一种基于铁蛋白/壳聚糖的天然色素分子包埋物的制备方法与流程

一种基于铁蛋白/壳聚糖的天然色素分子包埋物的制备方法，属于食品领域技术。

背景技术：

铁蛋白是一类广泛存在于动物、植物及微生物中的天然铁贮存蛋白。由于其特殊的中空结构和独特的蛋白质外壳，被广泛用于金属离子和有机小分子的载体。铁蛋白外壳分子结构保守，由24个亚基组成，且每两个亚基反向平行形成一组，构成一个近似正八面体，成4-3-2重轴对称中空的球状分子，通常其内径约为8nm，外径约为12nm，厚度约为2nm。一般来说，8nm的铁蛋白内部空腔可储存约4500个三价铁原子，以形成化合态的铁核。由此可见，利用铁蛋白在变性条件下(如低pH或高pH)的可逆自组装特性，将其蛋白质外壳作为纳米材料，有足够大的空间来装载一些营养小分子，也可以使小分子物质免受外界干扰，提高其水溶性和稳定性，具有很大的潜力。

天然色素是有天然资源获得的食用色素，主要是从植物、动物组织和微生物中提取的色素，其中植物类着色剂占多数。天然色素不仅具有给食品着色的作用，而且相当部分天然色素具有生理活性。常见的天然色素有β-胡萝卜素、叶黄素、叶绿色等。叶黄素是一种广泛存在于蔬菜、花卉、水果等植物中的天然脂溶性色素。医学实验证明植物中所含的天然叶黄素是一种性能优异的抗氧化剂，在食品中加入一定量的叶黄素可预防细胞衰老和机体器官衰竭，同时还可预防老年人眼球视网膜黄斑退化引起的视力下降与失明。另外，叶黄素还可作为饲料添加剂用于家禽肉蛋的着色，同时也已在食品工业中用作着色与营养保健剂；另一常见的天然色素芦丁具有抗氧化及抗自由基作用，可用于心脑血管疾病、肿瘤、炎症的治疗，因此天然色素具有较广的应用前景。但大部分天然色素水溶性差，生物半衰期短，这两个性质限制了大部分天然色素在食品应用及医药行业的生物利用率。铁蛋白提供了一个很好的解决此问题的契机。将脂溶性天然色素分子(例如叶黄素)装载进入铁蛋白内部空腔中形成铁蛋白-色素包埋物，这样既可以保护天然色素免受外界干扰，又可以提高天然色素的水溶性和稳定性，具有很大的应用前景。

另外，铁蛋白作为两性物质，其易与带不同电荷的多糖进行作用，发生复合凝集反应。壳聚糖(Chitosan)作为自然界唯一带阳离子(游离-NH₃⁺)的天然氨基多糖，具有良好的生物相容性、安全性和低成本等特点，已经成为药物或食品功能组分包埋的理想材料。

以大豆铁蛋白及壳聚糖作为原料，利用铁蛋白的可逆自组装性质和蛋白-多糖相互作用制备出均匀分散的、纳米级别的的铁蛋白-壳聚糖-天然色素分子包埋物经检索在国内外未见公开报道，本发明在国内外未见报道，在国内外未见公开使用。

技术实现要素：

本发明的目的之一是提供一种基于铁蛋白/壳聚糖的天然色素分子包埋物及其制备方法，以铁蛋白为载体蛋白，壳聚糖为辅助剂，装载稳定性差的天然色素分子物质。最终产品是一种由铁蛋白/壳聚糖装载天然色素分子的新型包埋物，既可以用作新型食品添加剂，也可以应用于改善医药疗效，还可以作为化妆品中的组成成分，包埋物分解后产生的铁蛋白、壳聚糖和天然色素也具有一定的生物活性作用。本产品充分利用了铁蛋白、壳聚糖和天然色素的功能，具有很高的实际应用和推广价值。

本发明提供了一种新型的包埋物的制备方法，包括以下步骤：将铁蛋白溶液置于离心管中，用氢氧化钠溶液调节pH值变性，搅拌；取天然色素类物质，溶于乙醇溶液；将多酚类乙醇溶液和上述铁蛋白溶液混合，室温搅拌，调节pH值复性，于4℃层析柜中搅拌，将上述溶液透析三次即得铁蛋白色素包埋物。随后将铁蛋白色素包埋物与壳聚糖按一定比例混合，搅拌，静制，于4℃层析柜中避光透析。

进一步的，所述铁蛋白溶液的浓度为2.0μM，其pH值为8左右。

进一步的，用1M NaOH调节所述铁蛋白溶液pH值至11.0左右。

进一步的，室温搅拌变性的铁蛋白溶液2h。

进一步的，铁蛋白和天然色素类溶液混合时的分子摩尔比为1∶200。

进一步的，铁蛋白和多酚类溶液混合室温搅拌2h。

进一步的，用1M HCl调节溶液pH值至7.5-8.0复性。

进一步的，复性后4℃层析柜中搅拌2h以上。

进一步的，透析时使用的透析袋孔径1000kDa。

进一步的，透析时透析液：Tris-HCl缓冲液(pH 7.5，50mM)。

进一步的，在4℃层析柜中透析三次，每隔6小时换一次透析缓冲液。

进一步的，壳聚糖：铁蛋白色素包埋物的摩尔浓度比例为20∶1-40∶1

进一步的，搅拌15分钟，20℃静置2h，

进一步的，透析袋孔径为10kDa，透析液为Mops缓冲液(pH 6.0，20mM)，4℃层析柜中避光透析四次，每隔8小时换一次透析缓冲液。

本产品的有益效果在于：作为一种营养物质的铁蛋白可以作为一种新型的纳米载体将脂溶性天然色素包埋到内部空腔再结合壳聚糖可显著提高脂溶性天然色素的水溶性，并且由于稳定的蛋白质外壳结构可以将包埋到其内部不稳定的色素分子与外界复杂的食品组分隔绝开而提高色素的热稳定性和光稳定性。且此新型包埋物既可作为功能性食品添加剂及营养补充剂使用，又大大提高了天然色素的生物利用率，广泛用于食品、药品、化妆品中，具有很高的实际应用和推广价值。

附图说明

图1为铁蛋白-壳聚糖-天然色素分子包埋物的技术路线图。

图2为铁蛋白-壳聚糖-天然色素分子包埋物(以叶黄素为例)的技术路线图。

图3为铁蛋白-壳聚糖-天然色素分子包埋物(以芦丁为例)的技术路线图。

图4为铁蛋白-壳聚糖-叶黄素包埋物的电镜图。

图5为铁蛋白-壳聚糖-芦丁包埋物的电镜图。

具体实施方式

本文将结合具体附图详细描述本发明具体实施例。应当注意的是，下述实施例中描述的技术特征或者技术特征的组合不应该被认为是孤立的，它们可以被相互组合从而达到更好的技术效果。在下述实施例的附图中，各附图所出现的相同符号代表相同的特征或者部件，可应用于不同的实施例中。

实施例1以叶黄素为例

准确称取20mg的叶黄素标准品溶解在100ml无水乙醇中制备成浓度为351.6μM的母液，4℃避光保存待用。将5mL 2.0μM铁蛋白溶液(pH 7.8，Tris缓冲液)置于10mL的离心管中。用1M NaOH调节溶液pH值至11.0左右，室温搅拌2h后，缓慢加入5.68mL叶黄素母液(4℃避光保存)使铁蛋白∶叶黄素的分子摩尔比为1∶200，室温搅拌2h，使其充分混合。随后用1M HCl调节溶液pH值至7.5-8.0，于4℃层析柜中搅拌2h以上。将复性后的溶液置于孔径为1000kDa的透析袋中，使用Tris-HCl缓冲液(pH 7.5，50mM)在4℃层析柜中避光透析三次，每隔6小时换一次透析缓冲液。由于叶黄素分子量大于铁蛋白的通道孔径(约为0.3nm)，从而使部分叶黄素包埋于铁蛋白内部空腔，游离的叶黄素则在透析过程中被除去。将透析完的溶液取出，用0.45um的亲水性纤维素膜过滤澄清。最后将包埋有叶黄素的铁蛋白质溶液放置 在4℃条件下避光保存。随后，将不同量的壳聚糖按比例添加入铁蛋白-叶黄素包埋物(1.0μM，2.0mL，pH6.0)溶液中，使壳聚糖∶铁蛋白-叶黄素包埋物的摩尔浓度比例为20∶1-40∶1，搅拌15分钟使其充分作用，20℃静置2h，然后，将反应物的溶液置于孔径为10kDa的透析袋中，使用Mops缓冲液(pH 6.0，20mM)在4℃层析柜中避光透析四次，每隔8小时换一次透析缓冲液，以除去未结合的壳聚糖，获得铁蛋白-壳聚糖-叶黄素包埋物，置于4℃下避光保存。

实施例2以芦丁为例

准确称取20mg的芦丁标准品溶解在80％无水乙醇中制备成浓度为323.0μM的母液，4℃避光保存待用。将5mL 2.0μM铁蛋白溶液(pH 7.8，Tris缓冲液)置于10mL的离心管中。用1M NaOH调节溶液pH值至11.0左右，室温搅拌2h后，缓慢加入3.7mL芦丁标准液(4℃避光保存)使铁蛋白∶芦丁的分子摩尔比为1∶120，室温搅拌1h，使其充分混合。随后用1M HCl调节溶液pH值至7.5-8.0，于4℃层析柜中搅拌2h以上。将复性后的溶液置于孔径为1000kDa的透析袋中，使用Tris-HCl缓冲液(pH 7.5，50mM)在4℃层析柜中避光透析三次，每隔6小时换一次透析缓冲液。由于芦丁分子量大于铁蛋白的通道孔径(约为0.3nm)，从而使部分芦丁包埋于铁蛋白内部空腔，游离的芦丁则在透析过程中被除去。将透析完的溶液取出，离心取上清液即可得到包埋有芦丁的铁蛋白溶液。随后，将不同量的壳聚糖按比例添加入铁蛋白-天然色素包埋物(1.0μM，2.0mL，pH 6.0)溶液中，使壳聚糖∶铁蛋白-芦丁包埋物的摩尔浓度比例为20∶1-40∶1，搅拌15分钟使其充分作用，20℃静置2h，然后，将反应物的溶液置于孔径为10kDa的透析袋中，使用Mops缓冲液(pH 6.0，20mM)在4℃层析柜中避光透析四次，每隔8小时换一次透析缓冲液，以除去未结合的壳聚糖，获得铁蛋白-壳聚糖-芦丁包埋物，置于4℃下避光保存。

本发明提供了一种新型的包埋物的制备方法，作为一种营养物质的铁蛋白可以作为一种新型的纳米载体将脂溶性天然色素包埋到内部空腔后再结合壳聚糖可显著提高脂溶性天然色素的水溶性，并且由于稳定的蛋白质外壳结构可以将包埋到其内部不稳定的色素分子与外界复杂的食品组分隔绝开而提高色素的热稳定性和光稳定性。鉴于此优点，这一技术在医药、食品和化妆品中均具有广阔的市场前景。

本文虽然已经给出了本发明的一些实施例，但是本领域的技术人员应当理解，在不脱离本发明精神的情况下，可以对本发明的实施例进行改变。上述实施例只是实例性的，不应以本文的实施例作为本发明权利范围的限定。