本发明属医药技术领域，涉及独根草(Oresitrophe rupifraga Bunge)提取物及其制备方法和在制药中的用途，尤其是在制备治疗神经退行性疾病药物中的用途。
背景技术：
现有技术公开了神经退行性疾病(Neuro-degenerative diseases)包括阿尔茨海默病(Alzheimer's disease，AD)、帕金森氏病(Parkinson's disease，PD)、肌萎缩侧索硬化症(Amyotrophic lateral sclerosis，ALS)和亨廷顿病(Huntington's disease，HD)等。研究显示，所述的神经退行性疾病伴随着全球人口的老龄化呈加重趋势，其不仅严重影响患者的生活质量，而且给社会带来极大的经济负担。虽然目前其发病机制并不明确，但大量研究资料表明，炎症在中枢神经系统退行性疾病中起重要作用。有研究报道，炎症反应介导的神经元退行性病变主要是由胶质细胞的过度活化继而导致炎症因子如一氧化氮(NO)、环氧合酶-2(cyclooxygenase-2)和肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)等过量释放所引起。因此，本领域技术人员关注有关脑内神经炎症抑制剂的研究，进一步开发研制具有治疗多种神经退行性疾病的新型药物。
研究显示，中草药在治疗神经退行性疾病方面体现出多成分、多靶点、低毒性的独特优势，如经方、验方在临床上得到成功应用等。独根草(Oresitrophe rupifraga)为虎耳草科(Saxifragaceae)独根草属植物(此属为单种)，主要分布在我国河南、河北、辽宁西部和山西东部，其生境十分独特，多生长于海拔600 2000米的山谷、悬崖之阴湿石隙等地，因而采集十分困难；民间以全草入药，具有清热利湿之功效，可用于小儿肠炎和泄泻，但其化学成分系统研究及相关生物活性尚未见任何报道。
基于现有技术的现状，本申请的发明人从该独根草属植物制备全草醇提物中，进一步分离其中的新化合物，并用于制备治疗神经退行性疾病药物。
分离得到的两个新化合物：(7R,8S,8'S)-9-hydroxy-4,4'-dimethoxy-7,9'-epoxy-8,8'-lignan(化合物1)和3β-hydroxy-15β-O-β-D-glucopyranosyl-cholesta-5-ene(化合物2)，经体外活性筛选发现均具有显著的抗神经炎症活性(IC50均小于10μM)。
技术实现要素：
本发明的目的是提供针对现有技术的缺陷，从独根草属植物制备全草醇提物，进一步分 离其中的新化合物，并用于制备治疗神经退行性疾病药物。
具体的，本发明提供了独根草(Oresitrophe rupifraga Bunge)提取物及其制备方法和在制药中的用途，尤其是在制备治疗神经退行性疾病药物中的用途。
本发明中，采用独根草属植物制备全草醇提物，进一步分离其中的新化合物，得到化合物1(木脂素，7R,8S,8'S)-9-hydroxy-4,4'-dimethoxy-7,9'-epoxy-8,8'-lignan)和化合物2(胆甾醇苷，3β-hydroxy-15β-O-β-D-glucopyranosyl-cholesta-5-ene)，本发明的实施例中，优选采集河南省焦作市修武县境内云台山的珍稀植物独根草(Oresitrophe rupifraga Bunge)制备全草醇提物后分离其中的化合物，经体外活性筛选，结果显示，所述的化合物均具有显著的抗神经炎症活性(IC50均小于10μM)；可用于制备治疗阿尔茨海默病和帕金森氏病等神经退行性疾病的药物。
本发明所述的化合物1和2，其结构式如下所示：
本发明的独根草提取物活性成分通过下述方法制得，首先以独根草全草为原料，采用溶剂提取法制成浓缩提取物；所采用的溶剂提取法中，可以选用水、甲醇、乙醇、丙酮等单一溶剂或多种溶剂的混和溶剂，在室温下浸渍提取或加热条件下回流提取，提取次数为2～3次，提取液浓缩后悬浮于水溶液中，先用石油醚萃取去除色素，之后用乙酸乙酯萃取2～3次，经过多次柱层析，从独根草的乙酸乙酯层组分中制得单体化合物1和化合物2。
本发明对制得的化合物1和2的抗神经炎症活性进行了测试，结果显示，所述化合物1和2对脂多糖(LPS)诱导的BV-2小胶质细胞中NO的释放均具有显著的抑制作用(IC50值分别为7.21和9.39μM)，且对细胞存活率没有毒性影响，进一步，可应用于预防和/或治疗多种神经退行性疾病。
本发明所述化合物1和2可分别单独应用或者合用，或与适宜的赋形剂结合，按照常规方法制成口服或者非口服剂型应用于神经退行性疾病的治疗。
本发明具有如下优点：
从珍稀植物独根草中制得的化学结构新颖额化合物1和2；经实验证实两者均具有显著的抗神经炎症活性，对神经退行性疾病，尤其是严重影响老年人生活质量的阿尔茨海默病和帕金森氏病具有有意义的应用前景；两者虽从独根草中分离量较少，但依据其结构特点，还 可通过半合成(如以胆甾醇为前体)或全合成进行放大生产和结构衍生化，应用前景较强。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步阐述，但这些实施例绝非对本发明有任何限制。本领域技术人员在本说明书的启示下对本发明实施中所作的任何变动都将落在权利要求书的范围内。
实施例1
采用独根草全草3kg，粉碎，用7L 90％甲醇室温冷浸36小时，共4次，合并4次提取液，减压浓缩，得到383g浸膏，将得到的浸膏用1.2L的水分散，然后依次用石油醚、乙酸乙酯和正丁醇萃取，将乙酸乙酯部分85.9g用大硅胶柱(10×80cm；100-200mesh)进行初步分段，洗脱剂为石油醚、乙酸乙酯(从5:1到0:1，v/v)和乙酸乙酯、甲醇(从20:1到0:1，v/v)，得到5个组分Fr.1-Fr.5；Fr.2采用硅胶柱多次的分离之后用半制备HPLC[MeOH/H2O 70:30,v/v；流速：3.0mL/min]得到化合物1(3.8mg,tR＝15.1min)；Fr.5(6.7g)经MCI柱层析[MeOH/H2O(3:7-1:0,v/v)]及反复正相硅胶柱色谱层析后，由Sephadex LH-20(CH2Cl2/MeOH,2:1)纯化得到化合物2(2.4mg)。
制得的化合物的光谱及理化数据如下：
(7R,8S,8'S)-9-Hydroxy-4,4'-dimethoxy-7,9'-epoxy-8,8'-lignan(化合物1)：白色粉末；[α]D22+11.7(c 0.2,MeOH)；UV(MeOH)λmax(logε):226(4.23),276(3.36)nm；CD(c 0.91×10-3M,MeOH)λmax(Δε)216(+0.61),231(–1.25)；IR(film)vmax:3414,2918,2849,1617,1512,1034cm-1；1H NMR(CDCl3,400MHz):δ7.25(2H,d,J＝8.5Hz,H-2/H-6),7.12(2H,d,J＝8.5Hz,H-2'/H-6'),6.87(2H,d,J＝8.5Hz,H-3/H-5),6.84(2H,d,J＝8.5Hz,H-3'/H-5'),4.83(1H,d,J＝6.4Hz,H-7),4.06(1H,dd,J＝8.0,7.2Hz,Ha-9'),3.91(1H,dd,J＝7.6,6.8Hz,Ha-9),3.80(3H,s,O-Me'),3.79(3H,s,O-Me),3.76(1H,overlapped,Hb-9),3.73(1H,dd,J＝8.0,6.4Hz,Hb-9'),2.91(1H,dd,J＝13.4,5.0Hz,H-7'),2.73(1H,m,H-8'),2.58(1H,dd,J＝13.4,10.7Hz,H-7'),2.39(1H,m,H-8)；13C NMR(CDCl3,100MHz):δ159.0(C-4),159.8(C-4'),135.0(C-1),132.5(C-1'),129.6(C-2'),127.0(C-2),114.0(C-3'),113.9(C-3),82.7(C-7),73.0(C-9'),61.0(C-9),55.3(O-Me),55.3(O-Me'),52.6(C-8),42.2(C-8'),32.7(C-7').(+)ESIMS m/z 351.0[M+Na]+,679.2[2M+Na]+；HR-ESIMS m/z 351.1568[M+Na]+(calcd for C20H24NaO4,351.1567,△＝0.5ppm).
3β-hydroxy-15β-O-β-d-glucopyranosyl-cholesta-5-ene(化合物2):白色粉末；[α]D22–30(c 0.1,CHCl3)；UV(CHCl3)λmax(logε):240(3.51),277(3.33)nm；IR(film)νmax:3387,2925,2868,1698,1259,1016,759cm-1；1H and 13C NMR数据见表1；(+)ESIMS m/z 587.0[M+Na]+；HR-ESIMS m/z 587.3922[M+Na]+(calcd for C33H56O7Na,537.3918,△＝0.7ppm).
表1.1H(400MHz,J in Hz)and 13C(100MHz)NMR Data of 2.
a Recorded in C5D5N；b Recorded in CDCl3.
实施例2：抗神经炎症活性测试实验
小鼠小胶质BV-2细胞购自美国典型培养物保藏中心(Manassas,VA,USA)，培养在DMEM(Dulbecco's modified Eagle's medium)培养基(包括1800mg/L NaHCO3,10％(v/v)热灭活的胎牛血清(FBS)，100unit/mL青霉素G钠盐和100μg/mL链霉素)，37℃，5％CO2环境，培养箱中；NO的产生量通过Griess试剂盒(Beyotime Biotechnology,China)测定，即BV-2细胞用不同浓度待测化合物预处理4h，然后加入脂多糖(LPS，1μg/ml,Sigma-Aldrich)孵育24h(空白组不加LPS)。吸取培养上清液，与等量的Griess试剂混合，室温避光静置10分钟，用酶标仪(M200,TECAN,Austria GmbH,Austria)于540nm波长处测定各组的OD值，用NaNO2绘制标准曲线，计算样品中NO的含量；数据使用单向方差分析法(ANOVA)进行分析并以平均值±SD表示，P<0.05，以L-NMMA为阳性对照，测试结果如表2所示：
表2.所测化合物对LPS诱导的BV-2细胞中NO释放的抑制作用
a IC50value of each compound was defined as the concentrationμM of indicated compound that caused 50％ inhibition of NO production in LPS-stimulated BV-2 cells.
b The results are averages of three independent experiments,and the data were expressed as mean±SD.
c Cell viability after treatment with 50μM of each compound was expressed as a percentage ％ of untreated control cells.
dL-NMMA:positive control.。