本发明属于医药技术领域，具体来说涉及一种5-羟甲基糠醛在制备抗幽门螺杆菌药物中的应用。
背景技术：
5-羟甲基糠醛是葡萄糖等单糖化合物在高温或弱酸等条件脱水产生的一个醛类化合物，一般经炮制或加热后含量会升高，该化合物在多数中药中都含有此成分。以往对5-羟甲基糠醛的研究认为在医药及食品中有含量的控制，但最近的研究发现其有很多新的药理作用（傅紫琴，王明艳，蔡宝昌.5-羟甲基糠醛5-HMF在中药中的研究现状探讨[ J ]中华中医药学刊，2008,26（3）508-510）。：
（1）抗心肌缺血
近年来，在中药复方研究中发现，5-羟甲基糠醛有一定的抗心肌缺血作用。对生脉散的化学成分进行研究，从其合煎剂中分离得到一个新成分，经UV、IR、MS、及NMR谱鉴定为5-HMF 。同时，研究发现，单味药在煎煮前不含5-HMF，单味五味子水煎后能产生少量 5-HMF，人参、麦冬水煎液中未发现5-HMF，而生脉散全方及麦冬与五味子配伍的水煎液中5-HM F的含量显著增高，推测5-HMF 生成可能与五味子酸性有关，而其含量主要受麦冬影响。进一步进行药效学研究后发现，全方合煎的药效明显优于该方单煎或两两组合配伍或三方单煎后混合的药效，推测该结果可能与其中所含的5-HMF及其含量有关。对分离所得5 -HMF进行初步药效学实验，研究表明，5-HMF能降低心肌缺血小鼠血清中LDA含量，降低心肌缺血小鼠心肌组织中MDA含量，提示生脉散全方煎煮后化学成分的变化有利于其抗心肌缺血作用，它的产生对复方整体疗效是有利的，是生脉散抗心肌缺血的物质基础之一。
（2）抗氧化作用
近年来从生脉散煎剂中分离鉴定了原三药材没有的5-HMF，证明5-HMF除具有抗心肌缺血作用外，还具有良好的抗氧化作用。同时，有报道称茅台酒中含有5-HMF，有较强的抗氧化性，有益于口腔健康，且同样具有抗心肌缺血作用。
（3）Ca2+拮抗活性
研究发现，梅果实(如乌梅)中所含的蔗糖经加工炮制后可生成5-HMF,具有Ca2+拮抗活性，有较强的拮抗由钾离子引起的豚鼠结肠带收缩的活性。同时，乌梅具有抗过敏作用，其抗过敏机理可能是非特异性刺激产生的游离抗体中和侵入体内的过敏原的结果，有人认为该作用机理可能与其中所含的 5-HMF有关。
（4）改善血液流变学
研究发现，生地黄在蒸制过程中生成5–HMF，随蒸制时间延长，熟地黄中5-HMF含量增加，炮制成熟地黄后其含量增加20倍左右。而药效学实验发现熟地黄可以通过改善红细胞变形能力、红细胞集合体形成等红细胞动态,并通过使纤溶系功能增强而改善血液流变学，从而呈现血液促进的作用,与熟地相比，生品在这方面作用较弱，这可能与两者所含5 -HMF含量的差异有关。另外，从产于日本的黄杏中分离得到了5-HMF，通过实验同样证实5-HMF在改善血液流变学方面有一定作用。
（5）影响甘草酸代谢
有报道称，蜂蜜中含有葡萄糖、蔗糖、5-HMF等成分，将这3种成分分别家兔口服给药后，观察其对家兔体内甘草酸和甘草次酸代谢情况的影响。结果表明，5-HMF能抑制甘草次酸氧化为3-脱氢甘草次酸，增加甘草次酸在体内的吸收，从而促进甘草酸和甘草次酸的抑制肿瘤、抗炎、降低血中胆固醇的作用。
（6）其他
近年来，有人以线粒体呼吸链复合体Ⅳ抑制剂叠氮钠微泵恒速灌注30天导致大鼠神经元能量代谢障碍和学习记忆能力减低，从而研究补肾中药山茱萸单体成分5-HMF作用，结果显示，5-HMF能够拮抗叠氮钠致神经细胞线粒体跨膜电位下降，并且可升高转AD患者线粒体DNA融合细胞的线粒体膜电位。
技术实现要素：
本发明的目的在于提供的一种5-羟甲基糠醛在制备抗幽门螺杆菌药物中的应用。
本发明是选用体外细胞培养实验筛选5-羟甲基糠醛对幽门螺杆菌标准株及临床株的抑菌作用；再通过小鼠体内药理实验证明5-羟甲基糠醛对小鼠胃内幽门螺杆菌的清除作用。
具体实施方式
本发明是以体外细胞培养为实验依据，再以小鼠为实验动物，观察5-羟甲基糠醛及制剂的抗幽门螺杆菌作用，具体实验如下：
1.材料
1.1 样品
5-羟甲基糠醛（上海泛科实业有限公司， 批号Q-00469）
5-羟甲基糠醛胶囊剂为按以下实施例自制，其余均为国产试剂。
1.2幽门螺杆菌标准株（NCTC11637）为中国疾病预防控制中心传染病防治所提供；临床分离株D141、D146，由贵州医科大学微生物学教研室保存和传代；幽门螺杆菌(H.pylori)菌株：幽门螺杆菌悉尼株SS1为中国疾病预防控制中心传染病防治所提供，贵州医科大学微生物学教研室保存和传代。
1.3 实验动物
SPF级C57BL/N6小鼠50只, 8~9周龄， (购于贵州医科大学动物实验中心), 雄50只，雌50只，体重20~25克。
1.4 培养基和主要试剂：
选择性培养基：MH血琼脂培养基（10%无菌脱纤维羊血）和H.pylori选择性添加剂。
MH琼脂培养基（杭州滨和微生物试剂，批号150724）；H.pylori选择性添加剂（英国，OXOID，批号：1690207）（含万古霉素5.0mg，头孢磺啶2.5mg，甲氧苄氨嘧啶2.5mg，两性霉素B2.5mg)。
微需氧产气袋（日本，三菱化学株式会社，批号：4334LJ-4）；
快速尿素酶试纸；革兰染色液（海博生物）；
细菌基因组DNA提取试剂盒（上海生工，批号B909KA1110）；
血液组织细胞基因组DNA提取试剂盒（天根生化科技，批号：04201）；16SrRNA通用引物（27F;1492R）（上海英骏合成）；
H.pylori 16SrRNA特异性引物，上游引物 5'-CTTCTAG AGTGCTGTTA-3' ，下游引物 5'-TCCCACACTCT AGAATAGT-3'（上海英骏合成）。
1.5耗材：EP管、Tip头等。
2.方法与结果
2.1抑菌试验(Clinical microbiology reviews, 2007, 20(2): 280–322.)
2.1.1供试品制备： 精密称取1.5 g 5-羟甲基糠醛溶于30mL水中，对倍稀释，其浓度分别为50mg/mL、25mg/mL、12.5mg/mL、6.25mg/mL、3.125mg/mL、1.5625mg/mL；
2.1.2制备含药的界值平板：100mLMH培养基内加入15mL脱纤维绵羊血，取4.5mL加入无菌平皿，再于平皿中加入各稀释度药0.5mL，混匀凝固后制备成为含药血琼脂平板，各试药在培养基内的终浓度（mg/ml）见表1。
2.1.3细胞培养实验： 将幽门螺杆菌标准株（NCTC11637）及临床分离株D141、D146培养物（培养1周）配制浓度为2.0麦氏单位的菌悬液。取5μL菌液（浓度为6×108CFU/ mL）接种于含药的MH血琼脂平板上，同时取5μL菌液接种于不含药的MH血琼脂平板上为对照。以敏感菌株Hp NCTC 11637对培养基及试验条件进行质控。微需氧环境，37℃培养1周观察结果。（试验重复两次）
2.1.4结果：观察平皿上是否有菌生长，判断试药对该菌种的抑菌作用。结果见表1。
+：有菌生长，—：无菌生长。
含5-羟甲基糠醛的试液对幽门螺杆菌标准株及临床株均具有抑菌作用，稀释度1-5与对照相比，明显菌量减少，说明有抗菌活性，最小药物抑菌浓度为3.125mg/mL。
2.2动物实验（吴晓娟，2013）
2.2.1供试药制备：取5-羟甲基糠醛胶囊剂6g（含5-羟甲基糠醛200mg），以20mL灭菌生理盐水溶解（每毫升含5-羟甲基糠醛10mg）稀释备用；
2.2.2动物造模
2.2.2.1造模：将50只小鼠随机分出6只雌雄各半为阴性对照组，其余44只为感染组。对各组小鼠称重，计算平均体重。44感染组小鼠每天早上8:00开始禁食禁水，晚上20:00进行预处理，每只小鼠给予0.1mol/L的NaHCO3溶液0.3mL进行灌胃, 1h后给予用营养肉汤溶液配制的H.pylori菌悬液，菌液浓度达到2个麦氏单位以上。晚上23:00开始供给食水。每天1次，连续灌胃感染8次。
2.2.2.2感染模型的检查：末次灌胃感染后第5天，对感染组和对照组小鼠称重，计算平均体重。随机取2只感染组小鼠禁食24后断颈处死，雌雄各1只，解剖取小鼠胃，用无菌生理盐水清洗干净后进行匀浆处理，将匀浆液进行尿素酶试验。剩余的胃组织匀浆液分别用于幽门螺杆菌培养，和胃组织细菌DNA的提取。
胃黏膜中H.pylori的分离培养：取小鼠胃组织匀浆液, 用接种环均匀涂布在含有15%绵羊血的MH培养基平板上, 置于混合气体(10%CO2: 5%O2: 85%N2)罐中培养24-72h，观察培养基上细菌菌落特点，取针尖样大小的透明菌落进行革兰染色镜检，并提取细菌DNA备用。
幽门螺杆菌的PCR鉴定：用H.pylori 16SrDNA特异性引物，对培养得到的细菌和小鼠胃组织提取的DNA进行H.pylori DNA的提取和PCR扩增，扩增产物以1.0%的琼脂糖凝胶电泳检测。
2.2.3药物治疗效果观察
将造模成功的感染组平均分成2组，每组20只雌雄各半，一组继续作为感染组，另一组作为5-羟甲基糠醛胶囊剂治疗组。
2.2.3.1动物给药：将新药以0.5g/Kg小鼠体重的计量对治疗组小鼠进行灌胃，即平均每只小鼠的药物量为10mg，每只小鼠每次给予1mL灌胃，1天1次，灌胃3h后方恢复正常饮水和饲料。连续给药14天后停止给药。
2.2.3.2动物停药：药物停止后第二天将5-羟甲基糠醛胶囊组和感染组以及阴性对照组的小鼠称重并计算平均体重，行断颈处死，取胃组织进行匀浆处理，进行尿素酶试验，H.pylori细菌培养和组织DNA提取。
2.2.4结果
2.2.4.1造模结果：造模随机抽取的两只小鼠胃组织匀浆后的组织尿素酶试验为阳性；胃组织经H.pylori培养后见细小针尖大小无色菌落，经革兰染色后油镜下可见到革兰阴性弯曲杆菌；组织提取的总DNA经H.pylori 特异性引物16SrDNA PCR扩增后经琼脂糖凝胶电泳，在约550bp处可见扩增产物，提示小鼠胃内有幽门螺杆菌定植。
2.2.4.2治疗效果：
（1）正常对照组胃黏膜H.pylori的检查：灌药停止后第二天6只正常对照组小鼠胃组织尿素酶试验为阴性；组织H.pylori培养经革兰染色未见到革兰阴性弯曲杆菌；组织总DNA经H.pylori 特异性引物16SrDNA PCR扩增后经电泳检测，在550bp处未见到特异性条带，见表2。
（2）感染对照组H.pylori的检查：感染对照组20只小鼠断颈处死后经胃组织培养挑取可疑菌落革兰染色均可见革兰阴性弯杆菌和革兰阴性短杆菌；培养出的细菌和胃组织提取的DNA以特异性引物16SrDNA PCR扩增，电泳均可见550bp条带，见表2。
（3）治疗组H.pylori的检查：20只小鼠胃组织中有4例尿素酶弱阳性，经培养未见典型H.pylori 菌落；胃黏膜组织DNA经H.pylori 特异性引物16SrDNA PCR扩增后电泳，有4例在550bp处见特异性电泳条带，其余16只未见特异性扩增产物，见表2.
通过药理实验证明，空白组与模型组比较**P<0.01，有极显著性差异，说明造模成功；而5-羟甲基糠醛胶囊剂与模型组比较**P<0.01，说明其与模型组相比有极显著性差异，抗幽门螺杆菌活性显著。
3．急性毒性实验
3.1受试药物
药物名称：5-羟甲基糠醛 （上海泛科实业有限公司， 批号Q-00469）
配制方法：临用时用蒸馏水配制成溶液使用。
3.2试验动物
昆明种小鼠，雌雄各半，体重18 ~ 22g；由贵州医科大学实验动物中心提供，合格证号：SCXK（渝）2007－0006。
动物进入实验室后，由专人饲养管理，分笼喂养，每笼10只。饲料为贵阳医学院动物实验中心提供的专用饲料。实验室内光照充足，通风良好，室温18 ~ 22℃，湿度65 ~ 75 % 。
3.3实验方法（陈奇，2006）：
3.3.1预实验确定样品1对小鼠的最大全不死量（LD0）和最小全死量（LD100）。
3.3.2正式实验
3.3.2.1计算各组剂量
在LD0和LD100的范围内，按等比级数设计5个剂量组，各组剂量间比值为“k”，K=（LD0/LD100）1/4
每组剂量分别为：
第一组：LD100；第二组：LD100×k；第三组：LD100×k2：第四组：LD100×k3；第五组：LD0。
3.3.2.2给药与观察
取健康小鼠50只，雌雄各半，禁食不禁水12h。按性别和体重随机分为5组，每组10只，按上述剂量分别灌胃给药，给药容积0.4ml/10g。给药后连续观察14d，记录动物的毒性反应情况和动物死亡的分布情况。计算半数致死量（LD50）。
4. 结果
4.1 预实验结果
灌胃给予样品后确定：LD0=1400mg/kg；LD100=2400mg/kg； k=0.87。
4.2 正式实验结果 见表3。
4.3 数据处理：
LD50按下列公式计算：
LD50=lg-1[Xm-i（∑P－0.5）] （mg/kg）
式中：Xm为最大剂量的对数；P为各组动物的死亡率；i为相邻两组剂量对数值之差。
将所得数据带入上式得5-羟甲基糠醛对小鼠的LD50 = 1883.1mg/kg。
4.4 急性毒性症状
有轻度中毒症状小鼠主要表现为给药后活动度下降、食欲减退、呆立。大部分在给药后2h~4h活动增加，开始少量摄食，12h后精神和摄食状况恢复正常。严重中毒小鼠出现自主神经系统反应：可见毛竖立，全身震颤、抽搐，呼吸快而浅表。多数缩作一团，不饮水，不摄食。其中以2400.0mg/kg剂量组小鼠中毒症状出现最早，约于给药后2min出现上述中毒症状，药后5min左右小鼠开始死亡。药后30min内小鼠死亡率最高，小鼠多于48h内死亡。解剖死亡小鼠，脏器肉眼观均未见明显异常改变。
计量取决于所要达到的效果，治疗时间及给药方式；活性计量为参考，这些计量一般是成人口服每天胶囊剂300-900mg，单位计量是5-羟甲基糠醛10-30mg。
实施例1：根据常规技术制备具有下述组成含5-羟甲基糠醛10mg的胶囊剂
5-羟甲基糠醛 10mg
淀粉 130mg
滑石粉 67mg
羧甲淀粉钠 48mg
磷酸氢钠 35mg
硬脂酸镁 10mg
以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非对本发明作任何形式上的限制，任何未脱离本发明技术方案内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与修饰，均仍属于本发明技术方案的范围内。