOH；

●Y¹代表H，Y²代表-CH₂CH₂Z'，Z'代表-(CONHCHY⁴)₂COOH且一个Y⁴代表异丙基，另一个代表–(CH₂)₃-NHCONH₂；

●Y¹代表H，Y²代表-CH₂CH₂Z'，Z'代表-(CONHCHY⁴)₂COOH且一个Y⁴代表–CH₃，另一个代表–(CH₂)₃-NHCONH₂；

●Y⁴代表任选被–NHCONH₂取代的直链或支化的C_1-6-烷基；

● 至少一个Y⁴代表选自异丙基和–CH₃；

●Y¹代表H，Y²代表-CH₂CH₂Z'，Z'代表-CONHCHY⁴COOH且Y⁴代表任选被–NH₂取代的芳基或苄基；

●Y⁴代表氨基苄基；

●R²代表–(CH₂)_0-3Z且Z代表–SY³；

●R⁴代表-CO-CHY⁴-NHY⁵且Y⁵代表H；

●R⁴代表-CO-CHY⁴-NHY⁵且Y⁵代表–CO-CHY⁶-NH₂；

●Y⁴代表任选被–NHCONH₂取代的直链或支化的C_1-6-烷基。

还优选的是式(IIa)、(II)、(III)、(IIIa)或(IV)的化合物及其盐、溶剂合物和溶剂合物的盐

其中

X₁代表N，X₂代表N且X₃代表C；或

X₁代表N，X₂代表C且X₃代表N；或

X₁代表CH或CF，X₂代表C且X₃代表N；或

X₁代表NH，X₂代表C且X₃代表C；或

X₁代表CH或CF，X₂代表N且X₃代表C；

（其中X₁代表CH，X₂代表C且X₃代表N是优选的）；

R¹代表H、–L-#1或–L-BINDER、–MOD或-(CH₂)_0-3Z，其中Z代表-H、-NHY³、-OY³、-SY³、卤素、-CO-NY¹Y²或-CO-OY³，

其中Y¹和Y²彼此独立地代表H、NH₂、-(CH₂CH₂O)_0-3-(CH₂)_0-3Z'（例如-(CH₂)_0-3Z'）或-CH(CH₂W)Z'，且Y³代表H或-(CH₃)_0-3Z'，其中Z'代表H、NH₂、SO₃H、COOH、-NH-CO-CH₂-CH₂-CH(NH₂)COOH或-(CO-NH-CHY⁴)_1-3COOH，其中W代表H或OH，

其中Y⁴彼此独立地代表任选被–NHCONH₂取代的直链或支化的C_1-6-烷基，或代表任选被–NH₂取代的芳基或苄基；

R²代表H、-CO-CHY⁴-NHY⁵或-(CH₂)_0-3Z，

其中Z代表-H、卤素、-OY³、-SY³、NHY³、-CO-NY¹Y²或-CO-OY³，

其中Y¹和Y²彼此独立地代表H、NH₂或-(CH₂)_0-3Z'，且Y³代表H或-(CH₂)_0-3Z'，其中Z'代表H、SO₃H、NH₂或COOH；

其中Y⁴彼此独立地代表任选被–NHCONH₂取代的直链或支化的C_1-6烷基，或代表任选被–NH₂取代的芳基或苄基，且Y⁵代表H或–CO-CHY⁶-NH₂，其中Y⁶代表直链或支化的C_1-6-烷基；

R⁴代表H；

A代表CO、SO、SO₂、SO₂NH或CNNH；

R³代表–L-#1或–L-BINDER、-MOD或任选取代的烷基、环烷基、芳基、杂芳基、杂烷基、杂环烷基，优选C_1-10-烷基、C_6-10-芳基或C_6-10-芳烷基、C_5-10-杂烷基、C_1-10-烷基-O-C_6-10-芳基或C_5-10-杂环烷基，其可被1-3个–OH基团、1-3个卤素原子、1-3个卤代烷基（各自具有1-3个卤素原子）、1-3个O-烷基、1-3个–SH基团、1-3个-S-烷基、1-3个-O-CO-烷基、1-3个-O-CO-NH-烷基、1-3个-NH-CO-烷基、1-3个-NH-CO-NH-烷基、1-3个-S(O)_n-烷基、1-3个-SO₂-NH-烷基、1-3个-NH-烷基、1-3个-N(烷基)₂基团、1-3个-NH((CH₂CH₂O)_1-20H)基团、1-3个-NH₂基团或1-3个-(CH₂)_0-3Z基团取代，其中Z代表-H、卤素、-OY³、-SY³、-NHY³、-CO-NY¹Y²或-CO-OY³，其中Y¹和Y²彼此独立地代表H、NH₂或-(CH₂)_0-3Z'，且Y³代表H、-(CH₂)_0-3-CH(NHCOCH₃)Z'、-(CH₂)_0-3-CH(NH₂)Z'或-(CH₂)_0-3Z'，其中Z'代表H、SO₃H、NH₂或COOH（其中“烷基”优选是C_1-10-烷基）；

R⁵代表H、-MOD、NH₂、NO₂、卤素（特别是F、Cl、Br）、-CN、CF₃、-OCF₃、-CH₂F、-CH₂F、SH或-(CH₂)_0-3Z，其中Z代表-H、-OY³、-SY³、卤素、NHY³、-CO-NY¹Y²或-CO-OY³，

其中Y¹和Y²彼此独立地代表H、NH₂或-(CH₂)_0-3Z'，且Y³代表H或-(CH₂)_0-3Z'，其中Z'代表H、SO₃H、NH₂或COOH；

R⁶和R⁷彼此独立地代表H、氰基、（任选氟代的）C_1-10-烷基、（任选氟代的）C_2-10-烯基、（任选氟代的）C_2-10-炔基、羟基、NO₂、NH₂、COOH或卤素（特别是F、Cl、Br），

R⁸代表（任选氟代的）C_1-10-烷基、（任选氟代的）C_2-10-烯基、（任选氟代的）C_2-10-炔基或（任选氟代的）C_4-10-环烷基；

其中取代基R¹和R³之一或无一代表–L-#1、–L-#1或–L-BINDER，

L代表连接体且#1代表与结合体或其衍生物的键且BINDER代表结合体，

R⁹代表H、F、CH₃、CF₃、CH₂F或CHF₂；

其中–MOD代表–(NR¹⁰)_n-(G1)_o-G2-H，其中

R¹⁰代表H或C₁-C₃-烷基；

G1代表–NHCO-、-CONH-或（其中，如果G1代表–NHCO-或，则R¹⁰不代表NH₂）；

n是0或1；

o是0或1；且

G2代表直链和/或支化的烃基，其具有1至10个碳原子并可被基团-O-、-S-、-SO-、SO₂、-NR^y-、-NR^yCO-、CONR^y-、-NR^yNR^y-、-SO₂NR^yNR^y-、-CONR^yNR^y-（其中R^y代表H、苯基、C₁-C₁₀-烷基、C₂-C₁₀-烯基或C₂-C₁₀-炔基，它们各自可被-NHCONH₂、-COOH、-OH、-NH₂、NH-CNNH₂、磺酰胺、砜、亚砜或磺酸取代）、-CO-、-CR^x=N-O-（其中Rx代表H、C₁-C₃-烷基或苯基）的一个或多个中断一次或多次，其中如果存在烃链包括侧链，其可被-NHCONH₂、-COOH、-OH、-NH₂、NH-CNNH₂、磺酰胺、砜、亚砜或磺酸取代，其中基团–MOD优选具有至少一个基团-COOH。

还优选的是式(IIa)、(II)、(III)、(IIIa)或(IV)的化合物及其盐、溶剂合物和溶剂合物的盐，其中

X₁代表N，X₂代表N且X₃代表C；或

X₁代表N，X₂代表C且X₃代表N；或

X₁代表CH或CF，X₂代表C且X₃代表N；或

X₁代表NH，X₂代表C且X₃代表C；或

X₁代表CH或CF，X₂代表N且X₃代表C；

（其中X₁代表CH，X₂代表C且X₃代表N是优选的）；

R¹代表H、–L-#1或–L-BINDER、–MOD或-(CH₂)_0-3Z，其中Z代表-H、-NHY³、-OY³、-SY³、卤素、-CO-NY¹Y²或-CO-OY³，

其中Y¹和Y²彼此独立地代表H、NH₂、-(CH₂CH₂O)_0-3-(CH₂)_0-3Z'（例如-(CH₂)_0-3Z'）或-CH(CH₂W)Z'，且Y³代表H或-(CH₃)_0-3Z'，其中Z'代表H、NH₂、SO₃H、COOH、-NH-CO-CH₂-CH₂-CH(NH₂)COOH或-(CO-NH-CHY⁴)_1-3COOH，其中W代表H或OH，

其中Y⁴彼此独立地代表任选被–NHCONH₂取代的直链或支化的C_1-6-烷基，或代表任选被–NH₂取代的芳基或苄基；

R²代表H、-CO-CHY⁴-NHY⁵或-(CH₂)_0-3Z，

其中Z代表-H、卤素、-OY³、-SY³、NHY³、-CO-NY¹Y²或-CO-OY³，

其中Y¹和Y²彼此独立地代表H、NH₂或-(CH₂)_0-3Z'，且Y³代表H或-(CH₂)_0-3Z'，其中Z'代表H、SO₃H、NH₂或COOH；

其中Y⁴彼此独立地代表任选被–NHCONH₂取代的直链或支化的C_1-6烷基，或代表任选被–NH₂取代的芳基或苄基，且Y⁵代表H或–CO-CHY⁶-NH₂，其中Y⁶代表直链或支化的C_1-6-烷基；

R⁴代表H；

A代表CO、SO、SO₂、SO₂NH或CNNH；

R³代表–L-#1或–L-BINDER、-MOD或任选取代的烷基、环烷基、芳基、杂芳基、杂烷基、杂环烷基，优选C_1-10-烷基、C_6-10-芳基或C_6-10-芳烷基、C_5-10-杂烷基、C_1-10-烷基-O-C_6-10-芳基或C_5-10-杂环烷基，其可被1-3个–OH基团、1-3个卤素原子、1-3个卤代烷基（各自具有1-3个卤素原子）、1-3个O-烷基、1-3个–SH基团、1-3个-S-烷基、1-3个-O-CO-烷基、1-3个-O-CO-NH-烷基、1-3个-NH-CO-烷基、1-3个-NH-CO-NH-烷基、1-3个-S(O)_n-烷基、1-3个-SO₂-NH-烷基、1-3个-NH-烷基、1-3个-N(烷基)₂基团、1-3个-NH((CH₂CH₂O)_1-20H)基团、1-3个-NH₂基团或1-3个-(CH₂)_0-3Z基团取代，其中Z代表-H、卤素、-OY³、-SY³、-NHY³、-CO-NY¹Y²或-CO-OY³，其中Y¹和Y²彼此独立地代表H、NH₂或-(CH₂)_0-3Z'，且Y³代表H、-(CH₂)_0-3-CH(NHCOCH₃)Z'、-(CH₂)_0-3-CH(NH₂)Z'或-(CH₂)_0-3Z'，其中Z'代表H、SO₃H、NH₂或COOH（其中“烷基”优选是C_1-10-烷基）；

R⁵代表H、-MOD、NH₂、NO₂、卤素（特别是F、Cl、Br）、-CN、CF₃、-OCF₃、-CH₂F、-CH₂F、SH或-(CH₂)_0-3Z，其中Z代表-H、-OY³、-SY³、卤素、NHY³、-CO-NY¹Y²或-CO-OY³，

其中Y¹和Y²彼此独立地代表H、NH₂或-(CH₂)_0-3Z'，且Y³代表H或-(CH₂)_0-3Z'，其中Z'代表H、SO₃H、NH₂或COOH；

R⁶和R⁷彼此独立地代表H或卤素（特别是F、Cl、Br），

R⁸代表（任选氟代的）C_1-10-烷基；

其中取代基R¹和R³之一或无一代表–L-#1或–L-BINDER，

L代表连接体且#1代表与结合体或其衍生物的键且BINDER代表结合体，

R⁹代表H、F、CH₃、CF₃、CH₂F或CHF₂；

其中–MOD代表–CH₂-S_x-(CH₂)_0-4-CHY⁵-COOH，其中x是0或1，且Y⁵代表H或NHY⁶，其中Y⁶代表H或-COCH₃。

还优选的是下列化合物，它们可任选与酸，例如三氟乙酸一起存在。这些化合物可经由与R¹、R²、R³、R⁴、R⁵、R⁸和R¹⁰，特别是R¹和R³的位置对应的位置经连接体连接到结合体上（其中氢原子被连接体取代）：

N-(3-氨基丙基)-N-{(1R)-1-[4-苄基-1-(2,5-二氟苯基)-1H-吡唑-3-基]-2,2-二甲基丙基}-2-羟基乙酰胺；

N-(3-氨基丙基)-N-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2-羟基乙酰胺；

(2S)-2-氨基-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰)氨基]-N-甲基丁酰胺(1:1)；

N-(3-氨基丙基)-N-{(1S)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2yl]-2,2-二甲基丙基}乙酰胺；

(15S,19R)-15-氨基-19-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-18-乙醇酰-20,20-二甲基-14-氧代-4,7,10-三氧杂-13,18-二氮杂二十一烷-1-酸；

N-{(2S)-2-氨基-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰)氨基]丁酰基}-β-丙氨酰基-L-缬氨酰基-N⁵-氨基甲酰基-L-鸟氨酸；

N-{(2S)-2-氨基-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰)氨基]丁酰基}-β-丙氨酰基-L-丙氨酰基-N⁵-氨基甲酰基-L-鸟氨酸；

N-{(2S)-2-氨基-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰)氨基]丁酰基}-β-丙氨酰基-4-氨基-L-苯基丙氨酸；

N-{(1R)-1-[1-(3-氨基苄基)-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}-N-(3-氨基丙基)-2-羟基乙酰胺(1:1)；

(2S)-2-氨基-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰)氨基]丁酸；

N-[(3S)-3-氨基-4-肼基-4-氧代丁基]-N-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2-羟基乙酰胺(1:1)；

N-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}-N-[(3S)-3,4-二氨基丁基]-2-羟基乙酰胺(1:1)；

N-{(2S)-2-氨基-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰)氨基]丁酰基}-β-丙氨酸；

(2S)-2-氨基-N-(2-氨基乙基)-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰)氨基]丁酰胺(2:1)；

(1-{(2S)-2-氨基-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰)氨基]丁酰基}肼基)乙酸；

N-[3-氨基-2-(硫烷基甲基)丙基]-N-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2-羟基乙酰胺盐酸盐(1:1)；

4-氨基-N-(3-氨基丙基)-N-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}苯甲酰胺(2:1)；

N-{3-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰)氨基]丙基}-N5-氨基甲酰基-L-鸟氨酰胺(1:1)；

L-缬氨酰基-N-{3-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰)氨基]丙基}-N5-氨基甲酰基-L-鸟氨酰胺(1:1)；

L-缬氨酰基-N-{3-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰)氨基]丙基}-N5-氨基甲酰基-L-鸟氨酰胺(1:1)；

N-(3-氨基丙基)-N-{(1S)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2-羟基乙酰胺；

S-(1-{2-[(N-{(2S)-2-氨基-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰)氨基]丁酰基}-β-丙氨酰基)氨基]乙基}-2,5-二氧代吡咯烷-3-基)-L-半胱氨酸；

S-[1-(2-{[2-({(2S)-2-氨基-4-[{(1R)-1-[4-苄基-1-(2,5-二氟苯基)-1H-吡唑-3-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰)氨基]丁酰基}氨基)乙基]氨基}-2-氧代乙基)-2,5-二氧代吡咯烷-3-基]-L-半胱氨酸；

N-{(2S)-2-氨基-4-[{(1R)-1-[4-苄基-1-(2,5-二氟苯基)-1H-吡唑-3-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰)氨基]丁酰基}-β-丙氨酰基-L-丙氨酰基-N-[4-(3-{[(2R)-2-氨基-2-羧乙基]硫烷基}-2,5-二氧代吡咯烷-1-基)苯基]-N⁵-氨基甲酰基-L-鸟氨酰胺；

S-(1-{2-[(N-{(2S)-2-氨基-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰)氨基]丁酰基}-β-丙氨酰基)氨基]乙基}-2,5-二氧代吡咯烷-3-基)-L-半胱氨酸；

S-[1-(2-{[2-({(2S)-2-氨基-4-[{(1R)-1-[4-苄基-1-(2,5-二氟苯基)-1H-吡唑-3-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰)氨基]丁酰基}氨基)乙基]氨基}-2-氧代乙基)-2,5-二氧代吡咯烷-3-基]-L-半胱氨酸；

N-{(2S)-2-氨基-4-[{(1R)-1-[4-苄基-1-(2,5-二氟苯基)-1H-吡唑-3-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰)氨基]丁酰基}-β-丙氨酰基-L-丙氨酰基-N-[4-(3-{[(2R)-2-氨基-2-羧乙基]硫烷基}-2,5-二氧代吡咯烷-1-基)苯基]-N⁵-氨基甲酰基-L-鸟氨酰胺；

S-(1-{2-[(N-{(2S)-2-氨基-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰)氨基]丁酰基}-β-丙氨酰基)氨基]乙基}-2,5-二氧代吡咯烷-3-基)-L-半胱氨酸；

N-[6-(3-{[(2R)-2-氨基-2-羧乙基]硫烷基}-2,5-二氧代吡咯烷-1-基)己酰基]-L-缬氨酰基-N⁵-氨基甲酰基-L-鸟氨酰基-N⁶-{(2S)-2-氨基-4-[{(1R)-1-[4-苄基-1-(2,5-二氟苯基)-1H-吡唑-3-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰)氨基]丁酰基}-L-赖氨酸；

S-[1-(2-{[2-({(2S)-2-氨基-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰)氨基]丁酰基}氨基)乙基]氨基}-2-氧代乙基)-2,5-二氧代吡咯烷-3-基]-L-半胱氨酸；

S-(2-{[2-({(2S)-2-氨基-4-[{(1R)-1-[4-苄基-1-(2,5-二氟苯基)-1H-吡唑-3-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰)氨基]丁酰基}氨基)乙基]氨基}-2-氧代乙基)-L-半胱氨酸；

S-{1-[6-(2-{(2S)-2-氨基-4-[{(1R)-1-[4-苄基-1-(2,5-二氟苯基)-1H-吡唑-3-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰)氨基]丁酰基}肼基)-6-氧代己基]-2,5-二氧代吡咯烷-3-基}-L-半胱氨酸；

N-[19-(3(R/S)-{[(2R)-2-氨基-2-羧乙基]硫烷基}-2,5-二氧代吡咯烷-1-基)-17-氧代-4,7,10,13-四氧杂-16-氮杂十九-1-酰基]-R/S-{2-[(3-氨基丙基){(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}氨基]-2-氧代乙基}高半胱氨酸；

S-{(3R/S)-1-[2-({(2S)-2-氨基-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰)氨基]丁酰基}氨基)乙基]-2,5-二氧代吡咯烷-3-基}-L-半胱氨酸；

N-[19-(3(R/S)-{[(2R)-2-氨基-2-羧乙基]硫烷基}-2,5-二氧代吡咯烷-1-基)-17-氧代-4,7,10,13-四氧杂-16-氮杂十九-1-酰基]-R/S-{2-[(3-氨基丙基){(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}氨基]-2-氧代乙基}高半胱氨酸；

S-[(3R/S)-1-(2-{[6-({2-[(3-氨基丙基){(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}氨基]-2-氧代乙基}硫烷基)己酰基]氨基}乙基)-2,5-二氧代吡咯烷-3-基]-L-半胱氨酸；

S-{1-[2-({[(1R,3S)-3-({(2S)-2-氨基-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰)氨基]丁酰基}氨基)环戊基]羰基}氨基)乙基]-2,5-二氧代吡咯烷-3-基}-L-半胱氨酸；

S-(2-{[2-({(2S)-2-氨基-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰)氨基]丁酰基}氨基)乙基]氨基}-2-氧代乙基)-L-半胱氨酸；

N⁶-(N-{(2S)-2-氨基-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰)氨基]丁酰基}-D-丙氨酰基)-L-赖氨酸；

N⁶-(N-{(2S)-2-氨基-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰)氨基]丁酰基}-β-丙氨酰基)-N²-{N-[6-(3-{[(2R)-2-氨基-2-羧乙基]硫烷基}-2,5-二氧代吡咯烷-1-基)己酰基]-L-缬氨酰基-L-丙氨酰基}-L-赖氨酸；

N-[2-({(2S)-2-氨基-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰)氨基]丁酰基}氨基)乙基]-L-谷氨酰胺；

N⁶-(N-{(2S)-2-氨基-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰)氨基]丁酰基}-β-丙氨酰基)-L-赖氨酸；

N-(3-氨基丙基)-N-{(1R)-1-[4-苄基-1-(2,5-二氟苯基)-1H-吡唑-3-基]-2,2-二甲基丙基}乙酰胺；

N-(3-氨基丙基)-N-{(1R)-1-[4-苄基-1-(2,5-二氟苯基)-1H-吡唑-3-基]-2,2-二甲基丙基}-2-甲氧基乙酰胺；

N-(3-氨基丙基)-N-{(1R)-1-[4-苄基-1-(2,5-二氟苯基)-1H-吡唑-3-基]-2,2-二甲基丙基}-2,4-二氟苯甲酰胺；

N-(3-氨基丙基)-N-{(1R)-1-[4-苄基-1-(2,5-二氟苯基)-1H-吡唑-3-基]-2,2-二甲基丙基}-4-甲基苯甲酰胺；

N-(3-氨基丙基)-N-{(1R)-1-[4-苄基-1-(2,5-二氟苯基)-1H-吡唑-3-基]-2,2-二甲基丙基}-2-乙氧基乙酰胺；

N-(3-氨基丙基)-N-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-3,3,3-三氟丙酰胺；

N-(3-氨基丙基)-N-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-4-氟苯甲酰胺；

N-(3-氨基丙基)-N-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}乙酰胺；

N-(3-氨基丙基)-N-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-4-(三氟甲基)苯甲酰胺；

N-(3-氨基丙基)-N-{(1R)-1-[4-苄基-1-(2,5-二氟苯基)-1H-吡唑-3-基]-2,2-二甲基丙基}-2-乙氧基乙酰胺；

N-(3-氨基丙基)-N-{(1R)-1-[4-苄基-1-(2,5-二氟苯基)-1H-吡唑-3-基]-2,2-二甲基丙基}-2-乙氧基乙酰胺；

(2S)-2-氨基-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰)氨基]丁酸；

(2S)-2-氨基-N-(2-氨基乙基)-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰)氨基]丁酰胺；

4-[(2-{[2-({(2S)-2-氨基-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰)氨基]丁酰基}氨基)乙基]氨基}-2-氧代乙基)氨基]-3-{[(2R)-2-氨基-2-羧乙基]硫烷基}-4-氧代丁酸；

4-[(2-{[2-({(2S)-2-氨基-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰)氨基]丁酰基}氨基)乙基]氨基}-2-氧代乙基)氨基]-2-{[(2R)-2-氨基-2-羧乙基]硫烷基}-4-氧代丁酸；

N-{(2S)-2-氨基-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰)氨基]丁酰基}-β-丙氨酸；

N-{(2S)-2-氨基-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰)氨基]丁酰基}-L-丝氨酸；

N-{(2S)-2-氨基-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰)氨基]丁酰基}-L-丙氨酸；

N-{(2S)-2-氨基-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰)氨基]丁酰基}甘氨酸；

N-(3-氨基丙基)-N-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-4-甲基苯甲酰胺；

N-(3-氨基丙基)-N-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-4-(甲基硫烷基)苯甲酰胺；

(2S)-N-(3-氨基丙基)-N-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2-羟基丙酰胺；

N-(3-氨基丙基)-N-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2-(甲基硫烷基)乙酰胺；

(2S)-N-(3-氨基丙基)-N-{(1R)-1-[4-苄基-1-(2,5-二氟苯基)-1H-吡唑-3-基]-2,2-二甲基丙基}-2-羟基丙酰胺；

4-[(3-氨基丙基){(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}氨基]-4-氧代丁酸甲酯；

4-[(3-氨基丙基){(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}氨基]-4-氧代丁酸；

(2R)-22-[(3R/S)-3-{[(2R)-2-氨基-2-羧乙基]硫烷基}-2,5-二氧代吡咯烷-1-基]-2-[({2-[(3-氨基丙基){(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}氨基]-2-氧代乙基}硫烷基)甲基]-4,20-二氧代-7,10,13,16-四氧杂-3,19-二氮杂二十二烷-1-酸；

4-氨基-N-(3-氨基丙基)-N-{(1R)-1-[4-苄基-1-(2,5-二氟苯基)-1H-吡唑-3-基]-2,2-二甲基丙基}苯甲酰胺；

N-乙酰基-S-{2-[(3-氨基丙基){(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}氨基]-2-氧代乙基}-L-半胱氨酸；

N-乙酰基-S-[2-([3-(L-丙氨酰基氨基)丙基]{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}氨基)-2-氧代乙基]-L-半胱氨酸；

(2S)-N-(3-氨基丙基)-N-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}四氢呋喃-2-甲酰胺；

3-({2-[(3-氨基丙基){(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}氨基]-2-氧代乙基}硫烷基)丙酸；

S-{2-[(3-氨基丙基){(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}氨基]-2-氧代乙基}高半胱氨酸；

4-氨基-N-(3-氨基丙基)-N-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}苯甲酰胺；

4-[(2-{[(2R)-2-({(2S)-2-氨基-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰)氨基]丁酰基}氨基)-2-羧乙基]氨基}-2-氧代乙基)氨基]-3-{[(2R)-2-氨基-2-羧乙基]硫烷基}-4-氧代丁酸；

4-[(2-{[(2R)-2-({(2S)-2-氨基-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰)氨基]丁酰基}氨基)-2-羧乙基]氨基}-2-氧代乙基)氨基]-2-{[(2R)-2-氨基-2-羧乙基]硫烷基}-4-氧代丁酸。

根据本发明特别优选的是下列式V、VI或VII的化合物，其中R¹、R²、R³、R⁴和R⁵具有上文提到的含义（如对例如式(IIa)或(IIIa)提到）：

特别优选的是式V、VI、VII的化合物，其中R¹和R⁵代表H或–L-#1；R²和R⁴彼此独立地代表–L-#1或H或R²和R⁴一起（形成吡咯烷环）代表–CH₂-CHR¹⁰-或–CHR¹⁰-CH₂-，R¹⁰代表H或–L-#1；且R³代表CH₂OH、CH(CH₃)OH或–L-#1，其中取代基R¹、R²、R³、R⁴、R⁵和R¹⁰之一代表–L-#1。尤其优选的是式VI的相应化合物。

连接体

文献公开了用于将有机分子共价偶联（结合）到结合体，例如抗体上的各种可能性（参见例如K. Lang和J. W. Chin. Chem. Rev. 2014, 114, 4764-4806, M. Rashidian等人Bioconjugate Chem. 2013, 24, 1277-1294）。根据本发明优选的是KSP抑制剂经由已作为游离硫醇存在或通过二硫桥的还原生成的抗体的半胱氨酸残基的一个或多个硫原子和/或经由抗体的赖氨酸残基的一个或多个NH基团偶联到抗体上。但是，也可以经由酪氨酸残基、经由谷氨酰胺残基、经由非天然氨基酸的残基、经由游离羧基或经由抗体的糖残基将KSP抑制剂连接到抗体上。对于偶联，使用所谓的连接体。连接体可分类成可体内裂解的连接体类别和体内稳定的连接体类别（参见L. Ducry和B. Stump, Bioconjugate Chem.21, 5-13 (2010)）。可体内裂解的连接体具有可体内裂解的基团，其中又可区分可体内化学裂解的基团和可体内酶促裂解的基团。“可体内化学裂解”和“可体内酶促裂解”是指该连接体或基团在血液循环中稳定并仅在靶细胞处或靶细胞中通过其中不同的化学或酶环境（较低pH；升高的谷胱甘肽浓度；溶酶体酶，如组织蛋白酶或血纤维蛋白溶酶，或糖苷酶（Glyosidasen），例如β-葡糖醛酸酶的存在）裂解，由此释放低分子量KSP抑制剂或其衍生物。可体内化学裂解的基团特别是二硫、腙、缩醛和缩醛胺；可体内酶促裂解的基团特别是2-8-寡肽基团，尤其是二肽基团或糖苷。在Bioconjugate Chem. 2002, 13, 855-869和Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters 8 (1998) 3341-3346以及Bioconjugate Chem. 1998, 9, 618-626中公开了肽裂解位点。这些包括，例如，缬氨酸-丙氨酸、缬氨酸-赖氨酸、缬氨酸-瓜氨酸、丙氨酸-赖氨酸和苯基丙氨酸-赖氨酸（任选具有附加酰胺基团）。

体内稳定的连接体以高稳定性为特征（在血浆中24小时后少于5%代谢产物）并且没有上文提到的可化学或酶促体内裂解的基团。

连接体–L-优选具有下示基本结构(i)至(iv)之一：

(i) –(CO)_m–SG1-L1-L2-

(ii) –(CO)_m –L1-SG-L1-L2-

(iii) –(CO)_m –L1-L2-

(iv) –(CO)_m –L1-SG-L2

其中m是0或1；SG是可（化学或酶促）体内裂解的基团（ 特别是二硫、腙、缩醛和缩醛胺；或可被组织蛋白酶或血纤维蛋白溶酶裂解的2-8-寡肽基团），SG1是寡肽基团或优选二肽基团，L1彼此独立地代表体内稳定的有机基团，且L2代表连向结合体的偶联基团或单键。在此，优选偶联到结合体的半胱氨酸残基或赖氨酸残基上。或者，可以偶联到结合体的酪氨酸残基、谷氨酰胺残基或非天然氨基酸上。非天然氨基酸可含有例如醛或酮基（例如甲酰基甘氨酸）或叠氮或炔基（参见Lan & Chin, Cellular Incorporation of Unnatural Amino Acids and Bioorthogonal Labeling of Proteins, Chem.Rev. 2014, 114, 4764-4806）。

根据本发明特别优选的是连接体基本结构(iii)，特别是当结合体是抗-TWEAKR抗体或抗-EGFR抗体时。通过代谢，具有连接体基本结构(iii)且连接体偶联到结合体蛋白质或肽的半胱氨酸或赖氨酸残基上的本发明的偶联物的给药产生下式的半胱氨酸或赖氨酸衍生物：

其中L1在每种情况下连接到低分子量KSP抑制剂，例如式(I)、(IIa)、(II)、(III)、(IIIa)、(IIIb)、(IIIc)、(IIId)、(IIIe)或(IV)的化合物上。

根据本发明也优选的是连接体基本结构(ii)和(iv)，特别是当在位置(iii)连接时，特别是当基团L1具有下列结构之一时：

(a) –NH-(CH₂)_0-4-(CHCH₃)_0-4-CHY⁵-CO-Y⁷，其中Y⁵代表H或NHY⁶，其中Y⁶代表H或-COCH₃，且Y⁷代表单键或–NH-(CH₂)_0-4–CHNH₂-CO-，以在裂解后获得相应的结构–NH-(CH₂)_0-4-(CHCH₃)_0-4-CHY⁵-COOH或–NH-(CH₂)_0-4-(CHCH₃)_0-4-CHY⁵-CO-NH-(CH₂)_0-4-CHNH₂-COOH。

(b) –CH₂-S_x-(CH₂)_0-4-CHY⁵-CO-，其中x是0或1，且Y⁵代表H或NHY⁶，其中Y6代表H或-COCH₃，以在裂解后获得相应的结构–CH₂-S_x-(CH₂)_0-4-CHY⁵-COOH。

当L1在每种情况下连接到低分子量KSP抑制剂，例如式(I)、(IIa)、(II)、(III)、(IIIa)、(IIIb)、(IIIc)、(IIId)、(IIIe)或(IV)的化合物上（特别是在位置R₄）时，这一实施方案是优选的。该结合体优选是抗-TWEAKR抗体或抗-EGFR抗体。

如果连接体连接到半胱氨酸侧链或半胱氨酸残基上，L2优选衍生自与半胱氨酸的巯基反应的基团。这些包括卤乙酰、马来酰亚胺、氮丙啶、丙烯酰、芳基化化合物、乙烯基砜、吡啶二硫、TNB硫醇和二硫-还原剂。这些基团通常以亲电子方式与巯基键反应，以形成硫桥（例如硫醚）或二硫桥。优选的是稳定的硫桥。L2优选是

其中

#¹是指与结合体的硫原子的连接点，

#²是指与基团L¹的连接点，且

R₂₂代表COOH、COOR、COR、CONHR、CONR₂（其中R在每种情况下代表C_1-3-烷基）、CONH₂，优选COOH。

L2特别优选是：

或

其中#¹是指与结合体的硫原子的连接点，#²是指与活性物质的连接点，x代表1或2，且R²²代表COOH、COOR、COR、CONHR（其中R在每种情况下代表C_1-3-烷基）、CONH₂，优选COOH。优选x=1且R²²代表COOH。

在本发明的偶联物中或在本发明的偶联物的混合物中，在优选大于80%，特别优选大于90%（在每种情况下基于连接体与结合体的键的总数计）的程度上存在连向结合体的半胱氨酸残基的键，特别优选作为式A3或A4的两种结构之一。在此，式A3或A4的结构通常一起存在，基于连向结合体的键的数量计，优选为60:40至40:60的比率。剩余键随之作为下列结构存在

。

根据本发明，L1优选由下式表示

其中

R¹⁰代表H、NH₂或C₁-C₃-烷基；

G1代表–NHCO-、-CONH-或；（如果G1代表NHCO或，则R¹⁰优选不是NH₂），

n是0或1；

o是0或1；且

G2代表具有1至100个碳原子的直链或支化的烃链，其来自亚芳基和/或直链和/或支化和/或环状亚烷基并可被基团-O-、-S-、-SO-、SO₂、-NR^y-、-NR^yCO-、-C(NH)NR^y-、CONR^y-、-NR^yNR^y-、-SO₂NR^yNR^y-、-CONR^yNR^y-（其中R^y代表H、苯基、C₁-C₁₀-烷基、C₂-C₁₀-烯基或C₂-C₁₀-炔基，它们各自可被NHCONH₂、-COOH、-OH、-NH₂、NH-CNNH₂、磺酰胺、砜、亚砜或磺酸取代）、-CO-、-CR^x=N-O-（其中R^x代表H、C₁-C₃-烷基或苯基）和/或具有最多4个选自N、O和S、-SO-或–SO₂-的杂原子的3至10元芳族或非芳族杂环（优选）的一个或多个中断一次或多次，其中如果存在烃链包括侧链，其可被-NHCONH₂、-COOH、-OH、-NH₂、NH-CNNH₂、磺酰胺、砜、亚砜或磺酸取代。

G2代表具有1至100个碳原子的直链或支化的烃链，其来自亚芳基和/或直链和/或支化和/或环状亚烷基并可被基团-O-、-S-、-SO-、SO₂、-NH-、-CO-、-NHCO-、-CONH-、-NMe-、-NHNH-、-SO₂NHNH-、-CONHNH-和具有最多4个选自N、O和S或-SO-的杂原子的5至10元芳族或非芳族杂环（优选）的一个或多个中断一次或多次，其中如果存在侧链，其可被–NHCONH₂、-COOH、-OH、-NH₂、NH-CNNH₂、磺酰胺、砜、亚砜或磺酸取代。

G2优选代表具有1至100个碳原子的直链或支化的烃链，其来自亚芳基和/或直链和/或支化和/或环状亚烷基并可被基团-O-、-S-、-SO-、SO₂、-NH-、-CO-、-NHCO-、-CONH-、-NMe-、-NHNH-、-SO₂NHNH-、-CONHNH-、-CR^x=N-O-（其中R^x代表H、C₁-C₃-烷基或苯基）和具有最多4个选自N、O和S、-SO-或–SO₂-的杂原子的3至10元，例如5至10元芳族或非芳族杂环（优选）的一个或多个中断一次或多次，其中如果存在烃链包括侧链，其可被–NHCONH₂、-COOH、-OH、-NH₂、NH-CNNH₂、磺酰胺、砜、亚砜或磺酸取代。

G2中的进一步的中断基团优选是

其中Rx代表H、C₁-C₃-烷基或苯基。

在此，#¹是连向KSP抑制剂的键且#²是连向与结合体的偶联基团（例如L2）的键。

来自亚芳基和/或直链和/或支化和/或环状亚烷基的直链或支化的烃链通常包含具有各自所示的碳原子数的α,ω-二价烷基。可作为优选提到的实例是：亚甲基、乙烷-1,2-二基（1,2-亚乙基）、丙烷-1,3-二基（1,3-亚丙基）、丁烷-1,4-二基（1,4-亚丁基）、戊烷-1,5-二基（1,5-亚戊基）、己烷-1,6-二基（1,6-亚己基）、庚烷-1,7-二基（1,7-亚己基）、辛烷-1,8-二基（1,8-亚辛基）、壬烷-1,9-二基（1,9-亚壬基）、癸烷-1,10-二基（1,10-亚癸基)。但是，该烃链中的亚烷基也可以是支化的的，即上文提到的直链亚烷基的一个或多个氢原子可任选被C_1-10-烷基取代，由此形成侧链。该烃链还可含有环状亚烷基（环烷二基），例如1,4-环己烷二基或1,3-环戊烷二基。这些环状基团可以是不饱和的。特别地，在该烃基中可存在芳基（亚芳基），例如亚苯基。在该环状亚烷基和亚芳基中，一个或多个氢原子也可任选被C_1-10-烷基取代。由此，形成任选支化的烃链。这种烃链具有总共0至100个碳原子，优选1至50，特别优选2至25个碳原子。

如果存在侧链，其可被–NHCONH₂、-COOH、-OH、-NH₂、NH-CNNH₂、磺酰胺、砜、亚砜或磺酸取代。

该烃链可被基团-O-、-S-、-SO-、SO₂、-NH-、-CO-、-NHCO-、-CONH-、-NMe-、-NHNH-、-SO₂NHNH-、-CONHNH-和具有最多4个选自N、O和S、-SO-或–SO₂-的杂原子的5至10元芳族或非芳族杂环（优选）的一个或多个中断一次或多次。

G2中的进一步的中断基团优选是

。

所述连接体优选符合下式：

§-(CO)m-L1-L2-§§

其中

m是0或1；

§代表连向活性物质分子的键且

§§代表连向结合体肽或蛋白质的键，且

L1和L2具有上文给出的含义。

L1特别优选具有式–NR¹¹B-，其中

R¹¹代表H或NH₂；

B代表–[(CH₂)_x-(X⁴)_y]w-(CH₂)_z-，

w = 0至20；

x = 0至5；

x = 0至5；

y = 0或1；

z = 0至5；且

X⁴代表–O-、-CONH-、–NHCO-或。

根据本发明优选的连接体L具有下式：

其中

#3代表连向活性物质分子的键，

#4代表连向结合体肽或蛋白质的键，

R¹¹代表H或NH₂；

B代表–[(CH₂)_x-(X⁴)_y]_w-(CH₂)_z-，

w = 0至20；

x = 0至5；

y = 0或1；

z = 1至5；且

X⁴代表–O-、-CONH-、–NHCO-或。

上文提到的连接体在式(I)或(II)的偶联物中尤其优选，其中该连接体通过取代R¹处的氢原子或与R⁴处的可裂解连接体SG1一起偶联，即R¹代表–L-#1或R⁴代表-SG1-L-#1，其中#1代表连向结合体的键。

根据本发明还优选的是下列连接体：在本发明的偶联物中或在本发明的偶联物的混合物中，在优选大于80%，特别优选大于90%（在每种情况下基于连接体与结合体的键的总数计）的程度上存在连向结合体的半胱氨酸残基的键，特别优选作为式A5或A6的两种结构之一：

其中

#¹是指与结合体的硫原子的连接点，

#²是指与基团L¹的连接点，且

R²²代表COOH、COOR、COR、CONHR（其中R在每种情况下代表C1-3-烷基）、CONH₂，优选COOH。

在此，式A5或A6的结构通常一起存在，基于连向结合体的键的数量计，优选为60:40至40:60的比率。剩余键随之作为下列结构存在

。

连接到半胱氨酸侧链或半胱氨酸残基上的其它连接体–L-具有下式：

其中

§代表连向活性物质分子的键且

§§代表连向结合体肽或蛋白质的键，

m是0、1、2或3；

n是0、1或2；

p是0至20；且

L3代表

；

其中

o是0或1；

且

G₃代表具有1至100个碳原子的直链或支化的烃链，其来自亚芳基和/或直链和/或环状亚烷基并可被基团-O-、-S-、-SO-、SO₂、-NH-、-CO-、-NHCO-、-CONH-、-NMe-、-NHNH-、-SO₂NHNH-、-CONHNH-和具有最多4个选自N、O和S、-SO-或SO₂的杂原子的3至10元（优选5至10元）芳族或非芳族杂环（优选）的一个或多个中断一次或多次，其中如果存在侧链，其可被–NHCONH₂、-COOH、-OH、-NH₂、NH-CNNH₂、磺酰胺、砜、亚砜或磺酸取代。

在上式中，优选地，

m是1；

p是0；

n是0；

且L3代表

；

其中

o是0或1；且

G₃代表-(CH₂CH₂O)_s(CH₂)_t(CONH)_u CH₂CH₂O)_v(CH₂)_w-，其中

s、t、v和w各自彼此独立地为0至20，且u是0或1。

上式§-(CO)m-L1-L2-§§中的优选基团L1是下示那些，其中r在每种情况下彼此独立地代表0至20，优选0至15，特别优选1至20，尤其优选2至10的数值：

在表C中给出L1的进一步实例，其中这一基团突出标示在框中。

在下表A和A'中给出连接体部分L1的实例。该表还指出L1的这些实例优选与哪种基团L2组合，以及优选的偶联点（R¹-R⁵）和m的优选值，即在L1前是否存在羰基（参见§-(CO)m-L1-L2-§§）。这些连接体优选偶联到半胱氨酸残基上。第一列还指出使用相关连接体的西妥昔单抗ADC的实施例号，但这在各行中同样适用于含其它抗体的ADC。如果L2是琥珀酰亚胺或由其衍生而得，这种酰亚胺也可以完全或部分为如上所述的水解开链琥珀酰胺的形式。根据L1，这种水解成开链琥珀酰胺可以是或多或少显著或完全不明显的。

*R²和R⁴形成被连接体取代的吡咯烷环。

**特别优选地，这些行中给出的连接体L1连接到选自下列的连接体L2上：

和/或

其中#¹是指与结合体的硫原子的连接点，#²是指与基团L¹的连接点，R²²优选代表COOH。在本发明的偶联物中或在本发明的偶联物的混合物中，在优选大于80%，特别优选大于90%（在每种情况下基于连接体与结合体的键的总数计）的程度上存在连向结合体的半胱氨酸残基的键，特别优选作为式A7或A8的两种结构之一。在此，式A7或A8的结构通常一起存在，基于连向结合体的键的数量计，优选为60:40至40:60的比率。剩余键随之作为下列结构存在

。

**: 见表A的注**

***: 当存在这一结构L2时，可同时存在下式结构L2：

。

具有相应连接体的偶联物的实例具有下列结构，其中X1、X2、X3和L1具有上文给出的含义，L2和L3具有与L1相同的含义，AK1代表经半胱氨酸残基连接的抗体，且n是1至10的数值。特别优选地，AK1是人、人源化或嵌合单克隆抗体或其抗原结合片段，特别是抗-TWEAKR抗体或其抗原结合片段或抗-EGFR抗体或其抗原结合片段。特别优选的是特异性结合到TWEAKR（SEQ ID NO:169）的位置47中的氨基酸D（D47）上的抗-TWEAKR抗体，特别是抗-TWEAKR抗体TPP-2090或抗-EGFR抗体西妥昔单抗或尼妥珠单抗。

如果该连接体连接到赖氨酸侧链或赖氨酸残基上，其优选具有下式：

-§-(SG)_x-L4-CO-§§

其中

§代表连向活性物质分子的键且

§§代表连向结合体肽或蛋白质的键，

x代表0或1，

SG代表可裂解基团，优选2-8寡肽，特别优选二肽，

且

L4代表单键或基团–(CO)_y-G4-，其中y代表0或1，且

G4代表具有1至100个碳原子的直链或支化的烃链，其来自亚芳基和/或直链和/或支化和/或环状亚烷基并可被基团-O-、-S-、-SO-、SO₂、-NH-、-CO-、-NHCO-、-CONH-、-NMe-、-NHNH-、-SO₂NHNH-、-CONHNH-和具有最多4个选自N、O和S、-SO-或-SO2-的杂原子的5至10元芳族或非芳族杂环（优选）的一个或多个中断一次或多次，其中如果存在侧链，其可被–NHCONH₂、-COOH、-OH、-NH₂、NH-CNNH₂、磺酰胺、砜、亚砜或磺酸取代。

下表B给出连向赖氨酸残基的连接体的实例。该表还给出优选偶联点（R¹-R⁵）。第一列还指出使用相应连接体的实施例号。

表B：赖氨酸连接体

-§-(SG)_x-L4-CO-§§

。

具有相应连接体的偶联物的实例具有下列结构，其中X1、X2、X3和L4具有上文给出的含义，AK2代表经赖氨酸残基连接的抗体，且n是1至10的数值。特别优选地，AK2是人、人源化或嵌合单克隆抗体或其抗原结合片段，特别是抗-TWEAKR抗体或其抗原结合片段或抗-EGFR抗体或其抗原结合片段。特别优选的是特异性结合到TWEAKR（SEQ ID NO:169）的位置47中的氨基酸D（D47）上的抗-TWEAKR抗体，特别是抗-TWEAKR抗体TPP-2090或抗-EGFR抗体西妥昔单抗或尼妥珠单抗。

根据本发明还优选的是基本结构(i)、(ii)或(iv)，其中SG1或SG代表可被组织蛋白酶裂解的基团，且L1和L2具有上文给出的含义。特别优选的是下列基团：

●-Val-Ala-CONH-（由此裂解丙氨酸的C-末端酰胺处的酰胺键）

●-NH-Val-Lys-CONH-（裂解赖氨酸的C-末端酰胺处的酰胺键）

●-NH-Val-Cit-CONH-（裂解瓜氨酸的C-末端酰胺处的酰胺键）

●-NH-Phe-Lys-CONH（裂解赖氨酸的C-末端酰胺处的酰胺键）

●-NH-Ala-Lys-CONH-（裂解赖氨酸的C-末端酰胺处的酰胺键）

●-NH-Ala-Cit-CONH-（裂解瓜氨酸的C-末端酰胺处的酰胺键）

SG1或SG特别优选是

或

或

其中X代表H或可任选被–NHCONH₂、-COOH、-OH、NH₂、-NH-CNNH₂或磺酸取代的C_1-10-烷基。

下表C给出连接体部分–SG1-L1-或–L1-SG-L1-的实例，其中SG1和SG是可被组织蛋白酶裂解的基团。表C还指出–SG1-L1-和–L1-SG-L1-的这些实例优选与哪种基团L2组合，以及优选的偶联点（R¹-R⁵）和m的优选值，即在L1前是否存在羰基（参见§-(CO)m-L1-L2-§§）。这些连接体优选偶联到半胱氨酸残基上。第一列还例性地对西妥昔单抗ADC给出使用相应连接体的实施例号，示。它们同样适用于含其它抗体的相应ADC。L1基团突出标示在框中。但是，这些基团L1可被对上式§-(CO)m-L1-L2-§§给出的基团L1之一替代。如果L2是琥珀酰胺或由其衍生而得，这种酰胺也可以完全或部分为如上所述的水解开链琥珀酰胺的形式。

具有基本结构(i)的偶联物的实例具有下列结构，其中X1、X2和X3具有上文给出的含义，L4具有与L1相同的含义，AK1代表经半胱氨酸残基连接的抗体，且n是1至10的数值。特别优选地，AK1是抗-TWEAKR抗体，特别是特异性结合到TWEAKR（SEQ ID NO:169）的位置47中的氨基酸D（D47）上的抗-TWEAKR抗体，特别是抗-TWEAKR抗体TPP-2090。

KSP抑制剂 - 连接体中间体和该偶联物的制备

本发明的偶联物通过首先提供含连接体的低分子量KSP抑制剂制备。由此获得的中间体随后与结合体（优选抗体）反应。

优选地，为了偶联到半胱氨酸残基上，使下示化合物之一与为此任选部分还原的含半胱氨酸的结合体，如抗体反应：

其中R代表-H或–COOH，

其中K代表任选被C₁-C₆-烷氧基或–OH取代的直链或支化的C₁-C₆烷基，且

其中X₁、X₂、X₃、SG1、L1、L2、L3和L4具有如上所述的相同含义。

该化合物可以例如以其三氟乙酸盐的形式使用。对于与结合体，例如抗体的反应，该化合物优选相对于结合体以2至12倍摩尔过量使用。

优选地，为了偶联到赖氨酸残基上，使下示化合物之一与含赖氨酸的结合体，如抗体反应：

其中X₁、X₂、X₃具有与式(II)中相同的含义且L4具有与L1相同的含义且L1具有与上文所述相同的含义。

为了偶联到半胱氨酸残基上的中间体，该反应可以如下所示：

可以相应地使其它中间体和其它抗体反应。

为了偶联到赖氨酸基团上的中间体，该反应可以如下所示：

根据本发明，这产生下列偶联物：

根据连接体，琥珀酰亚胺连接的ADC在偶联后可转化成具有有利的稳定性状况的开链琥珀酰胺。

这种反应（开环）可以在pH 7.5至9下，优选在pH 8下在25℃至37℃的温度下，例如通过搅拌进行。优选搅拌时间为8至30小时。

在上式中，X₁、X₂、X₃具有与式(II)中相同的含义，SG1和L1具有如上所述的相同含义且L2、L3和L4具有与L1相同的含义；R和K具有如上所述的相同含义。AK1是经半胱氨酸残基偶联的抗体且AK2是经赖氨酸残基偶联的抗体。特别优选地，AK1和AK2是抗-TWEAKR抗体，特别是特异性结合到TWEAKR（SEQ ID NO:169）的位置47中的氨基酸D（D47）上的抗体，特别是抗-TWEAKR抗体TPP-2090。

结合体

在最广义上，术语“结合体”被理解为是指结合到该结合体/活性物质偶联物指向的某些靶细胞群上存在的靶分子上的分子。术语结合体应以其最广的含义理解并且也包括例如凝集素、能够结合到某些糖链上的蛋白质和磷脂结合蛋白。此类结合体包括，例如，高分子量蛋白质（结合蛋白）、多肽或肽（结合肽）、非肽（例如适体（US5,270,163）（Keefe AD.等人, Nat. Rev. Drug Discov. 2010；9:537-550综述）或维生素）和所有其它细胞结合分子或物质。结合蛋白是例如抗体和抗体片段或拟抗体，例如亲和体（Affibodies）、Adnectins、Anticalins、DARPins、Avimers、纳米抗体（Gebauer M.等人, Curr. Opinion in Chem. Biol. 2009；13:245-255；Nuttall S.D.等人， Curr. Opinion in Pharmacology 2008；8:608-617综述）。结合肽是例如配体/受体对的配体，例如配体/受体对VEGF/KDR的VEGF，如配体/受体对转铁蛋白/转铁蛋白受体的转铁蛋白，或细胞因子/细胞因子受体，如配体/受体对TNFα/TNFα受体的TNFα。

文献还公开了有机分子共价偶联（结合）到抗体上的各种可能性。根据本发明优选的是毒簇经由抗体的半胱氨酸残基的一个或多个硫原子和/或经由抗体的赖氨酸残基的一个或多个NH基团偶联到抗体上。但是，也可以经由游离羧基或经由抗体的糖残基将毒簇连接到抗体上。

“靶分子”在最广义上被理解为是指存在于靶细胞群中的分子并可以是蛋白质（例如生长因子的受体）或非肽分子（例如糖或磷脂）。其优选是受体或抗原。

术语“细胞外”靶分子描述位于细胞外部的连接到细胞上的靶分子，或位于细胞外部的靶分子的一部分，即结合体可以在完整的细胞上连接到其细胞外靶分子上。细胞外靶分子可锚定在细胞膜中或是细胞膜的组成部分。本领域技术人员了解识别细胞外靶分子的方法。对于蛋白质，这可以通过（一个或多个）跨膜域的测定和蛋白质在该膜中的取向来进行。这些数据通常存放在蛋白质数据库（例如SwissProt）中。

术语“癌症靶分子”描述与相同组织类型的非癌细胞相比更大量地存在于一种或多种癌细胞种类上的靶分子。优选地，癌症靶分子与相同组织类型的非癌细胞相比选择性存在于一种或多种癌细胞种类上，其中“选择性”描述与相同组织类型的非癌细胞相比至少两倍富集在癌细胞上（“选择性癌症靶分子”)。癌症靶分子的使用允许通过本发明的偶联物选择性治疗癌细胞。

结合体可经由键连接到连接体上。结合体的连接可经由该结合体的杂原子。结合体的根据本发明可用于连接的杂原子是硫（在一个实施方案中经由结合体的巯基）、氧（根据本发明借助结合体的羧基或羟基）和氮（在一个实施方案中经由结合体的伯或仲胺基或酰胺基）。这些杂原子可存在于天然结合体中或通过化学方法或分子生物学方法引入。根据本发明，结合体与毒簇的连接对结合体与靶分子的结合活性只有轻微影响。在一个优选实施方案中，该连接对结合体与靶分子的结合活性没有影响。

根据本发明，术语“抗体”应以其最广的含义理解并包括免疫球蛋白分子，例如完全或修饰的单克隆抗体、多克隆抗体或多特异性抗体（例如双特异性抗体）。免疫球蛋白分子优选包含具有通常通过二硫桥连接的四个多肽链、两个重链（H链）和两个轻链（L链）的分子。各重链包含重链可变域（缩写为VH）和重链恒定域。重链恒定域可以例如包含三个结构域CH1、CH2和CH3。各轻链包含可变域（缩写为VL）和恒定域。轻链恒定域包含结构域（缩写为CL）。VH和VL域可进一步细分成高变区，也称作互补决定区（缩写为CDR），和具有低序列变异性的区域（骨架区，缩写为FR）。通常，各VH和VL区由三个CDR和最多四个FR构成。例如以下列顺序从氨基末端到羧基末端：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。抗体可获自对此任何合适的物种，例如兔、美洲驼、骆驼、小鼠或大鼠。在一个实施方案中，该抗体为人或鼠来源的。抗体可以例如是人的、人源化的或嵌合的。

术语“单克隆”抗体是指获自一群基本同质抗体的抗体，即该群的各个抗体除天然存在的突变（其可以为少数）外相同。单克隆抗体以高特异性识别单个抗原结合位点。术语单克隆抗体不涉及特定制备方法。

术语“完全”抗体是指包含抗原结合域和轻链和重链的恒定域的抗体。恒定域可以是天然存在的结构域或具有许多修饰的氨基酸位置的变体。

术语“修饰的完全”抗体是指借助共价键（例如肽键）经由它们的氨基末端或羧基末端与不源自抗体的另一多肽或蛋白质融合的完全抗体。此外，可以修饰抗体以在特定位置引入反应性半胱氨酸以促进偶联到毒簇上（参见Junutula等人Nat Biotechnol. 2008年8月 ；26(8):925-32）。

术语“人”抗体是指可获自人的抗体或是合成的人抗体。“合成的”人抗体是部分或更困难地完全地可基于人抗体序列的分析由合成序列计算机模拟获得的抗体。人抗体可以例如由从人源性抗体序列库中分离的核酸编码。此类抗体的实例可见于Söderlind等人, Nature Biotech. 2000, 18:853-856。

术语“人源化”或“嵌合”抗体描述由序列的非人部分和人部分构成的抗体。在这些抗体中，人免疫球蛋白的一部分序列（受体）被非人免疫球蛋白的序列部分（供体）替代。在许多情况下，该供体是鼠免疫球蛋白。在人源化抗体的情况下，受体的CDR的氨基酸被供体的氨基酸替代。有时，骨架的氨基酸也被供体的相应氨基酸替代。在一些情况下，该人源化抗体含有在抗体的优化过程中引入的既不包含于受体中又不包含于供体中的氨基酸。在嵌合抗体的情况下，供体免疫球蛋白的可变域与人抗体的恒定区融合。

本文所用的术语互补决定区（CDR）是指结合到抗原上所需的抗体可变区的氨基酸。通常，各可变区具有三个CDR区，被称作CDR1、CDR2和CDR3。各CDR区可包含根据Kabat定义的氨基酸和/或根据Chotia定义的高变环（loops）的氨基酸。根据Kabat的定义包含例如来自大致可变轻链的氨基酸位置24 – 34（CDR1）、50 – 56（CDR2）和89 – 97（CDR3）和可变重链的31 – 35（CDR1）、50 – 65（CDR2）和95 – 102（CDR3）附近的区域（Kabat等人, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 第5版 Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991)）。根据Chotia的定义包含例如来自大致可变轻链的氨基酸位置26 – 32（CDR1）、50 – 52（CDR2）和91 –96（CDR3）和可变重链的26 – 32（CDR1）、53 – 55（CDR2）和96 – 101（CDR3）的区域（Chothia和Lesk；J Mol Biol 196: 901-917 (1987)）。在一些情况下，CDR可包含来自根据Kabat和Chotia定义的CDR区的氨基酸。

根据重链恒定域的氨基酸序列，可以将抗体分成不同种类。完全抗体有五大类：IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，其中几种可分成进一步的亚类（同型），例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2。与不同种类对应的重链恒定域被称作[alpha/α]、[delta/δ]、[epsilon/ε], [gamma/γ]和[my/μ]。抗体的三维结构和亚基结构都是已知的。

抗体/免疫球蛋白的术语“功能片段”或“抗原结合抗体片段”被定义为仍包含抗体/免疫球蛋白的抗原结合域的抗体/免疫球蛋白的片段（例如IgG的可变域）。抗体的“抗原结合域”通常包含抗体的一个或多个高变区，例如CDR、CDR2和/或CDR3区。但是，抗体的“框架”或“骨架”区在抗体结合到抗原上的过程中也可能起到一定作用。框架区构成CDR的骨架。抗原结合域优选包含至少可变轻链的氨基酸4至103和可变重链的氨基酸5至109，更优选可变轻链的氨基酸3至107和可变重链的4至111，特别优选完整的可变轻链和重链，即VL的氨基酸1 – 109和VH的1至113（根据WO97/08320编号）。

本发明的“功能片段”或“抗原结合抗体片段”非穷举地包括Fab、Fab'、F(ab')2和Fv片段、双价抗体、单域抗体（DAb）、线性抗体、单链的抗体（单链Fv，缩写为scFv）；和多特异性抗体，如双和三特异性抗体，例如由抗体片段形成C. A. K Borrebaeck编辑(1995) Antibody Engineering (Breakthroughs in Molecular Biology), Oxford University Press；R. Kontermann & S. Duebel, 编辑 (2001) Antibody Engineering (Springer Laboratory Manual), Springer Verlag。非“多特异性”或“多功能”抗体的抗体是具有相同结合位点的那些。多特异性抗体可对抗原的不同表位是特异性的或可对多于一种抗原的表位是特异性的（参见例如WO 93/17715；WO 92/08802；WO 91/00360；WO 92/05793；Tutt,等人, 1991, J. Immunol. 147:60 69；美国专利号4,474,893；4,714,681 ；4,925,648；5,573,920；5,601,819；或Kostelny等人, 1992, J. Immunol. 148: 1547 1553）。可以构建F(ab')2或Fab分子以能够减少或完全防止在Ch1和CL结构域之间发生的分子间二硫化物相互作用的数量。

“表位”是指能特异性结合到免疫球蛋白或T细胞受体上的蛋白质决定簇。表位决定簇通常由分子的化学活性表面基团如氨基酸或糖侧链或其组合构成，并通常具有特定的三维结构性质以及特定的电荷性质。

“功能片段”或“抗原结合抗体片段”可经其氨基末端或羧基末端借助共价键（例如肽键）与非源自抗体的另一多肽或蛋白质融合。此外，可通过在特定位置引入反应性半胱氨酸而修饰抗体和抗原结合片段，以促进偶联到毒簇上（参见Junutula等人Nat Biotechnol. 2008 Aug；26(8):925-32）。

多克隆抗体可通过本领域普通技术人员已知的方法制备。单克隆抗体可通过本领域普通技术人员已知的方法制备（Köhler和Milstein, Nature, 256, 495-497, 1975）。人和人源化单克隆抗体可通过本领域普通技术人员已知的方法制备（Olsson等人, Meth Enzymol. 92, 3-16或Cabilly等人US 4,816,567或Boss等人US 4,816,397）。

本领域普通技术人员了解制备人抗体及其片段的各种方法，例如借助转基因小鼠（N Lonberg和D Huszar, Int Rev Immunol. 1995；13(1):65-93）或噬菌体展示技术（Clackson等人, Nature. 1991年8月15日；352(6336):624-8）。本发明的抗体可获自例如由汇集自大量健康志愿者的多种多样的抗体的氨基酸序列构成的重组抗体库。抗体也可借助已知的重组DNA技术制造。抗体的核酸序列可通过常规测序获得或可获自可公开访问的数据库。

“分离的”抗体或结合体已经纯化以除去细胞的其它成分。可能干扰诊断或治疗用途的细胞的污染成分是例如酶、激素或细胞的其它肽或非肽成分。优选的抗体或结合体已纯化至该抗体或结合体的大于95重量%的程度（例如通过Lowry法、UV-Vis光谱学或通过SDS毛细管凝胶电泳测定）。此外，已纯化至可以决定氨基末端或内部氨基酸序列的至少15个氨基酸的程度或已纯化至同质性的抗体，其中同质性通过SDS-PAGE在还原或非还原条件下测定（可以借助考马斯蓝染色或优选通过银着色进行检测）。但是，通常通过一个或多个纯化步骤制备抗体。

术语“特异性结合”是指抗体或结合体结合到预定抗原/靶分子上。抗体或结合体的特异性结合通常描述具有至少10^-7 M的亲和力（作为Kd值；即优选为具有比10^-7 M小的Kd值的那些）的抗体或结合体，其中该抗体或结合体对预定抗原/靶分子的亲和力比对不是预定抗原/靶分子或密切相关抗原/靶分子的非特异性抗原/靶分子（例如牛血清白蛋白或酪蛋白）高至少两倍。该抗体优选具有至少10^-7 M（作为Kd值；换言之优选为具有比10^-7 M小的Kd值的那些），优选至少10^-8 M，更优选10^-9 M至10^-11 M的亲和力。可以例如借助表面等离子体共振波谱法测定Kd值。

本发明的抗体/活性物质偶联物同样表现出在这些范围内的亲和力。该亲和力优选基本不受活性物质偶联的影响（一般而言，该亲和力降低小于一个量级，换言之，例如最多从10^-8 M到10^-7 M）。

根据本发明使用的抗体也优选以高选择性为特征。当本发明的抗体对靶蛋白表现出的亲合力比对非依赖性的其它抗原，例如人血清白蛋白好至少2倍，优选5倍或更优选10倍（可以例如借助表面等离子体共振波谱法测定亲和力），则存在高选择性。

此外，所用的本发明的抗体优选是交叉反应性的。为了能够促进和更好地解释临床前研究，例如毒理学或效力研究（例如在异种移植小鼠中），如果根据本发明使用的抗体不仅结合人靶蛋白还结合用于研究的物种中的物种靶蛋白，则是有利的。在一个实施方案中，根据本发明使用的抗体除人靶蛋白外还对至少一个其它物种的靶蛋白呈交叉反应性。对于毒理学和或效力研究，优选使用啮齿科、犬科和非人灵长科的物种。优选的啮齿物种是小鼠和大鼠。优选的非人灵长类动物是猕猴、猩猩和长尾猕猴。

在一个实施方案中，根据本发明使用的抗体除人靶蛋白外还对选自小鼠、大鼠和长尾猕猴（食蟹猴）的至少一个其它物种的靶蛋白呈交叉反应性。尤其优选的是除人靶蛋白外至少对小鼠靶蛋白呈交叉反应性的根据本发明使用的抗体。优选的是对其它非人物种的靶蛋白的亲和力与对人靶蛋白的亲和力相差不大于50倍，特别是不大于10倍的交叉反应性抗体。

抗癌症靶分子的抗体

结合体，例如抗体或其抗原结合片段指向的靶分子优选是癌症靶分子。术语“癌症靶分子”描述与相同组织类型的非癌细胞相比更大量存在于一种或多种癌细胞种类上的靶分子。优选地，癌症靶分子与相同组织类型的非癌细胞相比选择性存在于一种或多种癌细胞种类上，其中“选择性”描述与相同组织类型的非癌细胞相比至少两倍富集在癌细胞上（“选择性癌症靶分子”）。癌症靶分子的使用允许通过本发明的偶联物选择性治疗癌细胞。

对抗原，例如癌细胞抗原特异性的抗体可以由本领域普通技术人员借助他熟悉的方法（例如重组表达）制备或可商业获得（例如获自Merck KGaA, 德国）。癌症疗法中的已知市售抗体的实例是Erbitux®（西妥昔单抗，Merck KGaA）、Avastin®（贝伐单抗，Roche）和Herceptin®（曲妥珠单抗，Genentech）。曲妥珠单抗是IgG1κ型重组人源化单克隆抗体，其在细胞基检测中以高亲和力（Kd = 5 nM）结合人表皮生长受体的胞外域。该抗体在CHO细胞中重组产生。

在一个优选实施方案中，该靶分子是选择性癌症靶分子。

在一个特别优选的实施方案中，该靶分子是蛋白质。

在一个实施方案中，该靶分子是细胞外靶分子。在一个优选实施方案中，该细胞外靶分子是蛋白质。

癌症靶分子是本领域技术人员已知的。下面列出这些的实例。

癌症靶分子的实例是：

(1) EGF受体（NCBI参考序列NP_005219.2），SEQ ID NO: 213（1210个氨基酸）:

通过下划线标记胞外域。

(2) 间皮素（SwissProt参考Q13421-3），SEQ ID NO: 214（622氨基酸）:

>sp|Q13421-3|间皮素的MSLN_HUMAN同种型2 OS=智人 GN=MSLN

其中间皮素由氨基酸296-598编码。氨基酸37-286编码巨核细胞-强化因子。间皮素经GPI锚锚定在细胞膜中并定域在细胞外。

(3) 碳酸酐酶IX (SwissProt参考Q16790), SEQ ID NO: 215（459个氨基酸）:

>sp|Q16790|CAH9_HUMAN碳酸酐酶9 OS=智人GN=CA9 PE=1 SV=2

通过下划线标记胞外域。

(4) C4.4a（NCBI参考序列NP_055215.2；同义词LYPD3）, SEQ ID NO: 216（346个氨基酸）:

>gi|93004088|ref|NP_055215.2|含ly6/PLAUR结构域的蛋白质3-前体[智人]

通过下划线标记成熟胞外域。

(5) CD52（NCBI参考序列NP_001794.2），SEQ ID NO: 217

>gi|68342030|ref|NP_001794.2| CAMPATH-1抗原前体[智人]

(6) Her2（NCBI参考序列NP_004439.2），SEQ ID NO: 218

>gi|54792096|ref|NP_004439.2|受体酪氨酸-蛋白质激酶erbB-2同种型a [智人]

(7) CD20（NCBI参考序列NP_068769.2），SEQ ID NO: 219

>gi|23110987|ref|NP_068769.2| B-淋巴细胞抗原CD20 [智人]

(8) 淋巴细胞活化抗原CD30 (SwissProt ID P28908), SEQ ID NO: 220

>gi|68348711|ref|NP_001234.2| 肿瘤坏死因子受体超家族成员8同种型1-前体 [智人]

(9) 淋巴细胞粘附分子CD22 (SwissProt ID P20273), SEQ ID NO: 221

>gi|157168355|ref|NP_001762.2| B-细胞受体CD22同种型1-前体 [智人]

(10) 髓系细胞表面抗原CD33 (SwissProt ID P20138), SEQ ID NO: 222

>gi|130979981|ref|NP_001763.3| 髓系细胞表面抗原CD33同种型1-前体 [智人]

(11) 跨膜糖蛋白NMB (SwissProt ID Q14956), SEQ ID NO: 223

>gi|52694752|ref|NP_001005340.1| 跨膜糖蛋白NMB同种型a-前体 [智人]

(12) 粘附分子CD56 (SwissProt ID P13591), SEQ ID NO: 224

>gi|94420689|ref|NP_000606.3|神经细胞粘附分子1同种型1 [智人]

(13) 表面分子CD70 (SwissProt ID P32970), SEQ ID NO: 225

>gi|4507605|ref|NP_001243.1| CD70抗原 [智人]

(14) 表面分子CD74 (SwissProt ID P04233), SEQ ID NO: 226

>gi|10835071|ref|NP_004346.1| HLA II类组织相容性抗原γ链同种型b [智人]

(15) B-淋巴细胞抗原CD19 (SwissProt ID P15391), SEQ ID NO: 227

>gi|296010921|ref|NP_001171569.1| B-淋巴细胞抗原CD19同种型1-前体 [智人]

(16) 表面蛋白粘蛋白-1 (SwissProt ID P15941), SEQ ID NO: 228

>gi|65301117|ref|NP_002447.4| 粘蛋白-1同种型1-前体 [智人]

(17) 表面蛋白CD138 (SwissProt ID P18827), SEQ ID NO: 229

>gi|29568086|ref|NP_002988.3|多配体聚糖-1-前体 [智人]

(18) 整合素αV (Genbank Accession No.: NP_002201.1), SEQ ID NO: 230

>gi|4504763|ref|NP_002201.1| 整合素α-V同种型1-前体 [智人]

(19) 畸胎瘤衍化生长因子1蛋白质TDGF1 (Genbank Accession No.: NP_003203.1), SEQ ID NO: 231

>gi|4507425|ref|NP_003203.1| 畸胎瘤衍化生长因子1同种型1-前体 [智人]

(20) 前列腺特异性膜抗原PSMA (Swiss Prot ID: Q04609), SEQ ID NO: 232

>gi|4758398|ref|NP_004467.1| 谷氨酸羧肽酶2同种型1 [智人]

(21) 酪氨酸蛋白激酶EPHA2 (Swiss Prot ID: P29317), SEQ ID NO: 233

>gi|32967311|ref|NP_004422.2| 肝配蛋白A型受体2-前体 [智人]

(22) 表面蛋白SLC44A4 (Genbank Accession No: NP_001171515), SEQ ID NO: 234

>gi|295849282|ref|NP_001171515.1|胆碱转运蛋白样蛋白质4同种型2 [智人]

(23) 表面蛋白BMPR1B (SwissProt: O00238)

(24) 转运蛋白SLC7A5 (SwissProt: Q01650)

(25) 上皮前列腺抗原STEAP1 (SwissProt: Q9UHE8)

(26) 卵巢癌抗原MUC16 (SwissProt: Q8WXI7)

(27) 转运蛋白SLC34A2 (SwissProt: O95436)

(28) 表面蛋白SEMA5b (SwissProt: Q9P283)

(29) 表面蛋白LYPD1 (SwissProt: Q8N2G4)

(30) 内皮素受体B型EDNRB (SwissProt: P24530)

(31) 环指蛋白RNF43 (SwissProt: Q68DV7)

(32) 前列腺癌相关蛋白STEAP2 (SwissProt: Q8NFT2)

(33) 阳离子通道TRPM4 (SwissProt: Q8TD43)

(34) 补体受体CD21 (SwissProt: P20023)

(35) B细胞抗原受体复合物相关蛋白CD79b (SwissProt: P40259)

(36) 细胞粘附抗原CEACAM6 (SwissProt: P40199)

(37) 二肽酶DPEP1 (SwissProt: P16444)

(38) 白介素受体IL20Rα (SwissProt: Q9UHF4)

(39) 蛋白聚糖BCAN (SwissProt: Q96GW7)

(40) 肝配蛋白受体EPHB2 (SwissProt: P29323)

(41) 前列腺干细胞相关蛋白PSCA (Genbank Accession No: NP_005663.2 )

(42) 表面蛋白LHFPL3 (SwissProt: Q86UP9)

(43) 受体蛋白TNFRSF13C (SwissProt: Q96RJ3)

(44) B细胞抗原受体复合物相关蛋白CD79a (SwissProt: P11912)

(45) 受体蛋白CXCR5 (SwissProt: P32302)

(46) 离子通道P2X5 (SwissProt: Q93086)

(47) 淋巴细胞抗原CD180 (SwissProt: Q99467)

(48) 受体蛋白FCRL1 (SwissProt: Q96LA6)

(49) 受体蛋白FCRL5 (SwissProt: Q96RD9)

(50) MHC II类分子Ia抗原HLA-DOB (Genbank Accession No: NP_002111.1)

(51) T细胞蛋白VTCN1 (SwissProt: Q7Z7D3)

(52) TWEAKR (SEQ ID NO:169 (蛋白质)；SEQ ID NO:170 (DNA).

(53) 淋巴细胞抗原CD37 (Swiss Prot: P11049)

(54) FGF受体2；FGFR2 (基因ID: 2263；基因名称: FGFR2)。 该FGFR2受体存在于不同的剪接变体（α、β、IIIb、IIIc）中。所有剪接变体都可充当靶分子；

(55) 跨膜糖蛋白B7H3 (CD276；基因ID: 80381)

(56) B细胞受体BAFFR (CD268；基因ID: 115650)

(57) 受体蛋白ROR 1 (基因ID: 4919)

(58) 表面受体IL3RA (CD123；基因ID: 3561)

(59) CXC趋化因子受体CXCR5 (CD185；基因ID 643)

(60) 受体蛋白合胞素(基因ID 30816)。

在本发明的一个优选主题中，该癌症靶分子选自癌症靶分子(1) – (60)，特别是(1)、(6)和(52)。

在本发明的另一特别优选的主题中，该结合体结合到选自癌症靶分子(1) – (60)，特别是(1)、(6)和(52)的细胞外癌症靶分子上。

在本发明的另一特别优选的主题中，该结合体特异性结合到选自癌症靶分子(1) – (60)，特别是(1)、(6)和(52)的细胞外癌症靶分子上。在一个优选实施方案中，该结合体在结合到靶细胞上的细胞外靶分子上后由于该结合而被靶细胞内化。这导致该结合体/活性物质偶联物（其可以是免疫偶联物或ADC）被靶细胞吸收。随后优选在细胞内，优选借助溶酶体加工该结合体。

在一个实施方案中，该结合体是结合蛋白。在一个优选实施方案中，该结合体是抗体、抗原结合抗体片段、多特异性抗体或拟抗体。

优选的拟抗体是亲和体、Adnectins、Anticalins、DARPins、Avimers或纳米抗体。优选的多特异性抗体是双特异性和三特异性抗体。

在一个优选实施方案中，该结合体是抗体或抗原结合抗体片段，更优选分离的抗体或分离的抗原结合抗体片段。

优选的抗原结合抗体片段是Fab、Fab'、F(ab')2和Fv片段、双价抗体、DAb、线性抗体和scFv。特别优选的是Fab、双价抗体和scFv。

在一个特别优选的实施方案中，该结合体是抗体。特别优选的是单克隆抗体或其抗原结合抗体片段。更特别优选的是人、人源化或嵌合抗体或其抗原结合抗体片段。

结合癌症靶分子的抗体或抗原结合抗体片段可由本领域普通技术人员使用已知方法，例如化学合成或重组表达制备。癌症靶分子的结合体可以商业获得或可以由本领域普通技术人员使用已知方法，例如化学合成或重组表达制备。在WO 2007/070538（见第22页“抗体”）中描述了用于制备抗体或抗原结合抗体片段的其它方法。本领域技术人员知道所谓的噬菌体展示库（例如Morphosys HuCAL Gold）之类的方法可编制并可用于发现抗体或抗原结合抗体片段（参见WO 2007/070538，第24页及其后和第70页中的AK实施例1、第72页中的AK实施例2）。例如在第26页中（WO 2007/070538）描述了使用来自B细胞的DNA库制备抗体的其它方法。抗体的人源化方法描述在WO2007070538的第30-32页中并详细描述在Queen等人, Pros. Natl. Acad. Sci. USA 86:10029-10033, 1989或WO 90/0786中。此外，通常蛋白质，特别是抗体的重组表达方法是本领域技术人员已知的（参见例如Berger和Kimrnel (Guide to Molecular Cloning Techniques, Methods in Enzymology, 第152卷, Academic Press, Inc.)；Sambrook等人 (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, (第二版，Cold Spring Harbor Laboratory Press；Cold Spring Harbor, N.Y.；1989) 第1-3卷)；Current Protocols in Molecular Biology (F. M. Ausabel等人 [编辑], Current Protocols, Green Publishing Associates, Inc./John Wiley & Sons, Inc.)；Harlow等人 (Monoclonal Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1988, Paul [编辑])；Fundamental Immunology, (Lippincott Williams & Wilkins (1998))；和Harlow等人 (Using Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1998))。本领域技术人员知道蛋白质/抗体的表达所必需的相应载体、启动子和信号肽。常见方法也描述在WO 2007/070538第41-45页中。例如在WO 2007/070538第74页及其后的实施例6中描述了制备IgG1抗体的方法。能够测定抗体在结合到其抗原上后的内化的方法是技术人员已知的并例如描述在WO 2007/070538第80页中。本领域技术人员能够使用WO 2007/070538中描述的方法，其已用于与具有另外靶分子特异性的抗体的制备类似地制备碳酸酐酶IX (Mn)抗体。

抗-EGFR抗体

结合癌症靶分子EGFR的抗体的实例是西妥昔单抗（INN号7906）、帕尼单抗（INN号8499）和尼妥珠单抗（INN号8545）。西妥昔单抗（药物库登记号DB00002）是在SP2/0小鼠骨髓瘤细胞中产生并由ImClone Systems Inc/Merck KgaA/Bristol-Myers Squibb Co出售的嵌合抗-EGFR1抗体。西妥昔单抗适用于治疗具有野生型K-Ras基因的转移性、表达EGFR的结肠直肠癌。其具有10^-10M的亲和力。

序列:

西妥昔单抗轻链(κ), SEQ ID NO: 235:

西妥昔单抗重链, SEQ ID NO: 236:

帕尼单抗（INN号8499）（药物库登记号DB01269）是特异性结合到人EGF受体1上并由Abgenix/Amgen出售的重组单克隆人IgG2抗体。帕尼单抗源自转基因小鼠（XenoMouse）的免疫接种。这些小鼠能够产生人免疫球蛋白（轻链和重链）。选择产生抗EGFR的抗体的特异性B细胞克隆，这一克隆系用CHO细胞（中国仓鼠卵巢细胞）永生化。这些细胞现在用于生产100%人抗体。帕尼单抗被指示治疗对用氟嘧啶、奥沙利铂和伊立替康化疗耐受的表达EGFR的转移性结肠直肠癌。其具有10^-11M的亲和力。

序列:

帕尼单抗轻链(κ), SEQ ID NO: 237:

帕尼单抗重链, SEQ ID NO: 238:

尼妥珠单抗（INN号8545）（EP 00586002、EP 00712863）是特异性结合到人EGF受体1上并由YM BioScienecs Inc. (Mississauga Canada)出售的人源化单克隆IgG1抗体。其在非分泌NSO细胞（哺乳动物细胞系）中产生。尼妥珠单抗被批准用于治疗头颈瘤、高度恶性的星形细胞瘤和多形性胶质母细胞瘤（不在EU和US）和胰腺癌（Orphan drug, EMA）。其具有10^-8M的亲和力。

尼妥珠单抗轻链, SEQ ID NO: 239:

尼妥珠单抗重链, SEQ ID NO: 240:

EGFR抗体的进一步实施方案如下：

●扎鲁木单抗/2F8/HuMax-EGFr，来自Genmab A/S (WO 02/100348、WO 2004/056847，INN号8605)

●Necitumumab/11F8, ImClone/IMC-11F8，来自ImClone Systems Inc. [Eli Lilly & Co] (WO 2005/090407 (EP 01735348-A1、US 2007/0264253-A1、US 7,598,350、WO 2005/090407-A1)，INN号9083)

●马妥珠单抗/抗-EGFR MAb, Merck KGaA/抗-EGFR MAb, Takeda/EMD 72000/EMD-6200/EMD-72000和EMD-55900/MAb 425/单克隆抗体425，来自Merck KGaA/Takeda (WO 92/15683，INN号8103 (马妥珠单抗))

●RG-7160/GA-201/GA201/R-7160/R7160/RG7160/RO-4858696/RO-5083945/RO4858696/ RO5083945，来自Glycart Biotechnology AG (Roche Holding AG) (WO 2010/112413-A1、WO 2010/115554)

●GT-MAB 5.2-GEX/CetuGEX，来自Glycotope GmbH (WO 2008/028686-A2 (EP 01900750-A1、EP 01911766-A1、EP 02073842-A2、US 2010/0028947-A1)

●ISU-101，来自Isu Abxis Inc (ISU Chemical Co Ltd)/Scancell (WO 2008/004834-A1)

●ABT-806/mAb-806/ch-806/抗-EGFR单克隆抗体806，来自Ludwig Institute for Cancer Research/Abbott/Life Science Pharmaceuticals (WO 02/092771、WO 2005/081854和WO 2009/023265)

●SYM-004 (由两种嵌合IgG1抗体(992和1024)构成) ，来自Symphogen A/S (WO 2010/022736-A2)

●MR1-1/MR1-1KDEL，来自IVAX Corp (Teva Pharmaceutical Industries Ltd) (Duke University), (专利: WO2001/062931-A2)

●抗缺失突变体的抗体, EGFRvIII，来自Amgen/Abgenix (WO 2005/010151、US 7,628,986)

●SC-100，来自Scancell Ltd (WO 01/088138-A1)

●MDX-447/EMD 82633/BAB-447/H 447/MAb, EGFR, Medarex/Merck KgaA，来自Bristol-Myers Squibb (US)/Merck KGaA (DE)/Takeda (JP), (WO 91/05871、WO 92/15683)

●抗-EGFR-Mab，来自Xencor (WO 2005/056606)

●DXL-1218/抗-EGFR单克隆抗体(癌症), InNexus，来自InNexus Biotechnology Inc, Pharmaprojects PH048638。

在一个优选实施方案中，该抗-EGFR抗体选自西妥昔单抗、帕尼单抗、尼妥珠单抗、扎鲁木单抗、Necitumumab、马妥珠单抗、RG-716、GT-MAB 5.2-GEX、ISU-101、ABT-806、SYM-004、MR1-1、SC-100、MDX-447和DXL-1218。

在一个特别优选的实施方案中，该抗-EGFR抗体选自西妥昔单抗、帕尼单抗、尼妥珠单抗、扎鲁木单抗、Necitumumab和马妥珠单抗。

本领域技术人员知道可用于由上述抗体的CDR区借助序列变异制备其它抗体的方法，这些其它抗体对靶分子具有类似或更好的亲和力和/或特异性。

在另一实施方案中，该抗-EGFR抗体或抗原结合抗体片段选自

包含下列抗体之一的轻链的三个CDR区和重链的三个CDR区的抗体或抗原结合抗体片段：西妥昔单抗、帕尼单抗、尼妥珠单抗、扎鲁木单抗、Necitumumab、马妥珠单抗、RG-716、GT-MAB 5.2-GEX、ISU-101、ABT-806、SYM-004、MR1-1、SC-100、MDX-447和DXL-1218。

在另一实施方案中，该抗-EGFR抗体或抗原结合抗体片段选自

包含下列抗体之一的轻链的三个CDR区和重链的三个CDR区的抗体或抗原结合抗体片段：西妥昔单抗、帕尼单抗、尼妥珠单抗、扎鲁木单抗、Necitumumab、马妥珠单抗。这些抗体及其抗原结合片段经此引用并入本文，且它们可用于本发明。

抗-碳酸酐酶IX抗体

结合癌症靶分子碳酸酐酶IX的抗体的实例描述在WO 2007/070538-A2（例如权利要求1 – 16）中。

在一个优选实施方案中，该抗-碳酸酐酶IX抗体或抗原结合抗体片段选自抗-碳酸酐酶IX抗体或抗原结合抗体片段3ee9（ WO 2007/070538-A2中的权利要求4 (a)）、3ef2（WO2007/070538-A2中的权利要求4 (b)）、1e4（WO 2007/070538-A2中的权利要求4 (c)）、3a4（WO 2007/070538-A2中的权利要求4 (d)）、3ab4（WO 2007/070538-A2中的权利要求4 (e)）、3ah10（WO 2007/070538-A2中的权利要求4 (f)）、3bb2（WO 2007/070538-A2中的权利要求4 (g)）、1aa1（WO 2007/070538-A2中的权利要求4 (h)）、5a6（WO 2007/070538-A2中的权利要求4 (i)）和5aa3（WO 2007/070538-A2中的权利要求4 (j)）。

抗-C4.4a抗体:

根据本发明，使用C4.4a抗体。

C4.4a抗体和抗原结合片段的实例描述在WO 2012/143499 A2中。WO 2012/143499 A2的所有抗体经此引用并入本发明的说明书中，且它们可用于本发明。在WO 2012/143499 A2的表1中给出这些抗体的序列，其中各行显示第1列中所列的抗体的可变轻链或可变重链的各自CDR氨基酸序列。

在一个实施方案中，该抗-C4.4a抗体或其抗原结合抗体片段在结合到表达C4.4a的细胞上后被该细胞内化。

在另一实施方案中，该抗-C4.4a抗体或抗原结合抗体片段包含WO 2012/143499 A2的表1或WO 2012/143499 A2的表2中所列的抗体的至少一个、两个或三个CDR氨基酸序列。此类抗体的优选实施方案同样列在WO 2012/143499 A2中并经此引用并入本文。

抗-HER2抗体:

结合到癌症靶分子Her2上的抗体的一个实例是曲妥珠单抗（Genentech）。曲妥珠单抗是尤其用于治疗如乳腺癌的人源化抗体。

除曲妥珠单抗（INN 7637，CAS号: RN: 180288-69-1）和帕妥珠单抗（CAS号: 380610-27-5）外，结合到HER2上的抗体的进一步实例是WO 2009/123894-A2、WO 200/8140603-A2或WO 2011/044368-A2中公开的抗体。抗-HER2偶联物的一个实例是曲妥珠单抗-Emtansine（INN号 9295）。这些抗体及其抗原结合片段经此引用并入本文，且它们可用于本发明。

抗-CD20抗体:

结合到癌症靶分子CD20上的抗体的一个实例是利妥昔单抗（Genentech）。利妥昔单抗（CAS号: 174722-31-7）是用于治疗非霍奇金淋巴瘤的嵌合抗体。这些抗体及其抗原结合片段经此引用并入本文，且它们可用于本发明。

抗-CD52抗体:

结合到癌症靶分子CD52上的抗体的一个实例是阿仑单抗（Genzyme）。阿仑单抗（CAS号: 216503-57-0）是用于治疗慢性淋巴细胞白血病的人源化抗体。这些抗体及其抗原结合片段经此引用并入本文，且它们可用于本发明。

抗-间皮素抗体:

抗-间皮素抗体的实例描述在例如WO 2009/068204中。WO 2009/068204中描述的所有抗体经此引用并入本说明书中，以使这些抗体可用于本文中公开的本发明。

根据本发明使用的抗-间皮素抗体也优选以不变结合到间皮素上为特征。不变结合的特征在于，例如，根据本发明使用的抗体结合到无法被其它胞外蛋白遮盖的间皮素的表位上。这种其它胞外蛋白是例如蛋白质卵巢癌抗原125（CA125）。优选使用的抗体的特征在于CA125不会阻断它们结合到间皮素上。

抗-CD30抗体

结合癌症靶分子CD30并可用于治疗癌症，例如霍奇金淋巴瘤的抗体的实例是Brentuximab、Iratumumab和WO 2008/092117、WO 2008/036688或WO 2006/089232中公开的抗体。抗-CD30偶联物的一个实例是Brentuximab Vedotin（INN 号 9144）。这些抗体及其抗原结合片段经此引用并入本文，且它们可用于本发明。

抗-CD22抗体

结合癌症靶分子CD22并可用于治疗癌症，例如淋巴瘤的抗体的实例是Inotuzumab和依帕珠单抗。抗-CD22偶联物的实例是Inotuzumab Ozagamycin（INN号 8574）或抗-CD22-MMAE和抗-CD22-MC-MMAE（CAS RN: 139504-50-0和474645-27-7）。这些抗体及其抗原结合片段经此引用并入本文，且它们可用于本发明。

抗-CD33抗体

结合癌症靶分子CD33并可用于治疗癌症，例如白血病的抗体的实例是吉妥珠单抗和林妥珠单抗（INN 7580）。抗-CD33偶联物的一个实例是吉妥珠单抗-Ozagamycin。这些抗体及其抗原结合片段经此引用并入本文，且它们可用于本发明。

抗-NMB抗体

结合癌症靶分子NMB并可用于治疗癌症，例如黑素瘤或乳腺癌的抗体的一个实例是Glembatumumab（INN 9199）。抗-NMB偶联物的一个实例是Glembatumumab Vedotin（CAS RN: 474645-27-7）。这些抗体及其抗原结合片段经此引用并入本文，且它们可用于本发明。

抗-CD56抗体

结合癌症靶分子CD56并可用于治疗癌症，例如多发性骨髓瘤、小细胞肺癌、MCC或卵巢癌的抗体的一个实例是Lorvotuzumab。抗-CD56偶联物的一个实例是Lorvotuzumab Mertansine（CAS RN: 139504-50-0）。这些抗体及其抗原结合片段经此引用并入本文，且它们可用于本发明。

抗-CD70抗体

结合癌症靶分子CD70并可用于治疗癌症，例如非霍奇金淋巴瘤或肾细胞癌的的抗体的实例公开在WO 2007/038637-A2和WO 2008/070593-A2中。抗-CD70偶联物的一个实例是SGN-75（CD70 MMAF）。这些抗体及其抗原结合片段经此引用并入本文，且它们可用于本发明。

抗-CD74抗体

结合癌症靶分子CD74并可用于治疗癌症，例如多发性骨髓瘤的抗体的一个实例是Milatuzumab。抗-CD74偶联物的一个实例是Milatuzumab-多柔比星（CAS RN: 23214-92-8）。这些抗体及其抗原结合片段经此引用并入本文，且它们可用于本发明。

抗-CD19抗体

结合癌症靶分子CD19并可用于治疗癌症，例如非霍奇金淋巴瘤的抗体的一个实例公开在WO 2008/031056-A2中。抗-CD19偶联物其它抗体和的实例公开在WO 2008/047242-A2中。这些抗体及其抗原结合片段经此引用并入本文，且它们可用于本发明。

抗-粘蛋白抗体

结合癌症靶分子粘蛋白-1并可用于治疗癌症，例如非霍奇金淋巴瘤的抗体的实例是Clivatuzumab或WO 2003/106495-A2、WO 2008/028686-A2中公开的抗体。抗-粘蛋白偶联物的实例公开在WO 2005/009369-A2中。这些抗体及其抗原结合片段经此引用并入本文，且它们可用于本发明。

抗-CD138抗体

结合癌症靶分子CD138的抗体及其偶联物可用于治疗癌症，例如多发性骨髓瘤的实例公开在WO 2009/080829-A1、WO 2009/080830-A1中。这些抗体及其抗原结合片段经此引用并入本文，且它们可用于本发明。

抗-整合素-α V抗体

结合癌症靶分子整合素αV并可用于治疗癌症，例如黑素瘤、肉瘤或癌的抗体的实例是Intetumumab（CAS RN: 725735-28-4）、阿昔单抗（CAS RN: 143653-53-6）、Etaracizumab（CAS RN: 892553-42-3）或US 7,465,449、EP 719859-A1、WO 2002/012501-A1或WO2006/062779-A2中公开的抗体。抗-整合素ΑV偶联物的实例是Intetumumab-DM4和WO 2007/024536-A2中公开的其它ADC。这些抗体及其抗原结合片段经此引用并入本文，且它们可用于本发明。

抗-TDGF1抗体

结合癌症靶分子TDGF1并可用于治疗癌症的抗体的实例是WO 02/077033-A1、US 7,318,924、WO 2003/083041-A2和WO 2002/088170-A2中公开的抗体。抗-TDGF1偶联物的实例公开在WO 2002/088170-A2中。这些抗体及其抗原结合片段经此引用并入本文，且它们可用于本发明。

抗-PSMA抗体

结合癌症靶分子PSMA并可用于治疗癌症，例如前列腺癌的抗体的实例是WO 97/35616-A1、WO 99/47554-A1、WO 01/009192-A1和WO2003/034903中公开的抗体。抗-PSMA偶联物的实例公开在WO 2009/026274-A1和WO 2007/002222中。这些抗体及其抗原结合片段经此引用并入本文，且它们可用于本发明。

抗-EPHA2抗体

结合癌症靶分子EPHA2并可用于制备偶联物和用于治疗癌症的的抗体的实例公开在WO 2004/091375-A2中。这些抗体及其抗原结合片段经此引用并入本文，且它们可用于本发明。

抗-SLC44A4抗体

结合癌症靶分子SLC44A4并可用于制备偶联物和用于治疗癌症，例如胰腺或前列腺癌的抗体的实例公开在WO2009/033094-A2和US2009/0175796-A1中。这些抗体及其抗原结合片段经此引用并入本文，且它们可用于本发明。

抗-HLA-DOB抗体

结合到癌症靶分子HLA-DOB上的抗体的一个实例是可用于治疗癌症，例如非霍奇金淋巴瘤的抗体Lym-1（CAS RN: 301344-99-0）。抗-HLA-DOB偶联物的实例公开在例如WO 2005/081711-A2中。这些抗体及其抗原结合片段经此引用并入本文，且它们可用于本发明。

抗-VTCN1抗体

结合癌症靶分子VTCN1并可用于制备偶联物和用于治疗癌症，例如卵巢癌、胰腺癌、肺癌或乳腺癌的抗体的实例公开在WO 2006/074418-A2中。这些抗体及其抗原结合片段经此引用并入本文，且它们可用于本发明。

抗-FGFR2抗体

根据本发明，可使用抗-FGFR2抗体。

抗-FGFR2抗体和抗原结合片段的实例描述在WO2013076186中。WO2013076186的所有抗体经此引用并入本发明的说明书中，且它们可用于本发明。在WO2013076186的表9和表10中显示这些抗体的序列。优选的是衍生自被称作M048-D01和M047-D08的抗体的抗体、抗原结合片段和抗体变体。优选的抗-FGFR2结合到被称作FGFR2的各种剪接变体上。

在一个实施方案中，该抗-FGFR2抗体或其抗原结合抗体片段在结合到表达FGFR2的细胞上后被该细胞内化。

在另一实施方案中，该抗-FGFR2抗体或抗原结合抗体片段包含WO2013076186的表9或表10中所列的抗体的至少一个、两个或三个CDR氨基酸序列。此类抗体的优选实施方案同样列在WO2013076186中并经此引用并入本文。

抗-TWEAKR抗体

在一个优选实施方案中，当在本发明的方法中使用抗-TWEAKR抗体或其抗原结合片段时，这一种或多种抗体或片段选自下述那些。此外，结合到TWEAKR上的抗体是本领域技术人员已知的，参见例如WO2009/020933(A2)或WO2009140177 (A2)。

本发明特别涉及含有导致TWEAKR（SEQ ID NO:169 (蛋白质)；SEQ ID NO:170 (DNA)）的强活化的抗体或其抗原结合抗体片段或其变体的偶联物，以致强诱发过表达TWEAKR的各种癌细胞中的细胞凋亡。

已描述的抗-TWEAKR抗体（例如PDL-192）在诱发细胞凋亡和抑制增殖方面的TWEAKR激动活性有限并且没有达到内源性配体TWEAK的效力。激动活性的这种欠缺不是基于降低的亲和力，因为这些抗体以与内源性配体TWEAK相比在类似范围内的亲和力结合到TWEAKR上（Michaelson JS等人, MAbs. 2011年7月-8月；3(4):362-75；Culp PA等人, Clin Cancer Res. 2010年1月15日；16(2):497-508），且甚至具有更高结合亲和力的抗体也不一定表现出更有效的信号活性（Culp PA等人， Clin Cancer Res. 2010年1月15日；16(2):497-508）。此外，已经表明，已描述的抗体的抗肿瘤活性取决于Fc效应子功能，并且表明ADCC对小鼠模型中的体内效力起到重要作用。

抗-TWEAKR抗体的生成

利用完整的人抗体噬菌体库（Hoet RM等人, Nat Biotechnol 2005；23(3):344-8），以通过使用人和小鼠TWEAKR的二聚Fc融合胞外域作为固定化靶的蛋白质筛选（Panning）分离本发明的TWEAKR特异性人单克隆抗体（Hoogenboom H.R., Nat Biotechnol 2005；23(3):1105-16）。识别11种不同的Fab噬菌体，并将相应的抗体克隆到提供可溶性FAb中缺失的CH2-CH3结构域的哺乳动物EgG表达载体上。在识别优选抗体后，这些作为全长IgG表达。这些构建体如Tom等人, Methods Express中的第12章: Expression Systems，Micheal R. Dyson和Yves Durocher编辑, Scion Publishing Ltd, 2007（参见AK-实施例1）所述例如在哺乳动物细胞中短暂表达。该抗体通过蛋白质-A色谱法纯化并进一步使用如AK-实施例2中所述的ELISA和BIAcore分析通过它们与可溶性单体TWEAKR的结合亲和力表征。为了测定抗-TWEAKR抗体的细胞结合特征，在许多细胞系（HT29、HS68、HS578）上通过流式细胞术测试结合。进行NFκB报告基因检测以检查识别的所有11种抗体（人IgG1）的激动活性。选择具有最高体外效力的抗体（TPP-883）进行进一步的效力和亲和力成熟（细节参见AK-实施例1）。检测具有改进的激动活性的单取代变体：CDR-H3的G102T。最后，基于与最佳单取代变体G102T相比提高的亲和力选择7种变体。将其相应的DNA克隆到哺乳动物IgG表达载体中并在上文提到的NF-κB报告基因检测中检查功能活性。最后，将所得序列与人生殖系序列相比较，并且修改对亲和力和效力没有显著影响的偏差。通过抗体库筛选和通过亲和力和/或效力成熟获得下列抗体：“TPP-2090”、“TPP-2149”、“TPP-2093”、“TPP-2148”、“TPP-2084”、“TPP-2077”、“TPP-1538”、“TPP-883”、“TPP-1854”、“TPP-1853”、“TPP-1857”和“TPP-1858”。

本发明的抗体还可通过本领域中已知的方法，如抗体噬菌体展示筛选（参见例如Hoet RM等人, Nat Biotechnol 2005；23(3):344-8）、已确立的杂交瘤技术（参见例如Köhler和Milstein Nature. 1975年8月7日；256(5517):495-7）或小鼠免疫接种，尤其是hMAb小鼠（例如VelocImmune mouse®）的免疫接种获得。

抗-TWEAKR抗体的特定实施方案

本发明的一个实施方案是提供在一个或多个表达TWEAKR的细胞系中表现出半胱天冬酶3/7的强诱导的抗体或其抗原结合抗体片段或其变体。在一个优选实施方案中，所述一个或多个表达TWEAKR的细胞系包含于由WiDr、A253、NCI-H322、HT29和786-O构成的组中。可通过本领域中已知的常规方法，包括本文所述的那些测量“半胱天冬酶3/7的诱导”。在一个实施方案中，根据本发明通过用半胱天冬酶3/7溶液（Promega, #G8093）测定活性和在VICTOR V (Perkin Elmer)上读取发光来测定“半胱天冬酶3/7的诱导”。在培养时间结束时，测定半胱天冬酶3/7活性并与未处理的细胞比较测定半胱天冬酶3/7的诱导系数。当诱导系数大于1.2，优选大于1.5，再更优选大于1.8，再更优选大于2.1，再更优选大于2.5时，抗体被描述为表现出半胱天冬酶3/7的“强诱导”。提供与已描述的激动性抗体 [例如PDL-192(TPP-1104)、P4A8(TPP-1324)、136.1(TPP-2194)]相比以及与300 ng/ml重组人TWEAK相比导致HT29细胞中的半胱天冬酶3/7的更强诱导的抗-TWEAKR抗体。在WiDr、A253, NIC-H322和786-O细胞中也观察到诱导癌细胞中的半胱天冬酶3/7的这种强效力，其中在大多数实验中，检查的本发明的抗体与参考抗体[PDL-192(TPP-1104)、P4A8(TPP-1324)]和与300 ng/ml TWEAK相比诱发更高的变化系数。本发明的一些抗体仅以明显低于内源性配体TWEAK的亲和力并且也低于其它已知的激动性抗体的中等亲和力（>10 nM）结合到TWEAKR上。这种性质提供进一步的可能优点，例如可能更深渗入肿瘤中。

在这方面，本发明的一个实施方案是提供在新型表位特异性结合到TWEAKR上的抗体或其抗原结合抗体片段，其特征在于选择性结合到TWEAKR（SEQ ID NO:169；也见图1）的位置47（D47）处的天冬氨酸（D）上。对用于抗体相互作用的某些TWEAKR氨基酸识别的依赖性与对这些抗体测定的激动活性相关联。天然配体TWEAK表现出TWEAKR的有效活化并依赖于TWEAKR的富含半胱氨酸结构域中的亮氨酸46结合（Pellegrini等人, FEBS 280:1818-1829）。P4A8表现出极低激动活性并至少部分与TWEAKR的富含半胱氨酸结构域外的结构域相互作用。PDL-192表现出中等激动活性并依赖于R56结合到富含半胱氨酸的结构域上，但在TWEAK配体位点对面。本发明的抗体（例如TPP-2090）依赖于D47结合，且TWEAK依赖于L46结合。因此，TWEAK结合到类似但不同的结合位点上（图7）。因此，表现出强激动活性的本发明的抗体结合到与极高激动活性相关的抗体的新表位（D47依赖性）上。

TWEAKR（SEQ ID NO:169）的位置47处的氨基酸（D47）被认为对根据本发明的抗体的结合至关重要，这意味着当该抗体如AK-实施例2和图6中所述通过将其残基改变成丙氨酸而损失其ELISA信号的多于20%、或多于30%、或多于40%、或多于50%、或多于60%、或多于70%、或多于80%、或多于90%、或100%时，该抗体特异性结合到TWEAKR（SEQ ID NO:169）的位置47处的D（D47）上。或者，当该抗体与TPP-2203相比损失其对TPP-2614的ELISA信号的多于20%、或多于30%、或多于40%、或多于50%、或多于60%、或多于70%、或多于80%、或多于90%、或100%时，抗体特异性结合到TWEAKR（SEQ ID NO:169）的位置47处的D（D47）上。优选地，当该抗体与TPP-2203相比损失其对TPP-2614的ELISA信号的多于80%时，抗体特异性结合到TWEAKR（SEQ ID NO:169）的位置47处的D（D47）上。

在本申请中，参考如下表中所示的本发明的下列优选抗体：“TPP-2090”、“TPP-2149”、“TPP-2093”、“TPP-2148”、“TPP-2084”、“TPP-2077”、“TPP-1538”、“TPP-883”、“TPP-1854”、“TPP-1853”、“TPP-1857”、“TPP-1858”。

TPP-2090是：包含对应于SEQ ID NO: 2的重链区和对应于SEQ ID NO: 1的轻链区的抗体。

TPP-2149是：包含对应于SEQ ID NO: 12的重链区和对应于SEQ ID NO: 11的轻链区的抗体。

TPP-2093是：包含对应于SEQ ID NO: 22的重链区和对应于SEQ ID NO: 21的轻链区的抗体。

TPP-2148是：包含对应于SEQ ID NO: 32的重链区和对应于SEQ ID NO: 31的轻链区的抗体。

TPP-2084是：包含对应于SEQ ID NO: 42的重链区和对应于SEQ ID NO: 41的轻链区的抗体。

TPP-2077是：包含对应于SEQ ID NO: 52的重链区和对应于SEQ ID NO: 51的轻链区的抗体。

TPP-1538是：包含对应于SEQ ID NO: 62的重链区和对应于SEQ ID NO: 61的轻链区的抗体。

TPP-883是：包含对应于SEQ ID NO: 72的重链区和对应于SEQ ID NO: 71的轻链区的抗体。

TPP-1854是：包含对应于SEQ ID NO: 82的重链区和对应于SEQ ID NO: 81的轻链区的抗体。

TPP-1853是：包含对应于SEQ ID NO: 92的重链区和对应于SEQ ID NO: 91的轻链区的抗体。

TPP-1857是：包含对应于SEQ ID NO: 102的重链区和对应于SEQ ID NO: 101的轻链区的抗体。

TPP-1858是：包含对应于SEQ ID NO: 112的重链区和对应于SEQ ID NO: 111的轻链区的抗体。

TPP-2090是：包含对应于SEQ ID NO: 10的重链可变区和对应于SEQ ID NO: 9的轻链可变区的抗体。

TPP-2149是：包含对应于SEQ ID NO: 20的重链可变区和对应于SEQ ID NO: 19的轻链可变区的抗体。

TPP-2093是：包含对应于SEQ ID NO: 30的重链可变区和对应于SEQ ID NO: 29的轻链可变区的抗体。

TPP-2148是：包含对应于SEQ ID NO: 40的重链可变区和对应于SEQ ID NO: 39的轻链可变区的抗体。

TPP-2084是：包含对应于SEQ ID NO: 50的重链可变区和对应于SEQ ID NO: 49的轻链可变区的抗体。

TPP-2077是：包含对应于SEQ ID NO: 60的重链可变区和对应于SEQ ID NO: 59的轻链可变区的抗体。

TPP-1538是：包含对应于SEQ ID NO: 70的重链可变区和对应于SEQ ID NO: 69的轻链可变区的抗体。

TPP-883是：包含对应于SEQ ID NO: 80的重链可变区和对应于的SEQ ID NO: 79轻链可变区的抗体。

TPP-1854是：包含对应于SEQ ID NO: 90的重链可变区和对应于SEQ ID NO: 89的轻链可变区的抗体。

TPP-1853是：包含对应于SEQ ID NO: 100的重链可变区和对应于SEQ ID NO: 99的轻链可变区的抗体。

TPP-1857是：包含对应于SEQ ID NO: 110的重链可变区和对应于SEQ ID NO: 109的轻链可变区的抗体。

TPP-1858是：包含对应于SEQ ID NO: 120的重链可变区和对应于SEQ ID NO: 119的轻链可变区的抗体。

抗-TWEAKR抗体的优选实施方案是下列那些：

1. 特异性结合到TWEAKR（SEQ ID NO:169）的位置47处的D（D47）上的抗-TWEAKR抗体或其抗原结合片段。

2. 根据实施方案1的抗体或其抗原结合片段，其中该抗体是激动性抗体。

3. 根据实施方案1或2的抗体或其抗原结合片段，其包含：

可变重链，其包含：

(a) 由包含式PYPMX的氨基酸序列(SEQ ID NO: 171)编码的重链的CDR1，其中X是I或M；

(b) 由包含式YISPSGGXTHYADSVKG的氨基酸序列(SEQ ID NO: 172)编码的重链的CDR2，其中X是S或K；和

(c) 由包含式GGDTYFDYFDY的氨基酸序列(SEQ ID NO: 173)编码的重链的CDR3；

和可变轻链，其包含：

(a) 由包含式RASQSISXYLN的氨基酸序列(SEQ ID NO: 174)编码的轻链的CDR1，其中X是G或S；

(b) 由包含式XASSLQS的氨基酸序列(SEQ ID NO: 175)编码的轻链的CDR2，其中X是Q、A或N；和

(c) 由包含式QQSYXXPXIT的氨基酸序列(SEQ ID NO: 176)编码的轻链的CDR3，其中位置5的X是T或S，位置6的X是T或S且位置8的X是G或F。

4. 根据前述实施方案任一项的抗体或其抗原结合片段，其包含：

a. 包含如SEQ ID NO: 6中所示的重链的可变CDR1序列、如SEQ ID NO: 7中所示的重链的可变CDR2序列和如SEQ ID NO: 8中所示的重链的可变CDR3序列的可变重链，以及

包含如SEQ ID NO: 3中所示的轻链的可变CDR1序列、如SEQ ID NO: 4中所示的轻链的可变CDR2序列和如SEQ ID NO: 5中所示的轻链的可变CDR3序列的可变轻链或

b. 包含如SEQ ID NO: 16中所示的重链的可变CDR1序列、如SEQ ID NO: 17中所示的重链的可变CDR2序列、如SEQ ID NO:18中所示的重链的可变CDR3序列的可变重链，以及

包含如SEQ ID NO: 13中所示的轻链的可变CDR1序列、如SEQ ID NO: 14中所示的轻链的可变CDR2序列和如SEQ ID NO:15中所示的轻链的可变CDR3序列可变轻链或

c. 包含如SEQ ID NO: 26中所示的重链的可变CDR1序列、如SEQ ID NO: 27中所示的重链的可变CDR2序列、如SEQ ID NO:28中所示的重链的可变CDR3序列的可变重链，以及

包含如SEQ ID NO: 23中所示的轻链的可变CDR1序列、如SEQ ID NO: 24中所示的轻链的可变CDR2序列和如SEQ ID NO:25中所示的轻链的可变CDR3序列的可变轻链或

d. 包含如SEQ ID NO: 36中所示的重链的可变CDR1序列、如SEQ ID NO: 37中所示的重链的可变CDR2序列、如SEQ ID NO:38中所示的重链的可变CDR3序列的可变重链，以及

包含如SEQ ID NO: 33中所示的轻链的可变CDR1序列、如SEQ ID NO: 34中所示的轻链的可变CDR2序列和SEQ ID NO:35中所示的轻链的可变CDR3序列的可变轻链或

e. 包含如SEQ ID NO: 46中所示的重链的可变CDR1序列、如SEQ ID NO: 47中所示的重链的可变CDR2序列、如SEQ ID NO:48中所示的重链的可变CDR3序列的可变重链，以及

包含如SEQ ID NO: 43中所示的轻链的可变CDR1序列、如SEQ ID NO: 44中所示的轻链的可变CDR2序列和如SEQ ID NO:45中所示的轻链的可变CDR3序列的可变轻链或

f. 包含如SEQ ID NO: 56中所示的重链的可变CDR1序列、如SEQ ID NO: 57中所示的重链的可变CDR2序列、如SEQ ID NO:58中所示的重链的可变CDR3序列的可变重链，以及

包含如SEQ ID NO: 53中所示的轻链的可变CDR1序列、如SEQ ID NO: 54中所示的轻链的可变CDR2序列和如SEQ ID NO:55中所示的轻链的可变CDR3序列的可变轻链或

g. 包含如SEQ ID NO: 66中所示的重链的可变CDR1序列、如SEQ ID NO: 67中所示的重链的可变CDR2序列、如SEQ ID NO:68中所示的重链的可变CDR3序列的可变重链，以及

包含如SEQ ID NO: 63中所示的轻链的可变CDR1序列、如SEQ ID NO: 64中所示的轻链的可变CDR2序列和如SEQ ID NO:65中所示的轻链的可变CDR3序列的可变轻链或

h. 包含如SEQ ID NO: 76中所示的重链的可变CDR1序列、如SEQ ID NO: 77中所示的重链的可变CDR2序列、如SEQ ID NO:78中所示的重链的可变CDR3序列的可变重链，以及

包含如SEQ ID NO: 73中所示的轻链的可变CDR1序列、如SEQ ID NO: 74中所示的轻链的可变CDR2序列和如SEQ ID NO:75中所示的轻链的可变CDR3序列的可变轻链或

i. 包含如SEQ ID NO: 86中所示的重链的可变CDR1序列、如SEQ ID NO: 87中所示的重链的可变CDR2序列、如SEQ ID NO:88中所示的重链的可变CDR3序列的可变重链，以及

包含如SEQ ID NO: 83中所示的轻链的可变CDR1序列、如SEQ ID NO: 84中所示的轻链的可变CDR2序列和如SEQ ID NO:85中所示的轻链的可变CDR3序列的可变轻链或

j. 包含如SEQ ID NO: 96中所示的重链的可变CDR1序列、如SEQ ID NO: 97中所示的重链的可变CDR2序列、如SEQ ID NO:98中所示的重链的可变CDR3序列的可变重链，以及

包含如SEQ ID NO: 93中所示的轻链的可变CDR1序列、如SEQ ID NO: 94中所示的轻链的可变CDR2序列和如SEQ ID NO:95中所示的轻链的可变CDR3序列的可变轻链或

k. 包含如SEQ ID NO: 106中所示的重链的可变CDR1序列、如SEQ ID NO: 107中所示的重链的可变CDR2序列、如SEQ ID NO:108中所示的重链的可变CDR3序列的可变重链，以及

包含如SEQ ID NO: 103中所示的轻链的可变CDR1序列、如SEQ ID NO: 104中所示的轻链的可变CDR2序列和如SEQ ID NO:105中所示的轻链的可变CDR3序列的可变轻链或

l. 包含如SEQ ID NO: 116中所示的重链的可变CDR1序列、如SEQ ID NO: 117中所示的重链的可变CDR2序列、如SEQ ID NO:118中所示的重链的可变CDR3序列的可变重链，以及

包含如SEQ ID NO: 113中所示的轻链的可变CDR1序列、如SEQ ID NO: 114中所示的轻链的可变CDR2序列和如SEQ ID NO:115中所示的轻链的可变CDR3序列的可变轻链。

5. 根据前述实施方案任一项的抗体或其抗原结合片段，其包含：

a. 如SEQ ID NO:10中所示的重链的可变序列以及如SEQ ID NO:9中所示的轻链的可变序列，或

b. 如SEQ ID NO:20中所示的重链的可变序列以及如SEQ ID NO:19中所示的轻链的可变序列，或

c. 如SEQ ID NO:30中所示的重链的可变序列以及如SEQ ID NO:29中所示的轻链的可变序列，或

d. 如SEQ ID NO:40中所示的重链的可变序列以及如SEQ ID NO:39中所示的轻链的可变序列，或

e. 如SEQ ID NO:50中所示的重链的可变序列以及如SEQ ID NO:49中所示的轻链的可变序列，或

f. 如SEQ ID NO:60中所示的重链的可变序列以及如SEQ ID NO:59中所示的轻链的可变序列，或

g. 如SEQ ID NO:70中所示的重链的可变序列以及如SEQ ID NO:69中所示的轻链的可变序列，或

h. 如SEQ ID NO:80中所示的重链的可变序列以及如SEQ ID NO:79中所示的轻链的可变序列，或

i. 如SEQ ID NO:90中所示的重链的可变序列以及如SEQ ID NO:89中所示的轻链的可变序列，或

j. 如SEQ ID NO:100中所示的重链的可变序列以及如SEQ ID NO:99中所示的轻链的可变序列，或

k. 如SEQ ID NO:110中所示的重链的可变序列以及如SEQ ID NO:109中所示的轻链的可变序列，或

l. 如SEQ ID NO:120中所示的重链的可变序列以及如SEQ ID NO:119中所示的轻链的可变序列。

6. 根据前述实施方案任一项的抗体，其是IgG抗体。

7. 根据前述实施方案任一项的抗体，其包含：

a. 如SEQ ID NO:2中所示的重链的序列以及如SEQ ID NO:1中所示的轻链的序列，或

b. 如SEQ ID NO:12中所示的重链的序列以及如SEQ ID NO:11中所示的轻链的序列，或

c. 如SEQ ID NO:22中所示的重链的序列以及如SEQ ID NO:21中所示的轻链的序列，或

d. 如SEQ ID NO:32中所示的重链的序列以及如SEQ ID NO:31中所示的轻链的序列，或

e. 如SEQ ID NO:42中所示的重链的序列以及如SEQ ID NO:41中所示的轻链的序列，或

f. 如SEQ ID NO:52中所示的重链的序列以及如SEQ ID NO:51中所示的轻链的序列，或

g. 如SEQ ID NO:62中所示的重链的序列以及如SEQ ID NO:61中所示的轻链的序列，或

h. 如SEQ ID NO:72中所示的重链的序列以及如SEQ ID NO:71中所示的轻链的序列，或

i. 如SEQ ID NO:82中所示的重链的序列以及如SEQ ID NO:81中所示的轻链的序列，或

j. 如SEQ ID NO:92中所示的重链的序列以及如SEQ ID NO:91中所示的轻链的序列，或

k. 如SEQ ID NO:102中所示的重链的序列以及如SEQ ID NO:101中所示的轻链的序列，或

l. 如SEQ ID NO:112中所示的重链的序列以及如SEQ ID NO:111中所示的轻链的序列。

8. 根据前述实施方案任一项的抗原结合片段或根据前述实施方案任一项的抗体的抗原结合片段，其是scFv、Fab、Fab ̓片段或F(ab ̓ )2片段。

9. 根据前述实施方案任一项的抗体或抗原结合片段，其是单克隆抗体或其抗原结合片段。

10. 根据前述实施方案任一项的抗体或抗原结合片段，其是人、人源化或嵌合抗体或抗原结合片段。

特别优选的是抗-TWEAKR抗体TPP-2090。

同位素、 盐、 溶剂合物、 同位素变体

本发明还包括本发明的化合物的所有合适的同位素变体。本发明的化合物的同位素变体在此被理解为是指本发明的化合物内的至少一个原子已被具有相同原子序数但原子质量不同于自然界中通常或主要存在的原子质量的另一原子替换的化合物。可并入本发明的化合物中的同位素的实例是氢、碳、氮、氧、磷、硫、氟、氯、溴和碘的同位素，如²H（氘）、³H（氚）、¹³C、¹⁴C、¹⁵N、¹⁷O、¹⁸O、³²P、³³P、³³S、³⁴S、³⁵S、³⁶S、¹⁸F、³⁶Cl、⁸²Br、¹²³I、¹²⁴I、¹²⁹I和¹³¹I。本发明的化合物的特定同位素变体，尤其是其中已并入一种或多种放射性同位素的那些，可能有益于例如检查作用机制或体内的活性物质分布；由于比较容易制备和检测，用³H或¹⁴C同位素标记的化合物尤其适用于此用途。此外，同位素，例如氘的并入可由于该化合物的更大代谢稳定性而带来特定治疗益处，例如体内半衰期的延长或所需活性剂量的降低；本发明的化合物的此类改性因此任选也构成本发明的优选实施方案。可通过本领域技术人员已知的方法，例如通过下述方法和实施例中描述的程序、通过使用各自的试剂和/或起始化合物的相应同位素改性制备本发明的化合物的同位素变体。

本发明中优选的盐是本发明的化合物的生理可接受盐。还包括本身不适合药物用途但可例如用于本发明的化合物的分离或提纯的盐。

本发明的化合物的生理可接受盐包括无机酸、羧酸和磺酸的酸加成盐，例如盐酸、氢溴酸、硫酸、磷酸、甲磺酸、乙磺酸、苯磺酸、甲苯磺酸、萘二磺酸、乙酸、三氟乙酸、丙酸、乳酸、酒石酸、苹果酸、柠檬酸、富马酸、马来酸和苯甲酸的盐。

本发明的化合物的生理可接受盐还包括常规碱的盐，例如和优选碱金属盐（例如钠和钾盐）、碱土金属盐（例如钙和镁盐）和由氨或具有1至16个碳原子的有机胺，例如和优选乙胺、二乙胺、三乙胺、乙基二异丙胺、单乙醇胺、二乙醇胺、三乙醇胺、二环己胺、二甲基氨基乙醇、普鲁卡因、二苄胺、N-甲基哌啶、N-甲基吗啉、精氨酸、赖氨酸和1,2-乙二胺生成的铵盐。

溶剂合物在本发明中被描述为以固态或液态通过与溶剂分子配位而形成络合物的本发明的化合物的那些形式。水合物是溶剂合物的一种特定形式，其中与水发生配位。本发明中优选的溶剂合物是水合物。

此外，本发明还包括本发明的化合物的前药。术语“前药”在此是指本身在生物学上有活性或无活性但其在体内停留期间（例如通过代谢或水解方式）转化成本发明的化合物的化合物。

特定实施方案

下列实施方案特别优选：

实施方案A:

下式的ADC和该ADC的盐、溶剂合物和溶剂合物的盐

其中KSP-L-是下式(II)、(IIa)、(IIb)、(IIc)、(IId)、(IIe)或下式(IIf)的化合物，该结合体是抗-TWEAKR抗体（特别优选是特异性结合到TWEAKR（SEQ ID NO:169）的位置47中的氨基酸D（D47）上的抗-TWEAKR抗体，尤其是抗-TWEAK R抗体TPP-2090），且n是1至10的数值：

式(IIf):

其中

X₁代表N，X₂代表N且X₃代表C；

X₁代表CH，X₂代表C且X₃代表N；

X₁代表NH，X₂代表C且X₃代表C；或

X₁代表CH，X₂代表N且X₃代表C；

A代表CO（羰基）；

R¹代表–L-#1、H、-COOH、-CONHNH₂、-(CH₂)_1-3NH₂、-CONZ''(CH₂)_1-3 NH₂和–CONZ''CH₂COOH，其中Z''代表H或NH₂；

R²和R⁴代表H或–L-#1，或R²和R⁴一起（形成吡咯烷环）代表-CH₂-CHR¹⁰-或–CHR¹⁰-CH₂-，其中R¹⁰代表H或–L-#1；

R³代表–L-#1或C_1-10-烷基-，其可任选被–OH、O-烷基、SH、S-烷基、O-CO-烷基、O-CO-NH-烷基、NH-CO-烷基、NH-CO-NH-烷基、S(O)_n-烷基、SO₂-NH-烷基、NH-烷基、N(烷基)₂或NH₂（其中烷基优选是C_1-3-烷基）取代；

R⁵代表–L-#1、H或F；

R⁶和R⁷彼此独立地代表H、（任选氟代的）C_1-3-烷基、（任选氟代的）C_2-4-烯基、（任选氟代的）C_2-4-炔基、羟基或卤素；

R⁸代表可被–L-#1取代的支化的C_1-5-烷基；且

R⁹代表H或F，

其中取代基R¹、R²、R³、R⁴、R⁵、R⁸和R¹⁰之一代表–L-#1，且

–L-代表连接体且#1代表与抗体的键。

该连接体优选是连接体

§-(CO)m-L1-L2-§§

其中

m是0或1；

§代表连向KSP的键且

§§代表连向抗体的键，且

L2代表

其中

#¹是指与抗体的硫原子的连接点，

#²是指与基团L¹的连接点，

且L1由下式表示

#1–(NR¹⁰)_n-(G1)_o-G2-^#2

其中

R¹⁰代表H、NH₂或C₁-C₃-烷基；

G1代表–NHCO-或；

n是0或1；

o是0或1；且

G2代表具有1至100个碳原子的直链或支化的烃链，其来自亚芳基和/或直链和/或支化和/或环状亚烷基并可被基团-O-、-S-、-SO-、SO₂、-NH-、-CO-、-NHCO-、-CONH-、-NMe-、-NHNH-、-SO₂NHNH-、-CONHNH-和具有最多4个选自N、O和S或-SO-的杂原子的3至10元芳族或非芳族杂环（优选）的一个或多个中断一次或多次，其中如果存在侧链，其可被–NHCONH₂、-COOH、-OH、-NH₂、NH-CNNH₂、磺酰胺、砜、亚砜或磺酸取代。

在此，#¹是连向KSP抑制剂的键且#²是连向与结合体的偶联基团（例如L2）的键。

实施方案B:

下式的ADC和该ADC的盐、溶剂合物和溶剂合物的盐

其中KSP-L-是下式(II)、(IIa)、(IIb)、(IIc)、(IId)、(IIe)、(IIf)或下式(IIg)的化合物，该结合体是抗体且n是1至10的数值：

式(IIg):

其中

X₁代表N，X₂代表N且X₃代表C；

X₁代表CH，X₂代表C且X₃代表N；

X₁代表NH，X₂代表C且X₃代表C；或

X₁代表CH，X₂代表N且X₃代表C；

A代表CO（羰基）；

R¹代表–L-#1、H、-COOH、-CONHNH₂、-(CH₂)_1-3NH₂、-CONZ''(CH₂)_1-3 NH₂和–CONZ''CH₂COOH，其中Z''代表H或NH₂；

R²和R⁴代表H或–L-#1，或R²和R⁴一起（形成吡咯烷环）代表-CH₂-CHR¹⁰-或–CHR¹⁰-CH₂-，其中R¹⁰代表H或–L-#1；

R³代表–L-#1或C_1-10-烷基-，其可任选被–OH、O-烷基、SH、S-烷基、O-CO-烷基、O-CO-NH-烷基、NH-CO-烷基、NH-CO-NH-烷基、S(O)_n-烷基、SO₂-NH-烷基、NH-烷基、N(烷基)₂或NH₂（其中烷基优选是C_1-3-烷基）取代；

R⁵代表–L-#1、H或F；

R⁶和R⁷彼此独立地代表H、（任选氟代的）C_1-3-烷基、（任选氟代的）C_2-4-烯基、（任选氟代的）C_2-4-炔基、羟基或卤素；

R⁸代表支化的C_1-5-烷基；且

R⁹代表H或F，

其中取代基R¹、R²、R³、R⁴、R⁵和R¹⁰之一代表–L-#1，且

–L-代表连接体且#1与连向抗体的键，

其中–L-由下式表示

§-(CO)m-L1-L2-§§

其中

m是0或1；

§代表连向KSP的键且

§§代表连向抗体的键，且

L2代表

其中

#¹是指与抗体的硫原子的连接点，

#²代表与基团L¹的连接点，

且L1由下式表示

#¹–(NR¹⁰)_n-(G1)_o-G2-#²

其中

R¹⁰代表H、NH₂或C₁-C₃-烷基；

G1代表–NHCO-或；

n是0或1；

o是0或1；且

G2代表具有1至100个碳原子的直链或支化的烃链，其来自亚芳基和/或直链和/或支化和/或环状亚烷基并可被基团-O-、-S-、-SO-、SO₂、-NH-、-CO-、-NHCO-、-CONH-、-NMe-、-NHNH-、-SO₂NHNH-、-CONHNH-和具有最多4个选自N、O和S或-SO-的杂原子的3至10元芳族或非芳族杂环（优选）的一个或多个中断一次或多次，其中如果存在侧链，其可被–NHCONH₂、-COOH、-OH、-NH₂、NH-CNNH₂、磺酰胺、砜、亚砜或磺酸取代，

#¹是连向KSP抑制剂的键且#²是连向与抗体的偶联基团（例如L2）的键。

实施方案C:

下式的ADC和该ADC的盐、溶剂合物和溶剂合物的盐

其中KSP-L-是具有下示亚结构I(sub)的化合物，该结合体是抗-TWEAKR抗体（特别优选特异性结合到TWEAKR（SEQ ID NO:169）的位置47中的氨基酸D（D47）上的抗-TWEAKR抗体，尤其是抗-TWEAK R抗体TPP-2090）、抗-HER2抗体或抗-EGRF抗体（优选尼妥珠单抗），且n是1至10的数值：

其中

#a代表与所述分子剩余部分的键；

R^1a代表-L-#1、H或-(CH₂)_0-3Z，其中Z代表-H、卤素、-NHY³、-CO-NY¹Y²或-CO-OY³，

其中Y¹和Y²彼此独立地代表H、NH₂或-(CH₂CH₂O)_0-3-(CH₂)_0-3Z'，且Y³代表H或-(CH₂)_0-3Z'，其中Z'代表H、SO₃H、NH₂、COOH或-(CO-NH-CHY⁴)_1-3COOH，其中Y⁴彼此独立地代表任选被–NHCONH₂取代的直链或支化的C_1-6-烷基，或代表任选被–NH₂取代的芳基或苄基；

R^2a和R^4a彼此独立地代表H、-L-#1、-CO-CHY⁴-NHY⁵或-(CH₂)_0-3Z，或R^2a和R^4a一起（形成吡咯烷环）代表–CH₂-CHR¹⁰-或-CHR¹⁰-CH₂-，其中R¹⁰代表-L-#1、H、NH₂、COOH、SO₃H、SH或OH，且其中Z代表-H、-CO-NY¹Y²或-CO-OY³，

其中Y¹和Y²彼此独立地代表H、NH₂或-(CH₂)_0-3Z'，且Y³代表H或-(CH₂)_0-3Z'，其中Z'代表H、SO₃H、NH₂或COOH，

其中Y⁴彼此独立地代表任选被–NHCONH₂取代的直链或支化的C_1-6烷基，或代表任选被–NH₂取代的芳基或苄基，且Y⁵代表H或–CO-CHY⁶-NH₂，其中Y⁶代表直链或支化的C_1-6-烷基；

其中取代基R^1a、R^2a、R^4a或R¹⁰之一代表–L-#1，

–L-代表连接体且#1代表与抗体的键，

其中–L-由下式表示

§-(CO)m-L1-L2-§§

其中

m是0或1；

§代表连向KSP的键且

§§代表连向抗体的键，且

L2代表

其中

#¹是指与抗体的硫原子的连接点，

#²代表与基团L¹的连接点，

且L1由下式表示

#¹–(NR¹⁰)_n-(G1)_o-G2-#²

其中

R¹⁰代表H、NH₂或C₁-C₃-烷基；

G1代表–NHCO-或；

n是0或1；

o是0或1；且

G2代表具有1至100个碳原子的直链或支化的烃链，其来自亚芳基和/或直链和/或支化和/或环状亚烷基并可被基团-O-、-S-、-SO-、SO₂、-NH-、-CO-、-NHCO-、-CONH-、-NMe-、-NHNH-、-SO₂NHNH-、-CONHNH-和具有最多4个选自N、O和S或-SO-的杂原子的3至10元芳族或非芳族杂环（优选）的一个或多个中断一次或多次，其中如果存在侧链，其可被–NHCONH₂、-COOH、-OH、-NH₂、NH-CNNH₂、磺酰胺、砜、亚砜或磺酸取代，

#¹是连向KSP抑制剂的键且#²是连向与抗体的偶联基团（例如L2）的键。

实施方案D:

下式的ADC和该ADC的盐、溶剂合物和溶剂合物的盐

其中KSP-L-是下式(II)、(IIa)、(IIb)、(IIc)、(IId)、(IIe)、(IIf)、(IIg)或下式(IIh)的化合物，该结合体是抗体且n是1至10的数值：

式(IIh):

其中

X₁代表N，X₂代表N且X₃代表C；

X₁代表CH，X₂代表C且X₃代表N；

X₁代表NH，X₂代表C且X₃代表C；或

X₁代表CH，X₂代表N且X₃代表C；

A代表CO（羰基）；

R¹代表–L-#1；

R²和R⁴代表H，或R²和R⁴一起（形成吡咯烷环）代表-CH₂-CHR¹⁰-或–CHR¹⁰-CH₂-，其中R¹⁰代表H；

R³代表可任选被–OH、O-烷基、SH、S-烷基、O-CO-烷基、O-CO-NH-烷基、NH-CO-烷基、NH-CO-NH-烷基、S(O)_n-烷基、SO₂-NH-烷基、NH-烷基、N(烷基)₂或NH₂（其中烷基优选是C_1-3-烷基）取代的C_1-10-烷基-，或–MOD；

其中–MOD代表–(NR¹⁰)_n-(G1)_o-G2-H，其中

R¹⁰代表H或C₁-C₃-烷基；

G1代表–NHCO-、-CONH-或（其中，如果G1代表–NHCO-或，则R¹⁰不代表NH₂）；

n是0或1；

o是0或1；且

G2代表直链和/或支化的烃基，其具有1至10个碳原子并可被基团-O-、-S-、-SO-、SO₂、-NR^y-、-NR^yCO-、CONR^y-、-NR^yNR^y-、-SO₂NR^yNR^y-、-CONR^yNR^y-（其中R^y代表H、苯基、C₁-C₁₀-烷基、C₂-C₁₀-烯基或C₂-C₁₀-炔基，它们各自可被-NHCONH₂、-COOH、-OH、-NH₂、NH-CNNH₂、磺酰胺、砜、亚砜或磺酸取代）、-CO-、-CR^x=N-O-（其中Rx代表H、C₁-C₃-烷基或苯基）的一个或多个中断一次或多次，其中如果存在烃链包括侧链，其可被-NHCONH₂、-COOH、-OH、-NH₂、NH-CNNH₂、磺酰胺、砜、亚砜或磺酸取代，其中基团–MOD优选具有至少一个基团-COOH；

R⁵代表H或F；

R⁶和R⁷彼此独立地代表H、（任选氟代的）C_1-3-烷基、（任选氟代的）C_2-4-烯基、（任选氟代的）C_2-4-炔基、羟基或卤素；

R⁸代表支化的C_1-5-烷基；且

R⁹代表H或F，

其中–L-代表连接体且#1代表与抗体的键，

其中–L-由下式表示

§-(CO)m-L1-L2-§§

其中

m是0或1；

§代表与KSP的键且

§§代表与抗体的键，且

L2代表

其中

#¹是指连向抗体的硫原子的连接点，

#²代表连向基团L¹的连接点,

且L1由下式表示

#¹–(NR¹⁰)_n-(G1)_o-G2-#²

其中

R₁₀代表H、NH₂或C₁-C₃-烷基；

G1代表–NHCO-或；

n是0或1；

o是0或1；且

G2代表具有1至100个碳原子的直链或支化的烃链，其来自亚芳基和/或直链和/或支化和/或环状亚烷基并可被基团-O-、-S-、-SO-、SO₂、-NH-、-CO-、-NHCO-、-CONH-、-NMe-、-NHNH-、-SO₂NHNH-、-CONHNH-、-CR^x=N-O-（其中R^x代表H、C₁-C₃-烷基或苯基）和具有最多4个选自N、O和S、-SO-或–SO₂-的杂原子的3至10元芳族或非芳族杂环（优选）的一个或多个中断一次或多次，其中如果存在烃链包括侧链，其可被–NHCONH₂、-COOH、-OH、-NH₂、NH-CNNH₂、磺酰胺、砜、亚砜或磺酸取代，

#¹是连向KSP抑制剂的键且#²是连向与抗体的偶联基团（例如L2）的键。

实施方案E:

下式的ADC和该ADC的盐、溶剂合物和溶剂合物的盐

其中KSP-L-是具有下示亚结构I(sub)的化合物，该结合体是Nimutuzumab且n是1至10的数值：

其中

#a代表与所述分子剩余部分的键；

R^1a代表-L-#1、H或-(CH₂)_0-3Z，其中Z代表-H、卤素、-NHY³、-CO-NY¹Y²或-CO-OY³，

其中Y¹和Y²彼此独立地代表H、NH₂或-(CH₂CH₂O)_0-3-(CH₂)_0-3Z'，且Y³代表H或-(CH₂)_0-3Z'，其中Z'代表H、SO₃H、NH₂、COOH或-(CO-NH-CHY⁴)_1-3COOH，其中Y⁴彼此独立地代表任选被–NHCONH₂取代的直链或支化的C_1-6-烷基，或代表任选被–NH₂取代的芳基或苄基；

R^2a和R^4a彼此独立地代表H、-L-#1、-CO-CHY⁴-NHY⁵或-(CH₂)_0-3Z，或R^2a和R^4a一起（形成吡咯烷环）代表–CH₂-CHR¹⁰-或-CHR¹⁰-CH₂-，其中R¹⁰代表-L-#1, H、NH₂、COOH、SO₃H、SH或OH，且其中Z代表-H、-CO-NY¹Y²或-CO-OY³，

其中Y¹和Y²彼此独立地代表H、NH₂或-(CH₂)_0-3Z'，且Y³代表H或-(CH₂)_0-3Z'，其中Z'代表H、SO₃H、NH₂或COOH，

其中Y⁴彼此独立地代表任选被–NHCONH₂取代的直链或支化的C_1-6烷基，或代表任选被–NH₂取代的芳基或苄基，且Y⁵代表H或–CO-CHY⁶-NH₂，其中Y⁶代表直链或支化的C_1-6-烷基；

其中取代基R^1a、R^2a、R^4a或R¹⁰之一代表–L-#1，

–L-代表连接体且#1代表与抗体的键，

其中–L-由下式表示

§-(CO)m-L1-L2-§§

其中

m是0或1；

§代表连向KSP的键且

§§代表连向抗体的键，且

L2代表

其中

#¹是指与抗体的硫原子的连接点，

#²是指与基团L¹的连接点，

且L1由下式表示

#¹–(NR¹⁰)_n-(G1)_o-G2-#²

其中

R¹⁰代表H、NH₂或C₁-C₃-烷基；

G1代表–NHCO-或；

n是0或1；

o是0或1；且

G2代表具有1至100个碳原子的直链或支化的烃链，其来自亚芳基和/或直链和/或支化和/或环状亚烷基并可被基团-O-、-S-、-SO-、SO₂、-NH-、-CO-、-NHCO-、-CONH-、-NMe-、-NHNH-、-SO₂NHNH-、-CONHNH-和具有最多4个选自N、O和S或-SO-的杂原子的3至10元芳族或非芳族杂环（优选）的一个或多个中断一次或多次，其中如果存在侧链，其可被–NHCONH₂、-COOH、-OH、-NH₂、NH-CNNH₂、磺酰胺、砜、亚砜或磺酸取代，

#¹是连向KSP抑制剂的键且#²是连向与抗体的偶联基团（例如L2）的键。

在这一实施方案中，KSP-L-特别优选具有下式(IIi)及其盐、溶剂合物和溶剂合物的盐：

式(IIi):

其中

X₁代表N，X₂代表N且X₃代表C；或

X₁代表N，X₂代表C且X₃代表N；或

X₁代表CH或CF，X₂代表C且X₃代表N；或

X₁代表NH，X₂代表C且X₃代表C；或

X₁代表CH，X₂代表N且X₃代表C

（其中X₁代表CH，X₂代表C且X₃代表N是优选的）；

R¹代表H、–MOD或-(CH₂)_0-3Z，其中Z代表-H、-NHY³、-OY³、-SY³、卤素、-CO-NY¹Y²或-CO-OY³，

其中Y¹和Y²彼此独立地代表H、NH₂、-(CH₂CH₂O)_0-3-(CH₂)_0-3Z'（例如-(CH₂)_0-3Z'）或-CH(CH₂W)Z'，且Y³代表H或-(CH₂)_0-3Z'，其中Z'代表H、NH₂、SO₃H、COOH、-NH-CO-CH₂-CH₂-CH(NH₂)COOH或-(CO-NH-CHY⁴)_1-3COOH，其中W代表H或OH，

其中Y⁴彼此独立地代表任选被–NHCONH₂取代的直链或支化的C_1-6-烷基，或代表任选被–NH₂取代的芳基或苄基；

R²代表H、-MOD、-CO-CHY⁴-NHY⁵或-(CH₂)_0-3Z，或R²和R⁴一起（形成吡咯烷环）代表–CH₂-CHR¹⁰-或-CHR¹⁰-CH₂-，其中R¹⁰代表H、NH₂、SO₃H、COOH、SH或OH；

其中Z代表-H、卤素、-OY³、-SY³、NHY³、-CO-NY¹Y²或-CO-OY³，

其中Y¹和Y²彼此独立地代表H、NH₂或-(CH₂)_0-3Z'，且Y³代表H或-(CH₂)_0-3Z'，其中Z'代表H、SO₃H、NH₂或COOH；

其中Y⁴彼此独立地代表任选被–NHCONH₂取代的直链或支化的C_1-6烷基，或代表任选被–NH₂取代的芳基或苄基，且Y⁵代表H或–CO-CHY⁶-NH₂，其中Y⁶代表直链或支化的C_1-6-烷基；

R⁴代表H、-CO-CHY⁴-NHY⁵或-(CH₂)_0-3Z，优选H，

其中Z代表-H、卤素、-OY³、-SY³、NHY³、-CO-NY¹Y²或-CO-OY³，

其中Y¹和Y²彼此独立地代表H、NH₂或-(CH₂)_0-3Z'，且Y³代表H或-(CH₂)_0-3Z'，其中Z'代表H、SO₃H、NH₂或COOH；

其中Y⁴彼此独立地代表任选被–NHCONH₂取代的直链或支化的C_1-6烷基，或代表任选被–NH₂取代的芳基或苄基，且Y⁵代表H或–CO-CHY⁶-NH₂，其中Y⁶代表直链或支化的C_1-6-烷基；

或R²和R⁴一起（形成吡咯烷环）代表–CH₂-CHR¹⁰-或-CHR¹⁰-CH₂-，其中R¹⁰代表H、NH₂、SO₃H、COOH、SH或OH；

A代表CO、SO、SO₂、SO₂NH或CNNH；

R³代表–L-#1，

R⁵代表H、NH₂、NO₂、卤素（特别是F、Cl、Br）、-CN、CF₃、-OCF₃、-CH₂F、-CH₂F、SH或-(CH₂)_0-3Z，其中Z代表-H、-OY³、-SY³、卤素、NHY³、-CO-NY¹Y²或-CO-OY³，

其中Y¹和Y²彼此独立地代表H、NH₂或-(CH₂)_0-3Z'，且Y³代表H或-(CH₂)_0-3Z'，其中Z'代表H、SO₃H、NH₂或COOH；

R⁶和R⁷彼此独立地代表H、氰基、（任选氟代的）C_1-10-烷基、（任选氟代的）C_2-10-烯基、（任选氟代的）C_2-10-炔基、羟基、NO₂、NH₂、COOH或卤素（特别是F、Cl、Br），

R⁸代表（任选氟代的）C_1-10-烷基、（任选氟代的）C_2-10-烯基、（任选氟代的）C_2-10-炔基、（任选氟代的）C_4-10-环烷基或–(CH₂)_0-2-(HZ²)，其中HZ²代表具有最多2个选自N、O和S的杂原子的4-至7元杂环，其中这些基团的每个可被–OH、CO₂H或NH₂取代；

L代表连接体且#1代表与所述结合体或其衍生物的键，

其中–MOD代表–(NR¹⁰)_n-(G1)_o-G2-H，其中

R¹⁰代表H或C₁-C₃-烷基；

G1代表–NHCO-、-CONH-或（其中，如果G1代表–NHCO-或，则R¹⁰不代表NH₂）；

n是0或1；

o是0或1；且

G2代表直链和/或支化的烃基，其具有1至10个碳原子并可被基团-O-、-S-、-SO-、SO₂、-NR^y-、-NR^yCO-、CONR^y-、-NR^yNR^y-、-SO₂NR^yNR^y-、-CONR^yNR^y-（其中R^y代表H、苯基、C₁-C₁₀-烷基、C₂-C₁₀-烯基或C₂-C₁₀-炔基，它们各自可被-NHCONH₂、-COOH、-OH、-NH₂、NH-CNNH₂、磺酰胺、砜、亚砜或磺酸取代）、-CO-、-CR^x=N-O-（其中Rx代表H、C₁-C₃-烷基或苯基）的一个或多个中断一次或多次，其中如果存在烃链包括侧链，其可被-NHCONH₂、-COOH、-OH、-NH₂、NH-CNNH₂、磺酰胺、砜、亚砜或磺酸取代，其中基团–MOD优选具有至少一个基团-COOH。

实施方案F:

下列通式的化合物及其盐、溶剂合物和溶剂合物的盐：

其中

X₁代表N，X₂代表N且X₃代表C，或X₁代表CH，X₂代表C且X₃代表N；

R¹代表H或-(CH₂)_0-3Z，其中Z代表-H、-NHY³、-OY³、-SY³、卤素、-CO-NY¹Y²或-CO-OY³，

其中Y¹和Y²彼此独立地代表H、NH₂、-(CH₂CH₂O)_0-3-(CH₂)_0-3Z'或-CH(CH₂W)Z'，且Y³代表H或-(CH₂)_0-3Z'，其中Z'代表H、NH₂、SO₃H、COOH、-NH-CO-CH₂-CH₂-CH(NH₂)COOH或-(CO-NH-CHY⁴)_1-3COOH；其中W代表H或OH；

其中Y⁴彼此独立地代表任选被–NHCONH₂取代的直链或支化的C_1-6-烷基，或代表任选被–NH₂取代的芳基或苄基；

R²和R⁴彼此独立地代表H、-CO-CHY⁴-NHY⁵或-(CH₂)_0-3Z，或R²和R⁴一起（形成吡咯烷环）代表–CH₂-CHR¹⁰-或-CHR¹⁰-CH₂-，其中R¹⁰代表H、NH₂、SO₃H、COOH、SH或OH，

其中Z代表-H、卤素、-OY³、-SY³、NHY³、-CO-NY¹Y²或-CO-OY³，

其中Y¹和Y²彼此独立地代表H、NH₂或-(CH₂)_0-3Z'，且Y³代表H或-(CH₂)_0-3Z'，其中Z'代表H、SO₃H、NH₂或COOH；

其中Y⁴彼此独立地代表任选被–NHCONH₂取代的直链或支化的C_1-6烷基，或代表任选被–NH₂取代的芳基或苄基，且Y⁵代表H或–CO-CHY⁶-NH₂，其中Y⁶代表直链或支化的C_1-6-烷基；

A代表CO、SO、SO₂、SO₂NH或CNNH；

R³代表任选取代的烷基、芳基、杂芳基、杂烷基、杂环烷基，优选C_1-10-烷基、C_6-10-芳基或C_6-10-芳烷基、C_5-10-杂烷基、C_1-10-烷基-O-C_6-10-芳基或C_5-10-杂环烷基，其可被1-3个–OH基团、1-3个卤素原子、1-3个卤代烷基（各自具有1-3个卤素原子）、1-3个O-烷基、1-3个–SH基团、1-3个-S-烷基、1-3个-O-CO-烷基、1-3个-O-CO-NH-烷基、1-3个-NH-CO-烷基、1-3个-NH-CO-NH-烷基、1-3个-S(O)_n-烷基、1-3个-SO₂-NH-烷基、1-3个-NH-烷基、1-3个-N(烷基)₂基团、1-3个-NH₂基团或1-3个-(CH₂)_0-3Z基团取代，其中Z代表-H、卤素、-OY³、-SY³、-NHY³、-CO-NY¹Y²或-CO-OY³，其中Y¹和Y²彼此独立地代表H、NH₂或-(CH₂)_0-3Z'，且Y³代表H、-(CH₂)_0-3-CH(NHCOCH₃)Z'、-(CH₂)_0-3-CH(NH₂)Z'或-(CH₂)_0-3Z'，其中Z'代表H、SO₃H、NH₂或COOH（其中“烷基”优选代表C_1-10-烷基）；

R⁵代表H、F、NH₂、NO₂、卤素、SH或-(CH₂)_0-3Z，其中Z代表-H、卤素、-OY³、-SY³、-NHY³、-CO-NY¹Y²或-CO-OY³，

其中Y¹和Y²彼此独立地代表H、NH₂或-(CH₂)_0-3Z'，且Y³代表H或-(CH₂)_0-3Z'，其中Z'代表H、SO₃H、NH₂或COOH；

R⁶和R⁷彼此独立地代表H、氰基、（任选氟代的）C_1-10-烷基、（任选氟代的）C_2-10-烯基、（任选氟代的）C_2-10-炔基、羟基或卤素，

R⁸代表（任选氟代的）C_1-10-烷基、（任选氟代的）C_4-10-环烷基或任选取代的氧杂环丁烷；且

R⁹代表H、F、CH₃、CF₃、CH₂F或CHF₂。

实施方案G:

本发明还提供下列通式的结合体/活性物质：

其中BINDER代表结合体（优选：抗体）或其衍生物（优选：半胱氨酸残基），优选抗体，L代表连接体，WS代表活性物质，优选KSP抑制剂，例如式(II)、(IIa)、(IIb)、(IIc)、(IId)、(IIe)、(IIf)、(IIg)或(IIh)之一的根据本发明的KSP抑制剂，m代表1至2的数值，优选1，且n代表1至50，优选1.2至20，特别优选2至8的数值，其中L具有下列结构之一。在此，m是每连接体的活性物质分子数量且n是每BINDER的活性物质/连接体偶联物数量的平均值。偶联物分子中存在的所有WS的总和因此是m和n的乘积。

WS是在动物中，优选在人类中具有局部或全身治疗作用的活性物质。这些活性物质通常具有低于5 kDa，优选低于1.5 kDa的分子量。优选的活性物质是抗增殖物质，例如细胞毒性或细胞生长抑制物质。优选的活性物质是细胞毒性物质、血管生成抑制剂、细胞周期抑制剂、PI3激酶或m-TOR抑制剂、MAPK信号级联通路的抑制剂、HDAC抑制剂、蛋白酶体抑制剂、PARP抑制剂、Wnt/Hedgehog信号级联通路抑制剂和RNA聚合酶抑制剂。细胞毒性物质尤其是DNA结合或嵌入物质、DNA-烷基化物质、微管蛋白稳定物质或去稳定物质、铂化合物和拓扑异构酶I抑制剂。示例性的DNA结合物质是例如蒽环类，如多柔比星或柔红霉素。示例性DNA-烷基化物质是例如刺孢霉素、替莫唑胺或环磷酰胺和衍生物。示例性微管蛋白稳定物质或去稳定物质是例如紫杉烷类，如紫杉醇、多西紫杉醇、Maytansinoide和Auristatine、Tubulysine、长春花生物碱、埃博霉素及其衍生物。Maytansinoide的实例是Maytansin、美登醇、DM-1和DM-4（参见例如美国专利US5208020）。Auristatine的实例是Auristatin E、Monomethylauristatin E (MMAE)、Auristatin F、Monomethylauristatin F (MMAF)和Dolastin（尤其参见WO 09/117531、WO 2005/081711、WO 04/010957；WO02/088172或WO01/24763）。长春花生物碱的实例是长春新碱和长春碱。埃博霉素的实例是埃博霉素A、B、C、D、E或F（尤其参见WO 98/13375；WO2004/005269；WO 2008/138561；WO 2009/002993；WO 2009/055562；WO 2009/012958；WO2009/026177；WO 2009/134279；WO 2010/033733；WO2010/034724；WO 2011/017249；WO2011/057805）。铂化合物的实例是顺铂和卡铂。拓扑异构酶I抑制剂的实例是喜树碱和衍生物。血管生成抑制剂的实例是MetAP2抑制剂，例如烟曲霉醇。细胞周期抑制剂的实例是CDK抑制剂（例如BMS-387032或PD0332991）、Rho激酶抑制剂，例如GSK429286、PLK抑制剂，例如Volasertib、极光激酶抑制剂，例如AZD1152或MLN805Z。MAPK信号级联通路的抑制剂的实例尤其是MEK抑制剂（例如PD0325901）、Ras抑制剂、JNK抑制剂、B-Raf抑制剂（例如SB590885）或p38 MAPK抑制剂（例如SB202190）。HDAC抑制剂的实例是Belinostat和Givinostat。PARP抑制剂的实例是Iniparib和奥拉帕尼。RNA聚合酶抑制剂的实例是鹅膏毒素，例如α-Amantin、鹅膏素和鹅膏无毒环肽（Amanullin）。特别优选的活性物质是长春花生物碱、Auristatine、Maytansinoide、Tubulysine、Duocarmycine、激酶抑制剂、MEK抑制剂和KSP抑制剂。

在此，L代表下式A3或A4之一

其中#¹是指与结合体的硫原子的连接点，#²是指与活性物质的连接点，x代表1或2，且R²²代表COOH、COOR、COR（其中R在每种情况下代表C_1-3-烷基）、CONH₂、Br，优选COOH。

L1具有与上文相同的含义。-L1-#2优选由下式表示：

#³–(NR¹⁰)_n-(G1)_o-G2-#²

其中

#3是指与氮原子的连接点，

R¹⁰代表H、NH₂或C₁-C₃-烷基；

G1代表–NHCO-、-CONH-或（其中，如果G1代表NHCO或，则R10不代表NH₂），

n是0或1；

o是0或1；且

G2代表具有1至100个碳原子的直链或支化的烃链，其来自亚芳基和/或直链和/或支化和/或环状亚烷基并可被基团-O-、-S-、-SO-、SO₂、-NR^y-、-NR^yCO-、-C(NH)NR^y-、CONR^y-、-NR^yNR^y-、-SO₂NR^yNR^y-、-CONR^yNR^y-（其中R^y代表H、苯基、C₁-C₁₀-烷基、C₂-C₁₀-烯基或C₂-C₁₀-炔基，它们各自可被NHCONH₂、-COOH、-OH、-NH₂、NH-CNNH₂、磺酰胺、砜、亚砜或磺酸取代）、-CO-、-CR^x=N-O-（其中R^x代表H、C₁-C₃-烷基或苯基）和/或具有最多4个选自N、O和S、-SO-或–SO₂-的杂原子的3至10元芳族或非芳族杂环（优选）的一个或多个中断一次或多次，其中如果存在烃链包括侧链，其可被NHCONH₂、-COOH、-OH、-NH₂、NH-CNNH₂、磺酰胺、砜、亚砜或磺酸取代。

G2中的进一步的中断基团优选是

其中Rx代表H、C₁-C₃-烷基或苯基。

在本发明的偶联物中或在本发明的偶联物的混合物中，在优选大于80%，特别优选大于90%（在每种情况下基于连接体与结合体的键的总数计）的程度上特别优选作为式A3或A4的两种结构之一存在连向结合体的半胱氨酸残基的键。

含式A3或A4的连接体的偶联物可通过将结合体偶联到下式A3'和A4'的相应溴衍生物上获得：

式A3'或A4'的这些溴衍生物可通过如下列图式30至32中示例性所示使HOOCCH₂CHBrCOOR₂₂或HOOCCHBrCH₂COOR₂₂与结合体的胺基反应获得。

图式30:

[a): 2-溴-1-乙基吡啶鎓四氟硼酸盐(BEP), DCM, 吡啶, RT；b) 氯化锌, 三氟乙醇, 50℃, EDTA；c) 3-4当量TCEP, PBS缓冲液；d] PBS缓冲液, 20h RT.]

图式31:

[a): 2-溴-1-乙基吡啶鎓四氟硼酸盐(BEP), DCM, 吡啶, RT；b) 氯化锌, 三氟乙醇, 50℃, EDTA；c) 3-4当量TCEP, PBS缓冲液；d) PBS缓冲液, 20h RT.]

实施方案H:

本发明还提供下列通式的结合体/活性物质：

其中BINDER代表结合体（优选：抗体）或其衍生物（优选：半胱氨酸残基），优选抗体，L代表连接体，WS代表活性物质，优选KSP抑制剂，例如式(II)、(IIa)、(III)或(IIIa)之一的根据本发明的KSP抑制剂，m代表1至2的数值，优选1，且n代表1至50，优选1.2至20，特别优选2至8的数值，其中L具有下列结构之一。在此，m是每连接体的活性物质分子数量且n是每BINDER的活性物质/连接体偶联物数量的平均值。偶联物分子中存在的所有WS的总和因此是m和n的乘积。

在此，L代表：

其中#¹是指与结合体的硫原子的连接点，#²是指与活性物质的连接点，且R²²代表COOH、COOR、COR（其中R在每种情况下代表C_1-3-烷基）、CONH₂、Br，优选COOH。与结合体的硫原子的键因此可具有下列结构之一：

在每活性物质/结合体偶联物含有多于一个活性物质分子 WS的活性物质/结合体偶联物的情况下，根据式A1和/或A2的两种结构都可存在于活性物质/结合体偶联物中。由于本发明的活性物质/结合体偶联物可以是不同活性物质/结合体偶联物的混合物，这种混合物也可以包含式A1或式A2的活性物质/结合体偶联物，和式A1和A2的活性物质/结合体偶联物。

L₅是选自-(CH₂)_m-(CHR^S)_n-(OCH₂CH₂)_o-(X)_p-(CH₂)_q-的基团，其中m、n、o、p和q彼此独立地具有下列值：m=0-10；n=0或1；o=0-10；p=0或1；和q=0-10，其中m+n+o=1-15，优选1-6。X代表5或6元芳族或非芳族杂环或碳环，优选–C₆H₄-或-C₆H₁₀-。R^S代表酸基，优选-COOH或SO₃H。

L₆是选自–CONH-、-OCONH-、-NHCO-、-NHCOO-、或的基团，其中r是1、2或3。

L₇是单键或选自具有1至100（优选1至10）个碳原子的直链或支化的烃链的基团，所述烃链来自亚芳基和/或直链和/或支化和/或环状亚烷基并可被基团-O-、-S-、-SO-、SO₂、-NR^y-、-NR^yCO-、-C(NH)NR^y-、CONR^y-、-NR^yNR^y-、-SO₂NR^yNR^y-、-CONR^yNR^y-（其中R^y代表H、苯基、C₁-C₁₀-烷基、C₂-C₁₀-烯基或C₂-C₁₀-炔基，它们各自可被NHCONH₂、-COOH、-OH、-NH₂、NH-CNNH₂、磺酰胺、砜、亚砜或磺酸取代）、-CO-、-CR^x=N-O-（其中R^x代表H、C₁-C₃-烷基或苯基）和/或具有最多4个选自N、O和S、-SO-或–SO₂-的杂原子的3至10元，优选5至10元芳族或非芳族杂环（优选）的一个或多个中断一次或多次，其中如果存在烃链包括侧链，其可被-NHCONH₂、-COOH、-OH、-NH₂、NH-CNNH₂、磺酰胺、砜、亚砜或磺酸取代。

L₅优选是基团-(CH₂)_m-(CHR^S)_n-(OCH₂CH₂)_o-(X)_p-(CH₂)_q-，其中m=1-3，n=0，o=0-7，p=0且q=0或1。特别优选的是基团-(CH₂)_m-(CHR^S)_n-(OCH₂CH₂)_o-(X)_p-(CH₂)_q-，其中m=1或2，n=0，o=0或1，p=0和q=0或1。

L₆优选是选自–CONH-和-NHCO-的基团。

L₇优选是单键或–[(CH₂)_x-(X⁴)_y]w-(CH₂)_z-，

其中

w = 0至20；

x = 0至5；

y = 0或1；

z = 1至5；且

X⁴代表–O-、-CONH-、–NHCO-或。

L₇特别优选是单键或基团–[(CH₂)_x-NHCO-]]，其中x = 1至5。

–L₅-L₆-L₇-特别优选代表-(CH₂)_m-(CHR^S)_n-(OCH₂CH₂)_o-(X)_p-(CH₂)_q-NHCO-[(CH₂)_x-NHCO-]]，其中m=1或2，n=0，o=0或1，p=0，且q=0或1，且x=1-5。

但是，这两种结构也可以共同存在于本发明的偶联物中。

根据本发明，这些结合体/活性物质偶联物可由下式的化合物制备

其中L具有下式A'：

优选通过在具有7.5至8.5，优选8的pH的pH缓冲液中在低于37℃，优选10至25℃的温度下搅拌最多40小时，优选1至15小时而将A'转化成A。

实施方案I:

下式的抗体偶联物

其中

R2、R4和R5代表H；

R3代表–CH₂OH；

R1代表–L1-L2-BINDER，其中

L1代表

其中#2代表与L2的连接点，且#1代表与另一连接的连接点；

且L2代表下式A5和A6的结构之一或两者：

其中

#¹是指与结合体的硫原子的连接点，

#²是指与基团L¹的连接点，且

R²²代表COOH、COOR、COR、CONHR（其中R在每种情况下代表C1-3-烷基）、CONH₂，优选COOH。

在本发明的偶联物中或在本发明的偶联物的混合物中，在优选大于80%，特别优选大于90%（在每种情况下基于连接体与结合体的键的总数计）的程度上存在连向结合体的半胱氨酸残基的键，特别优选为式A5或A6的两种结构之一。

在此，式A5或A6的结构通常一起存在，基于连向结合体的键的数量计，优选为60:40至40:60的比率。剩余键随之作为下列结构存在

该结合体优选是结合体蛋白质或肽，特别优选人、人源化或嵌合单克隆抗体或其抗原结合片段，特别是抗-TWEAKR抗体或其抗原结合片段或抗-EGFR抗体或其抗原结合片段。特别优选的是特异性结合到TWEAKR（SEQ ID NO:169）的位置47中的氨基酸D（D47）上的抗-TWEAKR抗体，特别是抗-TWEAKR抗体TPP-2090或抗-EGFR抗体西妥昔单抗或尼妥珠单抗。替代该结合体，也可存在半胱氨酸残基。

治疗用途

本发明的化合物可用于治疗的过度增殖疾病特别包括癌症和肿瘤疾病。在本发明中，这些被理解为尤其是指下列疾病，但不限于它们：乳腺癌和乳腺肿瘤（乳腺癌包括导管和小叶形式，也原位（in situ））、呼吸道肿瘤（小细胞和非小细胞癌、支气管癌）、脑肿瘤（例如脑干肿瘤和下丘脑肿瘤、星形细胞瘤、室管膜瘤、胶质母细胞瘤、胶质瘤、髓母细胞瘤、脑膜瘤和神经外胚层和松果体瘤）、消化器官肿瘤（食道、胃、胆囊、小肠、大肠、直肠和肛门癌）、肝肿瘤（尤其是肝细胞癌、胆管细胞癌和混合肝细胞和胆管细胞癌）、头颈区的肿瘤（喉、下咽部、鼻咽、口咽、嘴唇和口腔癌，口腔黑色素瘤）、皮肤瘤（基底细胞瘤、Spinaliome、鳞状细胞癌、卡波西肉瘤、恶性黑素瘤、非黑素瘤皮肤癌、梅克尔细胞皮肤癌、肥大细胞瘤）、支持结缔组织肿瘤（尤其是软组织肉瘤、骨肉瘤、恶性纤维组织细胞瘤、软骨肉瘤、纤维肉瘤、血管肉瘤、平滑肌肉瘤、脂肪肉瘤、淋巴肉瘤和横纹肌肉瘤）、眼睛肿瘤（尤其是眼内黑色素瘤和成视网膜细胞瘤）、内分泌和外分泌腺的肿瘤（例如甲状腺和甲状旁腺、胰腺和唾液腺癌、腺癌）、尿道肿瘤（膀胱、阴茎、肾、肾盂和输尿管的肿瘤）和生殖器官肿瘤（在女性中为子宫内膜癌、子宫颈癌、卵巢癌、阴道癌、外阴癌和子宫癌，在男性中为前列腺癌和睾丸癌）。这些还包括实体形式和作为循环细胞的血液、淋巴系统和脊髓的增殖性血液病，如白血病、淋巴瘤和骨髓增生性疾病，例如急性髓细胞白血病、急性成淋巴细胞性白血病、慢性淋巴细胞性白血病、慢性髓细胞性白血病和毛细胞性白血病和AIDS相关淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤、皮肤T-细胞淋巴瘤、伯基特氏淋巴瘤和中枢神经系统中的淋巴瘤。

这些在人类中已充分表征的疾病在其它哺乳动物中也以相当的病因学发生，并在此同样可用本发明的化合物治疗。

用本发明的化合物治疗上述癌症疾病包括实体瘤的治疗及其转移或循环形式的治疗。

在本发明中，术语“治疗”在传统意义上使用并且是指为了对抗、减轻、减弱或缓解疾病或健康异常和改善例如在癌症的情况下因该疾病受损的生存状况而照料、护理和看护患者。

本发明因此还提供本发明的化合物用于治疗和/或预防疾病，特别是上文提到的疾病的用途。

本发明还提供本发明的化合物用于制造治疗和/或预防疾病，特别是上文提到的疾病的药剂的用途。

本发明还提供本发明的化合物在治疗和/或预防疾病，特别是上文提到的疾病的方法中的用途。

本发明还提供使用有效量的至少一种本发明的化合物治疗和/或预防疾病，特别是上文提到的疾病的方法。

本发明的化合物可以独自使用或如果需要，与一种或多种其它药理活性物质组合使用，只要这种组合不会造成不合意和不可接受的副作用。本发明因此还提供含有至少一种本发明的化合物和一种或多种附加活性物质的药剂，特别是用于治疗和/或预防上述疾病。

例如，本发明的化合物可以与用于治疗癌症的已知抗过度增殖、细胞生长抑制或细胞毒性物质组合。合适的组合活性物质的实例包括：

131I-chTNT、阿巴瑞克、阿比特龙、阿柔比星、阿法替尼、阿柏西普、阿地白介素、阿仑单抗、Alisertib、阿利维A酸、Alpharadin（氯化镭-223）、六甲蜜胺、氨鲁米特、AMP-514、氨柔比星、安吖啶、阿那曲唑、Arglabin、三氧化二砷、天冬酰胺酶、AT9283、阿西替尼、阿扎胞苷、巴利昔单抗、贝洛替康、苯达莫司汀、贝伐单抗、贝沙罗汀、比卡鲁胺、比生群、博来霉素、BMS-936559、博舒替尼、硼替佐米、Brentuximab vedotin、布舍瑞林、白消安、卡巴他赛、卡博替尼、亚叶酸钙、左亚叶酸钙、卡培他滨、卡铂、卡非佐米（蛋白酶体抑制剂）、卡莫氟、卡莫司汀、卡妥索单抗、塞来昔布、西莫白介素、西妥昔单抗、苯丁酸氮芥、氯地孕酮、氮芥、顺铂、克拉屈滨、氯膦酸、氯法拉滨、Copanlisib(BAY 80-6946)、Crisantaspase、克唑替尼、环磷酰胺、CYC116、环丙孕酮、阿糖胞苷、达卡巴嗪、放线菌素、阿法达贝泊汀、达拉菲尼、达鲁舍替、达沙替尼、道诺霉素、地西他滨、地加瑞克、地尼白介素-Diftitox、地诺单抗、地洛瑞林、二溴螺氯铵、多西紫杉醇、去氧氟尿苷、多柔比星、多柔比星 + 雌酮、依库珠单抗、依决洛单抗、依利醋铵、伊屈泼帕、内皮抑素、ENMD-2076、依诺他滨、表柔比星、环硫雄醇、阿法依泊汀、倍他依泊汀、依铂、艾日布林、埃罗替尼、雌二醇、雌氮芥、依托泊苷、依维莫司、依西美坦、法倔唑、非格司亭、氟达拉滨、氟尿嘧啶、氟他米特、福美斯坦、福莫司汀、氟维司群、硝酸镓、加尼瑞克、吉非替尼、吉西他滨、吉妥珠单抗、Glutoxim、戈舍瑞林、组胺二盐酸盐、组氨瑞林、羟基脲、碘I-125粒子、伊班膦酸、替伊莫单抗、依鲁替尼、伊达比星、异环磷酰胺、伊马替尼、咪喹莫特、INCB24360、英丙舒凡、干扰素-α、干扰素-β、干扰素-γ、易普利姆玛、伊立替康、伊沙匹隆、Lambrolizumab、兰瑞肽、拉帕替尼、来那度胺、来格司亭、香菇多糖、来曲唑、亮丙瑞林、左旋咪唑、麦角乙脲、洛铂、洛莫司汀、氯尼达明、马索罗酚（Masoprocol）、甲羟孕酮、甲地孕酮、美法仑、美雄烷、巯基嘌呤、甲氨蝶呤、甲氧沙林、氨基乙酰丙酸甲酯、甲睾酮、米伐木肽、米替福新、米铂、二溴甘露醇、米托胍腙、二溴卫矛醇、丝裂霉素、米托坦、米托蒽醌、MLN-8054、Mps1抑制剂（公开在WO2013/087579，特别是实施例01.01，WO2014/131739，特别是实施例2中）、奈达铂、奈拉滨、奈莫柔比星、尼洛替尼、尼鲁米特、尼妥珠单抗、尼莫司汀、二胺硝吖啶、Nivolumab、NMS-P715、NMS-P937、奥法木单抗、奥美拉唑、奥普瑞白介素、奥沙利铂、p53基因疗法、紫杉醇、Palbociclib、Palifermin、钯-103粒子、帕米膦酸、帕尼单抗、帕唑帕尼、培门冬酶、PEG-倍他依泊汀（甲氧基-PEG-倍他依泊汀）、聚乙二醇化非格司亭、Peg-干扰素-α-2b、培美曲塞、喷他佐辛、喷司他丁、培洛霉素、培磷酰胺、溶链菌、吡柔比星、普乐沙福、普卡霉素、聚氨葡糖、磷酸聚雌醇、多糖-K、帕纳替尼、卟吩姆-钠、普拉曲沙、泼尼莫司汀、丙卡巴肼、喹高利特、R763、雷洛昔芬、雷替曲塞、雷莫司汀、雷佐生、Refametinib、瑞格非尼、利塞膦酸、利妥昔单抗、罗米地辛、罗米司亭、Roninciclib、鲁索替尼、沙格司亭、Sipuleucel-T、西佐糖、索布佐生、甘氨双唑钠、SNS-314、索拉非尼、链脲菌素、舒尼替尼、他拉泊芬、他米巴罗汀、他莫昔芬、他索纳明、替西白介素、替加氟、替加氟 + 吉美嘧啶 + 奥特拉西、替莫泊芬、替莫唑胺、坦罗莫司（Temsirolimus）、替尼泊苷、睾酮、替曲膦、沙利度胺、塞替哌、胸腺法新、TKM-PLK1、硫鸟嘌呤、Tocilizumab、拓扑替康、托瑞米芬、托西莫单抗、Tozasertib、曲贝替定、曲美替尼、曲妥珠单抗、曲妥珠单抗emtansine、苏消安、维甲酸、曲洛司坦、曲普瑞林、曲洛磷胺、色氨酸、乌苯美司、戊柔比星、凡德他尼、伐普肽、威罗菲尼、长春碱、长春新碱、长春地辛、长春氟宁、长春瑞滨、Volasertib、伏立诺他、Vorozol、XL228、钇-90玻璃微球、净司他丁、净司他丁斯酯、唑来膦酸、佐柔比星。

此外，本发明的化合物可以例如与可例如结合到下列靶上的结合体组合：OX-40、CD137/4-1BB、DR3、IDO1/IDO2、LAG-3、CD40。

此外，本发明的化合物也可以与放射疗法和/或外科手术联合使用。

通常，用本发明的化合物与其它细胞生长抑制或细胞毒性活性剂的组合追求下列目标：

● 与用单一活性物质治疗相比，在减慢肿瘤生长、降低其尺寸或甚至完全消除其方面改进的效力；

● 以比单一疗法中低的剂量使用化疗药物的可能性；

● 与独立给药相比，有可能更耐受治疗，副作用较少；

● 治疗更广谱的肿瘤疾病的可能性；

● 实现更高的治疗响应率；

● 与当今标准疗法相比，更长的患者存活时间。

此外，本发明的化合物也可以与放射疗法和/或外科手术联合使用。

本发明还提供通常与一种或多种惰性、无毒、可药用辅助剂一起包含至少一种本发明化合物的药剂，及其用于上述目的的用途。

本发明的化合物可以全身和/或局部发挥作用。为此，它们可通过合适方式，例如肠道外、可能吸入或作为植入物或支架给药。

本发明的化合物可以以适合这些给药途径的给药形式给药。

肠道外给药可以绕开再吸收步骤（例如静脉内、动脉内、心脏内、脊柱内或腰内）或包括再吸收（例如肌肉内、皮下、皮内、经皮或腹膜内）。适合肠道外给药的给药形式包括溶液、混悬剂、乳剂或冻干产物形式的注射和输液制剂。优选的是肠道外给药，尤其是静脉给药。

通常已经发现，在肠道外给药的情况下有利的是给予大约0.001至1 mg/kg，优选大约0.01至0.5 mg/kg体重的量以实现有效结果。

然而，可能必须酌情偏离所示的量，尤其取决于体重、给药途径、个体对活性物质的响应、制剂性质和给药时间或时间间隔。因此，在一些情况下，少于上述最低量可能是足够的，而在另一些情况下，必须超过所提到的上限。在给予更大量的情况下，可能最好将它们在一天内分成几个单剂。

实施例

下列实施例例示本发明。本发明不限于这些实施例。

除非另行指明，下列试验和实施例中的百分比为重量百分比；份数为重量份。液体/液体溶液的溶剂比、稀释比和浓度在每种情况下基于体积。

合成途径：

对实施例示例，下列图式显示产生实施例的示例性合成途径：

图式1: 半胱氨酸连接的ADC的合成

图式2: 半胱氨酸连接的ADC的合成

图式3: 半胱氨酸连接的ADC的合成

图式4: 半胱氨酸连接的ADC的合成

图式5: 赖氨酸连接的ADC的合成

a) 三光气、THF、在氩气下

图式6: 赖氨酸连接的ADC的合成

图式7

[a): EDCI、HOBT、二异丙基乙基胺、RT；b) 乙醇、哌啶、甲胺、水、RT；c) HATU、二异丙基乙基胺、RT；d) TFA、DCM、RT]

图式8

[a): 例如EDCI、HOBT、二异丙基乙基胺、DMF、RT；b) 例如DCM/TFA 20:1、RT；c) 例如HATU、二异丙基乙基胺、DMF、RT；d) 例如TFA、DCM、RT]

图式9

[a): 例如2-溴-1-乙基吡啶鎓四氟硼酸盐、二异丙基乙基胺、DCM、RT；b) 例如2M LiOH溶液、THF、水、RT、区域异构体的HPLC分离；c) 例如EDCI、HOBT、二异丙基乙基胺、DMF、RT；d] 例如TFA、DCM、RT]

图式10

[a): 例如H₂、Pd-C、EtOH、RT；b) 例如对硝基苄基溴、K₂CO₃、DMF；c) 例如乙醇、40%的甲胺水溶液、50℃；d) 例如连二亚硫酸二钠、THF、水、50℃；e) 例如HATU、二异丙基乙基胺、DMF、RT；f) 例如哌啶、40%的甲胺水溶液、乙醇、50℃；g) 例如二异丙基乙基胺、DMF、RT；h) 例如哌啶、DMF、RT；i) TFA、DCM、RT]

图式11

[a): 例如Et₃N、DMF、RT；b) 例如H₂、Pd-C、EtOH/乙酸乙酯/THF(1:1:1)、RT；c) 例如4-甲基吗啉、DMF、RT；d) 例如HATU、HOAt、二异丙基乙基胺、DMF、RT；e] 例如TFA、RT]

图式12

[a): 例如NaBH(OAc)₃、HOAc、二氯甲烷、RT；b) 例如氯乙酰氯、NEt₃、DCM、RT；c) 例如Cs₂CO₃、DMF、50℃；d) 例如1-(2-氨基乙基)-1H-吡咯-2,5-二酮盐酸盐(1:1)、T3P^(R)、二异丙基乙基胺、MeCN、RT；e] 例如TFA、RT]

图式13

[a): 例如甲磺酰氯、NEt₃、二氯甲烷、0℃；b) 例如NaN₃、DMF、40℃；c) 例如H₂、Pd-C、EtOH/乙酸乙酯(1:1)、RT；d) 例如TBAF、THF、RT；e) 例如1-({[2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基]羰基}氧基)吡咯烷-2,5-二酮、NEt₃、CaCO₃、1,4-二氧杂环己烷、RT；f) 例如N-氯琥珀酰亚胺、TEMPO、四正丁基氯化铵、氯仿、0.05 N 碳酸钾/0.05 N碳酸氢钠溶液(1:1)；g) 例如NaBH(OAc)₃、HOAc、二氯甲烷、RT；h) 例如氯乙酰氯、NEt₃、DCM、RT；i) 例如TBAF、THF、水、RT；j) 例如4-甲基吗啉、DMF、RT；k) 例如TFA、RT]

图式14

[a): 例如甲醛、Na₂CO₃、水、RT；b) 例如Ac₂O、吡啶、THF、RT；c) 例如丙二酸二叔丁酯、KOtBu、THF、RT；d) 例如LiBH₄、THF、RT；e) 例如TBDMSCl、咪唑、DCM、RT；f] 例如戴斯马丁氧化剂、DCM；g) 例如三乙酰氧基硼氢化钠、AcOH、DCM、RT；h) 例如nBu₄NF、THF、RT；i) 例如SOCl₂、THF、RT；j) 例如AcSK、nBu₄NI、DMF、90℃；k) 例如NaOH、MeOH、THF、RT；l) 例如TCEP、二氧杂环己烷、RT；m) 例如差向异构体的分离；n) 例如6N盐酸、THF、RT o) 例如Mal-dPEG(3)-Mal、PBS缓冲液、ACN、RT]

图式15

[a): 例如Mal-dPEG(3)-Mal、PBS缓冲液、ACN、RT]

图式16

[a): 例如BF₃OEt₂、THF、0℃；b): 例如亚硝酸异戊酯、-10℃、0.5 h；c]: 例如2-氯-3-氧代丁酸甲酯、吡啶、水、-5℃；d): 例如NEt₃、甲苯、RT；e): 例如Et₃SiH、TFA、RT；f): 例如LiBH₄、THF、60℃；g): 例如戴斯马丁氧化剂、DCM、RT；h): 例如(R)-(+)-甲基-2-丙烷亚磺酰胺、异丙醇钛(IV)、THF、RT；i): 例如叔-BuLi、戊烷、THF、-78℃；j): 例如在二氧杂环己烷中的HCl、THF、MeOH、RT；k): 例如3-(1,3-二氧代-1,3-二氢-2H-异吲哚-2-基)丙醛、NaB(OAc)₃H、AcOH、DCM、RT；l): 例如乙酸2-氯-2-氧代乙酯、NEt₃、DCM、RT；m): 例如甲基胺、水、EtOH、50℃]

图式17

[a): 例如N-(叔丁氧基羰基)-5-氧代-L-正缬氨酸叔丁酯、NaB(OAc)₃H、AcOH、DCM、RT；b): 例如乙酸2-氯-2-氧代乙酯、NEt₃、DCM、RT；c): 例如甲胺、水、EtOH、60℃；d): 例如THF、DCM、50℃；e): 例如Boc₂O、NEt₃、DCM、RT；f): 例如三氟乙酸/1-(2-氨基乙基)-1H-吡咯-2,5-二酮(1:1)、HATU、二异丙基乙基胺、DMF、RT；f): 例如TFA、DCM、RT]

图式18: 半胱氨酸连接的ADC的合成

图式19: 半胱氨酸连接的ADC的合成

图式20: 半胱氨酸连接的ADC的合成

图式21: 半胱氨酸连接的ADC的合成

图式22

[a): 例如三乙酰氧基硼氢化钠、乙酸、DCM、RT；b) 例如乙酰氧基乙酰氯、NEt₃、DCM、RT；c) 例如LiOH、THF/水、RT；d) 例如H₂、Pd-C、EtOH、RT；e) 例如Teoc-OSu、NEt₃、二氧杂环己烷、RT；f] 例如Fmoc-Cl、二异丙基乙基胺、二氧杂环己烷/水2:1、RT]

图式23

[a): 例如三乙酰氧基硼氢化钠、乙酸、DCM、RT；b) 例如乙酰氧基乙酰氯、NEt₃、DCM、RT；c) 例如LiOH、甲醇、RT；d) 例如TFA、DCM、RT；e] 例如Boc₂O、二异丙基乙基胺、DCM、RT]

图式24

[a): 例如苄基溴、Cs₂CO₃、DMF、RT；b) 例如Pd(dppf)₂Cl₂、DMF、Na₂CO₃、85℃；c) 例如LiAlH₄、THF、0℃；MnO₂、DCM、RT；d) 例如Ti(iOPr)₄、THF、RT；e) 例如tBuLi、THF、-78℃；MeOH、NH₄Cl；f] 例如HCl/1,4-二氧杂环己烷]

图式25: 半胱氨酸连接的ADC的合成

图式26: 经水解琥珀酰胺合成半胱氨酸连接的ADC

这种方法特别用于其中L1 = CH₂的ADC以将这些ADC转化成开链连接形式。

图式27:

[a): 三乙酰氧基硼氢化钠、乙酸、DCM、RT；b) 乙酰氧基乙酰氯、二异丙基乙基胺、DCM、RT；c) LiOH、MeOH、RT；d) 三氟乙酸/1-(2-氨基乙基)-1H-吡咯-2,5-二酮(1:1) HATU、DMF、二异丙基乙基胺、RT；e] 氯化锌、三氟乙醇、50℃、EDTA.]

图式28:

[a): HATU、DMF、二异丙基乙基胺、RT；b) 氯化锌、三氟乙醇、50℃、EDTA.]

图式29:

[a): 三乙酰氧基硼氢化钠、乙酸、DCM、RT；b) 乙酰氧基乙酰氯、三乙胺、DCM、RT；c) LiOH、MeOH、RT；d) 三氟乙酸/1-(2-氨基乙基)-1H-吡咯-2,5-二酮(1:1) HATU、DMF、二异丙基乙基胺、RT；e] 氯化锌、三氟乙醇、50℃、EDTA.]

图式30:

[a): 2-溴-1-乙基吡啶鎓四氟硼酸盐(BEP)、DCM、吡啶、RT；b) 氯化锌、三氟乙醇、50℃、EDTA；c) 3-4当量的TCEP、PBS缓冲液；d) PBS缓冲液、20h RT.]

图式31:

[a): 2-溴-1-乙基吡啶鎓四氟硼酸盐(BEP)、DCM、吡啶、RT；b) 氯化锌、三氟乙醇、50℃、EDTA；c) 3-4当量的TCEP、PBS缓冲液；d) PBS缓冲液、20h RT.]。

A. 实施例

缩写和首字母缩略词:

A431NS 人肿瘤细胞系

A549 人肿瘤细胞系

ABCB1 ATP-结合盒亚家族B成员1（P-gp和MDR1的同义词）

abs. 纯

Ac 乙酰基

CAN 乙腈

aq. 含水，水溶液

ATP 三磷酸腺苷

BCRP 乳腺癌耐药蛋白，外排转运蛋白

BEP 2-溴-1-乙基吡啶鎓四氟硼酸盐

Boc 叔丁氧基羰基

br. 宽（在NMR中）

Bsp. 实施例

CI 化学电离（在MS中）

d 双重峰（在NMR中）

d 天

DC 薄层色谱法

DCI 直接化学电离（在MS中）

dd 双重双峰（在NMR中）

DMAP 4-N,N-二甲基氨基吡啶

DME 1,2-二甲氧基乙烷

DMEM Dulbecco’s Modified Eagle Medium（用于细胞培养的标准化营养培养基）

DMF N,N-二甲基甲酰胺

DMSO 二甲亚砜

DPBS, D-PBS, PBS Dulbecco's磷酸盐缓冲的盐溶液

　　　　　　　　PBS = DPBS = D-PBS, pH 7.4，来自Sigma, No D8537

　　　　　　　　组成：

　　　　　　　　0.2 g KCl

　　　　　　　　0.2 g KH₂PO₄ (无水)

　　　　　　　　8.0 g NaCl

　　　　　　　　1.15 g Na₂HPO₄ (无水)

　　　　　　　　用H₂O补充到1升

dt 双重三峰（在NMR中）

DTT DL-二硫苏糖醇

d. Th. 理论值的（在化学收率中）

EDC N'-(3-二甲基氨基丙基)-N-乙基碳二亚胺盐酸盐

EGFR 表皮生长因子受体

EI 电子碰撞电离（在MS中）

ELISA 酶联免疫吸附测定法

eq. 当量

ESI 电喷雾电离（在MS中）

ESI-MicroTofq ESI- MicroTofq (质谱仪名称Tof = 飞行时间和q = 四极)

FCS 胎牛血清

Fmoc (9H-芴-9-基甲氧基)羰基

ges. 饱和

GTP 5'-三磷酸鸟苷

h 小时

HATU O-(7-氮杂苯并三唑-1-基)-N,N,N',N'-四甲基脲鎓六氟磷酸盐

HCT-116 人肿瘤细胞系

HEPES 4-(2-羟乙基)哌嗪-1-乙烷磺酸

HOAc 乙酸

HOAt 1-羟基-7-氮杂苯并三唑

HOBt 水合1-羟基-1H-苯并三唑

HOSu N-羟基琥珀酰亚胺

HPLC 高压高效液相色谱法

HT29 人肿瘤细胞系

IC₅₀ 半最大抑制浓度

i.m. 肌肉内，给药到肌肉内

i.v. 静脉，给药到静脉内

konz. 浓缩

LC-MS 液相色谱法-质谱法联用

LLC-PK1 cells Lewis肺癌猪肾细胞系

L-MDR 人MDR1转染LLC-PK1细胞

m 多重峰（在NMR中）

MDR1 多药耐药蛋白1

MeCN 乙腈

min 分钟

MS 质谱法

MTT 溴化3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯基-2H-四唑鎓

NCI-H292 人肿瘤细胞系

NCI-H520 人肿瘤细胞系

NMM N-甲基吗啉

NMP N-甲基-2-吡咯烷酮

NMR 核磁共振谱法

NMRI 小鼠品系，源自Naval Medical Research Institute (NMRI)

Nude Mäuse 裸小鼠（受试动物）

NSCLC 非小细胞肺癌

PBS 磷酸盐缓冲的盐溶液

Pd/C 活性炭载钯

P-gp P-糖蛋白，转运蛋白

PNGaseF 用于裂解糖的酶

quant. 定量（收率）

quart 四重峰（在NMR中）

quint 五重峰（在NMR中）

R_f 保留指数（在DC中）

RT 室温

R_t 停留时间（在HPLC中）

s 单重峰（在NMR中）

s.c. 皮下，在皮肤下给药

SCC-4 人肿瘤细胞系

SCC-9 人肿瘤细胞系

SCID Mäuse 具有重症联合免疫缺陷的受试小鼠

t 三重峰（在NMR中）

TBAF 四正丁基氟化铵

TEMPO (2,2,6,6-四甲基哌啶-1-基)氧基

tert. 叔

TFA 三氟乙酸

THF 四氢呋喃

T3P^® 2,4,6-三丙基-1,3,5,2,4,6-三氧杂三磷杂环己烷2,4,6-三氧化物

UV 紫外光谱法

v/v （溶液的）体积比

Z 苄氧基羰基。

如果在本公开中在反应的描述中没有给出温度，始终应该采用室温。

HPLC和LC-MS方法:

方法1 (LC-MS):

仪器: Waters ACQUITY SQD UPLC系统；柱: Waters Acquity UPLC HSS T3 1.8 µ 50 x 1 mm；洗脱剂A: 1升水 + 0.25毫升99%的甲酸；洗脱剂B: 1升乙腈 + 0.25毫升99%的甲酸；梯度: 0.0 min 90% A → 1.2 min 5% A → 2.0 min 5% A 炉: 50℃；流速: 0.40 ml/min；UV检测: 208 – 400 nm。

方法2 (LC-MS):

MS仪器类型: Waters Synapt G2S；UPLC仪器类型: Waters Acquity I-CLASS；柱: Waters, BEH300, 2.1 x 150 mm, C18 1.7 µm；洗脱剂A: 1升水 + 0.01%甲酸；洗脱剂B: 1升乙腈 + 0.01%甲酸；梯度: 0.0 min 2% B → 1.5 min 2% B → 8.5 min 95% B → 10.0 min 95% B；炉: 50℃；流速: 0.50 ml/min；UV检测: 220 nm。

方法3 (LC-MS):

MS仪器: Waters (Micromass) QM；HPLC仪器: Agilent 1100系列；柱: Agilent ZORBAX Extend-C18 3.0 x 50 mm 3.5 micron；洗脱剂A: 1升水 + 0.01摩尔碳酸铵, 洗脱剂B: 1升乙腈；梯度: 0.0 min 98% A → 0.2min 98% A → 3.0 min 5% A→ 4.5 min 5% A ；炉: 40℃；流速: 1.75 ml/min；UV检测: 210 nm。

方法4 (LC-MS):

MS仪器类型: Waters Synapt G2S；UPLC仪器类型: Waters Acquity I-CLASS；柱: Waters, HSST3, 2.1 x 50 mm, C18 1.8 µm；洗脱剂A: 1升水 + 0.01%甲酸；洗脱剂B: 1升乙腈 + 0.01%甲酸；梯度: 0.0 min 10% B → 0.3 min 10% B → 1.7 min 95% B → 2.5 min 95% B；炉: 50℃；流速: 1.20 ml/min；UV检测: 210 nm。

方法5 (LC-MS):

仪器: Waters ACQUITY SQD UPLC系统；柱: Waters Acquity UPLC HSS T3 1.8 µ 50 x 1 mm；洗脱剂A: 1升水 + 0.25毫升99%的甲酸；洗脱剂B: 1升乙腈 + 0.25毫升99%的甲酸；梯度: 0.0 min 95% A → 6.0 min 5% A → 7.5 min 5% A 炉: 50℃；流速: 0.35 ml/min；UV检测: 210 – 400 nm。

方法6 (LC-MS):

仪器: Micromass Quattro Premier with Waters UPLC Acquity；柱: Thermo Hypersil GOLD 1.9 µ 50 x 1 mm；洗脱剂A: 1升水 + 0.5毫升50%的甲酸；洗脱剂B: 1升乙腈 + 0.5毫升50%的甲酸；梯度: 0.0 min 97% A → 0.5 min 97% A → 3.2 min 5% A → 4.0 min 5% A；炉: 50℃；流速: 0.3 ml/min；UV检测: 210 nm。

方法7 (LC-MS):

仪器: Agilent MS Quad 6150；HPLC: Agilent 1290；柱: Waters Acquity UPLC HSS T3 1.8 µ 50 x 2.1 mm；洗脱剂A: 1升水 + 0.25毫升99%的甲酸；洗脱剂B: 1升乙腈 + 0.25毫升99%的甲酸；梯度: 0.0 min 90% A → 0.3 min 90% A → 1.7 min 5% A → 3.0 min 5% A；炉: 50℃；流速: 1.20 ml/min；UV检测: 205 – 305 nm。

方法8 (LC-MS):

MS仪器类型: Waters Synapt G2S；UPLC仪器类型: Waters Acquity I-CLASS；柱: Waters, HSST3, 2.1 x 50 mm、C18 1.8 µm；洗脱剂A: 1升水 + 0.01%甲酸；洗脱剂B: 1升乙腈 + 0.01%甲酸；梯度: 0.0 min 2% B → 2.0 min 2% B → 13.0 min 90% B → 15.0 min 90% B；炉: 50℃；流速: 1.20 ml/min；UV检测: 210 nm。

方法9: 用于实施例181-191的LC-MS-Prep提纯方法（方法LIND-LC-MS-Prep）

MS仪器: Waters；HPLC仪器: Waters（柱Waters X-Bridge C18, 19 mm x 50 mm, 5 µm, 洗脱剂A: 水 + 0.05%氨, 洗脱剂B: 具有梯度的乙腈（ULC）；流速: 40 ml/min；UV检测: DAD；210 – 400 nm）。

或:

MS仪器: Waters；HPLC仪器: Waters（柱Phenomenex Luna 5µ C18(2) 100A, AXIA Tech. 50 x 21.2 mm, 洗脱剂A: 水 + 0.05%甲酸, 洗脱剂B: 具有梯度的乙腈（ULC）；流速: 40 ml/min；UV检测: DAD；210 – 400 nm）。

方法10: 用于实施例181-191的LC-MS分析方法（LIND_SQD_SB_AQ）

MS仪器: Waters SQD；HPLC仪器: Waters UPLC；柱: Zorbax SB-Aq (Agilent), 50 mm x 2.1 mm, 1.8 µm；洗脱剂A: 水 + 0.025%甲酸, 洗脱剂B: 乙腈（ULC） + 0.025%甲酸；梯度: 0.0 min 98%A - 0.9 min 25%A – 1.0 min 5%A - 1.4 min 5%A – 1.41 min 98%A – 1.5 min 98%A；炉: 40℃；流速: 0.600 ml/min；UV检测: DAD；210 nm。

方法11 (HPLC):

仪器: HP1100系列

柱:Merck Chromolith SpeedROD RP-18e, 50-4.6 mm、目录号1.51450.0001, 前置柱Chromolith Guard Cartridge Kit, RP-18e, 5-4.6mm, 目录号 1.51470.0001

梯度:流速5 ml/min

注射体积5 µl

溶剂A:在水中的HClO₄（70%）（4 ml/l）

溶剂B: 乙腈

起点 20% B

0.50 min 20% B

3.00 min 90% B

3.50 min 90% B

3.51 min 20% B

4.00 min 20% B

柱温度: 40℃

波长: 210 nm。

下文没有明确描述其制备的所有反应物或试剂购自一般可得的来源。对于其制备同样没有描述在下文中并且不可购得或获自一般不可得的来源的所有其它反应物或试剂，参考描述了其制备的出版文献。

原材料和中间体:

中间体C1

三氟乙酸-(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙-1-胺(1:1)

如WO2006/002326中所述制备标题化合物。

中间体C2

(2S)-4-({(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}氨基)-2-[(叔丁氧基羰基)氨基]丁酸叔丁酯

将4.22克（14.5毫摩尔）N-(叔丁氧基羰基)-L-高丝氨酸叔丁酯溶解在180毫升二氯甲烷中，然后加入3.5毫升吡啶和9.2克（21.7毫摩尔）1,1,1-三乙酰氧基-1λ⁵,2-苯碘酰-3(1H)-酮。将该配制品在室温下搅拌1小时，然后用500毫升二氯甲烷稀释并用10%的硫代硫酸钠溶液萃取两次，然后相继用5%的柠檬酸萃取两次和用10%的碳酸氢钠溶液萃取两次。分离出有机相，经硫酸镁干燥，然后在真空下浓缩。将残留物置于DMC中，并加入二乙醚和正戊烷的混合物。滤出沉淀物，然后浓缩滤液并从乙腈/水中冻干。这产生3.7克（93%）(2S)-2-[(叔丁氧基羰基)氨基]-4-氧代丁酸叔丁酯，其不经进一步提纯即用于下一步骤。（R_f值: 0.5 (DCM/甲醇95/5)）。

将3.5克（9.85毫摩尔）中间体C1溶解在160毫升DCM中，并加入3.13克（14.77毫摩尔）三乙酰氧基硼氢化钠和0.7毫升乙酸。在室温下搅拌5分钟后，加入3.23克（11.85毫摩尔）(2S)-2-[(叔丁氧基羰基)氨基]-4-氧代丁酸叔丁酯并将该配制品在室温下搅拌另外30分钟。然后在真空下蒸发溶剂并将残留物置于乙腈/水中。滤出沉淀的固体并干燥，以产生5.46克（84%）标题化合物。

HPLC (方法11): R_t = 2.5 min；

LC-MS (方法1): R_t = 1.13 min；MS (ESIpos): m/z = 613 (M+H)⁺。

中间体C3

(2S)-4-[(乙酰氧基乙酰基){(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}氨基]-2-[(叔丁氧基羰基)氨基]丁酸

将5.46克（8.24毫摩尔）中间体C2溶解在160毫升DCM中，然后加入4.8毫升三乙胺和2.2毫升（20.6毫摩尔）乙酰氧基乙酰氯。将该配制品在室温下搅拌整夜，然后在真空下浓缩。将残留物置于乙酸乙酯中并用饱和碳酸氢钠溶液萃取三次，然后用饱和氯化钠溶液萃取。有机相经硫酸钠干燥，然后浓缩。残留物通过在Biotage/Isolera (SNAP 340g)上使用洗脱剂环己烷/乙酸乙酯2:1的柱色谱法提纯。这产生4.57克（75%）酰化中间体。

LC-MS (方法1): R_t = 1.49 min；MS (ESIpos): m/z = 713 (M+H)⁺。

将1克（1.36毫摩尔）这种中间体溶解在20毫升DCM中，并加入20毫升TFA。在室温下搅拌5小时后浓缩，残留物用正戊烷搅拌两次。在每种情况下，滗析出正戊烷，残留固体在高真空下干燥。这产生1.1克(2S)-4-[(乙酰氧基乙酰基){(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}氨基]-2-氨基丁酸/三氟乙酸(1:1)。LC-MS (方法1): R_t = 0.93 min；MS (ESIpos): m/z = 557 (M+H)⁺。

将0.91克（1.57毫摩尔）这种中间体溶解在70毫升DCM中，并加入3.43克（15.7毫摩尔）二碳酸二叔丁酯和4.1毫升N,N-二异丙基乙基胺。在室温下搅拌30分钟后，该配制品用DCM稀释并用5%的柠檬酸萃取。有机相经硫酸钠干燥并浓缩。残留物用正戊烷搅拌两次并在每种情况下滗析出正戊烷。残留固体从乙腈/水1:1中冻干，以产生1.11克标题化合物。

HPLC (方法11): R_t = 2.55 min；

LC-MS (方法1): R_t = 1.3 min；MS (ESIpos): m/z = 657 (M+H)⁺。

中间体C4

(2S)-2-氨基-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰)氨基]丁酸/三氟乙酸(1:1)

将5.46克（8.24毫摩尔）中间体C2溶解在160毫升DCM中，并加入4.8毫升三乙胺和2.2毫升（20.6毫摩尔）乙酰氧基乙酰氯。将该配制品在室温下搅拌整夜，然后在真空下浓缩。将残留物置于乙酸乙酯中并用饱和碳酸氢钠溶液萃取三次，然后用饱和氯化钠溶液萃取。有机相经硫酸钠干燥，然后浓缩。残留物通过在Biotage/Isolera (SNAP 340g)上使用洗脱剂环己烷/乙酸乙酯2:1的柱色谱法提纯。这产生4.57克（75%）酰化中间体。

LC-MS (方法1): R_t = 1.49 min；MS (ESIpos): m/z = 713 (M+H)⁺。

将1.5克（2.035毫摩尔）这种中间体置于50毫升乙醇中，并加入5.8毫升40%的甲胺水溶液。将该配制品在50℃下搅拌4小时，然后浓缩。将残留物置于DCM中并用水洗涤两次。有机相经硫酸镁干燥，然后浓缩。该残留物在高真空下干燥。这产生1.235毫克这种中间体，其不经进一步提纯即进一步反应。

将1.235毫克（1.5毫摩尔）这种中间体溶解在15毫升DCM中，并加入15毫升TFA。在室温下搅拌4小时后浓缩。残留物通过制备型HPLC提纯。浓缩适当馏分，残留物从乙腈中冻干。这产生1.04克（定量）标题化合物。

HPLC (方法11): R_t = 1.9 min；

LC-MS (方法1): R_t = 0.89 min；MS (ESIpos): m/z = 515 (M+H)⁺。

中间体C5

(2S)-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰)氨基]-2-[(叔丁氧基羰基)氨基]丁酸

将0.9克（1.24毫摩尔）中间体C4溶解在60毫升DCM中，并加入2.7克（12.5毫摩尔）二碳酸二叔丁酯和3.3毫升N,N-二异丙基乙基胺。在室温下搅拌45分钟后，浓缩该配制品并将残留物置于二乙醚中，加入正戊烷直至开始变浑浊。将该配制品冷却至0℃，然后滗析。再次将正戊烷添加到残留物中并滗析。残留固体从乙腈/水1:1中冻干，以产生0.95克（定量）标题化合物。

HPLC (方法11): R_t = 2.5 min；

LC-MS (方法1): R_t = 1.27 min；MS (ESIpos): m/z = 615 (M+H)⁺。

中间体C6

三氟乙酸/{(2S)-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰)氨基]-1-肼基-1-氧代丁-2-基}氨基甲酸叔丁酯(1:1)

将150毫克（0.16毫摩尔）中间体C3溶解在21毫升DMF中，然后加入37.2毫克（0.19毫摩尔）N-(3-二甲基氨基丙基)-N'-乙基碳二亚胺盐酸盐（EDC）、37毫克（0.243毫摩尔）1-羟基苯并三唑、85微升N,N-二异丙基乙基胺和最后45毫克（0.18毫摩尔）市售肼甲酸9H-芴-9-基甲酯。将该配制品在室温下搅拌整夜，然后在真空下浓缩。残留物通过制备型HPLC提纯。浓缩适当馏分，残留物从乙腈/水中冻干。这产生60毫克（理论值的41%）受保护的中间体。

HPLC (方法11): R_t = 2.9 min；

LC-MS (方法1): R_t = 1.47 min；MS (ESIpos): m/z = 893 (M+H)⁺。

将60毫克（0.067毫摩尔）这种中间体溶解在19毫升乙醇中，并加入681微升哌啶和386微升40%的甲胺水溶液。将该配制品在50℃下搅拌18小时，然后浓缩。将残留物置于乙腈/水2:1中并用TFA调节至pH 2。然后重新浓缩，残留物通过制备型HPLC提纯。浓缩适当馏分，残留物从乙腈/水中冻干。这产生25毫克（理论值的51%）标题化合物。

HPLC (方法11): R_t = 2.2 min；

LC-MS (方法1): R_t = 1.27 min；MS (ESIpos): m/z = 629 (M+H)⁺。

中间体C7

1-{(2S)-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰)氨基]-2-[(叔丁氧基羰基)氨基]丁酰基}肼基)乙酸/三氟乙酸(1:1)

将0.2克（0.305毫摩尔）中间体C3溶解在80毫升DCM中，加入0.125克（0.46毫摩尔）2-溴-1-乙基吡啶鎓四氟硼酸盐（BEP）、94毫克（0.61毫摩尔）市售肼基乙酸乙酯盐酸盐和159微升N,N-二异丙基乙基胺，然后将该混合物在室温下搅拌1小时。然后将乙酸乙酯和水添加到反应混合物中，并分离相。有机相用饱和氯化钠溶液萃取，然后经硫酸镁干燥，过滤并浓缩。残留物在真空下干燥并且不经提纯即进一步反应。为此，将其置于20毫升四氢呋喃中，并加入10毫升水和3.2毫升2N氢氧化锂溶液。将该配制品在室温下搅拌1小时，然后使用TFA调节至pH 7。然后浓缩该配制品，残留物通过制备型HPLC提纯。由此将标题化合物与其更早洗脱的区域异构体分离。相应馏分的合并、冻干和干燥后产生19.7克（经2步骤，理论值的8%）无色泡沫形式的标题化合物。

HPLC (方法11): R_t = 2.4 min；

LC-MS (方法1): R_t = 1.22 min；MS (ESIpos): m/z = 687 (M+H)⁺。

在分离在受保护的中间体阶段的区域异构体后，在单独实验中通过NMR谱法进行区域异构体的结构赋值。标题化合物的受保护的中间体(1-{(2S)-4-[(乙酰氧基乙酰基) {(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}氨基]-2-[(叔丁氧基羰基) 氨基]丁酰基}肼基)乙酸乙酯具有下列1H NMR谱：

¹H NMR (500 MHz, DMSO-d₆): d = 7.8 (m, 2H), 7.4-7.2 (m, 6H), 7.08 (m, 1H), 6.73 (d, 1H), 5.6 (s, 1H), 5.25和4,89 (2d, 2H), 4.89和4.77 (2d, 2H), 4.62 (t, 1H), 4.32和3.78 (2d, 2H), 4.1 (t, 2H), 3.62-3.47 (m), 2.13 (s, 3H), 1.41和0.72 (2m, 2H), 1.3 (s, 9H), 1.18 (t, 3H), 0.92 (s, 9H)。

中间体C8

N-{(2S)-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰)氨基]-2-[(叔丁氧基羰基)氨基]丁酰基}-β-丙氨酸

将293毫克（0.41毫摩尔）中间体C3溶解在25毫升DMF中，然后加入144毫克（0.75毫摩尔）N-(3-二甲基氨基丙基)-N'-乙基碳二亚胺盐酸盐（EDC）、128毫克（0.83毫摩尔）1-羟基苯并三唑、218微升N,N-二异丙基乙基胺和最后70毫克（0.5毫摩尔）市售氯化3-甲氧基-3-氧代丙-1-铵。将该配制品在室温下搅拌4小时，然后在真空下浓缩。残留物通过制备型HPLC提纯。浓缩适当馏分，残留物在高真空下干燥。这产生177毫克（理论值的53%）受保护的中间体。

HPLC (方法11): R_t = 2.6 min；

LC-MS (方法1): R_t = 1.33 min；MS (ESIpos): m/z = 742 (M+H)⁺。

将177毫克（0.22毫摩尔）这种中间体置于20毫升甲醇中，并加入2.8毫升2N氢氧化锂溶液。将该配制品在室温下搅拌18小时。然后浓缩，将残留物置于水中并使用5%的柠檬酸将该溶液调节至pH 5。然后用DCM萃取两次，有机相经硫酸镁干燥并浓缩。残留物最后从乙腈/水中冻干，以产生133毫克（理论值的81%）标题化合物。

HPLC (方法11): R_t = 2.3 min；

LC-MS (方法3): R_t = 7.4 min；MS (ESIpos): m/z = 686 (M+H)⁺。

中间体C9

(6S)-6-{2-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰)氨基]乙基}-2,2-二甲基-4,7-二氧代-3,11,14,17-四氧杂-5,8-二氮杂二十烷-20-酸

在第一步骤中，在15毫升DMF中在44毫克（0.228毫摩尔）1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐、35毫克（0.228毫摩尔）水合1-羟基-1H-苯并三唑和60微升N,N-二异丙基乙基胺存在下使70毫克（0.114毫摩尔）中间体C5与32毫克（0.114毫摩尔）3-{2-[2-(2-氨基乙氧基)乙氧基]乙氧基}丙酸叔丁酯偶联。

将该配制品在室温下搅拌整夜，该产物通过制备型HPLC提纯。分离出33毫克（理论值的33%）受保护的中间体。这与1.1毫升三氟乙酸一起在11毫升二氯甲烷中搅拌1小时，以在后处理后产生26毫克（98%）完全脱保护的化合物。

最后，将该中间体置于2毫升DCM中并通过在室温下在3天搅拌下加入在每种情况下10毫克二碳酸二叔丁酯和79微升N,N-二异丙基乙基胺两次而引入叔丁氧基羰基保护基。产物通过制备型HPLC提纯后产生16.4毫克（理论值的66%）标题化合物。

HPLC (方法11): R_t = 2.3 min；

LC-MS (方法1): R_t = 1.22 min；MS (ESIpos): m/z = 818 (M+H)⁺。

中间体C10

{3-[{(1R)-1-[1-(3-氨基苄基)-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰)氨基]丙基}氨基甲酸叔丁酯

由中间体C1经6个步骤制备标题化合物：在第一步骤中，将1克（2.77毫摩尔）中间体C1和0.864克（5毫摩尔）(3-氧代丙基)氨基甲酸叔丁酯合并在100毫升甲醇中，并加入400毫升乙酸和1.288克（13.9毫摩尔）硼烷-吡啶络合物。将该配制品在室温下搅拌3天。然后在真空下浓缩，残留物通过在硅胶上的快速色谱法提纯（洗脱剂: 二氯甲烷/乙酸乙酯9:1 -> 二氯甲烷/甲醇95:5）。适当馏分的浓缩和在高真空下的干燥后产生1.255克（理论值的80%）N-烷基化中间体。

LC-MS (方法1): R_t = 1.0 min；MS (ESIpos): m/z = 513 (M+H)⁺。

将1.255克（2.2毫摩尔）这种中间体溶解在50毫升DCM中，然后加入1.2毫升三乙胺和0.52毫升（4.85毫摩尔）乙酰氧基乙酰氯。将该配制品在室温下搅拌整夜，然后在真空下浓缩。将残留物置于乙酸乙酯并用饱和碳酸氢钠溶液萃取三次，然后用饱和氯化钠溶液萃取。有机相经硫酸钠干燥，然后浓缩。残留物通过制备型HPLC提纯。

这产生593毫克（理论值的41%）酰化中间体。

LC-MS (方法1): R_t = 1.4 min；MS (ESIpos): m/z = 613 (M+H)⁺。

将993毫克（0.91毫摩尔）这种中间体溶解在100毫升乙醇中并在加入60毫克10%钯-活性炭后，在标准氢气压下在室温下氢化3小时。然后滤出催化剂并在真空下除去溶剂。这产生494毫克（理论值的91%）几乎无色油形式的脱苄基的咪唑衍生物。LC-MS (方法1): R_t = 1.17 min；MS (ESIpos): m/z = 523 (M+H)⁺。

将150毫克（0.25毫摩尔）这种中间体最初装载在15毫升DMF中，并加入69.2毫克（0.5毫摩尔）碳酸钾。在室温下搅拌15分钟后，加入60毫克（0.28毫摩尔）对硝基苄基溴并搅拌整夜。然后在真空下除去溶剂，将残留物置于乙酸乙酯中并用饱和碳酸氢钠溶液萃取。有机相用饱和氯化钠溶液洗涤，在旋转蒸发器上浓缩并通过制备型HPLC提纯。在旋转蒸发器上浓缩适当馏分，残留物从1,4-二氧杂环己烷中冻干。这产生169毫克（定量）中间体。

LC-MS (方法1): R_t = 1.39 min；MS (ESIpos): m/z = 658 (M+H)⁺。

将165毫克（0.251毫摩尔）这种中间体置于30毫升乙醇中，并加入0.35毫升40%的甲胺水溶液。将该配制品在50℃下搅拌5小时，然后再加入相同量的甲胺溶液。在搅拌另外10小时后，该配制品在真空下浓缩。用二乙醚再蒸馏两次，残留物然后从乙腈/水中冻干。这产生148毫克（89%）这种中间体。

LC-MS (方法6): R_t = 2.97 min；MS (ESIpos): m/z = 616 (M+H)⁺。

将98毫克（0.15毫摩尔）该前体溶解在15毫升THF中，然后在室温下加入569毫克（3.27毫摩尔）连二亚硫酸二钠在6毫升水中的溶液。在50℃下搅拌8小时后，再加入溶解在1毫升H₂O中的相同量的连二亚硫酸盐。在50℃下搅拌另外16小时后，将该配制品冷却至RT并用乙酸乙酯萃取。浓缩有机相，残留物通过制备型HPLC提纯。残留物从1,4-二氧杂环己烷中冻干后产生44.5毫克（理论值的47%）标题化合物。

LC-MS (方法1): R_t = 1.24 min；MS (ESIpos): m/z = 586 (M+H)⁺。

中间体C11

R/S-(11-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2,2-二甲基-6,12-二氧代-5-氧杂-7,11-二氮杂-2-硅杂十三烷-13-基)-高半胱氨酸/三氟乙酸盐(1:1)

将990.0毫克（2.79毫摩尔）(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙-1-胺最初装载在15.0毫升二氯甲烷中，加入828.8毫克（3.91毫摩尔）三乙酰氧基硼氢化钠和129.9毫克（3.21毫摩尔）乙酸，并在室温下搅拌5分钟。加入溶解在15.0毫升二氯甲烷中的698.1毫克（3.21毫摩尔）(3-氧代丙基)氨基甲酸2-(三甲基甲硅烷基)乙酯（中间体L58），并将反应混合物在室温下搅拌整夜。该反应混合物用乙酸乙酯稀释，有机相用饱和碳酸钠溶液和饱和NaCl溶液各洗涤两次。有机相经硫酸镁干燥并在真空下蒸发溶剂。残留物使用硅胶提纯（洗脱剂: 二氯甲烷/甲醇100:2）。在真空下蒸发溶剂，残留物在高真空下干燥。这产生1.25克（理论值的73%）化合物[3-({(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}氨基)丙基]氨基甲酸2-(三甲基甲硅烷基)乙酯。

LC-MS (方法1): R_t = 1.09 min；MS (ESIpos): m/z = 556 (M+H)⁺。

将151.4毫克（1.5毫摩尔）三乙胺和161.6毫克（1.43毫摩尔）氯乙酰氯添加到400.0毫克（0.65毫摩尔）[3-({(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}氨基)丙基]氨基甲酸2-(三甲基甲硅烷基)乙酯中。将反应混合物在室温下搅拌整夜。将乙酸乙酯添加到反应混合物中，有机相用水洗涤三次并用饱和NaCl溶液洗涤一次。经硫酸镁干燥并在真空下蒸发溶剂。残留物使用硅胶提纯（洗脱剂: 环己烷/乙酸乙酯3:1）。在真空下蒸发溶剂，残留物在高真空下干燥。这产生254.4毫克（理论值的57%）化合物{3-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(氯乙酰基)氨基]丙基}氨基甲酸2-(三甲基甲硅烷基)乙酯。

LC-MS (方法1): R_t = 1.49 min；MS (ESIneg): m/z = 676 (M+HCOO^-)^-。

将117.4毫克（0.19毫摩尔）{3-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(氯乙酰基)氨基]丙基}氨基甲酸2-(三甲基甲硅烷基)乙酯溶解在10.0毫升异丙醇中，并加入928.4微升1M NaOH和50.2毫克（0.37毫摩尔）DL-高半胱氨酸。将反应混合物在50℃下搅拌4.5小时。将乙酸乙酯添加到反应混合物中，有机相用饱和碳酸氢钠溶液和饱和NaCl溶液洗涤。有机相经硫酸镁干燥并在真空下蒸发溶剂。残留物通过制备型RP-HPLC提纯（柱: Reprosil 250x40；10µ, 流速: 50 ml/min, MeCN/水, 0.1% TFA）。在真空下蒸发溶剂，残留物在高真空下干燥。这产生75.3毫克（理论值的48%）标题化合物。

LC-MS (方法1): R_t = 1.24 min；MS (ESIpos): m/z = 731 (M+H)⁺.

¹H NMR (400 MHz, DMSO-d₆): δ [ppm] = 0.03 (s, 9H), 0.40 (m, 1H), 0.75-0.91 (m, 11H), 1.30 (m, 1H), 1.99-2.23 (m, 2H), 2.63-2.88 (m, 4H), 3.18-3.61 (m, 5H), 3.79-4.10 (m, 3H), 4.89 (d, 1H), 4.89 (d, 1H), 5.16 (d, 1H), 5.56 (s, 1H), 6.82 (m, 1H), 6.91 (s, 1H), 6.97 (m, 1H), 7.13-7.38 (m, 6H), 7.49 (s, 1H), 7.63 (m, 1H), 8.26 (s, 3H)。

中间体C12

R/S-[(8S)-11-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-8-羧基-2,2-二甲基-6,12-二氧代-5-氧杂-7,11-二氮杂-2-硅杂十三烷-13-基]高半胱氨酸

与中间体C11的合成类似地使用(2S)-4-氧代-2-({[2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基]羰基}氨基)丁酸甲酯（中间体L57）和中间体C52作为原材料进行合成。

LC-MS (方法1): R_t = 1.18 min；MS (ESIpos): m/z = 775 (M+H)⁺。

中间体C13

9-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2,2-二甲基-4,10-二氧代-3-氧杂-12-硫杂-5,9-二氮杂十八烷-18-酸

将90.0毫克（0.15毫摩尔）中间体C16和43.6毫克（0.23毫摩尔）6-(乙酰基硫烷基)己酸溶解在9.0毫升甲醇中，并加入一滴水和73.9毫克（0.54毫摩尔）碳酸钾。将反应混合物在50℃下搅拌4小时，然后用乙酸乙酯稀释。有机相用水/饱和NaCl溶液和饱和NaCl溶液洗涤，随后经硫酸镁干燥。在真空下蒸发溶剂，残留物在硅胶上色谱分离（洗脱剂: 二氯甲烷/甲醇 = 100:2）。在真空下蒸发溶剂，残留物在高真空下干燥。这以理论值的83%产生标题化合物。

LC-MS (方法1): R_t = 1.44 min；MS (ESIpos): m/z = 701 (M+H)⁺。

中间体C14

R/S-[2-({(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}{3-[(叔丁氧基羰基)氨基]丙基}氨基)-2-氧代乙基]高半胱氨酸

将100.0毫克（0.17毫摩尔）{3-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}(氯乙酰基)氨基]丙基}氨基甲酸叔丁酯（中间体C16）最初装载在4.0毫升异丙醇中，并加入276.5毫克（0.85毫摩尔）1 M NaOH溶液和45.9毫克（0.34毫摩尔）D/L-高半胱氨酸。将反应混合物在50℃下搅拌1小时。该反应混合物用乙酸乙酯稀释。有机相用饱和碳酸氢钠溶液和饱和NaCl溶液洗涤。经硫酸镁干燥，并在真空下蒸发溶剂。残留物通过制备型RP-HPLC提纯（柱: Reprosil 250x40；10µ, 流速: 50 ml/min, MeCN/水）。在真空下蒸发溶剂，残留物在高真空下干燥。

这产生92.6毫克（理论值的66%）标题化合物。

LC-MS (方法1): R_t = 1.07 min；MS (ESIpos): m/z = 688 (M+H)⁺。

中间体C15

[3-({(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}氨基)丙基]氨基甲酸叔丁酯

将750.0毫克（2.11毫摩尔）N-(3-氨基丙基)-N-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2-羟基乙酰胺（中间体C1）溶解在15.0毫升二氯甲烷中，加入626.0毫克（2.95毫摩尔）三乙酰氧基硼氢化钠和139微升（2.43毫摩尔）HOAc，并在室温下搅拌5分钟。然后加入420.3毫克（2.43毫摩尔）(3-氧代丙基)氨基甲酸叔丁酯（根据文献程序合成J.Med.Chem. 2003, 46, 3536），并在室温下搅拌整夜。向该反应混合物加入乙酸乙酯，用饱和碳酸钠溶液萃取两次。有机相用饱和NaCl溶液洗涤并经硫酸镁干燥。在真空下蒸发溶剂，残留物在硅胶上色谱分离（洗脱剂: 环己烷/乙酸乙酯 = 4:1）。在真空下蒸发溶剂，残留物在高真空下干燥。这产生881.0毫克（理论值的82%）标题化合物。

LC-MS (方法1): R_t = 1.07 min；MS (ESIpos): m/z = 513 [M+H]⁺。

中间体C16

{3-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}(氯乙酰基)氨基]丙基}氨基甲酸叔丁酯

将373.4毫克（0.73毫摩尔）[3-({(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}氨基)丙基]氨基甲酸叔丁酯）中间体C15)最初装载在5.0毫升二氯甲烷中，并加入169.5毫克（1.68毫摩尔）三乙胺和181.0毫克（1.60毫摩尔）氯乙酰氯。将反应混合物在室温下搅拌整夜，然后加入乙酸乙酯并用水反复萃取。有机相用饱和NaCl溶液洗涤并经硫酸镁干燥。在真空下蒸发溶剂，残留物在硅胶上色谱分离（洗脱剂: 二氯甲烷/甲醇 = 100:0.5）。在真空下蒸发溶剂，残留物在高真空下干燥。这产生336.0毫克（理论值的75%）标题化合物。

LC-MS (方法1): R_t = 1.48 min；MS (ESIpos): m/z = 589 [M+H]⁺。

中间体C17

9-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2,2-二甲基-4,10-二氧代-3,15,18,21,24-五氧杂-12-硫杂-5,9-二氮杂二十七烷-27-酸

将50.0毫克（0.09毫摩尔）{3-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}(氯乙酰基)氨基]丙基}氨基甲酸叔丁酯（中间体C16）最初装载在2.0毫升DMF中，并加入69.1毫克（0.21毫摩尔）碳酸铯和28.8毫克（0.10毫摩尔）1-硫烷基-3,6,9,12-四氧杂十五烷-15-酸。在50℃下搅拌整夜。向反应混合物加入水且直接通过制备型RP-HPLC提纯（柱: Reprosil 250x30；10µ, 流速: 50 ml/min, MeCN/水）。在真空下蒸发溶剂，残留物在高真空下干燥。这产生25.1毫克（理论值的35%）标题化合物。

LC-MS (方法1): R_t = 1.42 min；MS (ESIpos): m/z = 835 [M+H]⁺。

中间体C18

[22-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}-1-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-4,21-二氧代-7,10,13,16-四氧杂-19-硫杂-3,22-二氮杂二十五烷-25-基]氨基甲酸叔丁酯

将21.0毫克（0.03毫摩尔）9-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2,2-二甲基-4,10-二氧代-3,15,18,21,24-五氧杂-12-硫杂-5,9-二氮杂二十七烷-27-酸（中间体C17）和5.8毫克（0.0.3毫摩尔）1-(2-氨基乙基)-1H-吡咯-2,5-二酮盐酸盐(1:1)最初装载在1.0毫升乙腈中，并加入26.1毫克（0.20毫摩尔）N,N-二异丙基乙基胺和20.9毫克（0.03毫摩尔）T3P（50%在乙酸乙酯中）。在室温下搅拌整夜。该反应混合物直接通过制备型RP-HPLC提纯（柱: Reprosil 250x30；10µ, 流速: 50 ml/min, MeCN/水）。在真空下蒸发溶剂，残留物在高真空下干燥。这产生19.7毫克（理论值的79%）标题化合物。

LC-MS (方法1): R_t = 1.42 min；MS (ESIpos): m/z = 835 [M+H]⁺。

中间体C19

(13-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2,2-二甲基-6,12-二氧代-5-氧杂-10-硫杂-7,13-二氮杂-2-硅杂十六烷-16-基)氨基甲酸叔丁酯

将58.5毫克（0.10毫摩尔）{3-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}(氯乙酰基)氨基]丙基}氨基甲酸叔丁酯（中间体C16）最初装载在2.0毫升DMF中，并加入44.0毫克（0.20毫摩尔）(2-硫烷基乙基)氨基甲酸2-(三甲基甲硅烷基)乙酯（中间体L39）和64.7毫克（0.20毫摩尔）碳酸铯。在50℃下搅拌4小时。用46.6毫克（0.079毫摩尔）中间体C16重复该配制品。合并这两种反应混合物并直接通过制备型RP-HPLC提纯（柱: Reprosil 250x30；10µ, 流速: 50 ml/min, MeCN/水）。在真空下蒸发溶剂，残留物在高真空下干燥。这产生98.0毫克（理论值的71%）标题化合物。

LC-MS (方法1): R_t = 1.62 min；MS (ESIpos): m/z = 774 [M+H]⁺。

中间体C20

三氟乙酸/[3-({[(2-氨基乙基)硫烷基]乙酰基}{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}氨基)丙基]氨基甲酸叔丁酯

将98.0毫克（0.13毫摩尔）(13-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2,2-二甲基-6,12-二氧代-5-氧杂-10-硫杂-7,13-二氮杂-2-硅杂十六烷-16-基)氨基甲酸叔丁酯（中间体C19）最初装载在2.0毫升DMF/叔丁醇（9:1）中，并加入96.2毫克（0.63毫摩尔）CsF。在90℃下搅拌16小时。该反应混合物直接通过制备型RP-HPLC提纯（柱: Reprosil 250x30；10µ, 流速: 50 ml/min, MeCN/水, 0.1% TFA）。在真空下蒸发溶剂并将残留物冻干。这产生57.1毫克（理论值的61%）标题化合物。该化合物还包含相应的亚砜。

LC-MS (方法1): R_t = 1.08 min；MS (ESIpos): m/z = 630 [M+H]⁺。

中间体C21

[38-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}-1-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-3,31,37-三氧代-7,10,13,16,19,22,25,28-八氧杂-35-硫杂-4,32,38-三氮杂四十一烷-41-基]氨基甲酸叔丁酯

将57.1毫克（0.08毫摩尔）三氟乙酸/[3-({[(2-氨基乙基)硫烷基]乙酰基}{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}氨基)丙基]氨基甲酸叔丁酯（中间体C20）最初装载在3.0毫升DMF中，并加入53.0毫克（0.08毫摩尔）3-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-N-{27-[(2,5-二氧代吡咯烷-1-基)氧基]-27-氧代-3,6,9,12,15,18,21,24-八氧杂二十七烷-1-基}丙酰胺和15.5毫克（0.15毫摩尔）三乙胺。在室温下搅拌16小时。该反应混合物直接通过制备型RP-HPLC提纯（柱: Reprosil 250x30；10µ, 流速: 50 ml/min, MeCN/水）。在真空下蒸发溶剂并将残留物冻干。这产生49.7毫克（理论值的49%）标题化合物。

LC-MS (方法1): R_t = 1.34 min；MS (ESIpos): m/z = 1204 [M+H]⁺。

中间体C22

[38-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}-1-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-35-氧化-3,31,37-三氧代-7,10,13,16,19,22,25,28-八氧杂-35λ4-硫杂-4,32,38-三氮杂四十一烷-41-基]氨基甲酸叔丁酯

作为中间体C21的合成中的副产物形成标题化合物。这产生15.5毫克（理论值的15%）标题化合物。

LC-MS (方法1): R_t = 1.25 min；MS (ESIpos): m/z = 1220 [M+H]⁺。

中间体C23

3-氨基-4-{[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰)氨基]甲基}吡咯烷-1-甲酸叔丁酯

立体异构体的混合物

将411.2毫克（1.15毫摩尔）3-甲酰基-4-({[2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基]羰基}氨基)吡咯烷-1-甲酸叔丁酯（中间体L28）和339.7毫克（0.96毫摩尔）N-(3-氨基丙基)-N-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2-羟基乙酰胺（中间体C1）最初装载在6.0毫升二氯甲烷中，加入68.9毫克（1.15毫摩尔）HOAc并在室温下搅拌1小时。加入405.2毫克（1.91毫摩尔）三乙酰氧基硼氢化钠并在室温下搅拌2小时。在真空下蒸发溶剂并将乙酸乙酯和水添加到残留物中。水相用乙酸乙酯萃取三次。合并的有机相用饱和NaCl溶液洗涤一次并经硫酸镁干燥。在真空下蒸发溶剂，残留物使用Biotage Isolera提纯（硅胶，柱50 g SNAP, 流速40 ml/min, 石油醚/乙酸乙酯）。在真空下蒸发溶剂，残留物在高真空下干燥。这产生541.5毫克（理论值的81%）化合物3-[({(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}氨基)甲基]-4-({[2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基]羰基}氨基)吡咯烷-1-甲酸叔丁酯。

LC-MS (方法1): R_t = 1.24和1.29 min；MS (ESIpos): m/z = 698 [M+H]⁺。

将541.5毫克（0.78毫摩尔）3-[({(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}氨基)甲基]-4-({[2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基]羰基}氨基)吡咯烷-1-甲酸叔丁酯溶解在13.0毫升二氯甲烷中，并加入180.6毫克（1.78毫摩尔）三乙胺。将反应溶液冷却至0℃，加入233.1毫克（1.71毫摩尔）乙酰氧基乙酰氯并在室温下搅拌16小时。加入另外180.6毫克（1.78毫摩尔）三乙胺和233.1毫克（1.71毫摩尔）乙酰氧基乙酰氯，并在室温下搅拌另外80小时。在真空下蒸发溶剂并使残留物在水和乙酸乙酯之间分相。水相用乙酸乙酯萃取三次。合并的有机相用饱和NaCl溶液洗涤一次并经硫酸镁干燥。在真空下蒸发溶剂，残留物使用Biotage Isolera提纯（硅胶，柱50 g SNAP, 流速40 ml/min, 石油醚/乙酸乙酯）。在真空下蒸发溶剂，残留物在高真空下干燥。这产生529.2毫克（理论值的86%）化合物3-{[(乙酰氧基乙酰基){(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}氨基]甲基}-4-({[2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基]羰基}氨基)吡咯烷-1-甲酸叔丁酯。

LC-MS (方法1): R_t = 1.53和1.56 min；MS (ESIpos): m/z = 798 [M+H]⁺。

将529.2毫克（0.66毫摩尔）3-{[(乙酰氧基乙酰基){(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}氨基]甲基}-4-({[2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基]羰基}氨基)吡咯烷-1-甲酸叔丁酯最初装载在10.0毫升DMF/叔丁醇（9:1）中，并加入503.7毫克（3.32毫摩尔）CsF。将反应混合物在90℃下搅拌16小时。使反应混合物在水和乙酸乙酯之间分相。水相用乙酸乙酯萃取三次。合并的有机相用饱和NaCl溶液洗涤一次和经硫酸镁干燥。在真空下蒸发溶剂，残留物使用Biotage Isolera提纯（硅胶，柱50 g SNAP, 流速25 ml/min, 二氯甲烷/甲醇）。在真空下蒸发溶剂，残留物在高真空下干燥。这产生172.4毫克（理论值的40%）化合物3-{[(乙酰氧基乙酰基){(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}氨基]甲基}-4-氨基吡咯烷-1-甲酸叔丁酯。

LC-MS (方法1): R_t = 1.05和1.35 min；MS (ESIpos): m/z = 654 [M+H]⁺。

将172.4毫克（0.26毫摩尔）3-{[(乙酰氧基乙酰基){(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}氨基]甲基}-4-氨基吡咯烷-1-甲酸叔丁酯最初装载在4.5毫升甲醇/水（2:1）中，加入80.2毫克（0.58毫摩尔）碳酸钾并在室温下搅拌16小时。使反应混合物在水和乙酸乙酯之间分相。水相用乙酸乙酯萃取三次。合并的有机相用饱和NaCl溶液洗涤一次并经硫酸镁干燥。在真空下蒸发溶剂，残留物通过制备型RP-HPLC提纯（柱: Reprosil 250x30；10µ, 流速: 50 ml/min, MeCN/水）。在真空下蒸发溶剂，残留物在高真空下干燥。这产生116.0毫克（理论值的72%）标题化合物。

LC-MS (方法1): R_t = 1.01 min和1.03 min；MS (ESIpos): m/z = 612 [M+H]⁺。

中间体C24

三氟乙酸/3-(氨基甲基)-4-{[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰)氨基]甲基}吡咯烷-1-甲酸叔丁酯(1:1)

将26.8毫克N-(3-氨基丙基)-N-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2-羟基乙酰胺（中间体C1）溶解在3.0毫升二氯甲烷中，加入5.2毫克（0.09毫摩尔）HOAc和22.4毫克（0.11毫摩尔）三乙酰氧基硼氢化钠并在室温下搅拌5分钟。加入62.4毫克（0.09毫摩尔）3-甲酰基-4-[({[2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基]羰基}氨基)甲基]吡咯烷-1-甲酸叔丁酯（中间体L29）并在室温下搅拌整夜。在真空下蒸发溶剂，残留物通过制备型RP-HPLC提纯（柱: Reprosil 250x30；10µ, 流速: 50 ml/min, MeCN/水, 0.1% TFA）。在真空下蒸发溶剂，残留物在高真空下干燥。这产生57.6毫克（理论值的91%）化合物三氟乙酸/3-[({(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}氨基)甲基]-4-[({[2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基]羰基}氨基)甲基]吡咯烷-1-甲酸叔丁酯。

LC-MS (方法1): R_t = 1.25和1.27 min；MS (ESIpos): m/z = 712 [M+H]⁺。

将77.0毫克（0.11毫摩尔）3-[({(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}氨基)甲基]-4-[({[2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基]羰基}氨基)甲基]吡咯烷-1-甲酸叔丁酯最初装载在1.5毫升二氯甲烷中，并加入21.9毫克（0.22毫摩尔）三乙胺。在0℃下，随后加入29.5毫克（0.22毫摩尔）乙酰氧基乙酰氯并将反应混合物在室温下搅拌整夜。在真空下蒸发溶剂并将残留物置于乙酸乙酯中。有机相用水、饱和碳酸氢钠溶液和饱和NaCl溶液各洗涤一次。在经硫酸镁干燥后，在真空下蒸发溶剂。用77.0毫克（0.11毫摩尔）基 3-[({(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}氨基)甲基]-4-[({[2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基]羰基}氨基)甲基]吡咯烷-1-甲酸叔丁酯重复该配制品。合并的残留物在硅胶上提纯（洗脱剂: 环己烷/乙酸乙酯 = 2:1）。这产生171.1毫克（理论值的85%）化合物3-{[(乙酰氧基乙酰基){(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}氨基]甲基}-4-[({[2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基]羰基}氨基)甲基]吡咯烷-1-甲酸叔丁酯。

LC-MS (方法1): R_t = 1.56和1.57 min；MS (ESIpos): m/z = 812 [M+H]⁺。

将30.0毫克（0.04毫摩尔）3-{[(乙酰氧基乙酰基){(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}氨基]甲基}-4-[({[2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基]羰基}氨基)甲基]吡咯烷-1-甲酸叔丁酯溶解在0.5毫升TBAF溶液（1M在THF中）中。在室温下搅拌整夜。在真空下蒸发溶剂，残留物通过制备型RP-HPLC提纯（柱: Reprosil 250x30；10µ, 流速: 50 ml/min, MeCN/水, 0.1% TFA）。在真空下蒸发溶剂，残留物在高真空下干燥。这产生25.0毫克（理论值的92%）标题化合物。

LC-MS (方法1): R_t = 0.98 min；MS (ESIpos): m/z = 626 [M+H]⁺。

中间体C25

4-{[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰)氨基]甲基}-1-(叔丁氧基羰基)吡咯烷-3-甲酸

将171.4毫克（0.48毫摩尔）N-(3-氨基丙基)-N-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2-羟基乙酰胺（中间体C1）最初装载在4.0毫升二氯甲烷中，并加入248.5毫克（0.72毫摩尔）3-({[叔丁基(二甲基)甲硅烷基]氧基}甲基)-4-甲酰基吡咯烷-1-甲酸叔丁酯（中间体L30）和34.8毫克（0.58毫摩尔）HOAc。将反应混合物在室温下搅拌1小时。加入204.4毫克（0.97毫摩尔）三乙酰氧基硼氢化钠并在室温下搅拌60小时。在真空下除去溶剂，残留物使用Biotage Isolera提纯（硅胶，柱25 g SNAP, 流速25 ml/min, 石油醚/乙酸乙酯）。在真空下蒸发溶剂，残留物在高真空下干燥。这产生267.0毫克（理论值的77%）化合物3-[({(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}氨基)甲基]-4-({[叔丁基(二甲基)甲硅烷基]氧基}甲基)吡咯烷-1-甲酸叔丁酯。

LC-MS (方法1): R_t = 1.49 min；MS (ESIpos): m/z = 683 [M+H]⁺。

将267.0毫克（0.39毫摩尔）3-[({(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}氨基)甲基]-4-({[叔丁基(二甲基)甲硅烷基]氧基}甲基)吡咯烷-1-甲酸叔丁酯溶解在5.0毫升二氯甲烷中，加入91.0毫克（0.90毫摩尔）三乙胺并冷却至0℃。加入117.4毫克（0.86毫摩尔）乙酰氧基乙酰氯并在室温下搅拌16小时。加入另外593.4毫克（5.87毫摩尔）三乙胺和427.0毫克（3.13毫摩尔）乙酰氧基乙酰氯，并在室温下搅拌另外10小时。在真空下蒸发溶剂，残留物通过制备型RP-HPLC提纯（柱: Reprosil 250x30；10µ, 流速: 50 ml/min, MeCN/水）。然后在真空下蒸发溶剂，残留物在高真空下干燥。这产生216.3毫克（理论值的71%）化合物3-{[(乙酰氧基乙酰基){(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}氨基]甲基}-4-({[叔丁基(二甲基)甲硅烷基]氧基}甲基)吡咯烷-1-甲酸叔丁酯。

LC-MS (方法1): R_t = 1.70和1.72 min；MS (ESIpos): m/z = 783 [M+H]⁺。

将216.3毫克（0.28毫摩尔）3-{[(乙酰氧基乙酰基){(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}氨基]甲基}-4-({[叔丁基(二甲基)甲硅烷基]氧基}甲基)吡咯烷-1-甲酸叔丁酯最初装载在4.0毫升THF中，并加入16.6毫克（0.28毫摩尔）HOAc和361.1毫克（1.38毫摩尔）TBAF溶液（1M在THF中）。将反应溶液在室温下搅拌4小时。在真空下蒸发溶剂，残留物通过制备型RP-HPLC提纯（柱: Reprosil 250x30；10µ, 流速: 50 ml/min, MeCN/水）。然后在真空下蒸发溶剂，残留物在高真空下干燥。这产生94.0毫克（理论值的51%）化合物3-{[(乙酰氧基乙酰基){(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}氨基]甲基}-4-(羟甲基)吡咯烷-1-甲酸叔丁酯。

LC-MS (方法1): R_t = 1.34 min；MS (ESIpos): m/z = 669 [M+H]⁺。

将52.0毫克（0.08毫摩尔）3-{[(乙酰氧基乙酰基){(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}氨基]甲基}-4-(羟甲基)吡咯烷-1-甲酸叔丁酯最初装载在4.0毫升PBS缓冲液/乙腈（1:1）中，并加入1.2毫克（0.01毫摩尔）TEMPO。然后同时加入在1.0毫升水中的14.1毫克（0.16毫摩尔）亚氯酸钠和115.8微升（0.16毫摩尔）10%的次氯酸钠溶液。将反应混合物在室温下搅拌16小时。将反应混合物倒入10%的亚硫酸钠溶液中，并加入乙酸乙酯。水相用乙酸乙酯萃取三次，合并的有机相用饱和NaCl溶液洗涤一次并经硫酸镁干燥。在真空下蒸发溶剂且残留物不经进一步提纯即用于下一合成步骤。

LC-MS (方法1): R_t = 1.34 min；MS (ESIpos): m/z = 683 [M+H]⁺。

将103.0毫克（0.15毫摩尔）4-{[(乙酰氧基乙酰基){(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}氨基]甲基}-1-(叔丁氧基羰基)吡咯烷-3-甲酸最初装载在4.5毫升甲醇/水（2:1）中，加入45.9毫克（0.33毫摩尔）碳酸钾并在室温下搅拌3小时。使反应混合物在水和乙酸乙酯之间分相。水相用乙酸乙酯萃取三次，合并的有机相用饱和NaCl溶液洗涤一次并经硫酸镁干燥。在真空下蒸发溶剂且标题化合物不经进一步提纯即用于下一合成步骤。

LC-MS (方法1): R_t = 1.35 min；MS (ESIpos): m/z = 641 [M+H]⁺。

中间体C26

[3-({(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}氨基)-2-({[叔丁基(二甲基)甲硅烷基]氧基}甲基)丙基]氨基甲酸叔丁酯

将590毫克（1.69毫摩尔）三乙酰氧基硼氢化钠和155微升（2.70毫摩尔，162毫克）乙酸最初装载在30毫升二氯甲烷中，并将该混合物在室温下搅拌30分钟。然后逐滴加入600毫克（1.687毫摩尔）(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙-1-胺（由三氟乙酸/(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙-1-胺(1:1)通过用1N氢氧化钠水溶液萃取）和溶解在40毫升二氯甲烷中的750毫克（2.362毫摩尔）(3-{[叔丁基(二甲基)甲硅烷基]氧基}-2-甲酰基丙基)氨基甲酸叔丁酯。在室温下搅拌2小时。然后加入乙酸乙酯，该混合物用饱和碳酸钠溶液洗涤并浓缩有机相。残留物通过制备型HPLC分离（洗脱剂: ACN/水, 梯度）。这产生510毫克（理论值的46%）作为非对映体混合物的目标化合物。

异构体1:

LC-MS (方法1): R_t = 1.36 min (51%)；MS (EIpos): m/z = 657 [M+H]⁺。

异构体2:

LC-MS (方法1): R_t = 1.41 min (49%)；MS (EIpos): m/z = 657 [M+H]⁺。

中间体C27

乙酸2-({(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}{3-[(叔丁氧基羰基)氨基]-2-({[叔丁基(二甲基)甲硅烷基]氧基}甲基)丙基}氨基)-2-氧代乙酯

将510毫克（0,776毫摩尔）[3-({(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}氨基)-2-({[叔丁基(二甲基)甲硅烷基]氧基}甲基)丙基]氨基甲酸叔丁酯最初装载在30毫升二氯甲烷中，并在室温下加入181毫克（249微升，1.786毫摩尔）三乙胺和219毫克（1.553毫摩尔）乙酸2-氯-2-氧代乙酯。将反应混合物在室温下搅拌2小时，然后用饱和碳酸氢钠溶液洗涤。有机相经硫酸钠干燥并在旋转蒸发器上浓缩。残留物通过制备型HPLC分离（洗脱剂: ACN/水, 梯度）。这产生290毫克（理论值的49%）作为差向异构体混合物的目标化合物。

异构体1:

LC-MS (方法1): R_t = 1.70 min；MS (EIpos): m/z = 757 [M+H]⁺。

异构体2:

LC-MS (方法1): R_t = 1.72 min；MS (EIpos): m/z = 757 [M+H]⁺。

中间体C28

乙酸2-({(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}{3-[(叔丁氧基羰基)氨基]-2-(羟甲基)丙基}氨基)-2-氧代乙酯

将285毫克（0.376毫摩尔）乙酸2-({(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}{3-[(叔丁氧基羰基)氨基]-2-({[叔丁基(二甲基)甲硅烷基]氧基}甲基)丙基}氨基)-2-氧代乙酯溶解在5毫升THF中。加入452微升（0.452毫摩尔）四正丁基氟化铵在THF中的1M溶液，并将反应混合物在室温下搅拌3小时。该反应混合物通过制备型HPLC分离（洗脱剂: ACN/水, 梯度）并冻干。这产生214毫克（理论值的81%，根据LC/MS的纯度 = 92%）作为差向异构体混合物的目标化合物。

异构体1:

LC-MS (方法1): R_t = 1.37 min；MS (EIpos): m/z = 643 [M+H]⁺。

异构体2:

LC-MS (方法1): R_t = 1.40 min；MS (EIpos): m/z = 643 [M+H]⁺。

中间体C29

乙酸2-([3-(乙酰基硫烷基)-2-{[(叔丁氧基羰基)氨基]甲基}丙基]{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}氨基)-2-氧代乙酯

将210毫克（0.301毫摩尔）乙酸2-({(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}{3-[(叔丁氧基羰基)氨基]-2-(羟甲基)丙基}氨基)-2-氧代乙酯最初装载在8毫升纯THF中，在室温下逐滴加入溶解在8毫升纯THF中的178毫克（1.503毫摩尔，109微升）亚硫酰氯并在室温下搅拌40分钟。将反应混合物在旋转蒸发器上浓缩并在高真空下干燥。将残留物置于16毫升纯DMF中，加入172毫克（1.503毫摩尔）硫代乙酸钾和133毫克（0.361毫摩尔）四正丁基碘化铵并在90℃下搅拌2小时。在冷却后，加入水并用乙酸乙酯萃取该混合物。有机相在旋转蒸发器上浓缩，残留物通过制备型HPLC分离（洗脱剂: ACN/水, 梯度）并冻干。这产生155毫克（理论值的69%，根据LC/MS的纯度 = 94%)作为差向异构体混合物的目标化合物。

异构体1:

LC-MS (方法1): R_t = 1.50 min；MS (EIpos): m/z = 701 [M+H]⁺。

异构体2:

LC-MS (方法1): R_t = 1.51 min；MS (EIpos): m/z = 701 [M+H]⁺。

中间体C30

[二硫烷二基双(2-{[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰)氨基]甲基}丙-3,1-二基)]双氨基甲酸二-叔丁酯

将1.220克（1.010毫摩尔，根据LC/MS的纯度 = 58%）乙酸2-([3-(乙酰基硫烷基)-2-{[(叔丁氧基羰基)氨基]甲基}丙基]{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}氨基)-2-氧代乙酯最初装载在30毫升THF和30毫升甲醇中，加入10毫升1 N氢氧化钠水溶液并在室温下搅拌2小时。向该反应混合物加入水并用二氯甲烷萃取。有机相经硫酸钠干燥并在旋转蒸发器上浓缩。残留物通过制备型HPLC提纯（洗脱剂: ACN/水, 梯度）。这产生390毫克（理论值的54%，根据LC/MS的纯度 = 86%）作为非对映体混合物的目标化合物。

异构体:

LC-MS (方法1): R_t = 1.81 min；MS (EIpos): m/z = 1232 [M+H]⁺。

中间体C31

3-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰)氨基]-2-(硫烷基甲基)丙基}氨基甲酸叔丁酯

将390毫克（0.272毫摩尔，根据LC/MS的纯度 = 86%）[二硫烷二基双(2-{[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰)氨基]甲基}丙-3,1-二基)]双氨基甲酸二-叔丁酯置于20毫升1,4-二氧杂环己烷和10毫升PBS缓冲液中，并加入234毫克（0.817毫摩尔）3,3',3''-磷烷三基三丙酸盐酸盐(1:1)。在室温下搅拌16小时。然后将反应混合物在旋转蒸发器上浓缩并用二氯甲烷搅拌，浓缩滤液并在高真空下干燥。将残留物溶解在8毫升异丙醇中并通过手性色谱法提纯（柱: 250x30 mm，填充Daicel Chiralpak AZ-H，洗脱剂: 异己烷/异丙醇 = 90:10）。这产生目标化合物的两个馏分。馏分1含有181.2毫克（理论值的50%）异构体1且馏分2产生90.2毫克（理论值的25%）异构体2。

异构体1:

Chiral HPLC (柱: 250x4.6 mm，填充Diacel Chiralpak AZ-H，洗脱剂: 异己烷/乙醇90:10): R_t = 6.98 min.

LC-MS (方法1): R_t = 1.47 min；MS (EIpos): m/z = 617 [M+H]⁺。

异构体2:

Chiral HPLC (柱: 250x4.6 mm，填充Diacel Chiralpak AZ-H，洗脱剂: 异己烷/乙醇 90:10): R_t = 9.39 min.

LC-MS (方法1): R_t = 1.47 min；MS (EIpos): m/z = 617 [M+H]⁺。

中间体C32

N-[3-氨基-2-(硫烷基甲基)丙基]-N-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2-羟基乙酰胺盐酸盐(1:1) (异构体1)

将123毫克（199.42微摩尔）{3-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰)氨基]-2-(硫烷基甲基)丙基}氨基甲酸叔丁酯（异构体1）溶解在2毫升THF中并与10毫升半浓缩盐酸一起在室温下搅拌1小时。该反应溶液在氩气下脱气，然后冻干。这产生108毫克（理论值的98%）目标化合物。

异构体1

LC-MS (方法1): R_t = 0.95 min；MS (EIpos): m/z = 517 [M+H]⁺。

中间体C33

N-[3-氨基-2-(硫烷基甲基)丙基]-N-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2-羟基乙酰胺盐酸盐(1:1) (异构体2)

将123毫克（199.42微摩尔）{3-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰)氨基]-2-(硫烷基甲基)丙基}氨基甲酸叔丁酯（异构体2）溶解在2毫升THF中并与10毫升半浓缩盐酸一起在室温下搅拌1小时。该反应溶液在氩气下脱气，然后冻干。这产生58毫克（理论值的63%，根据LC/MS的纯度 = 91%）目标化合物。

异构体2

LC-MS (方法1): R_t = 0.97 min；MS (ESIpos): m/z = 517 [M+H]⁺。

中间体C34

[3-({(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}氨基)丙基]氨基甲酸叔丁酯

将3.790克（10.02毫摩尔）(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙-1-胺（获自三氟乙酸/(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙-1-胺(1:1)，通过用1N氢氧化钠水溶液萃取）、3.186克（15.04毫摩尔）三乙酰氧基硼氢化钠和690微升（12.03毫摩尔，722毫克）最初装载在100毫升二氯甲烷中。在室温下搅拌5分钟。

然后加入4.687克（27.06毫摩尔）(3-氧代丙基)氨基甲酸叔丁酯，并在室温下搅拌16小时。该反应混合物用二氯甲烷稀释并用饱和碳酸氢钠溶液洗涤。有机相经硫酸钠干燥并在旋转蒸发器上浓缩。残留物通过硅胶上的色谱法提纯（洗脱剂: 二氯甲烷/乙酸乙酯, 梯度 = 4:1 → 1:1）。这产生2.57克（理论值的48%，根据LC/MS的纯度 = 96%）目标化合物。

LC-MS (方法1): R_t = 1.00 min；MS (EIpos): m/z = 513 [M+H]⁺。

中间体C35

{3-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}(4-硝基苯甲酰基)氨基]丙基}氨基甲酸叔丁酯

将200毫克（0.38毫摩尔）[3-({(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}氨基)丙基]氨基甲酸叔丁酯最初装载在9毫升纯二氯甲烷中，并在室温下加入120微升（0.86毫摩尔，87毫克）三乙胺。在室温下，逐滴加入溶解在1毫升纯二氯甲烷中的83毫克（0.45毫摩尔）4-硝基苯甲酰氯，并在室温下搅拌1小时。加入水，并将该混合物在旋转蒸发器上浓缩。残留物通过制备型HPLC提纯（洗脱剂: ACN/水 + 0.1% TFA, 梯度）并干燥。这产生181毫克（理论值的73%）目标化合物。

LC-MS (方法1): R_t = 1.47 min；MS (EIpos): m/z = 662 [M+H]⁺。

中间体C36

{3-[(4-氨基苯甲酰基){(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}氨基]丙基}氨基甲酸叔丁酯

将170毫克（0.26毫摩尔）{3-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}(4-硝基苯甲酰基)氨基]丙基}氨基甲酸叔丁酯最初装载在10毫升乙酸中。加入143毫克（2.57毫摩尔）铁粉并在50℃下搅拌16小时。在冷却后，加入水并用乙酸乙酯萃取该混合物。有机相经硫酸钠干燥并在旋转蒸发器上浓缩。残留物在HV下干燥。这产生154毫克（理论值的77%，根据LC/MS的纯度 = 82%）目标化合物。

LC-MS (方法5): R_t = 4.73 min；MS (EIpos): m/z = 632 [M+H]⁺。

中间体C37

N-[19-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-17-氧代-4,7,10,13-四氧杂-16-氮杂十九-1-酰基]-L-缬氨酰基-N-[4-({(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}{3-[(叔丁氧基羰基)氨基]丙基}氨基甲酰基)苯基]-L-丙氨酰胺

将38.6毫克（0.05毫摩尔，LC/MS纯度 = 82%）{3-[(4-氨基苯甲酰基){(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}氨基]丙基}氨基甲酸叔丁酯溶解在纯DMF中，并加入24.8毫克（0.06毫摩尔）HATU和13.0毫克（0.10毫摩尔）N,N-二异丙基乙基胺。将该混合物在室温下搅拌5分钟，然后加入63毫克（0.06毫摩尔）N-[19-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-17-氧代-4,7,10,13-四氧杂-16-氮杂十九-1-酰基]-L-缬氨酰基-L-丙氨酸并在室温下搅拌3小时。加入7.5毫克（0.06毫摩尔）3H-[1,2,3]三唑并[4,5-b]吡啶-3-醇（HOAt）并搅拌16小时。加入19.1毫克（0.05毫摩尔）HATU并将该混合物在50℃下搅拌2小时。在冷却后，该反应混合物直接通过制备型HPLC提纯（洗脱剂: ACN/水 + 0.1% TFA, 梯度）。这产生6.5毫克（理论值的9%，根据LC/MS的纯度 = 83%）目标化合物。

LC-MS (方法2): R_t = 7.89 min；MS (EIpos): m/z = 1200.6 [M+H]⁺。

中间体C38

2-[3-({(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}氨基)丙基]-1H-异吲哚-1,3(2H)-二酮

将300.0毫克（0.84毫摩尔）2-[3-({(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}氨基)丙基]-1H-异吲哚-1,3(2H)-二酮（中间体C1）最初装载在4.0毫升二氯甲烷中，加入58.3毫克（0.97毫摩尔）HOAc和250.4毫克（1.18毫摩尔）三乙酰氧基硼氢化钠并在室温下搅拌5分钟。加入197.2毫克（0.97毫摩尔）3-(1,3-二氧代-1,3-二氢-2H-异吲哚-2-基)丙醛。将反应混合物在室温下搅拌整夜。该反应混合物用乙酸乙酯稀释，有机相用饱和碳酸钠溶液洗涤两次并用饱和NaCl溶液洗涤一次。在经硫酸镁干燥后，在真空下蒸发溶剂，残留物在硅胶上提纯（洗脱剂: 乙酸乙酯/环己烷1:5）。在真空下蒸发溶剂，残留物在高真空下干燥。这产生333.3毫克（70%）标题化合物。

LC-MS (方法1): R_t = 1.05 min；MS (ESIpos): m/z = 543 [M+H]⁺。

中间体C39

乙酸2-({(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}[3-(1,3-二氧代-1,3-二氢-2H-异吲哚-2-基)丙基]氨基)-2-氧代乙酯

将332.3毫克（0.61毫摩尔）2-[3-({(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}氨基)丙基]-1H-异吲哚-1,3(2H)-二酮（中间体C38）最初装载在8.0毫升二氯甲烷中，并加入142.5毫克（1.35毫摩尔）三乙胺。在0℃下，加入184.0毫克（1.35毫摩尔）乙酰氧基乙酰氯，并将反应混合物在室温下搅拌整夜。该反应混合物用乙酸乙酯稀释，有机相用饱和碳酸氢钠溶液洗涤两次并用饱和NaCl溶液洗涤一次。在经硫酸镁干燥后，在真空下蒸发溶剂，残留物在硅胶上提纯（洗脱剂: 乙酸乙酯/环己烷1:3）。在真空下蒸发溶剂，残留物在高真空下干燥。这产生367.1毫克（63%）标题化合物。

LC-MS (方法1): R_t = 1.42 min；MS (ESIpos): m/z = 643 [M+H]⁺。

中间体C40

N-(3-氨基丙基)-N-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2-羟基乙酰胺

将583.1毫克（0.91毫摩尔）乙酸2-({(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}[3-(1,3-二氧代-1,3-二氢-2H-异吲哚-2-基)丙基]氨基)-2-氧代乙酯（中间体C39）最初装载在15.0毫升乙醇中，并加入1.41克（18.15毫摩尔）甲胺（40%在水中）。将反应混合物在50℃下搅拌整夜。在真空下蒸发溶剂，残留物与甲苯共蒸馏三次。残留物在硅胶上提纯（洗脱剂: 二氯甲烷/甲醇 = 100:5）。在真空下蒸发溶剂，残留物在高真空下干燥。这产生324.9毫克（73%）标题化合物。

LC-MS (方法1): R_t = 0.97 min；MS (ESIpos): m/z = 471 [M+H]⁺。

中间体C41

三氟乙酸/L-缬氨酰基-N-{3-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰)氨基]丙基}-L-丙氨酰胺(1:1)

将50.0毫克（0.11摩尔）N-(3-氨基丙基)-N-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2-羟基乙酰胺（中间体C40）和30.4毫克（0.11毫摩尔）N-(叔丁氧基羰基)-L-丙氨酸2,5-二氧代吡咯烷-1-基酯最初装载在2.0毫升DMF中，并加入32.2毫克（0.32毫摩尔）4-甲基吗啉。将反应混合物在室温下搅拌整夜。加入19.1毫克（0.32毫摩尔）HOAc，该反应混合物直接通过制备型RP-HPLC提纯（柱: Reprosil 250x30；10µ, 流速: 50 ml/min, MeCN/水）。在真空下蒸发溶剂，残留物在高真空下干燥。这产生38.0毫克（56%）化合物[(2S)-1-({3-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰)氨基]丙基}氨基)-1-氧代丙-2-基]氨基甲酸叔丁酯。

LC-MS (方法1): R_t = 1.26 min；MS (ESIpos): m/z = 642 [M+H]⁺。

将33.6毫克（0.05毫摩尔）[(2S)-1-({3-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰)氨基]丙基}氨基)-1-氧代丙-2-基]氨基甲酸叔丁酯最初装载在3.0毫升二氯甲烷中。向反应混合物加入119.4毫克（1.05毫摩尔）TFA并在室温下搅拌整夜。在真空下蒸发溶剂，残留物直接通过制备型RP-HPLC提纯（柱: Reprosil 250x30；10µ, 流速: 50 ml/min, MeCN/水, 0.1% TFA）。在真空下蒸发溶剂，残留物在高真空下干燥。这产生32.8毫克（96%）化合物三氟乙酸/N-{3-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰)氨基]丙基}-L-丙氨酰胺(1:1)。

LC-MS (方法1): R_t = 0.93 min；MS (ESIpos): m/z = 542 [M+H]⁺。

将29.5毫克（0.05毫摩尔）三氟乙酸/N-{3-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰)氨基]丙基}-L-丙氨酰胺(1:1)和14.1毫克（0.05毫摩尔）N-(叔丁氧基羰基)-L-缬氨酸2,5-二氧代吡咯烷-1-基酯最初装载在1.0毫升DMF中，并加入18.2毫克（0.18毫摩尔）4-甲基吗啉。将反应混合物在室温下搅拌整夜并直接通过制备型RP-HPLC提纯（柱: Reprosil 250x30；10µ, 流速: 50 ml/min, MeCN/水）。在真空下蒸发溶剂，残留物在高真空下干燥。这产生23.1毫克（69%）化合物N-(叔丁氧基羰基)-L-缬氨酰基-N-{3-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰)氨基]丙基}-L-丙氨酰胺。

LC-MS (方法1): R_t = 1.30 min；MS (ESIpos): m/z = 741 [M+H]⁺。

将19.4毫克（0.03毫摩尔）N-(叔丁氧基羰基)-L-缬氨酰基-N-{3-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰)氨基]丙基}-L-丙氨酰胺溶解在1.5毫升二氯甲烷中，并加入59.7毫克（0.52毫摩尔）TFA。将反应混合物在室温下搅拌整夜。加入119.4毫克（1.04毫摩尔）TFA，并再在室温下搅拌整夜。在真空下蒸发溶剂，残留物直接通过制备型RP-HPLC提纯（柱: Reprosil 250x30；10µ, 流速: 50 ml/min, MeCN/水, 0.1% TFA）。在真空下蒸发溶剂，残留物在高真空下干燥。这产生19.2毫克（97%）标题化合物。

LC-MS (方法1): R_t = 0.96 min；MS (ESIpos): m/z = 641 [M+H]⁺。

中间体C42

四氟硼酸2,5-二氟苯重氮盐

最初装入3.00克（21.16毫摩尔，2.68毫升）三氟化硼-二乙醚络合物，并在0℃下缓慢地逐滴加入溶解在27毫升纯THF中的1.37克（10.58毫摩尔）2,5-二氟苯胺。在-10℃下，逐滴加入1.61克（13.75毫摩尔，1.85毫升）亚硝酸异戊酯溶解在3毫升纯THF中的溶液，并在相同温度下继续搅拌30分钟。加入15毫升二乙醚并滤出沉淀的重氮盐，用少量二乙醚洗涤并在高真空下干燥。这产生2.27克目标化合物（理论值的94%）。

LC-MS (方法6): R_t = 0.24 min；MS (ESIpos): m/z = 141 [M]⁺.

¹H NMR (400 MHz, DMSO-d₆): δ [ppm] = 8.11-8.17 (m, 1H), 8.36-8.43 (m, 1H), 8.69-8.73 (m, 1H)。

中间体C43

氯[2-(2,5-二氟苯基)亚肼基]乙酸甲酯

在氩气气氛下，将3.63克（24.13毫摩尔）2-氯-3-氧代丁酸甲酯最初装载在100毫升水中，在-5℃下加入48.90克（618.19毫摩尔，50.00毫升）吡啶，并在此温度下搅拌10分钟。在-5℃下，然后加入5.00克（21.94毫摩尔）四氟硼酸2,5-二氟苯重氮盐，以致形成橙色悬浮液。在此温度下搅拌30分钟，该配制品用水稀释并用二氯甲烷萃取三次。合并的有机相用饱和氯化钠溶液洗涤，经硫酸钠干燥，在旋转蒸发器上浓缩并在高真空下干燥。这产生5.52克目标化合物（理论值的97%，根据LC/MS的纯度 = 96%）。

LC-MS (方法1): R_t = 1.03 min；MS (ESIpos): m/z = 249 [M+H]⁺.

¹H NMR (400 MHz, DMSO-d₆): δ [ppm] = 3.85 (s, 3H), 6.88-6.94 (m, 1H), 7.16-7.21 (m, 1H), 7.31-7.37 (m, 1H), 10.00 (s, 1H)。

中间体C44

4-苯甲酰基-1-(2,5-二氟苯基)-1H-吡唑-3-甲酸甲酯

将3.50克（13.52毫摩尔）氯[2-(2,5-二氟苯基)亚肼基]乙酸甲酯（根据LC/MS的纯度96%）溶解在9毫升纯甲苯中，加入2.61克（14.87毫摩尔）(2E)-3-(二甲基氨基)-1-苯基丙-2-烯-1-酮和3.01克（29.73毫摩尔，4.14毫升）三乙胺并在室温下搅拌16小时。该反应混合物在旋转蒸发器上浓缩，残留物通过制备型HPLC分离（洗脱剂: ACN/含0.1%甲酸的水, 梯度）。这产生1.79克（理论值的39%）目标化合物。

LC-MS (方法1): R_t = 1.07 min；MS (ESIpos): m/z = 343 [M+H]⁺.

¹H NMR (400 MHz, DMSO-d₆): δ [ppm] = 3.86 (s, 3H), 7.44-7.50 (m, 1H), 7.55-7.72 (m, 4H), 7.81-7.87 (m, 3H), 8.80 (d, 1H)。

中间体C45

[4-苄基-1-(2,5-二氟苯基)-1H-吡唑-3-基]甲醇

将3.18克（8.92毫摩尔）4-苯甲酰基-1-(2,5-二氟苯基)-1H-吡唑-3-甲酸甲酯（根据LC/MS的纯度 = 96%）最初装载在50毫升三氟乙酸中，逐滴加入8.74克（75.13毫摩尔，12毫升）三乙基硅烷并在室温下搅拌1小时。该反应混合物在旋转蒸发器上浓缩并在高真空下干燥。将所得残留物置于120毫升纯THF中，并在0℃下逐滴加入2.89克（33.63毫摩尔，33.63毫升）硼烷-四氢呋喃络合物。搅拌整夜。由于低转化率，加入另外12.33毫升（12.33毫摩尔）在THF中的1M硼氢化锂溶液。在室温下搅拌1小时，在60℃下搅拌30分钟并在80℃下搅拌2小时。在0℃下，小心地用60毫升饱和碳酸氢钠溶液猝灭。该混合物用在每种情况下100毫升乙酸乙酯萃取两次，合并的有机相经硫酸钠干燥并在旋转蒸发器上浓缩，残留物在高真空下干燥。这产生2.67克（理论值的76%，纯度 = 96%）目标化合物。

LC-MS (方法3): R_t = 2.79 min；MS (ESIpos): m/z = 329 [M+H]⁺.

¹H NMR (400 MHz, DMSO-d₆): δ [ppm] = 3.91 (s, 2H), 4.45 (d, 2H), 6.51 (s, 1H), 7.18-7.23 (m, 2H), 7.27-7.32 (m, 4H), 7.46-7.53 (m, 1H), 7.60-7.65 (m, 1H), 7.95 (d, 1H)。

中间体C46

4-苄基-1-(2,5-二氟苯基)-1H-吡唑-3-甲醛

将2.66克（8.50毫摩尔）[4-苄基-1-(2,5-二氟苯基)-1H-吡唑-3-基]甲醇（纯度96%）溶解在150毫升二氯甲烷中，并逐份加入4.33克（10.20毫摩尔）戴斯马丁氧化剂。将该混合物在室温下搅拌2小时，然后加入100毫升半浓缩碳酸氢钠溶液和100毫升10%的硫代硫酸钠溶液并搅拌20分钟。分离出有机相，经硫酸钠干燥并在高真空下浓缩。这产生2.35克（理论值的88%，纯度 = 95%）目标化合物。

LC-MS (方法7): R_t = 1.49 min；MS (ESIpos): m/z = 299 [M+H]⁺.

¹H NMR (400 MHz, DMSO-d₆): δ [ppm] = 4.12 (s, 2H), 7.17-7.21 (m, 1H), 7.27-7.31 (m, 4H), 7.37-7.42 (m, 1H), 7.57-7.62 (m, 1H), 7.75-7.78 (m, 1H), 8.22 (d, 1H), 10.06 (s, 1H)。

中间体C47

(1R)-1-[4-苄基-1-(2,5-二氟苯基)-1H-吡唑-3-基]-2,2-二甲基丙-1-胺

将2.35克（7.56毫摩尔）4-苄基-1-(2,5-二氟苯基)-1H-吡唑-3-甲醛溶解在25毫升纯THF中，并加入1.10克（9.08毫摩尔）(R)-(+)-2-甲基-2-丙烷亚磺酰胺和4.73克（16.64毫摩尔）异丙醇钛(IV)。将反应混合物在室温下搅拌16小时，然后加入20毫升饱和氯化钠溶液和30毫升乙酸乙酯。然后加入大约3克硅藻土，在回流下沸腾1小时。过滤并从滤液中分离有机相。水相用乙酸乙酯萃取，合并的有机相用饱和氯化钠溶液洗涤，经硫酸钠干燥，在旋转蒸发器上浓缩并在高真空下干燥。残留物不经进一步提纯即进一步使用。

在氩气气氛下，将残留物溶解在60毫升纯THF中并冷却至-78℃，逐滴加入14.5毫升（23.24毫摩尔）在戊烷中的叔丁基锂溶液（c = 1.6 mol/l）。在-78℃下搅拌3小时，然后用5毫升甲醇和15毫升饱和氯化铵溶液猝灭。在搅拌下，使反应混合物升温至室温（大约30分钟）。用乙酸乙酯萃取，有机相用饱和氯化钠溶液萃取，在旋转蒸发器上浓缩并在高真空下干燥。残留物不经进一步提纯即进一步使用。

将残留物置于30毫升THF和6毫升甲醇中，加入6毫升（24.00毫摩尔）在二氧杂环己烷中的4N氯化氢溶液并在室温下搅拌1小时。然后加入15毫升饱和碳酸钠溶液，用乙酸乙酯萃取。分离出有机相，在旋转蒸发器上浓缩并在高真空下干燥。残留物通过制备型HPLC分离（洗脱剂: ACN/水, 梯度）。这产生目标化合物的两个馏分。第一馏分产生1.31克（理论值的72%，LC/MS纯度 = 97%）且第二馏分产生0.37克（理论值的17%，LC/MS纯度 = 83%）产物。

LC-MS (方法1): R_t = 0.88 min；MS (ESIpos): m/z = 356 [M+H]⁺.

¹H NMR (400 MHz, DMSO-d₆): δ [ppm] = 0.91 (s, 9H), 1.71 (s, 2H), 3.59 (s, 1H), 3.87 (s, 2H), 7.17-7.32 (m, 6H), 7.45-7.51 (m, 1H), 7.61-7.65 (m, 1H), 7.84(s br, 1H)。

中间体C48

(2S)-4-({(1R)-1-[4-苄基-1-(2,5-二氟苯基)-1H-吡唑-3-基]-2,2-二甲基丙基}氨基)-2-[(叔丁氧基羰基)氨基]丁酸叔丁酯

将1.28克（3.35毫摩尔，LC/MS纯度 93%）(1R)-1-[4-苄基-1-(2,5-二氟苯基)-1H-吡唑-3-基]-2,2-二甲基丙-1-胺溶解在100毫升纯二氯甲烷中，并在室温下加入261毫克（4.35毫摩尔，250微升）乙酸和1.14克（4.34毫摩尔）三乙酰氧基硼氢化钠，在搅拌5分钟后加入1.19克（4.35毫摩尔）(2S)-2-[(叔丁氧基羰基)氨基]-4-氧代丁酸叔丁酯。在室温下搅拌15分钟，在旋转蒸发器上浓缩，置于乙腈和水中并通过制备型HPLC提纯（洗脱剂: ACN/水 + 0.1% TFA, 梯度）。这产生1.64克（理论值的80%）目标化合物。

LC-MS (方法1): R_t = 1.10 min；MS (ESIpos): m/z = 613 [M+H]⁺.

¹H NMR (400 MHz, DMSO-d₆): δ [ppm] = 1.01 (s, 9H), 1.32 (s, 9H), 1.35 (s, 9H), 1.80-1.89 (m, 1H), 2.01-2.11 (m, 1H), 2.54-2.71 (m, 2H), 3.75-3.81 (m, 1H), 3.90 (s, 2H), 4.18 (d, 1H), 7.13 (d, 1H), 7.20-7.24 (m, 1H), 7.28-7.34 (m, 5H), 7.52-7.58 (m, 1H), 7.76-7.80 (m, 1H), 8.10 (s br, 1H), 8.23 (s br, 1H)。

中间体C49

(2S)-4-[{(1R)-1-[4-苄基-1-(2,5-二氟苯基)-1H-吡唑-3-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰)氨基]-2-[(叔丁氧基羰基)氨基]丁酸

将225毫克（0.37毫摩尔）(2S)-4-({(1R)-1-[4-苄基-1-(2,5-二氟苯基)-1H-吡唑-3-基]-2,2-二甲基丙基}氨基)-2-[(叔丁氧基羰基)氨基]丁酸叔丁酯溶解在10毫升纯二氯甲烷中，并加入156毫克（1.54毫摩尔）三乙胺。在0℃下，加入125毫克（0.92毫摩尔）乙酰氧基乙酰氯，并在室温下搅拌16小时。加入另外251毫克（1.84毫摩尔）乙酰氧基乙酰氯和186毫克（1.84毫摩尔）三乙胺，并在室温下搅拌3小时。加入少量二氯甲烷，用饱和碳酸氢钠溶液和饱和氯化钠溶液洗涤。有机相经硫酸钠干燥，在旋转蒸发器上浓缩并在高真空下干燥。将残留物置于10毫升乙醇中，加入0.91毫升（12.67毫摩尔）40%的甲胺水溶液并在50℃下搅拌3小时。该混合物在旋转蒸发器上浓缩，将残留物置于二氯甲烷中，有机相用水洗涤两次。有机相经硫酸钠干燥，在旋转蒸发器上浓缩并在高真空下干燥。将残留物置于2毫升二氯甲烷中，加入2毫升（25.96毫摩尔）三氟乙酸并在50℃下搅拌4小时。该混合物在旋转蒸发器上浓缩，残留物在高真空下干燥。将残留物置于10毫升纯二氯甲烷中，加入298毫克（2.95毫摩尔）三乙胺和429毫克（1.97毫摩尔）二碳酸二叔丁酯并在室温下搅拌1小时。该混合物在旋转蒸发器上浓缩，残留物通过制备型HPLC提纯（洗脱剂: ACN/水, 梯度）。这产生62毫克（理论值的27%）目标化合物。

LC-MS (方法1): R_t = 1.32 min；MS (ESIpos): m/z = 615 [M+H]⁺.

¹H NMR (400 MHz, DMSO-d₆): δ [ppm] = 0.91 (s, 9H), 1.32 (s, 9H), 2.64-2.72 (m, 4H), 3.50-3.58 (m, 1H), 3.72 (dd, 2H), 4.07-4.22 (m, 2H), 4.47-4.54 (m, 1H), 5.75 (s, 1H), 6.84-6.89 (m, 1H), 7.15-7.30 (m, 6H), 7.47-7.53 (m, 1H), 7.70-7.75 (m, 1H), 8.09-8.13 (m, 1H), 11.66 (s br, 1H)。

中间体C50

[(2S)-4-[{(1R)-1-[4-苄基-1-(2,5-二氟苯基)-1H-吡唑-3-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰)氨基]-1-{[2-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙基]氨基}-1-氧代丁-2-基]氨基甲酸叔丁酯

将60毫克（0.1毫摩尔）(2S)-4-[{(1R)-1-[4-苄基-1-(2,5-二氟苯基)-1H-吡唑-3-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰)氨基]-2-[(叔丁氧基羰基)氨基]丁酸溶解在10毫升纯DMF中，并加入74毫克（0.20毫摩尔）HATU。将74毫克（0.29毫摩尔）三氟乙酸/1-(2-氨基乙基)-1H-吡咯-2,5-二酮(1:1)单独溶解在2毫升纯DMF中，加入38毫克（0.29毫摩尔）N,N-二异丙基乙基胺并逐滴添加到反应混合物中。在室温下搅拌3天。该混合物直接通过制备型HPLC提纯（洗脱剂: ACN/水 + 0.1% TFA, 梯度）。这产生9.3毫克（理论值的13%）目标化合物。

LC-MS (方法1): R_t = 1.34 min；MS (ESIpos): m/z = 737 [M+H]⁺。

中间体C51

N-{(2S)-4-[{(1R)-1-[4-苄基-1-(2,5-二氟苯基)-1H-吡唑-3-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰)氨基]-2-[(叔丁氧基羰基)氨基]丁酰基}-β-丙氨酸

首先，中间体C47类似于中间体C2用N-{(2S)-2-[(叔丁氧基羰基)氨基]-4-氧代丁酰基}-β-丙氨酸苄酯还原性烷基化。该仲氨基随后如对中间体C27所述用乙酸2-氯-2-氧代乙酯酰化，这两种酯基团然后用在甲醇中的2M氢氧化锂溶液水解。这产生23毫克标题化合物。

LC-MS (方法1): R_t = 1.24 min；MS (ESIpos): m/z = 686 (M+H)⁺。

中间体C52

(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙-1-胺

将10.00克（49.01毫摩尔）4-溴-1H-吡咯-2-甲酸甲酯最初装载在100.0毫升DMF中，并加入20.76克（63.72毫摩尔）碳酸铯和9.22克（53.91毫摩尔）苄基溴。将反应混合物在室温下搅拌整夜。使反应混合物在水和乙酸乙酯之间分相，水相用乙酸乙酯萃取。合并的有机相经硫酸镁干燥并在真空下蒸发溶剂。用90.0克4-溴-1H-吡咯-2-甲酸甲酯重复该配制品。

这两个合并的配制品通过制备型RP-HPLC提纯（柱: Daiso 300x100；10µ, 流速: 250 ml/min, MeCN/水）。在真空下蒸发溶剂，残留物在高真空下干燥。这产生125.15克（理论值的87%）化合物1-苄基-4-溴-1H-吡咯-2-甲酸甲酯。

LC-MS (方法1): R_t = 1.18 min；MS (ESIpos): m/z = 295 [M+H]⁺。

在氩气下，将4.80克（16.32毫摩尔）1-苄基-4-溴-1H-吡咯-2-甲酸甲酯最初装载在DMF中，并加入3.61克（22.85毫摩尔）(2,5-二氟苯基)硼酸、19.20毫升饱和碳酸钠溶液和1.33克（1.63毫摩尔）[1,1'-双(二苯基膦基)二茂铁]-二氯钯(II):二氯甲烷。将反应混合物在85℃下搅拌整夜。该反应混合物经C盐过滤，滤饼用乙酸乙酯洗涤。有机相用水萃取，然后用饱和NaCl溶液洗涤。有机相经硫酸镁干燥并在真空下蒸发溶剂。残留物在硅胶上提纯（洗脱剂: 环己烷/乙酸乙酯100:3）。在真空下蒸发溶剂，残留物在高真空下干燥。这产生3.60克（理论值的67%）化合物1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-甲酸甲酯。

LC-MS (方法7): R_t = 1.59 min；MS (ESIpos): m/z = 328 [M+H]⁺。

将3.60克（11.00毫摩尔）1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-甲酸甲酯最初装载在90.0毫升THF中，并在0℃下加入1.04克（27.50毫摩尔）氢化锂铝（2.4 M在THF中）。将反应混合物在0℃下搅拌30分钟。在0℃下，加入饱和酒石酸钾钠溶液并将乙酸乙酯添加到反应混合物中。有机相用饱和酒石酸钾钠溶液萃取三次。有机相用饱和NaCl溶液洗涤一次并经硫酸镁干燥。在真空下蒸发溶剂并将残留物溶解在30.0毫升二氯甲烷中。加入3.38克（32.99毫摩尔）氧化锰(IV)并在室温下搅拌48小时。加入另外2.20克（21.47毫摩尔）氧化锰(IV)并在室温下搅拌整夜。该反应混合物经C盐过滤，滤饼用二氯甲烷洗涤。在真空下蒸发溶剂，残留物2.80克(1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-甲醛)不经进一步提纯即用于该合成的下一步骤。

LC-MS (方法7): R_t = 1.48 min；MS (ESIpos): m/z = 298 [M+H]⁺。

将28.21克（94.88毫摩尔）1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-甲醛与23.00克（189.77毫摩尔）(R)-2-甲基丙烷-2-亚磺酰胺一起最初装载在403.0毫升纯THF中，加入67.42克（237.21毫摩尔）异丙醇钛(IV)并在室温下搅拌整夜。加入500.0毫升饱和NaCl溶液和1000.0毫升乙酸乙酯，并在室温下搅拌1小时。经硅藻土过滤，滤液用饱和NaCl溶液洗涤两次。有机相经硫酸镁干燥，在真空下蒸发溶剂，残留物使用Biotage Isolera提纯（硅胶，柱1500+340 g SNAP, 流速200 ml/min, 乙酸乙酯/环己烷1:10）。

LC-MS (方法7): R_t = 1.63 min；MS (ESIpos): m/z = 401 [M+H]⁺。

将25.00克（62.42毫摩尔）(R)-N-{(E/Z)-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]亚甲基}-2-甲基丙烷-2-亚磺酰胺最初在氩气下装载在纯THF中并冷却至-78℃。然后在-78℃下加入12.00克（187.27毫摩尔）叔丁基锂（在戊烷中的1.7 M溶液）并在此温度下搅拌3小时。在-78℃下，然后相继加入71.4毫升甲醇和214.3毫升饱和氯化铵溶液，并使反应混合物升温至室温并在室温下搅拌1小时。用乙酸乙酯稀释并用水洗涤。有机相经硫酸镁干燥并在真空下蒸发溶剂。残留物(R)-N-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2-甲基丙烷-2-亚磺酰胺不经进一步提纯即用于该合成的下一步骤。

LC-MS (方法6): R_t = 2.97 min；MS (ESIpos): m/z = 459 [M+H]⁺。

将28.00克（61.05毫摩尔）(R)-N-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2-甲基丙烷-2-亚磺酰胺最初装载在186.7毫升1,4-二氧杂环己烷中，然后加入45.8毫升HCl/1,4-二氧杂环己烷溶液（4.0 M）。将反应混合物在室温下搅拌2小时并在真空下蒸发溶剂。残留物通过制备型RP-HPLC提纯（柱: Kinetix 100x30；流速: 60 ml/min, MeCN/水）。在真空下蒸发乙腈并将二氯甲烷添加到含水残留物中。有机相用碳酸氢钠溶液洗涤并经硫酸镁干燥。在真空下蒸发溶剂，残留物在高真空下干燥。这产生16.2克（理论值的75%）标题化合物。

LC-MS (方法6): R_t = 2.10 min；MS (ESIpos): m/z = 338 [M-NH₂]⁺, 709 [2M+H]⁺.

¹H NMR (400 MHz, DMSO-d₆): δ [ppm] = 0.87 (s, 9H), 1.53 (s, 2H), 3.59 (s, 1H), 5.24 (d, 2H), 6.56 (s, 1H), 6.94 (m, 1H), 7.10 (d, 2H), 7.20 (m, 1H), 7.26 (m, 2H), 7.34 (m, 2H), 7.46 (m, 1H)。

中间体C53

(2S)-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰)氨基]-2-{[(9H-芴-9-基甲氧基)羰基]氨基}丁酸

首先，中间体C52类似于C2用 (2S)-2-{[(苄氧基)羰基]氨基}-4-氧代丁酸苄酯还原性烷基化。该仲氨基随后如对中间体C27所述用乙酸2-氯-2-氧代乙酯酰化，这两种酯基团然后用在甲醇中的2M氢氧化锂溶液水解。将由此获得的中间体溶解在乙醇中，加入钯碳(10%)并在室温下在标准压力下用氢气氢化1小时。将脱保护的化合物置于二氧杂环己烷/水2:1中并在最后步骤中在N,N-二异丙基乙基胺存在下使用氯碳酸9H-芴-9-基甲酯引入Fmoc保护基。

LC-MS (方法1): R_t = 1.37 min；MS (ESIpos): m/z = 734 (M-H)^-。

中间体C54

N-[(2S)-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰)氨基]-2-{[(9H-芴-9-基甲氧基)羰基]氨基}丁酰基]-β-丙氨酸

首先，中间体C52类似于中间体C2用N-[(2S)-2-{[(苄氧基)羰基]氨基}-4-氧代丁酰基]-β-丙氨酸苄酯还原性烷基化。该仲氨基随后如对中间体C27所述用乙酸2-氯-2-氧代乙酯酰化。将由此获得的中间体溶解在乙醇中，加入钯碳(10%)并在室温下在标准压力下用氢气氢化1小时。这两种酯基团然后用在甲醇中的2M氢氧化锂溶液水解。将脱保护的化合物置于二氧杂环己烷/水2:1中并在最后步骤中在N,N-二异丙基乙基胺存在下使用氯碳酸9H-芴-9-基甲酯引入Fmoc保护基。这产生48毫克标题化合物。

LC-MS (方法1): R_t = 1.38 min；MS (ESIpos): m/z = 807 (M+H)⁺。

中间体C55

2-[3-({(1R)-1-[4-苄基-1-(2,5-二氟苯基)-1H-吡唑-3-基]-2,2-二甲基丙基}氨基)丙基]-1H-异吲哚-1,3(2H)-二酮

将340毫克（0.96毫摩尔）(1R)-1-[4-苄基-1-(2,5-二氟苯基)-1H-吡唑-3-基]-2,2-二甲基丙-1-胺溶解在7毫升纯DCM中，并在室温下加入69毫克（1.15毫摩尔，60微升）乙酸和284毫克（1.34毫摩尔）三乙酰氧基硼氢化钠。搅拌15分钟，然后加入233毫克（1.15毫摩尔）3-(1,3-二氧代-1,3-二氢-2H-异吲哚-2-基)丙醛。将该混合物在室温下搅拌4.5小时。加入另外233毫克（1.15毫摩尔）3-(1,3-二氧代-1,3-二氢-2H-异吲哚-2-基)丙醛、69毫克（1.15毫摩尔，60微升）乙酸和284毫克（1.34毫摩尔）三乙酰氧基硼氢化钠，并在室温下搅拌7小时。向该反应混合物加入乙酸乙酯，用饱和碳酸钠溶液洗涤。浓缩有机相，残留物通过制备型HPLC提纯两次 [1.) 洗脱剂: ACN/水 + 0.1% TFA, 梯度；2.) 洗脱剂: ACN/水 + 1% TFA+1.0% NEt₃]。这产生108毫克（理论值的21%）目标化合物。

LC-MS (方法1): R_t = 0.96 min；MS (ESIpos): m/z = 543 [M+H]⁺。

中间体C56

乙酸2-({(1R)-1-[4-苄基-1-(2,5-二氟苯基)-1H-吡唑-3-基]-2,2-二甲基丙基}[3-(1,3-二氧代-1,3-二氢-2H-异吲哚-2-基)丙基]氨基)-2-氧代乙酯

将102毫克（0.19毫摩尔）2-[3-({(1R)-1-[4-苄基-1-(2,5-二氟苯基)-1H-吡唑-3-基]-2,2-二甲基丙基}氨基)丙基]-1H-异吲哚-1,3(2H)-二酮最初装载在2毫升纯DCM中，并在室温下加入44毫克（0.43毫摩尔）三乙胺。在0℃下，加入溶解在1毫升纯DCM中的31毫克（0.23毫摩尔）乙酸2-氯-2-氧代乙酯。将该混合物在室温下搅拌40分钟。将另外26毫克乙酸2-氯-2-氧代乙酯溶解在0.5毫升纯DCM中，加入19毫克（0.19毫摩尔）三乙胺，并将该混合物在室温下搅拌60分钟。

加入水，该混合物在旋转蒸发器上浓缩，残留物通过制备型HPLC提纯（洗脱剂: ACN/水 + 0.1% TFA, 梯度）。这产生106毫克（理论值的88%）目标化合物。

LC-MS (方法1): R_t = 1.37 min；MS (ESIpos): m/z = 643 [M+H]⁺。

中间体C57

三氟乙酸/{(2S)-1-[(2-氨基乙基)氨基]-4-[{(1R)-1-[4-苄基-1-(2,5-二氟苯基)-1H-吡唑-3-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰)氨基]-1-氧代丁-2-基}氨基甲酸叔丁酯(1:1)

根据标准方法通过在HATU存在下将中间体C49与(2-氨基乙基)氨基甲酸9H-芴-9-基甲酯偶联和随后用哌啶裂解Fmoc保护基来制备标题化合物。这产生14毫克标题化合物（经2个步骤，理论值的40%）。

LC-MS (方法1): R_t = 0.98 min；MS (ESIpos): m/z = 657 (M+H)⁺。

中间体C58

(2S)-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰)氨基]-2-({[2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基]羰基}氨基)丁酸

首先，中间体C52类似于中间体C2用(2S)-2-{[(苄氧基)羰基]氨基}-4-氧代丁酸苄酯还原性烷基化。该仲氨基随后如对中间体C27所述用乙酸2-氯-2-氧代乙酯酰化，这两种酯基团然后用在甲醇中的2M氢氧化锂溶液水解。将由此获得的中间体溶解在乙醇中，加入钯碳(10%)并在室温下在标准压力下用氢气氢化1小时。

将500毫克（0.886毫摩尔）这种完全脱保护的中间体置于60毫升二氧杂环己烷中，并加入253毫克（0.975毫摩尔）1-({[2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基]羰基}氧基)吡咯烷-2,5-二酮和198微升三乙胺。在室温下搅拌24小时后，浓缩该配制品，残留物通过制备型HPLC提纯。适当馏分的合并、在真空下浓缩和在高真空下的干燥后产生312毫克（理论值的50%）标题化合物。

LC-MS (方法5): R_t = 4.61 min；MS (ESIpos): m/z = 658 (M+H)^-。

中间体C59

(2S)-4-({(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}[(2S)-2-甲氧基丙酰基]氨基)-2-{[(9H-芴-9-基甲氧基)羰基]氨基}丁酸

首先，(2S)-4-({(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}氨基)-2-{[(苄氧基)羰基]氨基}丁酸苄酯的仲氨基如对中间体C53所述在三乙胺存在下用(2S)-2-甲氧基丙酰氯（中间体C53的中间体）酰化。将所得中间体置于乙醇中，加入钯碳(10%)并在室温下在标准压力下用氢气氢化1小时。将脱保护的化合物置于二氧杂环己烷/水2:1中并在最后步骤中在N,N-二异丙基乙基胺存在下使用氯碳酸9H-芴-9-基甲酯引入Fmoc保护基。

LC-MS (方法1): R_t = 1.39 min；MS (ESIpos): m/z = 764 (M-H)^-。

中间体C60

(2S)-4-({(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}[(2S)-2-甲氧基丙酰基]氨基)-2-{[(9H-芴-9-基甲氧基)羰基]氨基}丁酸

类似于中间体C53进行合成。

LC-MS (方法1): R_t = 1.41 min；MS (ESIpos): m/z = 750 (M+H)⁺。

中间体C61

N-[(2S)-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰)氨基]-2-({[2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基]羰基}氨基)丁酰基]-β-丙氨酸

通过将60毫克（0.091毫摩尔）中间体C58与β-丙氨酸甲酯偶联、接着用2M氢氧化锂溶液进行酯裂解，制备标题化合物。这经2个步骤产生67毫克（理论值的61%）标题化合物。

LC-MS (方法1): R_t = 1.29 min；MS (ESIpos): m/z = 729 (M+H)⁺。

中间体C62

N-[(2S)-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰)氨基]-2-({[2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基]羰基}氨基)丁酰基]-D-丙氨酸

类似于中间体C61由中间体C58和D-丙氨酸甲酯制备标题化合物。

LC-MS (方法1): R_t = 1.32 min；MS (ESIpos): m/z = 729 (M+H)⁺。

中间体C63

三氟乙酸/{(2S)-1-[(2-氨基乙基)氨基]-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰)氨基]-1-氧代丁-2-基}氨基甲酸叔丁酯(1:1)

这种中间体的合成在第一步骤中以50毫克（0.075毫摩尔）中间体C3与26.2毫克（0.082毫摩尔）(2-氨基乙基)氨基甲酸9H-芴-9-基甲酯盐酸盐(1:1)在28.7毫克（0.15毫摩尔）1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐、22.9毫克（0.15毫摩尔）水合1-羟基-1H-苯并三唑和39微升N,N-二异丙基乙基胺存在下的偶联开始。在室温下搅拌18小时后浓缩，残留物通过制备型HPLC提纯。这产生45毫克（理论值的65%）这种中间体。

LC-MS (方法1): R_t = 1.51 min；MS (ESIpos): m/z = 921 (M+H)⁺。

将45毫克（0.049毫摩尔）这种中间体置于10毫升乙醇中并加入176微升40%的甲胺水溶液。在50℃下搅拌该配制品，在6小时后和在9小时后加入相同量的甲胺溶液。在50℃下进一步搅拌14小时后，加入另外700微升甲胺溶液，并在进一步搅拌24小时后，最后浓缩。将残留物置于DCM中并用水洗涤。浓缩有机相，残留物通过制备型HPLC提纯。适当馏分的浓缩和残留物在高真空下的干燥后产生32毫克（理论值的99%）{(2S)-1-[(2-氨基乙基)氨基]-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰)氨基]-1-氧代丁-2-基}氨基甲酸叔丁酯。

LC-MS (方法1): R_t = 0.95 min；MS (ESIpos): m/z = 657 (M+H)⁺。

中间体C64

三氟乙酸/{(2S)-1-[(2-氨基乙基)氨基]-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰)氨基]-1-氧代丁-2-基}氨基甲酸2-(三甲基甲硅烷基)乙酯(1:1)

类似于中间体C63由中间体C58制备标题化合物。

HPLC (方法11): R_t = 2.4 min；

LC-MS (方法1): R_t = 1.01 min；MS (ESIpos): m/z = 700 (M+H)⁺。

中间体C65

(8S)-8-{2-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-(乙醇酰)氨基]乙基}-2,2-二甲基-6,11-二氧代-5-氧杂-7,10-二氮杂-2-硅杂十四烷-14-酸

将215毫克（0.59毫摩尔）中间体L66最初装载在25毫升二氯甲烷中并加入377毫克（0.89毫摩尔）戴斯马丁氧化剂和144微升（1.78毫摩尔）吡啶。在室温下搅拌30分钟。该配制品然后用300毫升二氯甲烷稀释，有机相用10%的Na₂S₂O₃溶液、10%的柠檬酸溶液和饱和碳酸氢钠溶液各洗涤两次。有机相经硫酸镁干燥并在真空下蒸发溶剂。这产生305毫克醛，其不经进一步提纯即反应。

将175毫克（0.49毫摩尔）中间体C52溶解在50毫升二氯甲烷中，并加入147毫克（0.69毫摩尔）三乙酰氧基硼氢化钠和32.5微升乙酸。在室温下搅拌5分钟后，加入214毫克（0.593毫摩尔）上述醛，并将该配制品在室温下搅拌整夜。在此，代替预期产物，形成[(2S)-4-({(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}氨基)-1-(2,5-二氧代吡咯烷-1-基)丁烷-2-基]氨基甲酸2-(三甲基甲硅烷基)乙酯。由于这种酰亚胺也可转化成标题化合物，浓缩该配制品，残留物通过制备型HPLC提纯。在合并适当的含酰亚胺的馏分后，在真空下蒸发溶剂，残留物在高真空下干燥。这产生195毫克（58%）上文指定的酰亚胺。

LC-MS (方法5): R_t = 3.32 min；MS (ESIpos): m/z = 667 (M+H)⁺。

将65毫克（97.5微摩尔）这种酰亚胺置于15毫升二氯甲烷中，并加入367微升（3.4毫摩尔）乙酰氧基乙酰氯和595微升N,N-二异丙基乙基胺。在室温下搅拌30分钟后，在真空下在不加热下浓缩该配制品，残留物通过制备型HPLC提纯。合并适当的馏分并在溶剂蒸发和在高真空下干燥后产生28毫克（理论值的37%）乙酸(8S)-11-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-8-[(2,5-二氧代吡咯烷-1-基)甲基]-2,2-二甲基-6,12-二氧代-5-氧杂-7,11-二氮杂-2-硅杂十三烷-13-基酯。

LC-MS (方法1): R_t = 1.44 min；MS (ESIpos): m/z = 767 (M+H)⁺。

将28毫克（37微摩尔）这种中间体溶解在3毫升甲醇中，并加入548微升2M氢氧化锂溶液。在室温下搅拌10分钟后，用三氟乙酸将该配制品调节至pH 4，然后浓缩。残留物通过制备型HPLC提纯。合并适当的馏分，蒸发溶剂，残留物在高真空下干燥后，产生26毫克（理论值的96%）白色固体形式的标题化合物。

LC-MS (方法1): R_t = 1.33 min；MS (ESIpos): m/z = 743 (M+H)⁺。

中间体C66

[(2S)-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰)氨基]-1-{[2-(甘氨酰氨基)乙基]氨基}-1-氧代丁-2-基]氨基甲酸2-(三甲基甲硅烷基)乙酯

首先，根据肽化学的经典方法（HATU偶联和Boc裂解）由N-[(苄氧基)羰基]甘氨酸和(2-氨基乙基)氨基甲酸叔丁酯制备三氟乙酸/{2-[(2-氨基乙基)氨基]-2-氧代乙基}氨基甲酸苄酯(1:1)。

将13毫克（0.036毫摩尔）这种中间体和25毫克（0.033毫摩尔）中间体C58置于3毫升DMF中，并加入19毫克（0.05毫摩尔）HATU和17微升N,N-二异丙基乙基胺。

在室温下搅拌10分钟后浓缩，残留物通过制备型HPLC提纯。这产生17.8毫克（理论值的60%）中间体。

LC-MS (方法1): R_t = 1.36 min；MS (ESIpos): m/z = 891 (M+H)⁺。

将17毫克（0.019毫摩尔）这种中间体溶解在10毫升乙醇中，加入钯碳(10%)并在室温下在标准压力下用氢气氢化2小时。滤出催化剂，在真空下蒸发溶剂，残留物在高真空下干燥。这产生9毫克（理论值的62%）标题化合物。

LC-MS (方法1): R_t = 1.03 min；MS (ESIpos): m/z = 757 (M+H)⁺。

中间体C67

[3-({(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}氨基)丙基]氨基甲酸9H-芴-9-基甲酯

将605.3毫克（1.71毫摩尔）(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙-1-胺（中间体C52）最初装载在10.0毫升二氯甲烷中，加入506.7毫克（2.39毫摩尔）三乙酰氧基硼氢化钠和117.9毫克（1.96毫摩尔）乙酸并在室温下搅拌5分钟。将580.0毫克（1.96毫摩尔）(3-氧代丙基)氨基甲酸9H-芴-9-基甲酯（中间体L70）溶解在10.0毫升二氯甲烷中并将反应混合物在室温下搅拌整夜。该反应混合物用乙酸乙酯稀释，有机相用饱和碳酸钠溶液和饱和NaCl溶液各洗涤两次。有机相经硫酸镁干燥并在真空下蒸发溶剂。残留物在硅胶上提纯（洗脱剂: 环己烷/乙酸乙酯3:1）。在真空下蒸发溶剂，残留物在高真空下干燥。这产生514.7毫克（理论值的46%）标题化合物。

LC-MS (方法1): R_t = 1.10 min；MS (ESIpos): m/z = 634 (M+H)⁺。

中间体C68

[3-({(1R)-1-[4-苄基-1-(2,5-二氟苯基)-1H-吡唑-3-基]-2,2-二甲基丙基}氨基)丙基]氨基甲酸叔丁酯

与化合物中间体C67的合成类似地进行该合成。

1000.0毫克（2.81毫摩尔）(1R)-1-[4-苄基-1-(2,5-二氟苯基)-1H-吡唑-3-基]-2,2-二甲基丙-1-胺（中间体C47）

835.0毫克（3.94毫摩尔）三乙酰氧基硼氢化钠

194.0毫克（3.24毫摩尔）乙酸

560.0毫克（3.24毫摩尔）(3-氧代丙基)氨基甲酸叔丁酯

这产生695.8毫克（理论值的48%）标题化合物。

LC-MS (方法1): R_t = 1.02 min；MS (ESIpos): m/z = 513 (M+H)⁺。

中间体C69

11-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2,2-二甲基-6,12-二氧代-5-氧杂-14-硫杂-7,11-二氮杂-2-硅杂十七烷-17-酸

将117.0毫克（0.19毫摩尔）{3-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(氯乙酰基)氨基]丙基}氨基甲酸(2-(三甲基甲硅烷基)乙酯（中间体C70）和21.6毫克（0.20毫摩尔）3-硫烷基丙酸最初装载在3.0毫升甲醇中，加入89.5毫克（0.65毫摩尔）碳酸钾并在50℃下搅拌4小时。该反应混合物用乙酸乙酯稀释，有机相用水和饱和NaCl溶液洗涤。有机相经硫酸镁干燥，在真空下蒸发溶剂，残留物在高真空下干燥。该残留物不经进一步提纯即用于该合成的下一步骤。这产生106.1毫克（理论值的73%）标题化合物。

LC-MS (方法1): R_t = 1.42 min；MS (ESIneg): m/z = 700 (M-H)^-。

中间体C70

{3-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(氯乙酰基)氨基]丙基}氨基甲酸(2-(三甲基甲硅烷基)乙酯

将908.1毫克（1.63毫摩尔）[3-({(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}氨基)丙基]氨基甲酸2-(三甲基甲硅烷基)乙酯（见中间体C11的合成）和545.6毫克（5.39毫摩尔）三乙胺最初装载在10.0毫升二氯甲烷中，并冷却至0℃。在此温度下，加入590.5毫克（5.23毫摩尔）氯乙酰氯并在室温下搅拌整夜。该反应混合物用乙酸乙酯稀释，有机相用饱和碳酸氢钠溶液和饱和氯化铵溶液各洗涤三次。有机相用饱和NaCl溶液洗涤并经硫酸镁干燥。残留物通过制备型RP-HPLC提纯（柱: Reprosil 250x30；10µ, 流速: 50 ml/min, MeCN/水, 0.1% TFA）。在真空下蒸发溶剂，残留物在高真空下干燥。这产生673.8毫克（理论值的65%）标题化合物。

LC-MS (方法1): R_t = 1.53 min；MS (ESIneg): m/z = 676 (M+HCOO^-)^-。

中间体C71

S-(11-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2,2-二甲基-6,12-二氧代-5-氧杂-7,11-二氮杂-2-硅杂十三烷-13-基)-L-半胱氨酸/三氟乙酸(1:1)

将536.6毫克（4.43毫摩尔）L-半胱氨酸与531.5毫克（6.33毫摩尔）碳酸氢钠一起悬浮在2.5毫升水中。加入溶解在25.0毫升异丙醇中的400.0毫克（0.63毫摩尔）{3-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(氯乙酰基)氨基]丙基}氨基甲酸2-(三甲基甲硅烷基)乙酯（中间体C70）和1.16克（7.59毫摩尔）1,8-二氮杂双环[5.4.0]十一-7-烯。将反应混合物在50℃下搅拌1.5小时。将乙酸乙酯添加到反应混合物中，有机相用饱和碳酸氢钠溶液反复洗涤和用饱和NaCl溶液洗涤一次。有机相经硫酸镁干燥，在真空下蒸发溶剂，残留物在高真空下干燥。残留物通过制备型RP-HPLC提纯（柱: Reprosil 250x30；10µ, 流速: 50 ml/min, MeCN/水, 0.1% TFA）。在真空下蒸发溶剂，残留物在高真空下干燥。这产生449.5毫克（理论值的86%）标题化合物。

LC-MS (方法1): R_t = 1.20 min；MS (ESIpos): m/z = 717 (M+H)⁺。

中间体C72

(9S)-9-{[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰) 氨基]甲基}-2,2-二甲基-6,11-二氧代-5-氧杂-7,10-二氮杂-2-硅杂十四烷-14-酸

将90毫克（0.212毫摩尔）中间体L72最初装载在6毫升二氯甲烷中，并加入86微升（1.06毫摩尔）吡啶和135毫克（0.318毫摩尔）戴斯马丁氧化剂。在室温下搅拌30分钟。该配制品然后用30毫升二氯甲烷稀释，有机相用10%的Na₂S₂O₃溶液洗涤两次和用5%的柠檬酸溶液洗涤一次。有机相经硫酸镁干燥并在真空下蒸发溶剂。由此获得的醛不经进一步提纯即反应。

将63毫克（0.177毫摩尔）中间体C52溶解在15毫升二氯甲烷中，并加入52.4毫克（0.247毫摩尔）三乙酰氧基硼氢化钠和20.2微升乙酸。在室温下搅拌5分钟后，加入89.6毫克（0.212毫摩尔）上述醛，并将该配制品在室温下搅拌20分钟。该配制品在真空下浓缩，残留物通过制备型HPLC提纯。在合并适当的馏分后，在真空下蒸发溶剂，残留物从乙腈/水中冻干。这产生71毫克（经2个步骤，理论值的53%）(9R)-9-[({(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}氨基)甲基]-2,2-二甲基-6,11-二氧代-5-氧杂-7,10-二氮杂-2-硅杂十四烷-14-酸苄酯。

LC-MS (方法1): R_t = 1.21 min；MS (ESIpos): m/z = 761 (M+H)⁺。

将70毫克（92微摩尔）这种中间体置于15毫升二氯甲烷中，冷却至10℃并加入54微升三乙胺和25.5微升（0.23毫摩尔）乙酰氧基乙酰氯。在室温下搅拌1小时后，再加入相同量的酰基氯和三乙胺，并在室温下下搅拌另外1小时后再次加入。该配制品随后在室温下搅拌另外30分钟，然后在真空下浓缩，残留物通过制备型HPLC提纯。合并适当的馏分，在溶剂蒸发和残留物从乙腈/水中冻干后产生46.5毫克（理论值的59%）酰化中间体。

LC-MS (方法1): R_t = 1.53 min；MS (ESIpos): m/z = 861 (M+H)⁺。

将46毫克（53微摩尔）这种中间体溶解在5毫升甲醇中，并加入2.7毫升2M氢氧化锂溶液。在室温下搅拌10分钟后，用乙酸将该配制品调节至pH 3-4，然后用15毫升水稀释。水相用乙酸乙酯萃取，有机相经硫酸镁干燥并浓缩。残留物从乙腈/水中冻干并在残留物在高真空下干燥后产生37毫克（理论值的90%）白色固体形式的标题化合物。

LC-MS (方法1): R_t = 1.32 min；MS (ESIpos): m/z = 729 (M+H)⁺。

中间体C73

S-(11-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2,2-二甲基-6,12-二氧代-5-氧杂-7,11-二氮杂-2-硅杂十三烷-13-基)-N-[3-(三甲基甲硅烷基)丙酰基]-L-半胱氨酸

将619毫克（0.86毫摩尔）S-(11-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2,2-二甲基-6,12-二氧代-5-氧杂-7,11-二氮杂-2-硅杂十三烷-13-基)-L-半胱氨酸/三氟乙酸(1:1)（中间体C71）最初装载在8.8毫升二氯甲烷中，并加入87毫克（0.86毫摩尔）三乙胺和224毫克（0.86毫摩尔）N-[2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基羰氧基]吡咯烷-2,5-二酮。在1小时后，加入45毫克（0.17毫摩尔）N-[2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基羰氧基]吡咯烷-2,5-二酮。将反应混合物在室温下搅拌1小时。该混合物在真空下浓缩，将残留物置于二氯甲烷中，有机相然后用水和饱和碳酸氢钠溶液洗涤两次。有机相经硫酸镁干燥，在旋转蒸发器上浓缩并在高真空下干燥。残留物不经进一步提纯即进一步使用。这产生602毫克（71%，纯度 87%）标题化合物。

LC-MS (方法1): R_t = 1.58 min；MS (ESIpos): m/z = 861 (M+H)⁺。

中间体L1

三氟乙酸/N-(2-氨基乙基)-2-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙酰胺(1:1)

通过肽化学的经典方法由市售(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙酸和(2-氨基乙基)氨基甲酸叔丁酯制备标题化合物。

HPLC (方法11): R_t = 0.19 min；

LC-MS (方法1): R_t = 0.17 min；MS (ESIpos): m/z = 198 (M+H)⁺。

中间体L2

三氟乙酸/rel-(1R,2S)-2-氨基-N-[2-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙基]环戊烷甲酰胺(1:1)

由50毫克（0.214毫摩尔）市售顺式-2-[(叔丁氧基羰基)氨基]-1-环戊烷甲酸和60毫克（0.235毫摩尔）同样市售的三氟乙酸/1-(2-氨基乙基)-1H-吡咯-2,5-二酮(1:1)通过与EDC/HOBT偶联和随后用TFA脱保护制备标题化合物。这产生36毫克（经2个步骤，理论值的38%）标题化合物。

HPLC (方法11): R_t = 0.2 min；

LC-MS (方法1): R_t = 0.17 min；MS (ESIpos): m/z = 252 (M+H)⁺。

中间体L3

三氟乙酸/(1S,2R)-2-氨基-N-[2-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙基]环戊烷甲酰胺(1:1)

由50毫克（0.214毫摩尔）市售(1S,2R)-2-[(叔丁氧基羰基)氨基]环戊烷甲酸与72毫克（0.283毫摩尔）同样市售的三氟乙酸/1-(2-氨基乙基)-1H-吡咯-2,5-二酮(1:1)通过与EDC/HOBT偶联和随后用TFA脱保护制备标题化合物。这产生13毫克（经2个步骤，理论值的16%）标题化合物。

HPLC (方法11): R_t = 0.2 min；

LC-MS (方法1): R_t = 0.2 min；MS (ESIpos): m/z = 252 (M+H)⁺。

中间体L4

三氟乙酸/N-(2-氨基乙基)-4-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)环己烷甲酰胺(1:1)

通过肽化学的经典方法由市售1-[(4-{[(2,5-二氧代吡咯烷-1-基)氧基]羰基}环己基)甲基]-1H-吡咯-2,5-二酮和(2-氨基乙基)氨基甲酸叔丁酯制备标题化合物。

HPLC (方法11): R_t = 0.26 min；

LC-MS (方法1): R_t = 0.25 min；MS (ESIpos): m/z = 280 (M+H)⁺。

中间体L5

三氟乙酸/N-[4-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)苯基]-β-丙氨酰胺(1:1)

通过肽化学的经典方法由市售1-(4-氨基苯基)-1H-吡咯-2,5-二酮和N-(叔丁氧基羰基)-β-丙氨酸制备标题化合物。

HPLC (方法11): R_t = 0.22 min；

LC-MS (方法1): R_t = 0.22 min；MS (ESIpos): m/z = 260 (M+H)⁺。

中间体L6

三氟乙酸/N-[6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰基]-L-缬氨酰基-L-丙氨酰基-L-赖氨酸叔丁酯(1:1)

通过最初在EDC/HOBT存在下将市售6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酸与通过肽化学的经典方法制成的部分保护的肽L-缬氨酰基-L-丙氨酰基-N6-(叔丁氧基羰基)-L-赖氨酸叔丁酯偶联，制备标题化合物。此后在温和条件下通过在室温下在DCM中的5%三氟乙酸中搅拌而在氨基处脱保护，这以37%的收率产生标题化合物。

HPLC (方法11): R_t = 1.29 min；

LC-MS (方法1): R_t = 0.62 min；MS (ESIpos): m/z = 566 (M+H)⁺。

中间体L7

三氟乙酸/β-丙氨酰基-L-缬氨酰基-N⁵-氨基甲酰基-N-[4-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)苯基]-L-鸟氨酰胺(1:1)

根据肽化学的经典方法由市售1-(4-氨基苯基)-1H-吡咯-2,5-二酮通过相继在HATU存在下与N2-(叔丁氧基羰基)-N5-氨基甲酰基-L-鸟氨酸偶联、用TFA脱保护、与N-(叔丁氧基羰基)-L-缬氨酸2,5-二氧代吡咯烷-1-基酯偶联、用TFA脱保护、与N-(叔丁氧基羰基)-β-丙氨酸2,5-二氧代吡咯烷-1-基酯偶联和再次用TFA脱保护而制备标题化合物。这产生32毫克标题化合物。

HPLC (方法11): R_t = 0.31 min；

LC-MS (方法1): R_t = 0.47 min；MS (ESIpos): m/z = 516 (M+H)⁺。

中间体L8

三氟乙酸/L-丙氨酰基-N⁵-氨基甲酰基-N-[4-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)苯基]-L-鸟氨酰胺(1:1)

根据肽化学的经典方法由市售1-(4-氨基苯基)-1H-吡咯-2,5-二酮通过相继在HATU存在下与N²-(叔丁氧基羰基)-N⁵-氨基甲酰基-L-鸟氨酸偶联、用TFA脱保护、与N-(叔丁氧基羰基)-L-丙氨酸2,5-二氧代吡咯烷-1-基酯偶联和再次用TFA脱保护而制备标题化合物。这产生171毫克标题化合物。

HPLC (方法11): R_t = 0.23 min；

LC-MS (方法7): R_t = 0.3 min；MS (ESIpos): m/z = 417 (M+H)⁺。

中间体L9

三氟乙酸/β-丙氨酰基-L-缬氨酰基-N⁵-氨基甲酰基-N-[4-(2-甲氧基-2-氧代乙基)苯基]-L-鸟氨酰胺(1:1)

类似于中间体L7由市售(4-氨基苯基)乙酸甲酯制备标题化合物。这产生320毫克标题化合物。

HPLC (方法11): R_t = 0.45 min；

LC-MS (方法1): R_t = 0.48 min；MS (ESIpos): m/z = 493 (M+H)⁺。

中间体L10

N-[6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰基]-L-缬氨酰基-L-丙氨酰基-rel-N⁶-{[(1R,2S)-2-氨基环戊基]羰基}-L-赖氨酸/三氟乙酸(1:2)

由中间体L6通过用EDC/HOBT与顺式-2-[(叔丁氧基羰基)氨基]-1-环戊烷甲酸偶联和随后用TFA脱保护而制备标题化合物。这产生12毫克（经2个步骤，理论值的52%）标题化合物。

HPLC (方法11): R_t = 1.45 min；

LC-MS (方法1): R_t = 0.73 min；MS (ESIpos): m/z = 677 (M+H)⁺。

中间体L11

N-[6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰基]-L-缬氨酰基-L-丙氨酰基-N⁶-{[(1S,2R)-2-氨基环戊基]羰基}-L-赖氨酸/三氟乙酸(1:2)

由中间体L6通过用EDC/HOBT与(1S,2R)-2-[(叔丁氧基羰基)氨基]环戊烷甲酸偶联和随后用TFA脱保护而制备标题化合物。这产生11毫克（经2个步骤，理论值的39%）标题化合物。

HPLC (方法11): R_t = 1.45 min；

LC-MS (方法1): R_t = 0.74 min；MS (ESIpos): m/z = 677 (M+H)⁺。

中间体L12

三氟乙酸/1-[2-(2-氨基乙氧基)乙基]-1H-吡咯-2,5-二酮(1:1)

将381毫克（2.46毫摩尔）2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-甲酸甲酯添加到溶解在7毫升二氧杂环己烷/水1:1中的228毫克（1.12毫摩尔）[2-(2-氨基乙氧基)乙基]氨基甲酸叔丁酯中。然后加入1.2毫升饱和碳酸氢钠溶液并在室温下搅拌该配制品。在搅拌总共5天和另外两次加入相同量的碳酸氢钠溶液后，该配制品通过用三氟乙酸酸化、在旋转蒸发器上浓缩和通过制备型HPLC提纯而后处理。合并适当的馏分，在真空下除去溶剂，且残留物从乙腈/水1:1中冻干。

将残留物置于3毫升二氯甲烷中并加入1毫升三氟乙酸。在室温下搅拌15分钟后，在真空下除去溶剂，且残留物从乙腈/水1:1中冻干。这产生70毫克（经2个步骤，理论值的67%）树脂状残留物形式的标题化合物。

HPLC (方法11): R_t = 0.2 min；

LC-MS (方法1): R_t = 0.18 min；MS (ESIpos): m/z = 185 (M+H)⁺。

中间体L13

三氟乙酸/N2-[(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙酰基]-L-赖氨酸叔丁酯(1:1)

通过类似于中间体L6在EDC/HOBT存在下将(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙酸与N6-(叔丁氧基羰基)-L-赖氨酸叔丁酯盐酸盐(1:1)偶联和随后温和裂解叔丁氧基羰基保护基而制备标题化合物。

HPLC (方法11): R_t = 0.42 min；

LC-MS (方法1): R_t = 0.43 min；MS (ESIpos): m/z = 340 (M+H)⁺。

中间体L14

三氟乙酸/1-[2-(4-氨基哌嗪-1-基)-2-氧代乙基]-1H-吡咯-2,5-二酮(1:1)

类似于中间体L2由哌嗪-1-基氨基甲酸叔丁酯和(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙酸经2个步骤制备标题化合物。

HPLC (方法11): R_t = 0.2 min；

LC-MS (方法3): R_t = 0.25 min；MS (ESIpos): m/z = 239 (M+H)⁺。

中间体L15

三氟乙酸/N-(2-氨基乙基)-3-(2-{2-[2-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙氧基]乙氧基}乙氧基)丙酰胺(1:1)

将2.93克（10.58毫摩尔）3-{2-[2-(2-氨基乙氧基)乙氧基]乙氧基}丙酸叔丁酯溶解在100毫升二氧杂环己烷/水1:1中，并加入3.28克（21.15毫摩尔）2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-甲酸甲酯和饱和碳酸氢钠溶液直至达到6-7的pH。将该溶液在室温下搅拌30分钟，然后在真空下蒸发1,4-二氧杂环己烷。然后加入200毫升水，并将该混合物用每次300毫升乙酸乙酯萃取三次。合并有机萃取物，经硫酸镁干燥并过滤。浓缩后产生棕色油形式的3-(2-{2-[2-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙氧基]乙氧基}乙氧基)丙酸叔丁酯，其随后在高真空下干燥。

HPLC (方法11): R_t = 1.5 min；

LC-MS (方法3): R_t = 0.88 min；MS (ESIpos): m/z = 375 (M+NH₄)⁺。

这种中间体通过标准方法（用TFA脱保护、与(2-氨基乙基)氨基甲酸叔丁酯偶联和再次用TFA脱保护）转化成标题化合物。

HPLC (方法11): R_t = 0.2 min；

LC-MS (方法3): R_t = 0.25 min；MS (ESIpos): m/z = 344 (M+H)⁺。

中间体L16

N-[6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰基]-L-缬氨酰基-N⁵-氨基甲酰基-L-鸟氨酸

将535毫克（1.73毫摩尔）市售1-{6-[(2,5-二氧代吡咯烷-1-基)氧基]-6-氧代己基}-1H-吡咯-2,5-二酮和930毫升N,N-二异丙基乙基胺添加到266毫克（1.33毫摩尔）L-缬氨酰基-N⁵-氨基甲酰基-L-鸟氨酸在24毫升DMF中的溶液中。该配制品在超声浴中处理24小时，然后在真空下浓缩至干。留下的残留物通过制备型HPLC提纯并在适当馏分的浓缩和残留物在高真空下的干燥后产生337毫克（理论值的50%）标题化合物。

HPLC (方法11): R_t = 0.4 min；

LC-MS (方法3): R_t = 0.58 min；MS (ESIpos): m/z = 468 (M+H)⁺。

中间体L17

三氟乙酸/N-[6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰基]-L-缬氨酰基-N⁵-氨基甲酰基-L-鸟氨酰基-L-赖氨酸叔丁酯(1:1)

通过最初在EDC/HOBT和N,N-二异丙基乙基胺存在下将172毫克（0.37毫摩尔）中间体L16和125毫克（0.37毫摩尔）N6-(叔丁氧基羰基)-L-赖氨酸叔丁酯盐酸盐(1:1)偶联、然后通过在室温下在DCM中的10%三氟乙酸中搅拌2小时在温和条件下将氨基脱保护，制备标题化合物。从乙腈/水中冻干后经2个步骤产生194毫克（理论值的49%）标题化合物。

HPLC (方法11): R_t = 1.1 min；

LC-MS (方法1): R_t = 0.58 min；MS (ESIpos): m/z = 652 (M+H)⁺。

中间体L18

三氟乙酸/β-丙氨酰基-L-丙氨酰基-N⁵-氨基甲酰基-N-[4-(2-甲氧基-2-氧代乙基)苯基]-L-鸟氨酰胺(1:1)

由(4-氨基苯基)乙酸甲酯类似于中间体L7相继根据肽化学的经典方法通过在HATU存在下连接N²-(叔丁氧基羰基)-N⁵-氨基甲酰基-L-鸟氨酸、用TFA脱保护、与N-(叔丁氧基羰基)-L-丙氨酸2,5-二氧代吡咯烷-1-基酯偶联、用TFA脱保护、与N-(叔丁氧基羰基)-β-丙氨酸2,5-二氧代吡咯烷-1-基酯偶联和再次用TFA脱保护而制备标题化合物，这产生330毫克标题化合物。

HPLC (方法11): R_t = 0.29 min；

LC-MS (方法1): R_t = 0.41 min；MS (ESIpos): m/z = 465 (M+H)⁺。

中间体L19

三氟乙酸/L-丙氨酰基-N⁵-氨基甲酰基-N-(4-{[(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙酰基]氨基}苯基)-L-鸟氨酰胺(1:1)

由1,4-苯二胺相继根据肽化学的经典方法制备标题化合物。在第一步骤中，942毫克（8.72毫摩尔）1,4-苯二胺在HATU和N,N-二异丙基乙基胺存在下用0.8克（2.9毫摩尔）N²-(叔丁氧基羰基)-N⁵-氨基甲酰基-L-鸟氨酸单酰化。在第二步骤中，以类似方式，第二苯胺氨基在HATU和N,N-二异丙基乙基胺存在下用(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙酸酰化。用TFA脱保护、与N-(叔丁氧基羰基)-L-丙氨酸2,5-二氧代吡咯烷-1-基酯偶联和再次用TFA脱保护随之在3个进一步合成步骤中产生标题化合物，通过这一途径获得148毫克。

LC-MS (方法1): R_t = 0.21 min；MS (ESIpos): m/z = 474 (M+H)⁺.

LC-MS (方法4): R_t = 0.2 min；MS (ESIpos): m/z = 474 (M+H)⁺。

中间体L20

三氟乙酸/L-缬氨酰基-N⁵-氨基甲酰基-N-[4-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)苯基]-L-鸟氨酰胺(1:1)

根据肽化学的经典方法类似于中间体L8由市售1-(4-氨基苯基)-1H-吡咯-2,5-二酮通过相继在HATU存在下与N²-(叔丁氧基羰基)-N⁵-氨基甲酰基-L-鸟氨酸偶联、用TFA脱保护、与N-(叔丁氧基羰基)-L-缬氨酸2,5-二氧代吡咯烷-1-基酯偶联和再次用TFA脱保护而制备标题化合物，这产生171毫克标题化合物。

HPLC (方法11): R_t = 0.28 min；

LC-MS (方法1): R_t = 0.39 min；MS (ESIpos): m/z = 445 (M+H)⁺。

中间体L21

L-缬氨酰基-N⁶-(叔丁氧基羰基)-N-[4-(2-甲氧基-2-氧代乙基)苯基]-L-赖氨酰胺

根据肽化学的经典方法由市售0.42克（2.56毫摩尔）(4-氨基苯基)乙酸甲酯通过相继在HATU和N,N-二异丙基乙基胺存在下与N⁶-(叔丁氧基羰基)-N²-[(9H-芴-9-基甲氧基)羰基]-L-赖氨酸偶联、用哌啶脱保护、在N,N-二异丙基乙基胺存在下与N-[(苄氧基)羰基]-L-缬氨酸2,5-二氧代吡咯烷-1-基酯偶联和随后经10%钯-活性炭进行氢解裂解苄氧基羰基保护基而制备标题化合物。这产生360毫克（经4个步骤，理论值的32%）标题化合物。

HPLC (方法11): R_t = 1.5 min；

LC-MS (方法1): R_t = 0.73 min；MS (ESIpos): m/z = 493 (M+H)⁺。

中间体L22

三氟乙酸/N-[(9H-芴-9-基甲氧基)羰基]-L-缬氨酰基-N-{4-[(2S)-2-氨基-3-甲氧基-3-氧代丙基]苯基}-N⁵-氨基甲酰基-L-鸟氨酰胺(1:1)

由N-(叔丁氧基羰基)-4-硝基-L-苯基丙氨酸相继根据肽化学的经典方法制备标题化合物。2.5克（8.06毫摩尔）这种原材料在第一步骤中首先转化成铯盐，然后在DMF中用碘甲烷转化成甲酯。

然后在甲醇经10%钯-活性炭氢解地将硝基转化成氨基。

由此生成的氨基随后在HATU和N,N-二异丙基乙基胺存在下在DMF中用 N⁵-氨基甲酰基-N²-[(9H-芴-9-基甲氧基)羰基]-L-鸟氨酸酰化。在下一步骤中，在DMF中用哌啶裂解Fmoc基团。

然后在DMF中在1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐、水合1-羟基-1H-苯并三唑和N,N-二异丙基乙基胺存在下与N-[(9H-芴-9-基甲氧基)羰基]-L-缬氨酸进行偶联，最后用三氟乙酸裂解叔丁氧基羰基。

HPLC (方法11): R_t = 1.6 min；

LC-MS (方法1): R_t = 0.77 min；MS (ESIpos): m/z = 673 (M+H)⁺。

中间体L23

三氟乙酸/N-[2-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙基]-β-丙氨酰胺(1:1)

由市售三氟乙酸/1-(2-氨基乙基)-1H-吡咯-2,5-二酮(1:1)通过在EDCI/HOBT和N,N-二异丙基乙基胺存在下与N-(叔丁氧基羰基)-β-丙氨酸偶联和随后用三氟乙酸脱保护而制备标题化合物。

HPLC (方法11): R_t = 0.19 min。

中间体L24

三氟乙酸/1-氨基-N-[2-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙基]环丙烷甲酰胺(1:1)

将114毫克（0.67毫摩尔）市售1-[(叔丁氧基羰基)氨基]环丙烷甲酸溶解在25毫升DCM中，加入110毫克（0.623毫摩尔）市售三氟乙酸/1-(2-氨基乙基)-1H-吡咯-2,5-二酮(1:1)和395微升N,N-二异丙基乙基胺并冷却至-10℃。然后加入217毫克（0.793毫摩尔）2-溴-1-乙基吡啶鎓四氟硼酸盐，并将该配制品在室温下搅拌2小时。然后用乙酸乙酯稀释并相继用10%的柠檬酸、饱和碳酸氢钠溶液和饱和氯化钠溶液萃取，然后经硫酸镁干燥并浓缩。在高真空下的干燥后产生152毫克受保护的中间体。

然后将这些置于10毫升DCM中并用1毫升三氟乙酸脱保护。从乙腈/水中冻干后产生158毫克（经2个步骤，理论值的71%）标题化合物。

HPLC (方法11): R_t = 0.19 min.

LC-MS (方法3): R_t = 0.98 min；MS (ESIpos): m/z = 224 (M+H)⁺。

中间体L25

N-[31-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-29-氧代-4,7,10,13,16,19,22,25-八氧杂-28-氮杂三十一烷-1-酰基]-L-缬氨酰基-L-丙氨酸

将31.4毫克（0.17毫摩尔）缬氨酰基-L-丙氨酸溶解在3.0毫升DMF中并加入115.0毫克（0.17毫摩尔）3-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-N-{27-[(2,5-二氧代吡咯烷-1-基)氧基]-27-氧代-3,6,9,12,15,18,21,24-八氧杂二十七烷-1-基}丙酰胺和33.7毫克（0.0.33毫摩尔）三乙胺。在室温下搅拌整夜。该反应混合物直接通过制备型RP-HPLC提纯（柱: Reprosil 250x30；10µ, 流速: 50 ml/min, MeCN/水）。在真空下蒸发溶剂，残留物在高真空下干燥。这产生74.1毫克（理论值的58%）标题化合物。

LC-MS (方法1): R_t = 0.61 min；MS (ESIpos): m/z = 763 [M+H]⁺。

中间体L26

L-缬氨酰基-N⁶-(叔丁氧基羰基)-L-赖氨酸

将600.0毫克（1.58毫摩尔）N²-[(苄氧基)羰基]-N⁶-(叔丁氧基羰基)-L-赖氨酸悬浮在25.0毫升水/乙醇/THF（1:1:0.5）中，加入钯碳(10%)并在室温下在标准压力下用氢气氢化5小时。滤出催化剂并在真空下蒸发溶剂。所得化合物不经进一步提纯即用于下一步骤。

LC-MS (方法1): R_t = 0.42 min；MS (ESIpos): m/z = 247 [M+H]⁺。

将180毫克（0.73毫摩尔）N⁶-(叔丁氧基羰基)-L-赖氨酸溶解在5.0毫升DMF中并加入74.0毫克（0.73毫摩尔）三乙胺。然后加入254.6毫克（0.73毫摩尔）N-[(苄氧基)羰基]-L-缬氨酸2,5-二氧代吡咯烷-1-基酯和74.0毫克（0.73毫摩尔）三乙胺。将反应混合物在室温下搅拌3.5小时。该反应溶液直接通过制备型RP-HPLC提纯（柱: Reprosil 250x30；10µ, 流速: 50 ml/min, MeCN/水, 0.1% TFA）。在真空下蒸发溶剂，残留物在高真空下干燥。这产生294.1毫克（理论值的76%）N-[(苄氧基)羰基]-L-缬氨酰基-N⁶-(叔丁氧基羰基)-L-赖氨酸。

LC-MS (方法1): R_t = 0.97 min；MS (ESIpos): m/z = 480 [M+H]⁺。

将272.2毫克（0.57毫摩尔）N-[(苄氧基)羰基]-L-缬氨酰基-N⁶-(叔丁氧基羰基)-L-赖氨酸最初装载在20.0毫升乙酸乙酯/乙醇/THF（1:1:1）中并加入27.2毫克钯-活性炭。在室温下在标准压力下用氢气氢化5小时。借助Celite^(R)滤出，滤饼用乙酸乙酯/乙醇/THF（1:1:1）后洗涤。在真空下蒸发溶剂，残留物在高真空下干燥。标题化合物（182毫克，理论值的72%）不经进一步提纯即用于下一反应步骤。

LC-MS (方法1): R_t = 0.53 min；MS (ESIpos): m/z = 346 [M+H]⁺。

中间体L27

N-[31-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-29-氧代-4,7,10,13,16,19,22,25-八氧杂-28-氮杂三十一烷-1-酰基]-L-缬氨酰基-N⁶-(叔丁氧基羰基)-L-赖氨酸

将30毫克（0.07毫摩尔）L-缬氨酰基-N6-(叔丁氧基羰基)-L-赖氨酸（中间体L26）和46.1毫克（0.07毫摩尔）3-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-N-{27-[(2,5-二氧代吡咯烷-1-基)氧基]-27-氧代-3,6,9,12,15,18,21,24-八氧杂二十七烷-1-基}丙酰胺最初装载在1.5毫升DMF中并加入6.8毫克（0.07毫摩尔）4-甲基吗啉。该反应溶液在室温下搅拌整夜。该反应混合物直接通过制备型RP-HPLC提纯（柱: Reprosil 250x30；10µ, 流速: 50 ml/min, MeCN/水）。在真空下蒸发溶剂，残留物在高真空下干燥。这产生55.6毫克（理论值的90%）标题化合物。

LC-MS (方法1): R_t = 0.77 min；MS (ESIpos): m/z = 920 [M+H]⁺。

中间体L28

3-甲酰基-4-({[2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基]羰基}氨基)吡咯烷-1-甲酸叔丁酯

将461.7毫克（1.15毫摩尔）3-乙基-4-({[2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基]羰基}氨基)吡咯烷-1,3-二甲酸1-叔丁酯（根据WO 2006/066896的文献程序制备这种化合物）最初装载在5.0毫升纯二氯甲烷中并冷却至-78℃。然后逐滴缓慢加入326.2毫克（2.29毫摩尔）二异丁基氢化铝溶液（1 M在THF中）并在-78℃下搅拌2小时（通过薄层色谱法监测（石油醚/乙酸乙酯 = 3:1））。逐滴加入溶解在60毫升水中的1.3克（4.59毫摩尔）酒石酸钾钠并使反应混合物升温至室温。将乙酸乙酯添加到反应混合物中，水相用乙酸乙酯萃取三次。合并的有机相用饱和NaCl溶液洗涤一次并经硫酸镁干燥。在真空下蒸发溶剂，残留物在高真空下干燥。这产生629.0毫克作为粗产物的标题化合物，其不经进一步提纯即立即用于下一反应步骤。

中间体L29

3-甲酰基-4-[({[2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基]羰基}氨基)甲基]吡咯烷-1-甲酸叔丁酯

非对映体的混合物

将807.1毫克（2.34毫摩尔）3-({[叔丁基(二甲基)甲硅烷基]氧基}甲基)-4-(羟甲基)吡咯烷-1-甲酸叔丁酯（根据WO 2006/100036的文献程序制备）最初装载在8.0毫升二氯甲烷中并加入236.4毫克（2.34毫摩尔）三乙胺。在0℃下，逐滴加入267.6毫克（2.34毫摩尔）甲磺酰氯，并将反应混合物在室温下搅拌整夜。加入另外133.8毫克（1.17毫摩尔）甲磺酰氯和118.2毫克（1.17毫摩尔）三乙胺。将反应混合物在室温下搅拌整夜。用二氯甲烷稀释，有机相用饱和碳酸氢钠溶液、5%的硫酸氢钾溶液和饱和NaCl溶液各洗涤一次。在经硫酸镁干燥后，在真空下蒸发溶剂，残留物在Biotage Isolera上提纯（硅胶，柱50 g SNAP, 流速66 ml/min, 环己烷/乙酸乙酯）。在真空下蒸发溶剂，残留物在高真空下干燥。这产生402.0毫克（理论值的41%）化合物3-({[叔丁基(二甲基)甲硅烷基]氧基}甲基)-4-{[(甲基磺酰基)氧基]甲基}吡咯烷-1-甲酸叔丁酯。

LC-MS (方法1): R_t = 1.38 min；MS (ESIpos): m/z = 424 [M+H]⁺。

将400.0毫克（0.94毫摩尔）3-({[叔丁基(二甲基)甲硅烷基]氧基}甲基)-4-{[(甲基磺酰基)氧基]甲基}吡咯烷-1-甲酸叔丁酯最初装载在5.0毫升DMF中并加入98.2毫克（1.51毫摩尔）叠氮化钠。将反应混合物在40℃下搅拌10小时。然后加入另外30.7毫克（0.47毫摩尔）叠氮化钠并在40℃下搅拌另外10小时。加入乙酸乙酯，该有机相用水反复洗涤。在有机相经硫酸镁干燥后，在真空下蒸发溶剂，残留物在高真空下干燥。这产生309.5毫克（理论值的89%）化合物3-(叠氮甲基)-4-({[叔丁基(二甲基)甲硅烷基]氧基}甲基)吡咯烷-1-甲酸叔丁酯。该化合物不经进一步提纯即用于该合成的下一步骤。

LC-MS (方法1): R_t = 1.50 min；MS (ESIpos): m/z = 371 [M+H]⁺。

将250毫克（0.68毫摩尔）3-(叠氮甲基)-4-({[叔丁基(二甲基)甲硅烷基]氧基}甲基)吡咯烷-1-甲酸叔丁酯溶解在10.0毫升乙酸乙酯/乙醇(1:1)中并加入25.0毫克钯-活性炭(10%)。在室温下在标准压力下用氢气氢化8小时。该反应经Celite^(R)过滤，滤饼用乙酸乙酯充分洗涤。在真空下蒸发溶剂，残留物在高真空下干燥。这产生226.2毫克（理论值的82%）化合物3-(氨基甲基)-4-({[叔丁基(二甲基)甲硅烷基]氧基}甲基)吡咯烷-1-甲酸叔丁酯。该化合物不经进一步提纯即用于该合成的下一步骤。

LC-MS (方法1): R_t = 0.89 min；MS (ESIpos): m/z = 345 [M+H]⁺。

将715.0毫克（2.08毫摩尔）3-(氨基甲基)-4-({[叔丁基(二甲基)甲硅烷基]氧基}甲基)吡咯烷-1-甲酸叔丁酯溶解在15.0毫升THF中并加入2.28毫升（2.28毫摩尔）TBAF溶液（1M在THF中）。将反应混合物在室温下搅拌整夜。在真空下蒸发溶剂，残留物（1.54克）不经进一步提纯即用于该合成的下一步骤。

LC-MS (方法1): R_t = 0.41 min；MS (ESIpos): m/z = 231 [M+H]⁺。

将1.54克（4.88毫摩尔）3-(氨基甲基)-4-(羟甲基)吡咯烷-1-甲酸叔丁酯最初装载在1,4-二氧杂环己烷中，加入541.8毫克（4.88毫摩尔）氯化钙（无水）和488.6毫克（4.88毫摩尔）碳酸钙，并剧烈搅拌。然后加入592.8毫克（5.86毫摩尔）三乙胺和1.52克（5.86毫摩尔）1-({[2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基]羰基}氧基)吡咯烷-2,5-二酮并将反应混合物在室温下搅拌整夜。加入644.9毫克（10.7毫摩尔）HOAc和乙酸乙酯。有机相用水洗涤两次并用饱和NaCl溶液洗涤一次。在经硫酸镁干燥后，在真空下蒸发溶剂，残留物在硅胶上提纯（洗脱剂: 二氯甲烷/甲醇 = 100:1）。在真空下蒸发溶剂，残留物在高真空下干燥。这产生346.9毫克（理论值的19%）化合物3-(羟甲基)-4-[({[2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基]羰基}氨基)甲基]吡咯烷-1-甲酸叔丁酯。

LC-MS (方法1): R_t = 1.08 min；MS (ESIpos): m/z = 375 [M+H]⁺。

将804.0毫克（2.15毫摩尔）3-(羟甲基)-4-[({[2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基]羰基}氨基)甲基]吡咯烷-1-甲酸叔丁酯最初装载在20.0毫升氯仿和20.0毫升0.05 N碳酸钾/0.05 N碳酸氢钠溶液(1:1)中。然后加入59.7毫克（0.22毫摩尔）四正丁基氯化铵、429.9毫克（3.22毫摩尔）N-氯琥珀酰亚胺和33.5毫克（0.22毫摩尔）TEMPO并将反应混合物在室温下剧烈搅拌整夜。分离出有机相并在真空下脱除溶剂。残留物在硅胶上提纯（洗脱剂: 环己烷/乙酸乙酯 = 3:1）。这产生517.0毫克（理论值的46%）标题化合物。

LC-MS (方法1): R_t = 1.13 min；MS (ESIpos): m/z = 373 [M+H]⁺。

中间体L30

3-({[叔丁基(二甲基)甲硅烷基]氧基}甲基)-4-甲酰基吡咯烷-1-甲酸叔丁酯

立体异构体的混合物

将250.0毫克（0.72毫摩尔）3-({[叔丁基(二甲基)甲硅烷基]氧基}甲基)-4-(羟甲基)吡咯烷-1-甲酸叔丁酯（根据WO2006/100036的文献程序制备该化合物）最初装载在12.5毫升二氯甲烷/DMSO（4:1）中并加入219.6毫克（2.17毫摩尔）三乙胺。在2℃下，逐份加入345.5毫克（2.17毫摩尔）三氧化硫-吡啶络合物并在2℃下搅拌3小时。逐份加入另外345.5毫克（2.17毫摩尔）三氧化硫-吡啶络合物并在室温下搅拌17小时。使反应混合物在二氯甲烷和水之间分相。水相用二氯甲烷萃取三次，合并的有机相用水洗涤一次并经硫酸镁干燥。在真空下蒸发溶剂，残留物在高真空下干燥。残留物不经进一步提纯即用于该合成的下一步骤（薄层色谱法: 石油醚/乙酸乙酯7:3）。

中间体L31

{[(叔丁氧基羰基)氨基]甲基}丙二酸二-叔丁酯

将57.2克（488.27毫摩尔）氨基甲酸叔丁酯、51.2毫升（683.57毫摩尔）37%的甲醛水溶液和25.9克（244.13毫摩尔）碳酸钠添加到600毫升水中。使该混合物升温直至形成溶液，然后在室温下搅拌16小时。形成的悬浮液用500毫升二氯甲烷萃取并分离出有机相，用饱和氯化钠溶液洗涤并经硫酸钠干燥。在旋转蒸发器上浓缩，残留物在高真空下干燥，以产生结晶固体。将残留物置于1000毫升纯THF中，并在室温下逐滴加入322毫升（3.414摩尔）乙酸酐和138毫升（1.707摩尔）吡啶的混合物。将反应混合物在室温下搅拌16小时，然后在旋转蒸发器上借助室温下的水浴浓缩。将残留物置于二乙醚中并用饱和碳酸氢钠溶液洗涤三次和用饱和氯化钠溶液洗涤一次。有机相经硫酸钠干燥并在旋转蒸发器上浓缩，残留物在高真空下干燥2天。将残留物置于2000毫升纯THF中，并在冰冷却下加入456毫升（456.52毫摩尔）叔丁醇钾在THF中的1M溶液。在0℃下搅拌20分钟，然后逐滴加入溶解在200毫升纯THF中的100.8克（456.52毫摩尔）丙二酸二叔丁酯。在室温下搅拌48小时，然后加入水。该反应混合物在旋转蒸发器上浓缩并置于500毫升乙酸乙酯中。该混合物用500毫升水和100毫升饱和氯化钠溶液洗涤，有机相经硫酸钠干燥。有机相在旋转蒸发器上浓缩，残留物在高真空下干燥。该残留物通过经硅胶过滤提纯（洗脱剂: 环己烷/乙酸乙酯, 梯度 = 30:1 → 5:1）。这产生37.07克（理论值的22%）目标化合物。

LC-MS (方法6): R_t = 2.87 min；MS (ESIpos): m/z = 346 [M+H]⁺。

中间体L32

[3-羟基-2-(羟甲基)丙基]氨基甲酸叔丁酯

将37.0克（107.11毫摩尔）(乙酰氧基甲基)丙二酸二-叔丁酯溶解在1000毫升纯THF中，并在冰冷却下逐滴加入535.5毫升（1071.10毫摩尔）硼氢化锂在THF中的2M溶液。逐滴加入19.3毫升（1071.10毫摩尔）水并在室温下搅拌4.5小时。该反应混合物在旋转蒸发器上浓缩并在高真空下干燥。将残留物置于1500毫升乙酸乙酯中，加入100毫升水，并在冰冷却下搅拌（轻微放热）30分钟。分离出有机相，水相用500毫升乙酸乙酯萃取两次。有机相在旋转蒸发器上浓缩，残留物在高真空下干燥。这产生20.7克（理论值的94%）目标化合物。

LC-MS (方法6): R_t = 1.49 min；MS (EIpos): m/z = 106 [M-C₅H₈O₂]⁺。

中间体L33

[3-{[叔丁基(二甲基)甲硅烷基]氧基}-2-(羟甲基)丙基]氨基甲酸叔丁酯

将20.00克（97.44毫摩尔）[3-羟基-2-(羟甲基)丙基]氨基甲酸叔丁酯溶解在1000毫升纯二氯甲烷中并在室温下加入6.63克（97.44毫摩尔）咪唑和16.16克（107.18毫摩尔）叔丁基(氯)二甲基硅烷。在室温下搅拌16小时并用半浓缩氯化钠溶液洗涤该反应混合物。水相用乙酸乙酯萃取，合并的有机相经硫酸钠干燥，在旋转蒸发器上浓缩并在高真空下干燥。这产生28.50克（理论值的92%）目标化合物。

¹H NMR (400 MHz, DMSO-d₆): δ [ppm] = 0.02 (s, 6H), 0.86 (s, 9H), 1.37 (s, 9H), 1.58-1.73 (m, 1H), 2.91 (q, 2H), 3.33-3.36 [m, (2H, obscured)], 3.53-3.58 (m, 2H), 6.65-6.72 (m, 1H)。

中间体L34

(3-{[叔丁基(二甲基)甲硅烷基]氧基}-2-甲酰基丙基)氨基甲酸叔丁酯

将12.65克（39.591毫摩尔）[3-{[叔丁基(二甲基)甲硅烷基]氧基}-2-(羟基-甲基)丙基]氨基甲酸叔丁酯溶解在200毫升二氯甲烷中并在室温下逐滴加入溶解在150毫升二氯甲烷中的19.31克（45.53毫摩尔）戴斯马丁氧化剂。将该混合物在室温下搅拌2小时，然后加入250毫升半浓缩碳酸氢钠溶液和250毫升10%的硫代硫酸钠溶液并搅拌20分钟。分离出有机相，水相用乙酸乙酯萃取。合并的有机相用300毫升水洗涤，经硫酸钠干燥，在旋转蒸发器上浓缩并在高真空下干燥。这产生11.35克（理论值的90%）目标化合物。

¹H NMR (400 MHz, DMSO-d₆): δ [ppm] = 0.02 (s, 6H), 0.84(s, 9H), 1.36 (s, 9H), 1.48-1.51 (m, 1H), 3.08-3.32 [m, (1H, obscured)], 3.50-3.58 (m, 2H), 3.81-3.91 (m, 1H), 6.71 (t, 1H), 9.60 (d, 1H)。

中间体L35

(3-氧代丙基)氨基甲酸叔丁酯

根据文献中已知的方法（例如Jean Bastide等人 J. Med. Chem. 2003, 46(16), 3536-3545）制备标题化合物。

中间体L36

N-[(苄氧基)羰基]-L-缬氨酰基-N5-氨基甲酰基-L-鸟氨酸

将100毫克（0.57毫摩尔）N⁵-氨基甲酰基-L-鸟氨酸置于4.0毫升DMF中并加入0.08毫升（0.57毫摩尔）三乙胺。然后加入199.0毫克（0.57毫摩尔）2,5-二氧代吡咯烷-1-基 N-[(苄氧基)羰基]-L-缬氨酸和0.08毫升（0.57毫摩尔）三乙胺。在室温下搅拌48小时。该反应混合物直接通过制备型RP-HPLC提纯（柱: Reprosil 250x30；10µ, 流速: 50 ml/min, MeCN/水 + 0.1% TFA）。在真空下蒸发溶剂，残留物在高真空下干燥。这产生75.7毫克（理论值的33%）标题化合物。

LC-MS (方法1): R_t = 0.69 min；MS (ESIpos): m/z = 409 [M+H]⁺。

中间体L37

L-缬氨酰基-N⁵-氨基甲酰基-L-鸟氨酸

将75.7毫克（0.19毫摩尔）中间体L36悬浮在25毫升水/乙醇/THF中，加入7.5毫克钯-活性炭(10%)并在室温下在标准压力下用氢气氢化4.5小时。滤出催化剂，将反应混合物在真空下脱除溶剂并在高真空下干燥。残留物不经进一步提纯即用于下一步骤。这产生64.9毫克（理论值的93%）标题化合物。

LC-MS (方法6): R_t = 0.25 min；MS (ESIpos): m/z = 275 [M+H]⁺。

中间体L38

N-[31-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-29-氧代-4,7,10,13,16,19,22,25-八氧杂-28-氮杂三十一烷-1-酰基]-L-缬氨酰基-N⁵-氨基甲酰基-L-鸟氨酸

将38.3毫克（0.14毫摩尔）中间体L37最初装载在3.0毫升DMF中并加入96.4毫克（0.14毫摩尔）3-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-N-{27-[(2,5-二氧代吡咯烷-1-基)氧基]-27-氧代-3,6,9,12,15,18,21,24-八氧杂二十七烷-1-基}丙酰胺和39.0微升（0.28毫摩尔）三乙胺。在室温下搅拌整夜。然后向反应混合物加入16.0微升（0.28毫摩尔）HOAc，且直接通过制备型RP-HPLC提纯（柱: Reprosil 250x30；10µ, 流速: 50 ml/min, MeCN/水）。在真空下蒸发溶剂，残留物在高真空下干燥。这产生58.9毫克（理论值的45%）标题化合物。

LC-MS (方法1): R_t = 0.61 min；MS (ESIpos): m/z = 849 [M+H]⁺。

中间体L39

(2-硫烷基乙基)氨基甲酸2-(三甲基甲硅烷基)乙酯

将300毫克（2.64毫摩尔）2-氨基乙硫醇盐酸盐(1:1)最初装载在3.0毫升二氯甲烷中并加入668.0毫克（6.60毫摩尔）三乙胺和719.1毫克（2.77毫摩尔）1-({[2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基]羰基}氧基)吡咯烷-2,5-二酮。在室温下搅拌2天（通过薄层色谱法监测: 二氯甲烷/甲醇 = 100:1.5）。向该反应混合物加入乙酸乙酯，用水洗涤三次。有机相用饱和NaCl溶液洗涤两次并经硫酸镁干燥。在真空下蒸发溶剂，残留物在高真空下干燥。该化合物不经进一步提纯即用于该合成的下一步骤。

中间体L40

N-[31-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-29-氧代-4,7,10,13,16,19,22,25-八氧杂-28-氮杂三十一烷-1-酰基]-L-缬氨酰基-N⁶-(叔丁氧基羰基)-L-赖氨酸

600毫克（1.58毫摩尔）N²-[(苄氧基)羰基]-N⁶-(叔丁氧基羰基)-L-赖氨酸在25.0毫升水/乙醇/THF（1:1:0.5）中使用钯碳(10%)在室温下在标准压力下用氢气氢化。该化合物N⁶-(叔丁氧基羰基)-L-赖氨酸不经进一步提纯即用于该合成的下一步骤。

LC-MS (方法1): R_t = 0.99 min；MS (ESIpos): m/z = 247 [M+H]⁺。

将180.0克（0.73毫摩尔）N⁶-(叔丁氧基羰基)-L-赖氨酸溶解在5.0毫升DMF中并加入74.0毫克（0.73毫摩尔）三乙胺。加入254.6毫克（0.73毫摩尔）N-[(苄氧基)羰基]-L-缬氨酸2,5-二氧代吡咯烷-1-基酯和74.0毫克（0.73毫摩尔）三乙胺。将反应混合物在室温下搅拌3.5小时。该反应混合物直接通过制备型RP-HPLC提纯（柱: Reprosil 250x30；10µ, 流速: 50 ml/min, MeCN/水, 0.1% TFA）。在真空下蒸发溶剂，残留物在高真空下干燥。这产生294.1毫克（理论值的76%）化合物N-[(苄氧基)羰基]-L-缬氨酰基-N⁶-(叔丁氧基羰基)-L-赖氨酸。

LC-MS (方法1): R_t = 0.97 min；MS (ESIpos): m/z = 480 [M+H]⁺。

将272.2毫克（0.57毫摩尔）N-[(苄氧基)羰基]-L-缬氨酰基-N⁶-(叔丁氧基羰基)-L-赖氨酸溶解在20毫升乙酸乙酯/乙醇/THF（1:1:1）中，加入27.2毫克钯-活性炭并在标准压力下和在室温下用氢气氢化。经Celite ^(R)过滤，滤饼用乙酸乙酯/乙醇/THF（1:1:1）充分洗涤。在真空下蒸发溶剂，残留物在高真空下干燥。这产生182.0毫克（理论值的72%）化合物L-缬氨酰基-N⁶-(叔丁氧基羰基)-L-赖氨酸。

LC-MS (方法1): R_t = 0.53 min；MS (ESIpos): m/z = 346 [M+H]⁺。

将30.0毫克（0.07毫摩尔）L-缬氨酰基-N6-(叔丁氧基羰基)-L-赖氨酸和46.1毫克（0.07毫摩尔）3-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-N-{27-[(2,5-二氧代吡咯烷-1-基)氧基]-27-氧代-3,6,9,12,15,18,21,24-八氧杂二十七烷-1-基}丙酰胺溶解在1.5毫升DMF中并加入6.8毫克（0.07毫摩尔）4-甲基吗啉。将反应混合物在室温下搅拌整夜。该反应混合物直接通过制备型RP-HPLC提纯（柱: Reprosil 250x30；10µ, 流速: 50 ml/min, MeCN/水）。在真空下蒸发溶剂，残留物在高真空下干燥。这产生55.6毫克（理论值的90%）标题化合物。

LC-MS (方法1): R_t = 0.77 min；MS (ESIpos): m/z = 920 [M+H]⁺。

中间体L41

N-[19-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-17-氧代-4,7,10,13-四氧杂-16-氮杂十九-1-酰基]-L-缬氨酰基-N⁶-(叔丁氧基羰基)-L-赖氨酸

600毫克（1.58毫摩尔）N²-[(苄氧基)羰基]-N⁶-(叔丁氧基羰基)-L-赖氨酸在25.0毫升水/乙醇/THF（1:1:0.5）中使用钯碳(10%)在室温下在标准压力下用氢气氢化。该化合物N⁶-(叔丁氧基羰基)-L-赖氨酸不经进一步提纯即用于该合成的下一步骤。

LC-MS (方法1): R_t = 0.99 min；MS (ESIpos): m/z = 247 [M+H]⁺。

将180.0克（0.73毫摩尔）N⁶-(叔丁氧基羰基)-L-赖氨酸溶解在5.0毫升DMF中并加入74.0毫克（0.73毫摩尔）三乙胺。加入254.6毫克（0.73毫摩尔）N-[(苄氧基)羰基]-L-缬氨酸2,5-二氧代吡咯烷-1-基酯和74.0毫克（0.73毫摩尔）三乙胺。将反应混合物在室温下搅拌3.5小时。该反应混合物直接通过制备型RP-HPLC提纯（柱: Reprosil 250x30；10µ, 流速: 50 ml/min, MeCN/水, 0.1% TFA）。然后在真空下蒸发溶剂，残留物在高真空下干燥。这产生294.1毫克（理论值的76%）化合物N-[(苄氧基)羰基]-L-缬氨酰基-N⁶-(叔丁氧基羰基)-L-赖氨酸。

LC-MS (方法1): R_t = 0.97 min；MS (ESIpos): m/z = 480 [M+H]⁺。

将272.2毫克（0.57毫摩尔）N-[(苄氧基)羰基]-L-缬氨酰基-N⁶-(叔丁氧基羰基)-L-赖氨酸溶解在20.0毫升乙酸乙酯/乙醇/THF（1:1:1）中，加入27.2毫克钯-活性炭并在标准压力下和在室温下用氢气氢化。经Celite^(R)过滤，滤饼用乙酸乙酯/乙醇/THF（1:1:1）充分洗涤。在真空下蒸发溶剂，残留物在高真空下干燥。这产生182.0毫克（理论值的72%）化合物L-缬氨酰基-N⁶-(叔丁氧基羰基)-L-赖氨酸。

LC-MS (方法1): R_t = 0.53 min；MS (ESIpos): m/z = 346 [M+H]⁺。

将30.0毫克（0.07毫摩尔）L-缬氨酰基-N6-(叔丁氧基羰基)-L-赖氨酸和34.3毫克（0.07毫摩尔）3-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-N-{15-[(2,5-二氧代吡咯烷-1-基)氧基]-15-氧代-3,6,9,12-四氧杂十五烷-1-基}丙酰胺溶解在1.5毫升DMF中并加入6.8毫克（0.07毫摩尔）4-甲基吗啉。将反应混合物在室温下搅拌整夜。该反应混合物直接通过制备型RP-HPLC提纯（柱: Reprosil 250x30；10µ, 流速: 50 ml/min, MeCN/水）。在真空下蒸发溶剂，残留物在高真空下干燥。这产生40.6毫克（理论值的82%）标题化合物。

LC-MS (方法1): R_t = 0.73 min；MS (ESIpos): m/z = 744 [M+H]⁺。

中间体L42

N-[19-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-17-氧代-4,7,10,13-四氧杂-16-氮杂十九-1-酰基]-L-缬氨酰基-N⁵-氨基甲酰基-L-鸟氨酸

将50.0毫克（0.18毫摩尔）L-缬氨酰基-N⁵-氨基甲酰基-L-鸟氨酸（中间体L37）最初装载在DMF中并加入93.6毫克（0.18毫摩尔）3-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-N-{15-[(2,5-二氧代吡咯烷-1-基)氧基]-15-氧代-3,6,9,12-四氧杂十五烷-1-基}丙酰胺和36.9毫克（0.37毫摩尔）三乙胺。将反应混合物在室温下搅拌整夜。加入21.9毫克（0.37毫摩尔）HOAc且反应混合物直接通过制备型RP-HPLC提纯（柱: Reprosil 250x30；10µ, 流速: 50 ml/min, MeCN/水）。在真空下蒸发溶剂，残留物在高真空下干燥。这产生20.6毫克（理论值的14%）标题化合物。

LC-MS (方法1): R_t = 0.55 min；MS (ESIpos): m/z = 673 [M+H]⁺。

中间体L43

N-[67-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-65-氧代-4,7,10,13,16,19,22,25,28,31,34,37,40,43,46,49,52,55,58,61-二十氧杂-64-氮杂六十七烷-1-酰基]-L-缬氨酰基-N⁵-氨基甲酰基-L-鸟氨酸

将11.3毫克（0.04毫摩尔）L-缬氨酰基-N⁵-氨基甲酰基-L-鸟氨酸（中间体L37）最初装载在DMF中并加入50.0毫克（0.04毫摩尔）3-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-N-{63-[(2,5-二氧代吡咯烷-1-基)氧基]-63-氧代-3,6,9,12,15,18,21,24,27,30,33,36,39,42,45,48,51,54,57,60-二十氧杂六十三烷-1-基}丙酰胺和8.3毫克（0.08毫摩尔）三乙胺。将反应混合物在室温下搅拌整夜。加入4.9毫克（0.08毫摩尔）HOAc且反应混合物直接通过制备型RP-HPLC提纯（柱: Reprosil 250x30；10µ, 流速: 50 ml/min, MeCN/水）。在真空下蒸发溶剂，残留物在高真空下干燥。这产生15.8毫克（理论值的20%）标题化合物。

LC-MS (方法4): R_t = 0.94 min；MS (ESIpos): m/z = 1377 [M+H]⁺。

中间体L44

N-[19-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-17-氧代-4,7,10,13-四氧杂-16-氮杂十九-1-酰基]-L-缬氨酰基-L-丙氨酸

将73.3毫克（0.39毫摩尔）L-缬氨酰基-L-丙氨酸溶解在7.0毫升DMF中并加入200.0毫克（0.39毫摩尔）3-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-N-{15-[(2,5-二氧代吡咯烷-1-基)氧基]-15-氧代-3,6,9,12-四氧杂十五烷-1-基}丙酰胺和78.8毫克（0.78毫摩尔）三乙胺。将反应混合物在室温下搅拌整夜。该反应混合物直接通过制备型RP-HPLC提纯（柱: Reprosil 250x30；10µ, 流速: 50 ml/min, MeCN/水）。在真空下蒸发溶剂，残留物在高真空下干燥。这产生103.3毫克（理论值的45%）标题化合物。

LC-MS (方法1): R_t = 0.58 min；MS (ESIpos): m/z = 587 [M+H]⁺。

中间体L45

(2S)-2-[(叔丁氧基羰基)氨基]-4-氧代丁酸叔丁酯

将2.00克（7.26毫摩尔）N-(叔丁氧基羰基)-L-高丝氨酸叔丁酯溶解在90毫升二氯甲烷中，然后加入1.76毫升吡啶和4.62克（10.90毫摩尔）1,1,1-三乙酰氧基-1λ⁵,2-苯碘酰-3(1H)-酮（戴斯马丁氧化剂）。将该配制品在室温下搅拌2小时，然后用200毫升二氯甲烷稀释并用10%的硫代硫酸钠溶液萃取两次，然后相继用5%的柠檬酸萃取两次和用饱和碳酸氢钠溶液萃取两次。分离出有机相，经硫酸钠干燥，然后在真空下干燥。将100毫升二乙醚和环己烷（v/v=1:1）添加到残留物中，以致形成白色沉淀物。将其抽吸滤出。在旋转蒸发器上浓缩滤液并在高真空下干燥，以产生1.74克（理论值的88%）浅黄色油形式的目标化合物。

LC-MS (方法1): R_t = 0.85 min；MS (ESIpos): m/z = 274 [M+H]⁺.

¹H NMR (400 MHz, DMSO-d₆): δ [ppm] = 1.38 (s, 18H), 2.64-2.81 (m, 2H), 4.31-4.36 (m, 1H), 7.23 (d, 1H), 9.59 (s, 1H)。

中间体L46

三氟乙酸/N-[2-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙基]-L-谷氨酸叔丁酯(1:1)

通过首先在EDC/HOBT和N,N-二异丙基乙基胺存在下将200毫克（0.79毫摩尔）三氟乙酸/1-(2-氨基乙基)-1H-吡咯-2,5-二酮(1:1)与263毫克（0.87毫摩尔）(4S)-5-叔丁氧基-4-[(叔丁氧基羰基)氨基]-5-氧代戊酸/三氟乙酸(1:1)偶联、然后通过在室温下在DCM中的10%三氟乙酸中搅拌1小时在温和条件下将氨基脱保护，制备标题化合物。从乙腈/水中冻干后经2个步骤产生85毫克（理论值的20%）标题化合物。

LC-MS (方法1): R_t = 0.37 min；MS (ESIpos): m/z = 326 [M+H]⁺。

中间体L47

三氟乙酸/β-丙氨酰基-L-丙氨酰基-N⁵-氨基甲酰基-N-[4-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)苯基]-L-鸟氨酰胺(1:1)

通过将中间体L8与N-(叔丁氧基羰基)-β-丙氨酸2,5-二氧代吡咯烷-1-基酯偶联和随后用TFA脱保护，制备标题化合物。

LC-MS (方法3): R_t = 1.36 min；MS (ESIpos): m/z = 488 (M+H)⁺。

中间体L48

三氟乙酸/(1R,2S)-2-氨基-N-[2-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙基]环戊烷甲酰胺(1:1)

类似于中间体L2由市售(1R,2S)-2-[(叔丁氧基羰基)氨基]环戊烷甲酸制备标题化合物。

LC-MS (方法3): R_t = 1.22 min；MS (ESIpos): m/z = 252 (M+H)⁺。

中间体L49

三氟乙酸/N-(溴乙酰基)-L-缬氨酰基-L-丙氨酰基-L-赖氨酸叔丁酯(1:1)

通过首先在二氯甲烷中在N,N-二异丙基乙基胺存在下将市售溴乙酸酐与根据肽化学的经典方法制成的部分保护的肽L-缬氨酰基-L-丙氨酰基-N⁶-(叔丁氧基羰基)-L-赖氨酸叔丁酯偶联，制备标题化合物。此后在温和条件下通过在室温下在DCM中的10%三氟乙酸中搅拌而在氨基处脱保护，以经2个步骤以49%收率产生标题化合物。

LC-MS (方法1): R_t = 1.09 min；MS (ESIpos): m/z = 593和595 (M+H)⁺。

中间体L50

三氟乙酸/(1S,3R)-3-氨基-N-[2-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙基]环戊烷甲酰胺(1:1)

由市售(1S,3R)-3-[(叔丁氧基羰基)氨基]环戊烷甲酸和同样市售的三氟乙酸/1-(2-氨基乙基)-1H-吡咯-2,5-二酮(1:1)通过在N,N-二异丙基乙基胺存在下用HATU偶联和随后用TFA脱保护而制备标题化合物。

HPLC (方法11): R_t = 0.2 min；

LC-MS (方法3): R_t = 0.88 min；MS (ESIpos): m/z = 252 (M+H)⁺。

中间体L51

三氟乙酸/(1R,3R)-3-氨基-N-[2-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙基]环戊烷甲酰胺(1:1)

由市售(1R,3R)-3-[(叔丁氧基羰基)氨基]环戊烷甲酸和同样市售的三氟乙酸/1-(2-氨基乙基)-1H-吡咯-2,5-二酮(1:1)通过在N,N-二异丙基乙基胺存在下用HATU偶联和随后用TFA脱保护而制备标题化合物。

LC-MS (方法3): R_t = 0.98 min；MS (ESIpos): m/z = 250 (M-H)^-。

中间体L52

三氟乙酸/N-(2-氨基乙基)-2-溴乙酰胺(1:1)

将420毫克（2.62毫摩尔）(2-氨基乙基)氨基甲酸叔丁酯置于50毫升二氯甲烷中并加入817毫克（3.15毫摩尔）溴乙酸酐和913微升（5.24毫摩尔）N,N-二异丙基乙基胺。将该配制品在室温下搅拌1小时，然后在真空下干燥。残留物通过制备型HPLC提纯。

这产生577毫克受保护的中间体，然后将其置于50毫升二氯甲烷中并加入10毫升三氟乙酸。在室温下搅拌1小时后，该配制品在真空下浓缩，残留物从乙腈/水中冻干。这产生705毫克（理论值的65%）标题化合物。

LC-MS (方法3): R_t = 0.34 min；MS (ESIpos): m/z = 181和183 (M+H)⁺。

中间体L53

三氟乙酸/(1S,3S)-3-氨基-N-[2-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙基]环戊烷甲酰胺(1:1)

由市售(1S,3S)-3-[(叔丁氧基羰基)氨基]环戊烷甲酸和同样市售的三氟乙酸/1-(2-氨基乙基)-1H-吡咯-2,5-二酮(1:1)通过在N,N-二异丙基乙基胺存在下用HATU偶联和随后用TFA脱保护而制备标题化合物。

HPLC (方法11): R_t = 0.19 min；

LC-MS (方法3): R_t = 0.88 min；MS (ESIpos): m/z = 250 (M-H)^-。

中间体L54

三氟乙酸/(1R,3S)-3-氨基-N-[2-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙基]环戊烷甲酰胺(1:1)

由市售(1R,3S)-3-[(叔丁氧基羰基)氨基]环戊烷甲酸和同样市售的三氟乙酸/1-(2-氨基乙基)-1H-吡咯-2,5-二酮(1:1)通过在N,N-二异丙基乙基胺存在下用HATU偶联和随后用TFA脱保护而制备标题化合物

LC-MS (方法3): R_t = 0.89 min；MS (ESIpos): m/z = 252 (M+H)⁺。

中间体L55

三氟乙酸/N⁶-D-丙氨酰基-N²-{N-[6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-己酰基]-L-缬氨酰基-L-丙氨酰基}-L-赖氨酸叔丁酯(1:1)

通过首先在HATU存在下将中间体L6与N-(叔丁氧基羰基)-D-丙氨酸偶联，接着在温和条件下通过在室温下在DCM中的5%三氟乙酸中搅拌90分钟而在氨基处脱保护，制备标题化合物。

HPLC (方法11): R_t = 1.35 min；

LC-MS (方法1): R_t = 0.67 min；MS (ESIpos): m/z = 637 (M+H)⁺。

中间体L56

三氟乙酸/N-[6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰基]-L-缬氨酰基-L-丙氨酰基-N⁶-{[(1R,3S)-3-氨基环戊基]羰基}-L-赖氨酸叔丁酯(1:1)

通过首先在HATU存在下将中间体L6与(1R,3S)-3-[(叔丁氧基羰基)氨基]环戊烷甲酸偶联，接着在温和条件下通过在室温下在DCM中的25%三氟乙酸中搅拌15分钟而在氨基处脱保护，制备标题化合物。

HPLC (方法11): R_t = 1.4 min；

LC-MS (方法1): R_t = 0.7 min；MS (ESIpos): m/z = 677 (M+H)⁺。

中间体L57

(2S)-4-氧代-2-({[2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基]羰基}氨基)丁酸甲酯

将500.0毫克（2.72毫摩尔）L-天冬氨酸甲酯盐酸盐和706.3毫克（2.72毫摩尔）2,5-二氧代吡咯烷-1-甲酸2-(三甲基甲硅烷基)乙酯最初装载在5.0毫升1,4-二氧杂环己烷中并加入826.8毫克（8.17毫摩尔）三乙胺。将反应混合物在室温下搅拌整夜。该反应混合物直接通过制备型RP-HPLC提纯（柱: Reprosil 250x40；10µ, 流速: 50 ml/min, MeCN/水, 0.1% TFA）。然后在真空下蒸发溶剂，残留物在高真空下干燥。这产生583.9毫克（理论值的74%）化合物(3S)-4-甲氧基-4-氧代-3-({[2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基]羰基}氨基)丁酸。

LC-MS (方法1): R_t = 0.89 min；MS (ESIneg): m/z = 290 (M-H)^-。

将592.9毫克(3S)-4-甲氧基-4-氧代-3-({[2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基]羰基}氨基)丁酸最初装载在10.0毫升1,2-二甲氧基乙烷中，冷却至-15℃并加入205.8毫克（2.04毫摩尔）4-甲基吗啉和277.9毫克（2.04毫摩尔）氯甲酸异丁酯。在15分钟后抽吸滤出沉淀物并用每次10.0毫升1,2-二甲氧基乙烷洗涤两次。将滤液冷却至-10℃，并在剧烈搅拌下加入溶解在10毫升水中的115.5毫克（3.05毫摩尔）硼氢化钠。分离相，有机相用饱和碳酸氢钠溶液和饱和NaCl溶液各洗涤一次。有机相经硫酸镁干燥，在真空下蒸发溶剂，残留物在高真空下干燥。这产生515.9毫克（理论值的91%）化合物N-{[2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基]羰基}-L-高丝氨酸甲酯。

LC-MS (方法1): R_t = 0.87 min；MS (ESIpos): m/z = 278 (M+H)⁺。

将554.9毫克（2.00毫摩尔）N-{[2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基]羰基}-L-高丝氨酸甲酯最初装载在30.0毫升二氯甲烷中并加入1.27克（3.0毫摩尔）戴斯马丁氧化剂和474.7毫克（6.00毫摩尔）吡啶。在室温下搅拌整夜。在4小时后，该配制品用二氯甲烷稀释，有机相用10%的Na₂S₂O₃溶液、10%的柠檬酸溶液和饱和碳酸氢钠溶液各洗涤三次。有机相经硫酸镁干燥和在真空下蒸发溶剂。这产生565.7毫克（理论值的97%）标题化合物。

¹H NMR (400 MHz, DMSO-d₆): δ [ppm] = 0.03 (s, 9H), 0.91 (m, 2H), 2.70-2.79 (m, 1H), 2.88 (dd, 1H), 3.63 (s, 3H), 4.04 (m, 2H), 4.55 (m, 1H), 7.54 (d, 1H), 9.60 (t, 1H)。

中间体L58

(3-氧代丙基)氨基甲酸2-(三甲基甲硅烷基)乙酯

将434.4毫克（5.78毫摩尔）3-氨基-1-丙醇和1.50克（5.78毫摩尔）2,5-二氧代吡咯烷-1-甲酸2-(三甲基甲硅烷基)乙酯溶解在10.0毫升二氯甲烷中，加入585.3毫克（5.78毫摩尔）三乙胺并在室温下搅拌整夜。该反应混合物用二氯甲烷稀释，有机相用水和饱和碳酸氢钠溶液洗涤，然后经硫酸镁干燥。在真空下蒸发溶剂。残留物(3-羟丙基)氨基甲酸2-(三甲基甲硅烷基)乙酯（996.4毫克，理论值的79%）在高真空下干燥并且不经进一步提纯即用于该合成的下一步骤。

将807.0毫克（3.68毫摩尔）(3-羟丙基)氨基甲酸2-(三甲基甲硅烷基)乙酯最初装载在15.0毫升氯仿和15.0毫升0.05 N碳酸钾/0.05 N碳酸氢钠溶液(1:1)中。然后加入102.2毫克（0.37毫摩尔）四正丁基氯化铵、736.9毫克（5.52毫摩尔）N-氯琥珀酰亚胺和57.5毫克（0.37毫摩尔）TEMPO并将反应混合物在室温下剧烈搅拌整夜。该反应混合物用二氯甲烷稀释，有机相用水和饱和NaCl溶液洗涤。有机相经硫酸镁干燥并在真空下蒸发溶剂。残留物在高真空下干燥并且不经进一步提纯即用于该合成的下一步骤（890.3毫克）。

中间体L59

三氟乙酸/1-{2-[2-(2-氨基乙氧基)乙氧基]乙基}-1H-吡咯-2,5-二酮(1:1)

将300.0毫克（0.91毫摩尔）(2-{2-[2-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙氧基]乙氧基}乙基)氨基甲酸叔丁酯最初装载在二氯甲烷中，加入4.2克（36.54毫摩尔）TFA并在室温下搅拌1小时（通过DC监测: 二氯甲烷/甲醇10:1）。在真空下蒸发挥发性组分，残留物与二氯甲烷共蒸馏四次。将残留物在高真空下干燥并且不经进一步提纯即用于该合成的下一步骤。

LC-MS (方法1): R_t = 0.19 min；MS (ESIpos): m/z = 229 (M+H)⁺。

中间体L60

6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰氯

将200.0毫克（0.95毫摩尔）6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酸溶解在4.0毫升二氯甲烷中并加入338.0毫克（2.84毫摩尔）亚硫酰氯。将反应混合物在室温下搅拌3小时，然后加入1滴DMF。搅拌另外1小时。在真空下蒸发溶剂，与二氯甲烷共蒸馏三次。粗产物不经进一步提纯即用于该合成的下一步骤。

中间体L61

三氟乙酸/N-[6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰基]-L-缬氨酰基-L-丙氨酰基-L-赖氨酸2-(三甲基甲硅烷基)乙酯(1:1)

首先，由N²-[(苄氧基)羰基]-N⁶-(叔丁氧基羰基)-L-赖氨酸根据肽化学的经典方法（使用EDCI/DMAP用2-(三甲基甲硅烷基)乙醇酯化、氢解、在HATU存在下与N-[(苄氧基)羰基]-L-缬氨酰基-L-丙氨酸偶联和再次氢解）制备三肽衍生物L-缬氨酰基-L-丙氨酰基-N⁶-(叔丁氧基羰基)-L-赖氨酸2-(三甲基甲硅烷基)乙酯。通过在HATU和N,N-二异丙基乙基胺存在下将这种部分受保护的肽衍生物与市售6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酸偶联，制备标题化合物。此后在温和条件下通过在室温下在DCM中的5%三氟乙酸中搅拌2.5小时而在氨基处脱保护，保留酯保护基。后处理和通过制备型HPLC提纯后产生438毫克标题化合物。

HPLC (方法11): R_t = 1.69 min；

LC-MS (方法1): R_t = 0.78 min；MS (ESIpos): m/z = 610 (M+H)⁺。

中间体L62

三氟乙酸/N-[6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰基]-L-缬氨酰基-N⁵-氨基甲酰基-L-鸟氨酰基-L-赖氨酸2-(三甲基甲硅烷基)乙酯(1:1)

首先，由N²-[(苄氧基)羰基]-N⁶-(叔丁氧基羰基)-L-赖氨酸根据肽化学的经典方法制备N⁶-(叔丁氧基羰基)-L-赖氨酸2-(三甲基甲硅烷基)乙酯。148毫克（0.43毫摩尔）这种中间体然后在195毫克（0.51毫摩尔）HATU和149微升N,N-二异丙基乙基胺存在下与200毫克（0.43毫摩尔）中间体L16偶联。在浓缩和残留物通过制备型HPLC提纯后，将该受保护的中间体置于20毫升DCM中并通过添加2毫升三氟乙酸和在室温下搅拌1小时使叔丁氧基羰基保护基脱落。浓缩和残留物从乙腈/水中冻干后产生254毫克（经2个步骤，理论值的63%）。

HPLC (方法11): R_t = 1.51 min；

LC-MS (方法1): R_t = 0.68 min；MS (ESIpos): m/z = 696 (M+H)⁺。

中间体L63

(4S)-4-{[(2S)-2-{[(2S)-2-{[6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰基]氨基}-3-甲基丁酰基]氨基}丙酰基]氨基}-5-氧代-5-[2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基]戊酸

首先，由(2S)-5-(苄氧基)-2-[(叔丁氧基羰基)氨基]-5-氧代戊酸根据肽化学的经典方法制备三肽衍生物(4S)-4-{[(2S)-2-{[(2S)-2-氨基-3-甲基丁酰基]氨基}丙酰基]氨基}-5-氧代-5-[2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基]戊酸（使用EDCI/DMAP用2-(三甲基甲硅烷基)乙醇酯化、用三氟乙酸裂解Boc保护基、在HATU存在下与N-[(苄氧基)羰基]-L-缬氨酰基-L-丙氨酸偶联和在甲醇中经10%钯-活性炭氢解）。通过这种部分受保护的肽衍生物与市售1-{6-[(2,5-二氧代吡咯烷-1-基)氧基]-6-氧代己基}-1H-吡咯-2,5-二酮的偶联制备标题化合物。后处理和通过制备型HPLC提纯后产生601毫克标题化合物。

LC-MS (方法1): R_t = 0.96 min；MS (ESIpos): m/z = 611 (M+H)⁺。

中间体L64

(4S)-4-{[(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙酰基]氨基}-5-氧代-5-[2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基]戊酸

由(2S)-5-(苄氧基)-2-[(叔丁氧基羰基)氨基]-5-氧代戊酸根据肽化学的经典方法（使用EDCI/DMAP用2-(三甲基甲硅烷基)乙醇酯化、用三氟乙酸裂解Boc保护基、苄酯在甲醇中经10%钯-活性炭氢解裂解和在N,N-二异丙基乙基胺存在下与1-{2-[(2,5-二氧代吡咯烷-1-基)氧基]-2-氧代乙基}-1H-吡咯-2,5-二酮偶联）制备标题化合物。