本发明涉及一种植物药及其应用，具体是以孔雀草挥发油为活性成分的药物及其在制备抗鼻炎药物中的用途。
背景技术：
孔雀草(tagetespatulal.)又名红黄草、藤菊、小万寿菊，为菊科万寿菊属植物，为一年生草本，花期为7月～9月。我国各地均有栽培，是一种常见的观赏花卉。孔雀草有药用和保健作用，花叶可以入药，有清热化痰、补血通经的功效。能治疗百日咳、气管炎、感冒等。
从20世纪80年代开始，人们即开始对孔雀草的化学成分进行研究，分离得到万寿菊素(patuletin)，槲皮万寿菊素(quercetagetin)，槲皮万寿菊甙(quercetagitrin)等黄酮类化合物(国家中医药管理局《中华本草》编委会；中华本草[m]；上海科学技术出版社，1999年版)。孔雀草挥发油中主要成份为2-蒈烯、β-水芹烯、胡椒酮、胡椒烯酮、异松油烯、柠檬烯等(胡建安，孔雀草精油化学成分初探[j].香料香精化妆品，1992(01)：24-26.；romagnolic，brunir，andreottie，etal.chemicalcharacterizationandantifungalactivityofessentialoilofcapitulafromwildindiantagetespatulal[j].protoplasma，2005，225(1-2)：57-65)，目前人们多对孔雀草花卉进行研究，药用价值研究较少。
鼻炎为临床常见病和多发病，鼻炎的发生主要与过敏反应有关，属于免疫性炎症的范畴。目前，治疗鼻炎主要采用特非那丁等抗组胺药物或曲尼司特、酮替芬等抗过敏药物，这些药物对鼻炎的慢性化和反复发作疗效较差或无效。而中药治疗具有毒副作用小、协同作用强等优势而更具有开发前景。因此，我们在对抗鼻炎中药有效成分筛选过程中惊喜地发现孔雀草挥发油具有良好的抗鼻炎的药理活性。
经过水蒸气蒸馏法或二氧化碳超临界萃取技术，可以对孔雀草中的挥发油进行提取，使其适合开发成为抗鼻炎的药物。
技术实现要素：
本发明的目的是提供一种孔雀草挥发油用于制备抗鼻炎药物中的新用途。
具体发明内容主要包括以下三个方面：
1、建立制备孔雀草挥发油的方法
(1)水蒸气蒸馏法，取孔雀草全草，剔除杂质，粉碎，过2-100目筛，加入水5-15倍量的水采用水蒸气蒸馏法，提取孔雀草中挥发油，提取时间为1-6小时，分取挥发油，加无水硫酸镁或无水硫酸钠干燥，即得。
(2)二氧化碳超临界流体萃取法，取孔雀草全草，剔除杂质，粉碎，过2-100目筛，将粗粉放入萃取缸进行萃取，启动co2循环系统，设定萃取缸温度为30-45℃，萃取缸压力为15-25mpa；分离釜i温度为24-30℃，分离釜i压力为6-9mpa；分离釜ii温度为18-25℃，分离釜ii压力为3-5mpa；萃取时间为50-150min，从分离釜i和分离釜ii放料口取出挥发油，即得孔雀草挥发油。
该两种方法提取方法均未使用有毒试剂，提取的挥发油具有无毒，无残留，提取工艺简单，萃取效率高的特点。
2、孔雀草挥发油的抗鼻炎作用
药理学实验证明，所制备的挥发油对豚鼠应变性鼻炎模型有很好的治疗作用。
3、所得孔雀草挥发油可单独或与其它药物组合，制成抗鼻炎的药物。
具体实施方式
实施例1：水蒸气蒸馏法制备孔雀草挥发油
取孔雀草全草，剔除杂质，称取1kg，粉碎，过20目筛，加入自来水8l，水蒸气蒸馏法提取3小时，分取挥发油层，加入无水硫酸钠干燥，即得孔雀草挥发油，收率为0.17％(重量比)。
实施例2：水蒸气蒸馏法制备孔雀草挥发油
取孔雀草全草，剔除杂质，称取1kg，粉碎，过50目筛，加入自来水10l，水蒸气蒸馏法提取6小时，分取挥发油层，加入无水硫酸镁干燥，即得孔雀草挥发油，收率为0.20％(重量比)。
实施例3：二氧化碳超临界流体萃取法制备孔雀草挥发油
取孔雀草全草，剔除杂质，称取1kg，粉碎，过60目筛。接通电源，开冷循环及加热，设定萃取缸温度为30℃，分离釜i温度为25℃，分离釜ii温度为20℃。将孔雀草粗粉放入萃取缸中，启动co2循环系统，设定流速为10l/min。调节萃取缸压力为15mpa，分离釜i压力为8mpa，分离釜ii压力为4mpa。待各参数达到设定值，开始计时，经过60min萃取，从分离釜i和分离釜ii放料口取出挥发油，即得孔雀草挥发油，提取率为0.22％(重量比)。
实施例4：二氧化碳超临界流体萃取法制备孔雀草挥发油
取孔雀草全草，剔除杂质，称取1kg，粉碎，过40目筛。接通电源，开冷循环及加热，设定萃取缸温度为28℃，分离釜i温度为25℃，分离釜ii温度为20℃。将孔雀草粗粉放入萃取缸中，启动co2循环系统，设定流速为8l/min。调节萃取缸压力为15mpa，分离釜i压力为8mpa，分离釜ii压力为4mpa。待各参数达到设定值，开始计时，经过90min萃取，从分离釜i和分离釜ii放料口取出挥发油，即得孔雀草挥发油，提取率为0.21％(重量比)。
实施例5孔雀草挥发油喷雾剂的制备
取实施例1～4中任意孔雀草挥发油8～15ml，加乳化剂吐温-805～9ml混合均匀，同时缓慢加入水至形成初乳，再加入水至1000ml，灌装至喷雾瓶，密封贮藏，即得孔雀草挥发油喷雾剂。
实施例6.孔雀草挥发油滴鼻剂的制备
取实施例1～4中任意孔雀草挥发油8～15ml，加乳化剂吐温-805～9ml混合均匀，同时缓慢加入水至形成初乳，再加入水至1000ml，灌装至低密聚乙烯药用塑料瓶包装，即得。
实验例1：孔雀草挥发油对豚鼠应变性鼻炎的作用实验
1.1实验材料
1.1.1动物
健康豚鼠，雌雄各半，体重250-300g，购自辽宁长生生物技术有限公司，生产许可证号：scxk(辽)2010-0001。
1.1.2药物
阳性药物采用曲安奈德鼻喷雾剂(江西珍视明药业有限公司，批号150601)；所用挥发油为实施例1-2中的孔雀草挥发油。甲苯-2，4二异氰酸酯(上海试剂一厂，批号20111001)，橄榄油(中国医药集团上海化学试剂公司，批号f20150202)，吐温-80(国药集团化学试剂有限公司，批号：20150113)。
药物的制备：取孔雀草挥发油适量，加吐温-800.8ml混合均匀，同时缓慢加入水至形成初乳，再加入水使配制成浓度约为4mg/ml，2mg/ml的溶液，备用。
1.1.3仪器
bx50显微镜(日本olympus公司)，mias-2000图形分析系统。
1.2实验方法
实验分组：将豚鼠随机分成5组，其中包括空白组、模型组、阳性药组、低剂量组、高剂量组，每组10只。
参照文献(tanakak，okamotoy，nagayay，etal.anasalallergymodeldevelopedintheguineapigbyintranasalapplicationof2，4-toluenediisocyanate[j].internationalarchivesofallergyandimmunology，1988，85(4)：392-397.)制备鼻超敏反应模型的制作方法进行造模。模型组动物用微量加样器自豚鼠双侧鼻孔滴入10％甲苯-2，4二异氰酸酯橄榄油溶液，每侧5μl，每日1次，连续7天。通过行为学评分判断模型是否成功。7天后改为隔日1次(于给生理盐水或治疗药物15分钟之后给予橄榄油或甲苯-2，4二异氰酸酯，维持致敏状态，直到药物治疗结束。正常组动物同法给予橄榄油。造模成功的豚鼠，按性别和体重随机分成5组，每组10只，分别是空白组、模型组、挥发油高、低剂量组、阳性药组。同时按下表剂量分别对各组动物给药，每天给药1次，连续2周。
表1各组给药剂量及给药体积
标本采集方法：最后一次给药1小时用10％甲苯-2，4二异氰酸酯橄榄油溶液滴鼻激发动物，做行为学评分。30分钟后，股动脉取血，待血液自然凝固，2500r/min离心20min，收集上清液，将血清-20℃保存备用。采血后处死豚鼠，剥离鼻周围皮肤，包括上颚骨皮肤，沿鼻中线切开，暴露鼻中隔与双侧鼻腔，剪下鼻中隔黏膜，用faa固定。
指标检测：
行为学评分：以鼻部症状和体征为主要观察内容。造模第五天开始，每天给予橄榄油致敏动物后，15min后开始观察豚鼠的鼻痒、喷嚏、清涕出现次数与轻重程度，观察时间为40min，记录结果并评分。评分标准如下：
鼻痒：轻度搔鼻1-2次积1分，剧烈搔鼻、到处摩擦积2分；
喷嚏：1～3个积1分，4-10个积2分，11个以上积3分；流涕：流至鼻孔积1分，超出前鼻孔积2分，涕流满面积3分。以第7天给致敏原后的症状评分为准，各症状记分叠加，总分超过5分者模型成功。
病理标本切片制作及结果分析方法：取下豚鼠鼻中隔黏膜后，faa液固定48小时，逐级酒精脱水，二甲苯透明、浸腊，石蜡包埋，常规切片4μm，he染色.每只动物每项指标在10×20倍光镜下选取5个视野，在mias-2000图形分析系统下定量观察鼻中隔黏膜炎细胞浸润情况、组织间隙水肿情况以及静脉血管扩张情况。
1.3实验结果
1.3.1行为学评分
治疗最后一次鼻腔激发豚鼠鼻部症状记分作为疗效评定标准，5组间进行比较，结果见表2。与正常组相比，给药治疗前，模型组、孔雀草挥发油各剂量组、阳性对照药组行为学评分均显著增加，统计学具显著性差异(p＜0.01)。与模型组比较，给药治疗后，孔雀草挥发油的高、低剂量组及阳性药组行为学评分都显著降低，统计学具显著性差异(p＜0.05或p＜0.01)。
表2治疗前后动物行为学评分
注：与正常组比较，##表示p＜0.01；与模型组比较，*表示p＜0.05，**表示p＜0.01。
1.3.2鼻中隔黏膜he染色示炎细胞侵润情况：
运用mias-2000图形分析系统对炎细胞在选定区域的鼻黏膜固有层中所占的面积总和比、积分光密度总和比进行分析，评价炎细胞的侵润情况。结果如表3所示，与空白组比较，模型组鼻黏膜组织中炎细胞所占的面积总和比、积分光密度总和比显著升高(p＜0.05或p＜0.01)。与模型相比，挥发油高、低剂量组和阳性药组炎细胞所占的面积总和比、积分光密度总和比都显著降低(p＜0.05或p＜0.01)；表明孔雀草挥发油能减轻炎细胞在局部的侵润。
表3孔雀草挥发油对炎细胞侵润情况的影响
注：与模型组比较，*表示p＜0.05，**表示p＜0.01。
1.3.3鼻中隔黏膜he染色示组织水肿情况
运用mias-2000图形分析系统对水肿部位在选定区域的鼻黏膜固有层中所占的面积比进行分析，观察黏膜水肿情况。结果如表4所示：与正常组比较，模型组鼻黏膜组织中水肿所占的面积比升高，统计学具显著性差异(p＜0.01)。与模型组相比，孔雀草挥发油高、低剂量组及阳性药组水肿面积比都有不同程度的降低，统计学具有显著性差异(p＜0.05或p＜0.01)。提示孔雀草挥发油可以减轻鼻黏膜组织间隙水肿。
表4孔雀草挥发油对组织间隙水肿情况的影响
注：与模型组比较，**表示p＜0.01。
1.3.4鼻中隔黏膜he染色示毛细血管大小情况
运用mias-2000图形分析系统对鼻黏膜中毛细血管的大小进行分析，求出每组动物的血管面积、周长、最大直径的平均值，进行统计比较。结果如表5所示：毛细血管面积均值：与正常组相比，模型组毛细血管面积均值显著增高，统计学具有显著性差异(p＜0.01)。与模型组相比，孔雀草挥发油高、低剂量组及阳性药组毛细血管面积均值显著减小，统计学具有显著性差异(p＜0.05或p＜0.01)。毛细血管周长均值与最大直径：与正常组相比，模型组毛细血管周长均值显著增高(p＜0.01)。与模型组相比，孔雀草挥发油高、低剂量组及阳性药组均值显著降低，统计学具显著性差异(p＜0.01)。提示孔雀草挥发油可以通过降低毛细血管通透性，减轻炎症症状。
表5孔雀草挥发油对鼻黏膜毛细血管大小的影响
注：与模型组比较，*表示p＜0.05，**表示p＜0.01。
1.4统计学处理
经spss20.0统计软件处理数据，结果采用
实验例2：孔雀草挥发油对豚鼠应变性鼻炎的作用实验
1.1材料与方法
1.1.1动物
健康豚鼠，雌雄各半，体重250-300g，购自辽宁长生生物技术有限公司，生产许可证号：scxk(辽)2010-0001。
1.1.2药物
阳性药物采用曲安奈德鼻喷雾剂(江西珍视明药业有限公司，批号150601)；所用挥发油为实施例3-4中的孔雀草挥发油。甲苯-2，4二异氰酸酯(上海试剂一厂，批号20111001)，橄榄油(中国医药集团上海化学试剂公司，批号f20150202)，吐温-80(国药集团化学试剂有限公司，批号：20150113)。
药物的制备：取孔雀草挥发油适量，加吐温-800.8ml混合均匀，同时缓慢加入水至形成初乳，再加入水使配制成浓度约为4mg/ml，2mg/ml的溶液，备用。
1.1.3仪器
bx50显微镜(日本olympus公司)，mias-2000图形分析系统。
1.2实验方法
实验分组：将豚鼠随机分成5组，其中包括空白组、模型组、阳性药组、低剂量组、高剂量组，每组10只。
参照文献(tanakak，okamotoy，nagayay，etal.anasalallergymodeldevelopedintheguineapigbyintranasalapplicationof2，4-toluenediisocyanate[j].internationalarchivesofallergyandimmunology，1988，85(4)：392-397.)制备鼻超敏反应模型的制作方法进行造模。模型组动物用微量加样器自豚鼠双侧鼻孔滴入10％甲苯-2，4二异氰酸酯橄榄油溶液，每侧5μl，每日1次，连续7天。通过行为学评分判断模型是否成功。7天后改为隔日1次(于给生理盐水或治疗药物15分钟之后给予橄榄油或甲苯-2，4二异氰酸酯，维持致敏状态，直到药物治疗结束。正常组动物同法给予橄榄油。造模成功的豚鼠，按性别和体重随机分成5组，每组10只，分别是空白组、模型组、挥发油高、低剂量组、阳性药组。同时按下表剂量分别对各组动物给药，每天给药1次，连续2周。
表6各组给药剂量及给药体积
标本采集方法：最后一次给药1小时用10％甲苯-2，4二异氰酸酯橄榄油溶液滴鼻激发动物，做行为学评分。30分钟后，股动脉取血，待血液自然凝固，2500r/min离心20min，收集上清液，将血清-20℃保存备用。采血后处死豚鼠，剥离鼻周围皮肤，包括上颚骨皮肤，沿鼻中线切开，暴露鼻中隔与双侧鼻腔，剪下鼻中隔黏膜，用faa固定。
指标检测：
行为学评分：以鼻部症状和体征为主要观察内容。造模第五天开始，每天给予橄榄油致敏动物后，15min后开始观察豚鼠的鼻痒、喷嚏、清涕出现次数与轻重程度，观察时间为40min，记录结果并评分。评分标准如下
鼻痒：轻度搔鼻1-2次积1分，剧烈搔鼻、到处摩擦积2分；
喷嚏：1～3个积1分，4-10个积2分，11个以上积3分；流涕：流至鼻孔积1分，超出前鼻孔积2分，涕流满面积3分。以第7天给致敏原后的症状评分为准，各症状记分叠加，总分超过5分者模型成功。
病理标本切片制作及结果分析方法：取下豚鼠鼻中隔黏膜后，faa液固定48小时，逐级酒精脱水，二甲苯透明、浸腊，石蜡包埋，常规切片4μm，he染色.每只动物每项指标在10x20倍光镜下选取5个视野，在mias-2000图形分析系统下定量观察鼻中隔黏膜炎细胞浸润情况、组织间隙水肿情况以及静脉血管扩张情况。
1.3实验结果
1.3.1行为学评分
治疗最后一次鼻腔激发豚鼠鼻部症状记分作为疗效评定标准，5组间进行比较，结果见表2。与正常组相比，给药治疗前，模型组、孔雀草挥发油各剂量组、阳性对照药组行为学评分均显著增加，统计学具显著性差异(p＜0.01)。与模型组比较，给药治疗后，孔雀草挥发油的高、低剂量组及阳性药组行为学评分都显著降低，统计学具显著性差异(p＜0.05或p＜0.01)。
表7治疗前后动物行为学评分
注：与正常组比较，##表示p＜0.01；与模型组比较，*表示p＜0.05，**表示p＜0.01。
1.3.2鼻中隔黏膜he染色示炎细胞侵润情况
运用mias-2000图形分析系统对炎细胞在选定区域的鼻黏膜固有层中所占的面积总和比、积分光密度总和比进行分析，评价炎细胞的侵润情况。结果如表3所示，与空白组比较，模型组鼻黏膜组织中炎细胞所占的面积总和比、积分光密度总和比显著升高(p＜0.05或p＜0.01)。与模型相比，挥发油高、低剂量组和阳性药组炎细胞所占的面积总和比、积分光密度总和比都显著降低(p＜0.05或p＜0.01)；表明孔雀草挥发油能减轻炎细胞在局部的侵润。
表8孔雀草挥发油对炎细胞侵润情况的影响
注：与模型组比较，*表示p＜0.05，**表示p＜0.01。
1.3.3鼻中隔黏膜he染色示组织水肿情况
运用mias-2000图形分析系统对水肿部位在选定区域的鼻黏膜固有层中所占的面积比进行分析，观察黏膜水肿情况。结果如表4所示：与正常组比较，模型组鼻黏膜组织中水肿所占的面积比升高，统计学具显著性差异(p＜0.01)。与模型组相比，孔雀草挥发油高、低剂量组及阳性药组水肿面积比都有不同程度的降低，统计学具有显著性差异(p＜0.05或p＜0.01)。提示孔雀草挥发油可以减轻鼻黏膜组织间隙水肿。
表9孔雀草挥发油对组织间隙水肿情况的影响
注：与模型组比较，**表示p＜0.01。
1.3.4鼻中隔黏膜he染色示毛细血管大小情况
运用mias-2000图形分析系统对鼻黏膜中毛细血管的大小进行分析，求出每组动物的血管面积、周长、最大直径的平均值，进行统计比较。结果如表5所示：毛细血管面积均值：与正常组相比，模型组毛细血管面积均值显著增高，统计学具有显著性差异(p＜0.01)。与模型组相比，孔雀草挥发油高、低剂量组及阳性药组毛细血管面积均值显著减小，统计学具有显著性差异(p＜0.05或p＜0.01)。毛细血管周长均值与最大直径：与正常组相比，模型组毛细血管周长均值显著增高(p＜0.01)。与模型组相比，孔雀草挥发油高、低剂量组及阳性药组均值显著降低，统计学具显著性差异(p＜0.01)。提示孔雀草挥发油可以通过降低毛细血管通透性，减轻炎症症状。
表10孔雀草挥发油对鼻黏膜毛细血管大小的影响
注：与模型组比较，*表示p＜0.05，**表示p＜0.01。
1.4统计学处理
经spss20.0统计软件处理数据，结果采用
上述仅为本发明的具体实施例，但本发明的设计构思并不局限于此，凡利用此构思对本发明进行非实质性的改动，均应属于侵犯本发明保护范围的行为。