技术领域
本发明涉及骨科假体技术领域，具体地说，涉及一种抗感染和促进成骨分化的抗菌肽
修饰钛合金假体及其制备方法。
背景技术：
骨科假体最重要的两个并发症主要是感染和松动，感染主要是由细菌容易在假体表面
粘附及形成生物膜引起，而松动主要是由骨-假体骨整合不良引起。而目前抗感染内植物的
构建主要是基于抗细菌粘附及抗生物膜形成理论设计的，忽视了骨整合不良的问题，而骨
整合假体却忽视了抗感染问题。例如，抗感染内植物的抗菌涂层通过释放预载的抗菌剂如
抗生素、防腐剂、银、锌或NO产生抗菌作用，然而这种改性存在较大的缺点，虽然在抗
感染内植物局部抗菌剂释放已被证明可以杀死细菌，但高剂量的抗菌剂可能会有毒，从而
抑制骨髓间充质干细胞成骨细胞活性，进而抑制骨整合，并且局部抗生素释放周期较长，
细菌容易对抗生素产生耐药性。
抗生素如庆大霉素接枝的钛合金虽然具有良好的抗菌性能，但却不能促进成骨细胞增
殖分化。理想的骨科假体至少具备以下两种生物活性：抗菌同时促进骨整合。但目前构建
的骨科假体很难兼顾以上两种生物功能，内植物固定抗菌剂势必会影响成骨分化及骨矿化，
而单纯的骨整合假体却很难具备抗菌性能。因此目前多采用复合抗菌剂及羟基磷灰石或β-
磷酸钙达到抗菌的同时促进骨整合的目的。例如中国专利文献公开号：CN103977456A，公
开了一种载万古霉素/羟基磷灰石人工关节假体的制备工艺，首先通过微弧氧化技术在人工
关节假体表面制备表面多孔且和基体结合紧密的二氧化钛生物膜，然后采用仿生溶液技术
在多孔的二氧化钛生物膜表面生成载万古霉素/羟基磷灰石的复合抗菌生物膜，该复合抗菌
生物膜的内层为致密的二氧化钛，外层为多孔结构，多孔结构内充满载万古霉素的羟基磷
灰石，不但明显提高了人工关节假体的生物活性，而且万古霉素的缓释释放具有很好的抗
菌效果，对于预防人工关节置换术后的假体感染具有非常重要的意义。但复合抗菌剂及促
成骨剂制备工艺较复杂，并且抗菌剂释放很难控制，同时抗菌剂及促成骨剂的量效比也很
难控制。
钛及钛合金是目前临床较为理想且常用的人工关节及内固定植入物材料。鉴于钛合金
的生物惰性，对钛及钛合金材料表面的物理学改性逐渐成为研究热点。如前所述，理想的
改性是提高其生物活性，同时达到抗菌和促进骨整合的目的。同样地，目前的技术难以使
其同时具备两种生物活性，抗菌剂一般会对骨髓间充质干细胞成骨功能有抑制作用，更谈
不上促进骨髓间充质干细胞成骨分化。
抗菌肽KR-12序列为KRIVQRIKDFLR，该序列是一种缘于人源抗菌肽LL-37的生物
活性片段。该抗菌肽KR-12具有较广谱的抗菌能力，毒性小。目前关于抗菌肽KR-12固定
修饰的钛合金假体还未见报道，更未见该类假体促进成骨分化和骨矿化方面的相关报道。
技术实现要素：
本发明的目的是针对目前钛合金假体植入体内可能出现的两大并发症感染及松动的技
术问题，提供一种抗感染和促进成骨分化的抗菌肽修饰钛合金假体及其制备方法和用途。
在本发明的第一方面，提供了一种抗感染和促进成骨分化的抗菌肽修饰钛合金假体，
所述的抗菌肽修饰钛合金假体是在钛合金表面固定序列如SEQIDNO.1所示的抗菌肽。
作为一种优选实施方式，所述的抗菌肽是以共价键接枝方式固定在钛合金表面。
更优选地，所述的钛合金表面引入有功能官能团氨基，并与所述抗菌肽的功能官能团
羧基发生共价键结合。
更优选地，所述的抗菌肽修饰钛合金假体制备方法为：
a)将钛合金浸入5-10M的强碱溶液中，60-80℃下油浴反应8-12h，然后取出钛合金用
去离子水除去残留的碱性溶液；
b)用无水乙醇清洗碱处理后的钛合金并去除表面水分，真空干燥，然后浸泡在浓度为
5-10％wt的APTES/甲苯溶液中，油浴条件下加热至微沸，冷凝回流反应8-12h；冷却后分
别用无水乙醇、去离子水清洗，干燥；
c)将上述钛合金放入所述抗菌肽的乙酸溶液中，所述抗菌肽浓度为1-5mg/ml，pH为
3-6，滴加EDC水溶液和NHS水溶液，使得EDC最终浓度为2-4mg/mL，NHS最终浓度为
0.2-0.9mg/mL，在惰性气体回流下保护反应8-12h后取出，去离子水清洗，干燥，即得。
更优选地，其制备方法为：
a)将钛合金浸入5M的氢氧化钠溶液中，80℃下油浴反应12h，然后取出钛合金用去
离子水除去残留的碱性溶液；
b)用无水乙醇清洗碱处理后的钛合金并去除表面水分，真空干燥，然后浸泡在浓度为
10％wt的APTES/甲苯溶液中，油浴条件下加热至微沸，100℃下冷凝回流反应12h；冷却
后分别用无水乙醇、去离子水清洗，干燥；
c)将上述钛合金放入所述抗菌肽的乙酸溶液中，所述抗菌肽浓度为1mg/ml，pH为3，
滴加EDC水溶液和NHS水溶液，使得EDC最终浓度为3mg/mL，NHS最终浓度为0.3mg/mL，
在惰性气体氩气回流下保护反应12h后取出，去离子水清洗，干燥，即得。
在本发明的第二方面，提供了所述抗菌肽修饰钛合金假体的制备方法，包括以下步骤：
a)将钛合金浸入5-10M的强碱溶液中，60-80℃下油浴反应8-12h，然后取出钛合金用
去离子水除去残留的碱性溶液；
b)用无水乙醇清洗碱处理后的钛合金并去除表面水分，真空干燥，然后浸泡在浓度为
5-10％wt的APTES/甲苯溶液中，油浴条件下加热至微沸，冷凝回流反应8-12h；冷却后分
别用无水乙醇、去离子水清洗，干燥；
c)将上述钛合金放入所述抗菌肽的乙酸溶液中，所述抗菌肽浓度为1-5mg/ml，pH为
3-6，滴加EDC水溶液和NHS水溶液，使得EDC最终浓度为2-4mg/mL，NHS最终浓度为
0.2-0.9mg/mL，在惰性气体回流下保护反应8-12h后取出，去离子水清洗，干燥，即得。
优选地，其制备方法包括以下步骤：
a)将钛合金浸入5M的氢氧化钠溶液中，80℃下油浴反应12h，然后取出钛合金用去
离子水除去残留的碱性溶液；
b)用无水乙醇清洗碱处理后的钛合金并去除表面水分，真空干燥，然后浸泡在浓度为
10％wt的APTES/甲苯溶液中，油浴条件下加热至微沸，100℃下冷凝回流反应12h；冷却
后分别用无水乙醇、去离子水清洗，干燥；
c)将上述钛合金放入所述抗菌肽的乙酸溶液中，所述抗菌肽浓度为1mg/ml，pH为3，
滴加EDC水溶液和NHS水溶液，使得EDC最终浓度为3mg/mL，NHS最终浓度为0.3mg/mL，
在惰性气体氩气回流下保护反应12h后取出，去离子水清洗，干燥，即得。
在本发明的第三方面，提供了所述的抗菌肽修饰钛合金假体在制备骨科假体中的应用，
特别地，在制备抗菌、促进成骨分化的骨科假体中的应用。
本发明优点在于：
1、本发明将序列如SEQIDNO.1所示的抗菌肽固定到钛合金表面，抗菌实验、促进成
骨早期分化实验和促进骨矿化实验结果表明该抗菌肽修饰的钛合金具有优异的抗菌生物活
性，且意外地发现其具备促进成骨早期分化及骨矿化的生物活性，这与以往的假体抗菌剂
抑制成骨细胞活性不同，可以改善目前钛合金应用于临床的缺点，为构建抗感染同时促进
骨整合的假体提供新的方法，解决目前骨科假体植入体内面临的感染及早期松动的两大并
发症问题，在医学生物技术领域有广阔的应用价值。
2、本发明通过共价接枝的方法将抗菌肽固定到钛板上，利用的化学反应为氨基与羧基
发生的脱水缩合反应，工艺简单，反应条件温和，效率高，成本低，可重复性好，改性后
的钛合金抗菌和促进成骨早期分化及骨矿化的效果十分显著。
附图说明
图1是XPS光电子能谱分析抗菌肽KR-12修饰的钛合金表面元素及共价键的变化结果。
图2是6h与24h时表皮葡萄球菌在各组钛片表面的激光共聚焦显微镜照片和定量分析结
果。
图3是6h与24h时耐药表皮葡萄球菌在各组钛片表面的激光共聚焦显微镜照片和定量分析
结果。
图4为各组钛片成骨早期分化实验ALP染色与定量分析结果。
图5为各组钛片骨矿化实验茜素红表征骨矿化钙结节形成与定量分析结果。
具体实施方式
下面结合附图对本发明提供的具体实施方式作详细说明。
实施例1本发明的抗菌肽修饰钛合金假体的制备(一)
1、抗菌肽KR-12的制备
采用固相合成法合成抗菌肽KR-12，其氨基酸序列为：KRIVQRIKDFLR(SEQID
NO.1)。KR-12抗菌肽纯度在95％以上。
2、钛片表面引入功能官能团氨基
通过两步法在钛片表面引入功能官能团氨基，首先对钛片进行碱处理，引入羟基，再
进行硅烷化处理引入氨基。具体为：首先将钛合金圆片(Ti6Al4V，Ti，φ10×2mm，上海艳
钛金属材料有限公司)浸入含有浓度为5M的强碱溶液的烧杯中，用保鲜膜封闭烧杯，在
80℃下油浴反应12h。然后取出钛片用去离子水超声清洗2次，每次2min，超声清洗完后
在去离子水中浸泡7天除去残留的碱性溶液。硅烷化处理之前无水乙醇超声清洗2次，然
后在真空下干燥2天确保表面无水。然后将干燥的钛片浸泡在浓度为10％的氨丙基三乙氧
基硅烷(APTES)/甲苯溶液中，溶液在油浴条件下加热至微沸，100℃下冷凝回流反应12h，
终止反应。分别用无水乙醇、去离子水超声清洗3次，常温下干燥。
3、钛片表面共价键固定抗菌肽KR-12
将引入功能官能团氨基的钛片放入抗菌肽KR-12的乙酸溶液中(抗菌肽KR-12浓度为
1mg/mL，用5μM的乙酸水溶液配制)，pH为3，滴加1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺
(EDC)水溶液和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)水溶液，使得EDC最终浓度为3mg/mL，NHS
最终浓度为0.3mg/mL，在惰性气体氩气回流下保护反应12h后取出，去离子水超声清洗，
真空干燥。即制备得到本发明的抗菌肽修饰钛合金假体。
4、钛片表面共价键固定抗菌肽KR-12的表征
随机取两个钛片进行X光电子能谱(XPS)检测，确定抗菌肽KR-12是否成功接枝到
钛片上。图1是XPS光电子能谱分析抗菌肽KR-12修饰的钛合金表面元素及共价键的变化
结果，其中，Ti(对照组)，Ti-AA(Ti表面硅烷化引入氨基组)，Ti-KR-12(氨基化的Ti
表面KR-12抗菌肽修饰组)。硅烷化后的谱图中N1s、C1s和Si2p元素含量增加，Na1s、
O1s和Ti2p3元素减少，表明钛涂层表面覆盖了一层APTES层。共价键接枝抗菌肽KR-12
后，Na1s、Si2p、O1s和Ti2p3元素减少，N1s、C1s元素含量进一步增强，表明抗菌肽KR-12
成功固定到钛合金上。对于Ti-KR-12来说，N谱显示Ti-KR-12在397eV和400eV位置显
示出两个峰。400eV的胺或酰胺键峰属于接枝的KR-12抗菌肽。XPS数据证实了在钛表面
的KR-12抗菌肽共价固定的存在。
5、抗菌肽KR-12修饰钛合金的抗菌实验
本实验采用的细菌为表皮葡萄球菌(ATCC：35984)及耐药表皮葡萄球菌(MRSE)，
但其他G+及G-菌同样适用于本实验。
实验分为3组：I：Ti(n＝12)，II：Ti-AA(n＝12)，III：Ti-KR-12(n＝12)。将各组钛
片消毒灭菌置于24孔板中，每组设3个复孔。将ATCC35984以每孔500μl(浓度调整为1×106CFU/ml)分别接种至上述各组钛片上，37℃下静态培养6h、24h，培养到特定时间点后取
出各组钛片，用无菌PBS清洗3次以去除未黏附的浮游细菌。用2.5％的戊二醛固定1h，对
各组钛片用BacLight.BacterialViabilityKits(MolecularProbes)进行细菌死活
染色，染色时间15min。Live/Dead试剂盒含有两种荧光染液，荧光染液SYTO9能使活细
菌发出绿色荧光，PI(Propidiumiodide)可使死细菌发出红色荧光。激光共聚焦显微镜下观
察材料表面的形态结构及细菌活力。
图2中A是表皮葡萄球菌早期6h粘附及24h定植的激光共聚焦显微镜照片，其中，Ti
(对照组)，Ti-AA(Ti表面硅烷化引入氨基组)，Ti-KR-12(氨基化的Ti表面KR-12抗菌
肽修饰组)。激光共聚焦(CLSM)被用于观察6h及24h时细菌在不同钛板表面活性。Ti组，
6h及24h细菌粘附较多，到24h可见细菌成团块状。Ti-AA组，6h及24h细菌粘附同样较
多，且到24h可见细菌成团块状。Ti-KR-12组，6h表面的菌落表现为散在、单一的形态，
24h可见抗菌肽KR-12修饰的钛片表面细菌数量较少并且可见许多死菌。可见，抗菌肽
KR-12修饰的钛片可明显抑制细菌在其表面的黏附及生长。
组织平板法表征各组钛片活菌的数量，三组钛片(2mm×10mm)常规高温高压消毒后
放入12孔板孔底，每孔加1ml上述新鲜细菌悬液，浓度为1×106CFU/ml，重复3孔，放入
培养箱有氧37℃静态培养，分别于培养6h、24h后用无菌镊子轻轻取出各组钛片，PBS轻
轻洗涤3次以去除表面未黏附浮游细菌，超声20min洗脱表面的细菌，倍比稀释，进行涂
板，放入培养箱24h后计算菌落的数目。
图2中B为6h及24h表皮葡萄球菌在各组钛片表面定植的定量分析结果。6h时Ti、
Ti-AA及Ti-KR-12表面粘附的活菌数量分别为：(153.33±30)×103、(240±36.6)×103、
(15.7±1.5)×103，24h时Ti、Ti-AA及Ti-KR-12表面活菌的数量分别为：(1340±100)×103、
(1566.7±305.5)×103、(99.33±10.1)×103。
图3中A是耐药表皮葡萄球菌早期6h粘附及24h定植的激光共聚焦显微镜照片，其中，
Ti(对照组)，Ti-AA(Ti表面硅烷化引入氨基组)，Ti-KR-12(氨基化的Ti表面KR-12抗
菌肽修饰组)。图3中B为6h及24h耐药表皮葡萄球菌在各组钛片表面定植的定量分析结
果。6h时Ti、Ti-AA及Ti-KR-12表面粘附的活菌数量分别为：(283±15)×103、(560±76)
×103、(30±1.5)×103，24h时Ti、Ti-AA及Ti-KR-12表面活菌的数量分别为：(1300±97)×103、
(1760±156)×103、(112±12.6)×103。
以上结果表明6h及24hTi-KR-12均能够明显抑制表皮葡萄球菌及耐药表皮葡萄球菌的
定植。
6、抗菌肽KR-12修饰钛合金的促进成骨分化实验
本实验采用的细胞为人骨髓间充质干细胞，但其他人成体干细胞(脂肪间充质干细胞、
内皮祖细胞等)具有成骨分化潜能的干细胞同样适用于本实验。
实验分成3组：I：Ti，II：Ti-AA，III：Ti-KR-12。将各组钛片消毒灭菌置于24孔板
中，每组设3个复孔。第三代人骨髓间充质干细胞(humanbonemarrowstemcell，hBMSC)
以细胞密度为2×104接种于各组钛片上，每孔1ml。37℃、5％CO2条件下在细胞培养箱内
培养24h达到细胞贴壁后，细胞培养基更换为含有成骨诱导液的a-MEM培养基，成骨诱导
培养基为：500ml的a-MEM培养基加入10％FBS、0.1μM的地塞米松、50μM的抗坏血酸
盐及10mMβ-甘油磷酸钠。此后，每3天换液，10d及14d后进行碱性磷酸酶(ALP)染色
分析。
图4为各组钛片成骨早期分化ALP染色与定量分析结果，其中，A：ALP染色，B：
ALP活性定量分析。由图可知，抗菌肽KR-12修饰的钛片ALP活性在第10天显著高于其
他两组，ALP活性值定义为细胞总ALP活性/总蛋白含量。ALP定量结果显示：Ti：1.2±0.09，
Ti-AA：1.33±0.08，Ti-KR-12：1.55±0.1。10d时Ti-KR-12组的hBMSCALP活性明显高于
Ti及Ti-AA组，p＜0.05，具有统计学意义，表明抗菌肽KR-12修饰的钛片能够显著促进成
骨早期分化。
7、抗菌肽KR-12修饰钛合金的促进骨矿化实验
实验分成3组：I：Ti，II：Ti-AA，III：Ti-KR-12。将钛片置于24孔板中，第三代hBMSC
接种于各组钛片上，每孔1ml。37℃、5％CO2条件下在细胞培养箱内培养24h达到细胞贴
壁后，细胞培养基更换为含有成骨诱导液的a-MEM培养基。此后，每3天换液，14天后
进行茜素红染色观察钙结节形成并进行定量分析。
图5为各组钛片骨矿化实验茜素红表征骨矿化钙结节形成与定量分析实验结果，其中，
A：茜素红染色，B：茜素红定量分析。第10天和第14天时，与Ti组相比，Ti-KR-12组
具有小的、分散的钙结节。定量结果显示，培养10dTi组钛片的细胞外基质矿化仅为
Ti-KR-12组钛片的50％，培养14dTi组的细胞外基质矿化仅为Ti-KR-12组钛片的70％，表
明抗菌肽KR-12修饰的钛合金能够显著促进细胞外基质矿化。
实施例2本发明的抗菌肽修饰钛合金假体的制备(二)
1、抗菌肽KR-12的制备
同实施例1。
2、钛片表面引入功能官能团氨基
通过两步法在钛片表面引入功能官能团氨基，首先对钛片进行碱处理，引入羟基，再
进行硅烷化处理引入氨基。具体为：首先将钛合金圆片(Ti6Al4V，Ti，φ10×2mm，上海艳
钛金属材料有限公司)浸入含有浓度为10M的强碱溶液的烧杯中，用保鲜膜封闭烧杯，在
60℃下油浴反应8h。然后取出钛片用去离子水超声清洗2次，每次2min，超声清洗完后在
去离子水中浸泡7天除去残留的碱性溶液。硅烷化处理之前无水乙醇超声清洗2次，然后
在真空下干燥2天确保表面无水。然后将干燥的钛片浸泡在浓度为5％的APTES/甲苯溶液
中，溶液在油浴条件下加热至微沸，100℃下冷凝回流反应10h，终止反应。分别用无水乙
醇、去离子水超声清洗3次，常温下干燥。
3、钛片表面共价键固定抗菌肽KR-12
将引入功能官能团氨基的钛片放入抗菌肽KR-12的乙酸溶液中(抗菌肽KR-12浓度为
5mg/mL，用5μM的乙酸水溶液配制)，pH为6，滴加EDC水溶液和NHS水溶液，使得
EDC最终浓度为2mg/mL，NHS最终浓度为0.9mg/mL，在惰性气体氩气回流下保护反应
8h后取出，去离子水超声清洗，真空干燥。即制备得到本发明的抗菌肽修饰钛合金假体。
实施例3本发明的抗菌肽修饰钛合金假体的制备(三)
1、抗菌肽KR-12的制备
同实施例1。
2、钛片表面引入功能官能团氨基
通过两步法在钛片表面引入功能官能团氨基，首先对钛片进行碱处理，引入羟基，再
进行硅烷化处理引入氨基。具体为：首先将钛合金圆片(Ti6Al4V，Ti，φ10×2mm，上海艳
钛金属材料有限公司)浸入含有浓度为8M的强碱溶液的烧杯中，用保鲜膜封闭烧杯，在
70℃下油浴反应10h。然后取出钛片用去离子水超声清洗2次，每次2min，超声清洗完后
在去离子水中浸泡7天除去残留的碱性溶液。硅烷化处理之前无水乙醇超声清洗2次，然
后在真空下干燥2天确保表面无水。然后将干燥的钛片浸泡在浓度为8％的APTES/甲苯溶
液中，溶液在油浴条件下加热至微沸，100℃下冷凝回流反应8h，终止反应。分别用无水乙
醇、去离子水超声清洗3次，常温下干燥。
3、钛片表面共价键固定抗菌肽KR-12
将引入功能官能团氨基的钛片放入抗菌肽KR-12的乙酸溶液中(抗菌肽KR-12浓度为
1mg/mL，用5μM的乙酸水溶液配制)，pH为5，滴加EDC水溶液和NHS水溶液，使得
EDC最终浓度为4mg/mL，NHS最终浓度为0.2mg/mL，在惰性气体氩气回流下保护反应
10h后取出，去离子水超声清洗，真空干燥。即制备得到本发明的抗菌肽修饰钛合金假体。
对比例1
1、抗菌肽KR-12的制备
同实施例1。
2、钛片表面引入功能官能团氨基
通过两步法在钛片表面引入功能官能团氨基，首先对钛片进行碱处理，引入羟基，再
进行硅烷化处理引入氨基。具体为：首先将钛合金圆片(Ti6Al4V，Ti，φ10×2mm，上海艳
钛金属材料有限公司)浸入含有浓度为8M的强碱溶液的烧杯中，用保鲜膜封闭烧杯，在
70℃下油浴反应10h。然后取出钛片用去离子水超声清洗2次，每次2min，超声清洗完后
在去离子水中浸泡7天除去残留的碱性溶液。硅烷化处理之前无水乙醇超声清洗2次，然
后在真空下干燥2天确保表面无水。然后将干燥的钛片浸泡在浓度为8％的APTES/甲苯溶
液中，溶液在油浴条件下加热至微沸，100℃下冷凝回流反应8h，终止反应。分别用无水乙
醇、去离子水超声清洗3次，常温下干燥。
3、钛片表面共价键固定抗菌肽KR-12
将引入功能官能团氨基的钛片放入抗菌肽KR-12的乙酸溶液中(抗菌肽KR-12浓度为
0.5mg/mL，用5μM的乙酸水溶液配制)，pH为5，滴加EDC水溶液和NHS水溶液，使得
EDC最终浓度为4mg/mL，NHS最终浓度为0.2mg/mL，在惰性气体氩气回流下保护反应
10h后取出，去离子水超声清洗，真空干燥。即制备得到本发明的抗菌肽修饰钛合金假体。
实施例4
应用如实施例1所述的组织平板法检测实施例2-3、对比例1得到的抗菌肽KR-12修饰
钛片在培养24h后的活菌数量。结果见表1，可见本发明方法得到的抗菌肽KR-12修饰钛
片能显著抑制细菌的生长。
表1实施例2-3、对比例1的抗菌肽KR-12修饰钛片的活菌数量
应用如实施例1所述的方法检测实施例2-3、对比例1得到的抗菌肽KR-12修饰钛片接
种hBMSC10d后ALP活性，评价其促进成骨早期分化的能力。结果见表2，可见本发明方
法得到的抗菌肽KR-12修饰钛片能显著促进成骨早期分化。
表2实施例2-3、对比例1的抗菌肽KR-12修饰钛片ALP活性值
实施例2
实施例3
对比例1
ALP活性值
1.48±0.08
1.51±0.07
1.42±0.06
应用如实施例1所述的方法检测实施例2-3、对比例1得到的抗菌肽KR-12修饰钛片接
种hBMSC10d后茜素红染色后的吸光度，评价其促进成细胞外基质矿化的能力。结果见表
3，可见本发明方法得到的抗菌肽KR-12修饰钛片能显著促进成骨矿化。
表3实施例2-3、对比例1的抗菌肽KR-12修饰钛片茜素红染色后的吸光度
实施例2
实施例3
对比例1
吸光度
0.26±0.03
0.27±0.04
0.23±0.04
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，
在不脱离本发明方法的前提下，还可以做出若干改进和补充，这些改进和补充也应视为本
发明的保护范围。