兰花萃取物及其制备方法和应用与流程

本发明涉及化学制剂领域，特别是提供一种兰花萃取物及其制备方法和应用，该兰花萃取物具有美白功能、抗氧化以及抗皱(抗老化)的功效。
背景技术：
：正常皮肤的颜色取决于：1、皮肤中各种色素的含量与分布状况；2、皮肤血液中血红蛋白氧化还原的比例；3、皮肤的厚度以及光线在皮肤表面的散射。由于外界环境的影响(紫外线、污染的空气)，不正确的生活方式(不正确的美容、劣质的化妆品、电子显示屏的辐射)，人体皮肤的衰老(免疫能力下降、微循环消失、代谢能力降低)都会引起皮肤产生色素沉积、色素分布不均、皮肤失去光泽产生暗哑。黑色素细胞(Melanocytes)位于皮肤基底层细胞内，为单细胞的分泌器官，其细胞呈圆形，黑色素细胞由长而分支的管状突起，这些突起在表皮细胞中穿梭。黑色素于表皮的深层内形成，并向皮肤的表面移行，但黑色素细胞本体并不会跟着移行，而是由角质细胞负责转移黑色素的工作，角质细胞将这些黑色素转至皮肤的表面，以形成天然的保护屏障。晒太阳或者暴露在紫外光下会促进黑色素细胞内酪胺酸酶活性，而增加黑色素产生，皮肤经由黑色素的合成路径(Raper-Masonpathway，图2)，产生自发性化学反应与酵素催化作用而形成黑色素。黑色素为一种高分子的复合体，当皮肤被紫外线照射时，黑色素细胞内的酪胺酸酶(tyrosinase)会被活化，加速催化细胞内酪胺酸(tyrosine)氧化为二羟基苯基丙胺酸(dihydroxyphenylalanine，简称DOPA)，而二羟基苯基丙胺酸(DOPA)再由酪胺酸酶催化为多巴醌(dopachrome)，黑色素的生合成路径牵涉到藉由酪胺酸酶的酪胺酸催化羟基化为L-3,4-二羟基苯基丙胺酸(L-3，4-dihydroxyphenylalanine，L-DOPA)及L-DOPA转变为多巴醌(dopachrome)；而多巴醌是经由氧化反应转变为黑色素，透过一系列的氧化反应，由多巴醌形成真黑色素(eumelanin)。酪胺酸酶(tyrosinase)为一种含铜离子的多酚氧化酶，由黑色素细胞合成，其活性会因为来源不同而有所不同，酪胺酸酶与酪胺酸(tyrosine)的活性键结位置有三处活性中心铜离子，现今研究有关抑制酪胺酸酶活性的机转上，主要有两种方式：(1)酪胺酸酶的去活化：此反应机转主要是因为酵素分子结构上带有铜离子，抑制物藉以利用类似铜螯合剂(copper-chelatingagent)的方式来螯合铜离子或与铜离子相互竞争，藉以减少铜离子的结合力，进而降低酪胺酸酶的活性，以阻断黑色素生成机制，此抑制类型最具代表的成分为曲酸(kojicacid)。(2)竞争性取代酪胺酸酶受质：此反应机转为抑制物与酪胺酸或多巴等受质相互竞争和酪胺酸酶进行反应，导致与酪胺酸酶作用的受质减少，而减少黑色素形成，此竞争性取代受质类型最具代表的成分包括对苯二酚(hydroquinone)、熊果素(arbutin)等。美白是最受亚洲女性重视的化妆保养品功能之一。传统上，评估化妆品原料是否具有美白的潜力，主要有下列几种模式：(1)酪胺酸酶是否受到抑制：由于酪胺酸酶是黑色素形成的重要酵素，因此若此酵素受到抑制，则黑色素的形成可能减少(图2)。(2)老鼠的黑色素瘤细胞系统(B16cellline):由于原料(或成分)要能有效抑制酪胺酸酶，则该成分作用机制的前提上需能进入细胞方能达此效果。因此亦有学者以老鼠的黑色素瘤细胞系统(B16cellline)作为模式，探讨成分是否具有抑制黑色素细胞生长或者抑制黑色素形成的美白潜力。但B16细胞系为黑色素细胞的肿瘤细胞系，其黑色素产生的量以及成分对B16细胞所能达到的抑制效果，往往与健康人的皮肤系统不同。(3)初代培养(primaryculture)的人类黑色素细胞(humanmelanocyte):由于是人类的黑色素细胞的初代培养，因此最接近人体真实的皮肤细胞系统。通常会以无害的成分最大剂量(例如可维持95％细胞存活的成分浓度)进行对黑色素细胞产生黑色素是否可以达成抑制效果作为美白筛选的测试。多数情况下以上三种模式均能看到有明显美白效果的成分并不多；如有此种效果，则显示该成分确实具有较佳的美白潜力。各国主管机关在审核新的化妆品功能原料是否准用时，对原料的安全评估结果亦极为重视。化妆品新原料需要做的安全性评估传统上是以动物实验的方式来进行，其中最重要且基本的为皮肤刺激性、皮肤腐蚀性以及皮肤致敏性测试等。但欧盟于2013年7月开始实施禁用动物试验(animalban)，规定以动物测试的产品禁止贩卖(Marketingban)，所以国际间在替代动物实验(Alternativetesting)已经开始投入大量的金钱和时间，致力开发替代动物实验之方法，亦即以所谓的3D人类仿生皮肤组织及OECD所认可的实验方法来进行化妆品原料的安全评估测试。本研究率先引进德国的3Dhumanskintissue进行化妆品原料的皮肤刺激性(OECD439)以及皮肤腐蚀性测试(OECD431)。另亦以人体临床测试加做皮肤致敏性的测试，并验证3Dskin的皮肤刺激性和皮肤腐蚀性测试结果。由于需兼顾功能成分的安全性和有效性，因此目前卫生署以正面表列的方式公告可使用的美白成分及其浓度，这些成分包括曲酸(kojicacid)、熊果素(arbutin)、鞣花酸(ellagicacid)及洋甘菊抽取物(chamomileET)等，详见下表1。由表1来看，可使用的美白成分并不算多，且酸类物质多半含有局部使用的刺激感。近年由于日本佳丽宝公司使用杜鹃花醇造成消费者白斑症的问题，因此寻找安全又有效、且具有实质上的应用性的美白化妆品原料、甚至同时具有美白以外其他功能特性的化妆品新原料，就成了许多业者研究的目标。表1技术实现要素：基于此，有必要提供一种兰花萃取物及其制备方法和应用。本发明的目的即在于提供一种兰花萃取物，其中所述兰花为蝴蝶兰属，所述兰花萃取物由下列步骤所制备而得：(1)萃取：将所述兰花与溶剂以重量比例为0.5：1～10：1，进行混合粉碎或者破壁得到兰花浆；其中所述溶剂包含水或醇类(醇类，例如：乙醇、丙醇、丁醇)或其混合物中的至少一种；(2)固液分离：将步骤(1)所述兰花浆进行固液分离，将杂质去除，留下液态为兰花滤液；(3)活性划分：将步骤(2)所述兰花滤液以『分子筛』薄膜处理(薄膜制程)纯化，得到兰花萃取筛分液；(4)浓缩：将步骤(3)所述兰花萃取筛分液以『分子筛』薄膜处理浓缩，或者其他真空或蒸煮方式进行部分浓缩，得到活性沉淀物与具活性的液态活性萃取液。在其中一个实施例中，所述兰花是系选自蝴蝶兰属SogoYukidian种「旭东威士忌」(PhalaenopsisSogoYukidian’Shiuh-DongWhishkey’)，该兰花为植物品种权证书品种权字第A00595号，源自于青山兰花生物科技有限公司。在其中一个实施例中，步骤(1)中所述兰花与所述溶剂较佳为以重量比例5:1的方式进行萃取(打浆)。在其中一个实施例中，步骤(2)中所述固液分离的温度为0～60℃。在其中一个实施例中，步骤(2)中所属固液分离的温度为0～35℃。在其中一个实施例中，步骤(2)固液分离时可使用离心法或过滤法，所述过滤法采用的过滤材料为硅藻土、珍珠岩、滤纸、滤布及滤心(0.1～5μm)至少一种。在其中一个实施例中，步骤(3)所述活性划分，及步骤(4)所述浓缩中所述薄膜处理采两段步骤：第一段采用无机陶瓷膜或有机复合膜；第二段采用纳滤膜(NF，nanofiltrationmembrane)或逆渗透膜。在其中一个实施例中，所述无机陶瓷膜为氧化铝膜、氧化锆膜或氧化鍗。在其中一个实施例中，所述有机复合膜为聚砜膜、醋酸纤维膜、聚四氟乙烯膜或聚丙烯膜。在其中一个实施例中，所述纳滤膜或逆渗透膜可为单一薄膜或复合薄膜，材质为复合膜(TFM，thinfilmmembrane)、聚偏氟乙烯(PVDF)、聚砜(PS)、聚醚砜(PES)及聚丙烯腈(PAN)中的至少一种，其中第二段分离的压力为150-400psi，最佳压力为200-300psi。在其中一个实施例中，步骤(4)所述活性沉淀物结构鉴定是以核磁共振(NMR)及质谱仪(MS)进行化学结构的分析鉴定。本发明另一目的在于提供一种医药组合物，包含有效量的上述液态活性萃取液、活性沉淀物(化合物)或其组合及其药学上可接受的赋形剂。本发明的另一目的在于提供一种兰花萃取物用于制备具美白功能的药物的用途，其中所述兰花萃取物为上述的液态活性萃取液、活性沉淀物或其组合。在其中一个实施例中，所述兰花萃取物是用于制备抑制酪胺酸酶的美白药物或活性成分。在其中一个实施例中，所述兰花萃取物是用于制备抑制黑色素形成的美白药物或活性成分。本发明的另一目的在于提供一种兰花萃取物用于制备治疗自由基引起疾病的药物的用途，其中所述兰花萃取物为上述的液态活性萃取液、活性沉淀物或其组合。在其中一个实施例中，所述兰花萃取物是用于制备快速清除自由基的药物或活性成分。本发明的另一目的在于提供一种兰花萃取物用于制备抗皱(抗老化)药物的用途，其中所述兰花萃取物为上述的液态活性萃取液、活性沉淀物或其组合。在其中一个实施例中，所述兰花萃取物是用于制备治疗胶原蛋白缺乏所引起疾病的药物或活性成分。在其中一个实施例中，所述兰花萃取物是用于制备抑制基质金属蛋白酶的抗皱(抗老化)药物或活性成分。在其中一个实施例中，所述兰花萃取物时用于制备抑制胶原蛋白酶的抗皱(抗老化)药物或活性成分。在其中一个实施例中，所述兰花萃取物是用于制备抑制弹性蛋白酶的抗皱(抗老化)药物或活性成分。本发明的另一目的在于提供一种兰花萃取物，其中所述兰花为蝴蝶兰属，所述兰花萃取物由下列步骤所制备而得：(1)萃取：将所述兰花与溶剂以重量比例为0.5：1～10：1，进行混合粉碎或者破壁得到兰花浆；其中所述溶剂为水或醇类(醇类，例如：乙醇、丙醇、丁醇)或其混合物中的至少一种；(2)固液分离：将步骤(1)所述兰花浆进行固液分离，将杂质去除，留下液态为兰花滤液。本发明的另一目的在于提供一种兰花萃取物，其中所述兰花为蝴蝶兰属，所述兰花萃取物由下列步骤所制备而得：(1)萃取：将所述兰花与溶剂以重量比例为0.5：1～10：1，进行混合粉碎或者破壁得到兰花浆；其中所述溶剂为水或醇类(醇类，例如：乙醇、丙醇、丁醇)或其混合物中的至少一种；(2)固液分离：将步骤(1)所述兰花浆进行固液分离，将杂质去除，留下液态为兰花滤液；(3)活性划分：将步骤(2)所述兰花滤液以『分子筛』薄膜处理纯化，得到兰花萃取筛分液；(4)浓缩：将步骤(3)所述兰花萃取筛分液以『分子筛』薄膜处理浓缩，或者其他真空或蒸煮方式进行部分浓缩，得到活性沉淀物与具活性的液态活性萃取液。本发明的另一目的在于提供一种制备兰花活性萃取物的方法，其中所述兰花为蝴蝶兰属，包含下列步骤：(1)萃取：将所述兰花与溶剂以重量比例为0.5：1～10：1，进行混合粉碎或者破壁得到兰花浆；其中所述溶剂为水或醇类(醇类，例如：乙醇、丙醇、丁醇)或其混合物中的至少一种；(2)固液分离：将步骤(1)所述兰花浆进行固液分离，将杂质去除，留下液态为兰花滤液；(3)活性划分：将步骤(2)所述兰花滤液以『分子筛』薄膜处理纯化，得到兰花萃取筛分液；(4)浓缩：将步骤(3)所述兰花萃取筛分液以『分子筛』薄膜处理浓缩，或者其他真空或蒸煮方式进行部分浓缩，得到活性沉淀物与具活性的液态活性萃取液。与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：本案发明人经多年研究，发现特定兰花(蝴蝶兰属)经过特殊的萃取制程，其萃取物同时具有抑制酪胺酸酶的活性、抗氧化力以及抗皱(抗老化)能力。此萃取物至少涵盖三种结构类似的黄酮类，在酪胺酸酶、老鼠B16黑色素细胞、以及人类初代培养的黑色素细胞、以及人体实验都看到美白的效果，同时经生化与分子生物学的分析，亦发现其具有抗氧化和抗皱(抗老化)的效果。此特定兰花可以基源鉴定的方式分辨其与其他兰花的差异。全程以低温、水相的绿色制备方法，得到同时具有数个功能特性的活性萃取物，其为具有特定的黄酮类结构的结晶或含有此黄酮类的活性萃取液。该活性萃取物具酪胺酸酶抑制能力，并同时具备抑制黑色素细胞产生黑色素的能力、以及抗氧化和抗皱(抗老化)的效果，在体外细胞实验及人体实验均证实其安全性，具有实际的商品应用性。附图说明图1为兰花萃取步骤流程，其中，110取兰花花朵120将兰花与溶剂进行混合粉碎或者破壁130进行固液分离140进行活性划分150进行浓缩160得到活性沉淀物与液态活性萃取液；图2藉由酪胺酸酶(tyrosinase)合成黑色素的路径(Raper-Masonpathway)；图3为兰花萃取物的活性沉淀物1H-NMR分析图谱(Varian500)(A)；以及13C-NMR分析图谱(Varian500)(B)；图4为兰花的活性沉淀物的质谱仪(massspectrometry,MS)分析结果(A)；以及标准品(Apigenin-6-ribosido-7-glucoside)的质谱仪(massspectrometry,MS)分析结果(B)；图5为兰花的活性沉淀物的质谱仪(massspectrometry,MS)分析结果(A)；以及标准品(Saponarin)的质谱仪(massspectrometry,MS)分析结果(B、C)；图6为兰花的活性沉淀物的质谱仪(massspectrometry,MS)分析结果(A)；以及标准品(Apigenin7-glucoside)的质谱仪(massspectrometry,MS)分析结果(B)；图7为兰花萃取浓缩液进行体外皮肤腐蚀性试验结果(A)；以及兰花萃取浓缩液进行体外皮肤刺激性试验结果(B)；图8为兰花萃取浓缩液经不同浓度的乙醇与水萃取后，总多酚的含量(gallicacidequivalent，GAE)；图9为兰花萃取浓缩液经不同浓度的乙醇与水萃取后，DPPH自由基清除率(A)；兰花萃取浓缩液与BHT的自由基清除率(B)；兰花、兰叶萃取浓缩液与ABTS的自由基清除能力(C)；图10为兰花滤液经不同浓度的乙醇与水萃取后，进行酪胺酸酶抑制率评估(A)；为不同种兰花不同步骤的兰花萃取浓缩液(物)，以水萃取测试酪胺酸酶抑制率(B)；为兰花、兰叶萃取浓缩液测试酪胺酸酶抑制能力(C)；图11为兰花萃取浓缩液或活性沉淀物经不同浓度的乙醇与水萃取后，其黑色素细胞抑制黑色素实验结果；图12A至H为不同的旭东威士忌兰花萃取液对HMC-4细胞进行细胞存活率实验的结果；图13不同的旭东威士忌的兰花萃取液抑制黑色素表现的试验结果，其中M254为M254培养基，M2为M2培养基，KA为曲酸(Kojicacid)；图14为兰花萃取浓缩液测试抗皱(抗老化)能力。具体实施方式以下结合具体实施例对本发明的兰花萃取物及其萃取方法和应用作进一步详细的说明。本说明书中所述的所有技术性及科学术语，除非另外有所定义，皆为该所属领域具有通常技艺者可共同了解的意义。如本文中所使用，术语“萃取物”是指藉由萃取作用所制备的产物。该萃取物可以溶于溶剂中的溶液形式呈现，或萃取物可为不含或大体上不含溶剂的浓缩物或精华呈现。如下文进一步所述，萃取物亦可调配于医药组合物或食品中。术语萃取物可为自特定萃取步骤或一系列萃取步骤获得的单一萃取物，或萃取物亦可为自独立萃取步骤获得的萃取物的组合。因此，该等经合并的萃取物亦涵盖于术语“萃取物”。如本文所用“原料”通常是指植物原材料，包含单独的整个植物或植物的一个或多个组成部分的组合，包含叶、根(包括但不限于主根、尾根、及纤维根)、茎、皮、浆果、种子、及花，其中该植物或组成部分可包含原始、经干燥、经蒸煮、经加热或以其他方式经物理加工以利于加工的材料，其可进一步包含完整、剁碎、切丁、碾磨、研磨或以其他方式经加工以影响该植物材料的大小及实体完整性的材料。术语「原料」可用于表示用于额外萃取制程的材料来源的萃取产物。另外，于本发明可为皮肤外用剂组合物，组成除上述兰花萃取物以外，基剂可依需要适宜添加用于一般化妆品及医药品等皮肤外用剂所用的成分，例如保湿剂、抗氧化剂、油性成分、紫外线吸收剂、界面活性剂、增黏剂、醇类、粉末成分、色剂、水性成分、水、各种皮肤营养剂等。亦可适宜地添加其他依地酸二钠、依地酸三钠、柠檬酸钠、聚磷酸钠、偏磷酸钠、葡萄糖酸等的金属阻断剂；咖啡因、丹宁酸、维拉帊米(verapamil)、胺甲环酸及其衍生物、甘草萃取物、甘草素、火棘果实的热水萃取物、各种生药、乙酸生育酚酯、甘草酸及其衍生物或其盐等的药剂；维生素C、抗坏血酸磷酸镁、抗坏血酸葡糖苷、熊果苷、曲酸等的其他美白剂；葡萄糖、果糖、甘露糖、蔗糖、海藻糖等的糖类等。本发明的皮肤外用剂组合物是例如软膏、乳霜、乳液、药水、面膜(pack)、浴用剂、霜剂等皮肤外用剂型，只要是用于习知皮肤外用剂组合物者均可而不特别规定其剂型。术语「治疗」、「治疗中」及其类术语系指延缓、改善、减少或逆转目前正折磨着患者的该病症或该病症相关的任何症状的方法以及预防该病症或其任何正出现的症状的方法。术语「药学上可接受」意谓物质或组合物必须与调配物的其他成份兼容，且对患者无害。术语「药学上可接受的赋形剂」，如本文中所用者，意指谙于此技者所知可与兰花萃取物的物理和化学特性兼容的任何生理学惰性，药理学上不活性的物质。药学上可接受的赋形剂包括，但不限于，聚合物、树脂、增塑剂、填料、润滑剂、稀释剂、黏合剂、崩解剂、溶剂、共一溶剂、界面活性剂、防腐剂、甜味剂、调味剂、药学级的染料或颜料、及黏度剂。术语「医药组成物(pharmaceuticalcomposition)」为一种固体或液体组成物，其形式、浓度和纯度程度适合投予给病患(如人类或动物病患)，在施予之后，其可诱发所欲生理变化。医药组成物为无菌及非发热性者(non-pyrogenic)。如本文所用术语「有效量」是指产生期望生物反应所必需的量。如彼等业内普通技术者可理解，复合物或生物活性剂的有效量可视诸如下列等因素而变化：期望生物终点、拟递送生物活性剂、囊封基质的组成、目标组织等等。本发明是以下面的实施例予以示范阐明，但本发明不受下述实施例所限制。本发明所用的兰花、原料、生物材料皆市售易于取得，下列仅为示例可取得的管道。实施例一兰花萃取物萃取方法兰花的萃取方法，步骤如图1所示，取兰花为蝴蝶兰属SogoYukidian种「旭东威士忌」(PhalaenopsisSogoYukidian’Shiuh-DongWhishkey’，以下简称旭东威士忌)，该兰花为植物品种权证书品种权字第A00595号，以下列步骤所制备而得：(1)萃取：将所述兰花与溶剂以重量比例为0.5：1～10：1，较佳为5:1；时间为3～60分钟，较佳为10分钟；温度为0～60℃，较佳为0～35℃；可利用超音波、研磨等萃取方式进行提取，较佳为超音波，进行混合粉碎或者破壁得到兰花浆；所述溶剂为水、醇类或醇类水溶液，其中所述醇类为乙醇、丙醇、或丁醇。(2)固液分离：将步骤(1)所萃取的兰花浆进行脱浆，脱浆时间为20～60分钟，较佳为30～40分钟；温度0～60℃，较佳为0～35℃；以离心、压榨等方式脱浆，较佳为离心1000～3000rpm；最佳为离心1500～2000rpm。留下液态为兰花粗萃取液，抛弃花渣；(3)粗滤：将步骤(2)的兰花粗萃取液进行粗过滤，粗过滤时可使用硅藻土、珍珠岩、滤纸、滤布或滤心，较佳为使用硅藻土、珍珠岩及滤心(0.1～5μm)搭配使用，得到兰花滤液；(4)活性划分：将步骤(3)的兰花滤液以『分子筛』薄膜处理(薄膜制程)纯化，薄膜分两段分离；第一段：薄膜采孔径0.04～1μm的无机陶瓷膜(氧化铝膜、氧化锆膜、氧化鍗等无机陶瓷膜)或有机复合膜(聚砜膜(PS)、醋酸纤维膜、聚四氟乙烯膜、聚丙烯膜等有机复合膜)，较佳薄膜孔径为0.04μm。分离细小微粒，留下渗透液。第二段：薄膜采纳滤膜(nanofiltrationmembrane，NF)或逆渗透膜，截留分子量100～1000MW，最佳截留分子量150MW。其中该薄膜可为有机的单一或复合膜，材质为包含有复合膜(TFM,thinfilmmembrane)、聚偏氟乙烯(PVDF)、聚砜(PS)、聚醚砜(PES)、聚丙烯腈(PAN)中的至少一种；其中该薄膜分离的压力为150-400psi，最佳压力为200-300psi。分离多余的水分及有机物，得到活性沉淀物与具活性的液态活性萃取液，即为兰花萃取浓缩液；(5)过滤：将步骤(4)的所述兰花萃取浓缩液过滤后，得到活性沉淀物。活性沉淀物经水洗、干燥得白色-黄色结晶物，再以DMSO为溶剂，经1H-NMR(图3A)以脉冲序列(PulseSequence)为s2pul、25℃、relax.Delay1.0秒、脉冲(pulse)45℃、Acq.时间3.000秒、宽(Width)8000.0Hz、52repetitions、ObserveH1，499.8789802MHz、Linebroadening0.1Hz、FTsize65536、总时间4分16秒；与13C-NMR(图3B)，以脉冲序列(PulseSequence)为s2pul、25℃、relax.Delay0.5秒、脉冲(pulse)40℃、Acq.时间1.042秒、宽(Width)31446.5Hz、896repetitions、ObserveC13,125.6946696MHz、DecoupleH1,499.8814989MHz、Power36dB、Linebroadening1.0Hz、FTsize131072、总时间50分50秒。分析后，初步认为是黄酮类化合物。由质谱仪(massspectrometry，MS)分析上述兰花的活性沉淀物中的结构，发现该兰花的活性沉淀物为黄酮类(flavone)的组合物；该组合物大部分是接双醣的flavone，也有少部分为接单醣的flavone。该组合物中的主要结构至少包括:i.C26H28O14:MW:564，为接双醣(ribosido和glucoside)的flavone，是组合物中含量高的成分，可推定为洋元荽黄素-6-核糖苷-7-葡萄糖苷(Apigenin-6-ribosido-7-glucoside)(图4(A)兰花的活性沉淀物和图4(B)标准品Apigenin-6-ribosido-7-glucoside)；ii.C27H30O15:MW:594，为接双醣(2个glucoside)的flavone，是组合物中含量高的成分，可推定为皂草苷(Saponarin)(图5(A)兰花的活性沉淀物和(B、C)标准品Saponarin)；iii.C21H20O10:MW:432，为接单醣(1个glucoside)的flavone，是组合物中含量较少的成分，可推定为洋元荽黄素-7-葡萄糖苷Apigenin7-glucoside(图6(A)兰花的活性沉淀物和(B)标准品Apigenin7-glucoside)。实施例二兰花萃取浓缩液的皮肤刺激及敏感性测试A.兰花萃取浓缩液无皮肤刺激性及腐蚀性—细胞测试参照皮肤腐蚀性标准试验invitroSkinCorrosion:ReconstructedHumanEpidermis(RHE)TestMethod(版本4.3，2012/11)(OECD431)，及参照皮肤刺激性标准试验invitroSkinIrritation:ReconstructedHumanEpidermisTestMethod(版本3.1，2012/11)(OECD439)，以购自德国的的3D上皮细胞组进行试验。根据上述OECD431与OECD439的标准方法进行体外皮肤腐蚀性/刺激性测试。体外腐蚀性试验中，以水作为负向对照组、氢氧化钾为正向对照组，旭东威士忌的兰花萃取浓缩液(EW-DK)，即为步骤(4)浓缩后以孔径0.04μm的PS膜，并以截留分子量为150MW的TFM膜，得到兰花萃取浓缩液，经OECD431体外腐蚀试验判定为无皮肤腐蚀性(图7A)。体外刺激性试验中，以杜氏磷酸缓冲液(Dulbecco'sPhosphate-BufferedSaline)作为负向对照组、5％SDS溶液作为正向对照组。旭东威士忌的兰花萃取浓缩液经的体外刺激性试验判定为无皮肤刺激性(图7B)。B.兰花萃取浓缩液无眼睛刺激性之试验—细胞测试本实施例利用浓度为5.7％及6.7％的旭东威士忌兰花萃取浓缩液，以子宫颈癌细胞(HeLa细胞)来进行眼睛刺激性的试验；该旭东威士忌兰花萃取浓缩液系利用实施例一中步骤(4)的薄膜分离步骤，以孔径0.04μm的PS膜，并再以截留分子量为150MW的TFM膜来获得，最后再以红外线水分计测试固含量浓度分别为6.7wt％与5.7wt％的萃取浓缩液，直接进行试验。其中眼睛刺激性测试的方法如下:解冻保存于液体氮中的人的子宫颈癌细胞，并于含有5％FBS的MEM培养基中培养直到可以用来做实验所需要的细胞数量。由10,000μg/mL，以含5％FBS的MEM培基10倍连续稀释成5个浓度的实验用料。当细胞足够用于实验时，以胰蛋白酶收集细胞后，将细胞接种入96孔微孔盘中(以下以盘表示)个孔中，进行3天前培养。用培基调整旭东威士忌兰花萃取浓缩液(实验用料)直到适合实验的浓度后，加入盘中，再培养48小时。将培养基从盘中移除，用磷酸盐缓冲液(PBS)洗净后，置换入含有MTT的培养基(以下以MTT表示)，培养2小时；从盘中移除MTT，以PBS(-)洗净后，加入含盐酸之异丙醇，将细胞内生成的Formazandye萃取出来，确认Formazandye被均匀萃取出后，于570nm测吸亮度，并算出细胞存活率为50％时的实验用料浓度(EC50)。本实验进行2次，取平均值进行评估。试验结果显示浓度为5.7％及6.7％的旭东威士忌兰花萃取浓缩液无眼睛刺激性(表2)表2兰花萃取浓缩液无眼睛刺激性的试验*在不用动物来实验的情况下，要得到完全无刺激性的判定，必需要细胞生存率为50％时浓度(EC50)为5,000μg/mL以上。表2中的EC50大于5,000μg/mL，因此判定为无刺激性。表3为不同浓度的旭东威士忌兰花萃取浓缩液对细胞存活率的影响。第3表*％为兰花萃取浓缩液中的固含量(solidcontent)，为重量百分浓度。C.兰花萃取浓缩液无皮肤刺激及敏感性的试验—人体测试该实验是由AMA实验室(AMALABORATORIES,INC.)以旭东威士忌兰花萃取浓缩液对52位不同性别及不同年龄的受试者来进行测试，受试者为年龄介于18-69岁间的9位男性与43位女性，其中包括38位高家索人(Caucasian)、12位西班牙裔(Hispanic)及2位亚洲裔(Asian)；每一位受试者分别接受9次的测试，该测试结果如表4所示(AMA实验室报告的参考编号为:MS12.RIPT.M6496OP50.FEN.REV.2)；该结果显示旭东威士忌兰花萃取液对皮肤不具刺激性及致敏性；其中该旭东威士忌兰花萃取浓缩液系利用实施例一中步骤(4)的浓缩步骤，以孔径0.04μm的PS膜，并再以截留分子量为150MW的TFM膜来获得。表4兰花萃取浓缩液对人体无皮肤刺激及敏感性其中C:表示高家索人，H:表示西班牙裔，A:表示亚洲裔；F:女性，M:男性；9次受测反应中的数值若为0则表示没有任何反应(noevidenceofeffect)，Dc表示测试中断，受试者未现身受测试；得分中之N/A表示因测试中断，所以无法计算其得分。根据上表，52位受测者中，仅有2位因为个人因素中断实验，其余50未受测者均无产生任何皮肤刺激性(skinirritation)或者过敏性反应(skinsensitization)。显见该兰花萃取浓缩液的皮肤安全性。实施例三兰花萃取浓缩液总多酚含量实验方法：(1)测试碳酸钠对没食子酸吸收光谱的影响，取0.25mL的1,000μg/mL没食子酸(gallicacid)，0.5mL的20％、2％、0.2％、0.02％、0.002％及0.0002％的碳酸钠，加4.25mL的蒸馏水，在常温下反应25分钟后，以分光亮度计于200-800nm侦测吸亮度。没食子酸终浓度为50μg/mL。(2)添加Folin-Ciocalteu试剂与碳酸钠的顺序对没食子酸量测的影响以修改Folin-Ciocalteu方法测试方法，取0.25mL的没食子酸及同体积的Folin-Ciocalteu试剂、0.5mL20％碳酸钠及4mL的蒸馏水，没食子酸的最终浓度为0、20、60及100μg/mL。在常温下反应25分钟后，以分光亮度计于730nm侦测吸亮度。实验利用水或不同20、40、60、80、100％浓度乙醇进行萃取，步骤同实施例一，旭东威士忌萃取至实施例一步骤(3)的粗滤液实验结果从图8中可以发现，兰花以不同浓度乙醇萃取后总多酚含量数据显示，水相萃取较醇相萃取可以得到出更高含量的多酚类，通常总多酚含量高者抗氧化力较强。实施例四兰花萃取浓缩液具抗氧化功能评估实验方法：清除DPPH自由基能力测定，取2ml0.2g/ml的试验样品，以及5mg/ml的2,6-二第三丁基对甲酚(BHT)乙醇溶液，分别加入新鲜配制2.5×10-4Mα,α-diphenyl-β-picrylhydrazyl(DPPH)的乙醇溶液0.5ml，均匀混合避光静置30分钟后，UV-VIS设定扫描区段400nm-700nm，测其517nm的吸光值，计算其清除率，吸光值愈低表示清除能力愈强。以上实验均进行三重复。清除自由基能力EC50测定依照实验一测得的实验数据，分别取清除率前三名不同浓度试验样品测其清除率，依照不同试验样品所需的适当浓度，试验样品乙醇溶液2ml，加入新鲜配制2.5×10-4M浓度DPPH0.5ml，均匀混合避光静置30分钟后，UV-Vis设定扫描区段400nm-700nm，测其517nm的吸光值。以上实验均进行三重复。以浓度为y轴、清除率为x轴分别绘制测试样品的检量线并计算清除率50％的EC50浓度。旭东威士忌兰花萃取浓缩液(EW-DK)的浓度，即为实施例一步骤(4)浓缩后以孔径0.04μm的PS膜，并以截留分子量为150MW的TFM膜，得到兰花萃取浓缩液，是采用红外线水分计测试其固含量，取2mg/ml作为一致的浓度。实验结果从图9A可知，DPPH自由基清除率测试印证了总多酚含量检测结果，兰花以水相萃取，拥有较强的自由基清除能力，同时也具有较高的总多酚含量。同时图9B显示，取兰花萃取浓缩液与BHT(2,6-Di-tert-butyl-4-methylphenol)比较抗氧化能力，可以发现相较于BHT，兰花萃取浓缩液可以非常快速的清除自由基，达到短时间内抗氧化的效果。另外，图9C显示，对于ABTS(2,2'-azino-bis[3-ethylbenzthiazoline-6-sulphonicacid])自由基清除能力结果，IC50显示可达成自由基清除能力的结果，兰花萃取浓缩液相较于兰叶萃取浓缩液更具有自由基清除的能力。实施例五兰花萃取液具美白功能-抑制酪胺酸酶A.抑制酪胺酸酶测试-不同浓度乙醇萃取酵素功能性测定方式是利用酵素进行黑色素形成过程中生成物dopachrome的形成含量决定酵素功能性，dopachrome在UV/VIS波长475nm有吸收，由酵素功能性抑制率可以观察到此化合物使否具备减少黑色素生成的能力。1.测试溶液980μl含有0.8mML-tyrosine与0.9Mphosphatebuffer(pH6.8)均匀混合后，静置室温10分钟。2.将440.5unit的酪胺酸酶及测试样品10μl迅速混合，并且以UV/VIS波长475nm测定3分钟吸收变化。酪胺酸酶抑制率(％)＝{(对照组–实验组)/对照组}×100％。旭东威士忌兰花以0～100％乙醇为萃取溶剂，以实施例一步骤(2)方法萃取的兰花滤液，使用红外线水分计测试其含量，取2mg/ml作为一致的浓度。实验结果如图10A所示，6种测试样品进行抑制酪胺酸酶功能性评估，由结果显示第一、二批次的4种测试样品(60％、40％、20％乙醇及水相)，均达到75％以上酪胺酸酶抑制率。(注：80％乙醇因为造成体外试管测试时酪胺酸酶变性，因此结果不计)。与卫生署核可的美白成分功能相比(本实验采用3mM的熊果素)，兰花滤液对于酪胺酸酶的抑制，在低浓度即显现出良好的效果，并且经由两个批次实验，具再现性，显示兰花滤液具有优秀的美白功能性潜力。B.抑制酪胺酸酶测试-不同品种不同步骤的萃取液(物)详细各种兰花与不同步骤的萃取液(物)，皆以水为萃取溶剂萃取，差异从步骤(3)开始，以红外线水分计测试其固含量，取2mg/ml作为一致的浓度。如下表5所列。表5本发明的兰花活性萃取物的获得方式实验结果如图10B所示，分析同属不同种的旭东威士忌与美人，均具有抑制酪胺酸酶功能，以旭东威士忌的功能性较佳；但比较不同属不同种青山大红袍，数据显示青山大红袍的萃取液，无抑制酪胺酸酶功能。所以均是蝴蝶兰，但依不同品种，有不一样的功能性强弱差异。C.抑制酪胺酸酶测试-花与叶的功效旭东威士忌兰花与兰叶，利用水萃取后，至步骤(4)浓缩中以孔径0.04μm的PS膜，得到兰花、兰叶萃取浓缩液，以红外线水分计测试其固含量，取2mg/ml作为一致的浓度，测试酪胺酸酶抑制情形。实验结果如图10C所示，IC50显示可达成抑制酪胺酸酶的结果，兰花萃取浓缩液相较于兰叶萃取浓缩液更具有抑制酪胺酸酶的活性能力。实施例六A.兰花萃取液具美白功能-抑制老鼠黑色素瘤细胞产生黑色素实验方法为1.将老鼠黑色素瘤细胞(B16)培养在6-well培养盘，加入DMEM(含10％FBS)培养液放置在37℃、5％CO2培养箱中，隔天在培养液中加入不同浓度的测试剂。2.将不同浓度的测试剂加入培养液中培养3天，以PBS清洗细胞再加入适量trypsin/EDTA静置3分钟，待细胞与培养皿分开后，将细胞取出并以PBS清洗，离心5000rpm5分钟。3.离心后去掉上清液，加入PBS并与细胞沉淀物缓慢混合均匀，离心5000rpm5分钟。4.步骤3再重复一次。5.最后将上清液去除，并将细胞沉淀物加入1ml的1NNaOH缓慢打散细胞，使其均匀分布在NaOH溶液中。6.离心3000rpm10分钟，取1ml上清液测UV/VIS波长405nm吸收。7.测定得到的数值除以存活细胞数，作为黑色素含量测定实验结果。新鲜兰花抑制老鼠黑色素瘤细胞产生黑色素，旭东威士忌兰花利用不同浓度溶剂萃取(水、20％乙醇、80％乙醇、100％乙醇)，至步骤(2)的兰花滤液(品项1-4)、至步骤(4)浓缩后以孔径0.04μm的PS膜，并以截留分子量为150MW的TFM膜得到兰花萃取浓缩液；再经过分离取得的活性沉淀物(品项5)、熊果素5mM(品项6)、对照组(品项7，1％DMSO)，皆以红外线水分计测试其固含量，取2mg/ml作为一致的浓度，如下表6所列。表6各试管添加的不同萃取物说明品项备注1100％水萃取220％乙醇萃取380％乙醇萃取4100％乙醇萃取5100％水萃取结晶沉淀物6熊果素5mM7对照组实验结果如图11所示，由老鼠黑色素瘤细胞抑制黑色素实验结果显示，熊果素、兰花乙醇萃取液、兰花水相白色结晶均具有明显抑制黑色素瘤细胞(B16)的效果。B.兰花萃取液具美白功能-抑制人类初代培养(primaryculture)的黑色素细胞(HMC-4)产生黑色素实验方法为以不同的旭东威士忌兰花萃取液，于人类初代培养(primaryculture)的黑色素细胞(HMC-4)上进行抑制黑色素表现的试验；而于进行抑制黑色素表现的试验前，先以不同的旭东威士忌兰花萃取液对HMC-4细胞进行细胞存活率(cellviability)的实验，然后以细胞存活率大于95％的最大测试剂量(浓度)进行抑制黑色素表现的试验。表7以及表8为抑制黑色素表现的试验中所使用的旭东威士忌兰花萃取液的不同剂量与萃取方法，图12A-H为表7以及表8中各旭东威士忌兰花萃取液对HMC-4细胞进行细胞存活率实验的结果，图13则为不同的旭东威士忌兰花萃取液抑制黑色素表现的试验结果；由图13可知所有受测试旭东威士忌兰花萃取液剂量虽以细胞存活率大于95％的最大测试剂量(浓度)进行抑制黑色素表现的试验，然该浓度的萃取液皆可抑制黑色素的表现。表7抑制黑色素表现的试验中所使用的旭东威士忌兰花萃取液的剂量与萃取方法表8抑制黑色素表现的试验中所使用的旭东威士忌兰花萃取液的剂量与萃取方法实施例七兰花萃取液具抗皱(抗老化)功效一、基质金属蛋白酶-1(MMP-1)MMP-1(基质金属蛋白酶-1，MatrixMetalloproteinase-1)是通称的胶原蛋白分解酶的一种，也就是说MMP-1负责真皮组织的胶原蛋白降解。本实施例利用旭东威士忌步骤(4)浓缩后以孔径0.04μm的PS膜，并再以截留分子量为150MW的TFM膜，得到兰花萃取浓缩液。以红外线水分计测试固含量浓度分别为重量百分比6.7％与5.7％，直接进行试验。实验结果如图14所示，其中该抗皱(抗老化)功效测试方法及步骤为:1.将储存于液态氮的二倍体纤维母细胞(TIG-118，Normalhumandiploidfibroblasts)解冻，并以含5％FBS(FetalBovineSerum，胎牛血清)的MEM培养基(MinimumEssentialMedium)培养至实验所需的足够细胞数。2.在进行预备试验之前确认待测试物质不会对细胞(TIG-118)产生毒性的浓度后，并且从最适宜正式测试时的最高(大)浓度稀释2倍，一共得做成3个浓度(1％、0.5％、0.25％)作为测试浓度。3.将上述步骤1中实验所需的足够细胞以胰蛋白酶处理取得后，并接种于35mm培养皿中(使其细胞密度为50,000细胞/mL)。4.然后该接种于35mm培养皿之细胞于培养24小时后，将培养液去除，以步骤2稀释好含测试物质的试验溶液取代，再继续培养24小时后，抽取细胞mRNA(提取试剂组：RNeasyMinikit,Qiagen)，以实时定量聚合酶连锁反应(Quantitativereal-timePCR)分析MMP-1的基因表现量。Real-timePCR分析的条件：使用设备：ABIPRISM7900HT,AppliedBiosystemsCo.,Ltd.PCR温度条件为:Stage1：42℃5min,95℃10sec(1cycle)Stage2：95℃5sec,60℃34sec(40cycle)Stage3：95℃15sec,60℃1min,95℃15sec(1cycle)二、弹性蛋白酶(elastase)皮肤弹性的减少和真皮层中弹性纤维(elasticfibers)的卷曲会使得皮肤形成皱纹，而弹性蛋白酶(elastase)抑制剂可抑制弹性蛋白酶的活性，防止皮肤弹性纤维的损伤，从而有助于减轻皱纹的形成。本实施例利用浓度为5％及1％的旭东威士忌兰花萃取浓缩液，将其分别以Tris-盐酸缓冲液进行稀释，共计分别做成5种浓度，进行弹性蛋白酶的活性抑制的测试(表9)，其中5％及1％的旭东威士忌兰花萃取浓缩液皆有非常好的弹性蛋白酶的活性抑制率。同时并做5％及1％的旭东威士忌兰花萃取浓缩液抑制弹性蛋白酶的IC50的测试(表10)。其中该旭东威士忌兰花萃取浓缩液是利用实施例一中步骤(4)的浓缩步骤，以孔径0.04μm的PS膜，并再以截留分子量为150MW的TFM膜来获得。表9不同浓度的旭东威士忌兰花萃取浓缩液对弹性蛋白酶的活性抑制率表10不同浓度的旭东威士忌兰花萃取浓缩液抑制弹性蛋白酶的IC50其中所述弹性蛋白酶活性抑制测试的方法如下:将不同浓度的旭东威士忌兰花萃取浓缩液、酵素液(elastase溶液)、基质溶液(N-Succiny-Ala-Ala-Ala-p-Nitroanilide)混合，于37℃加温15分钟后，于415nm测吸亮度，并按下列算式算出弹性蛋白酶的活性抑制率。A：空白溶液反应后的吸亮度B：实验溶液反应后的吸亮度A0、B0：代替酵素液，用Tris-盐酸缓冲液时的吸亮度。三、胶原蛋白酶(collagenase)胶原蛋白酶会降解皮肤中的胶原蛋白，进而造成皮肤产生皱纹及老化，而胶原蛋白酶抑制剂可以抑制胶原蛋白酶，防止皮肤产生皱纹及老化。本实施例利用浓度为5.7％及6.7％的旭东威士忌兰花萃取浓缩液，将其分别以柠檬酸缓冲液2倍连续稀释成5种浓度，进行胶原蛋白酶的活性抑制的测试(表11)，其中100％浓度的5.7％及6.7％的旭东威士忌兰花萃取浓缩液具有最佳的胶原蛋白酶的活性抑制率；其中该旭东威士忌兰花萃取浓缩液是利用实施例一中步骤(4)的浓缩步骤，以孔径0.04μm的PS膜，并再以截留分子量为150MW的TFM膜来获得，最后再以红外线水分计测试固含量浓度分别为6.7％与5.7％的萃取浓缩液，直接进行试验。表11不同浓度的旭东威士忌兰花萃取浓缩液对胶原蛋白酶的活性抑制率其中该胶原蛋白酶活性抑制测试的方法如下:将不同浓度的旭东威士忌兰花萃取浓缩液、胜肽溶液(Pz-Pro-Leu-Gly-Pro-D-Arg-OH)混合，于37℃下加温后，加入酵素液(collagenase)，再于37℃反应后，加入0.1MTrisbuffer(含有20mMCaCl2,pH7.1)停止反应，加入乙酸乙酯、于3,000rpm离心分离。于320nm测乙酸乙酯层的吸亮度、按下列算式计算胶原蛋白酶活性抑制率(％)。A：空白溶液反应后的吸亮度B：实验溶液反应后的吸亮度A0、B0：以精制水代替酵素液时的吸亮度。实施例八兰花萃取液于人体的护肤功效测试本实施例利用旭东威士忌步骤(4)浓缩后以孔径0.04μm的PS膜，并再以截留分子量为150MW的TFM膜，得到兰花萃取浓缩液。以红外线水分计测试固含量浓度分别为1.0％，直接进行试验。对31位不同年龄、性别的受测者在台大医院进行人体皮肤功效测试，并于测试两周后分析其结果。在这次影像测试所评估的四种斑点指标，包括:可见斑点、紫外线色斑、棕色斑及红色斑；其中可见斑点为标准白光下肉眼可看到的黑色斑点；紫外线色斑为使用365nm紫外光摄影下看到的黑色斑点(紫外线摄影会突显肉眼看不到的斑点部份)；棕色斑为使用RBX偏光专利技术所模拟得到的皮肤深层斑点评估；红色斑为使用RBX偏光专利技术所模拟得到的皮肤红色斑点评估；而表中数值多寡代表数量的多少而分值比例代表检测项目的特征程度(密度)。于使用两周后没有受测者发生不良反应及不适感。测试结果如表12及表13所示，该结果发现在可见斑、棕色斑及红色斑数目在使用两周后有统计上的下降趋势，但在特征程度(密度)部份则没有统计上的差异，且在使用两周的分析结果可看到具有减少黑色素斑数量(可见斑及深层斑)及减少红色斑数量的效果。表12兰花萃取液于人体的护肤功效测量数值表13兰花萃取液于人体护肤功效测试的结果统计数值數值越低越好发明利用青山兰花培育的独特品种白色蝴蝶兰(即蝴蝶兰属SogoYukidian种旭东威士忌兰花)，经萃取后在抑制酪胺酸酶、抑制老鼠B16黑色素细胞及人类HMC-4细胞产生黑色素及人体等实验中，显示有良好的美白能力，同时也具有抗皱(抗老化)、抗老化能力，且经多种细胞实验、体外测试及人体实验后，均证实安全无腐蚀刺激性、亦无皮肤致敏性。本研究团队研究植物活性多年，能在多种系统(酵素、动物细胞系统、人类初代皮肤细胞的系统、以及临床实验)均验证美白的效果的活性成分、且温和无刺激的成分极为少见。由此可见此原料与制备方法的优异性。制备方法方面，萃取物经由薄膜处理后，除了可实现量产，并可以得到分离纯化浓缩的效果。浓缩后的兰花萃取液，会产生大量的沉淀物，收集后经研究分析，该沉淀物属于三种结构类似的黄酮化合物群组。萃取液及沉淀物具有良好的美白能力、抗皱(抗老化)能力以及抗氧化力。此制备方法属于绿色制程，并不产生毒性有机溶剂、且放大容易、亦可连结微生物管控，产出卫生安全的活性萃取浓缩液进而可沉淀获得的黄酮活性化合物。经尝试其他不同属的兰花，无酪胺酸酶抑制能力；而与另一同属的兰花相比，虽均具酪胺酸酶抑制能力，但以本发明的品种抑制能力较佳。本专利所使用的制备方法及试剂，均允许使用于化妆保养品。以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。当前第1页1 2 3