远志皂苷B在制备电离辐射防护药物中的应用的制作方法

本发明涉及远志皂苷B在电离辐射防护中的应用,属于医药技术领域。

背景技术：

辐射防护剂的研究开始于20世纪60年代，辐射防护剂主要通过参与辐射与机体发生的化学反应发挥辐射保护作用，如辐射初期射线造成的机体内自由基的增加、DNA、蛋白质、磷脂等生物大分子的破坏等，辐射防护剂通过参与上述化学反应来减轻辐射对目标分子的损伤。因此这类辐射防护剂通常预防给药或者在辐射发生后立即使用，才能发挥较好的辐射防护作用。现有辐射防护剂的研究存在毒副作用过大，治疗效果有限，价格昂贵等限制，不能满足辐射越来越普遍的情况下人们对辐射防护剂的要求，如何研发出高效低毒的辐射防护剂成为人们迫切需要解决的问题。中药具有来源广、毒副作用小、价格低、易于获得等特点，人们开始关注中药有效成分的抗辐射研究，中药抗辐射的研究主要集中在对辐射具有较强敏感性的造血系统、生殖系统、免疫系统等的保护作用，围绕着如何减轻辐射造成的DNA损伤、清除自由基、发挥抗氧化作用、抑制细胞内凋亡通路的激活、减轻细胞的凋亡和坏死等方面进行，取得了初步的研究结果。中药有效成分如多糖类、黄酮类、多酚类、生物碱类、皂苷类等具有较好的辐射防护作用。

植物远志(Polygala)为远志科多年生草本植物，以干燥根入药，为我国常用的中草药，始载于《神农本草经》，全草能益智强志，故称远志。国内外研究表明，远志富含皂苷类、寡糖酯类等化合物，远志皂苷是著名的益智中药远志的有效成分,具有抗氧化、抗衰老、抗痴呆等药理作用。据报道，远志皂苷可提高由过氧化氢（H₂O₂）所致大鼠肾上腺嗜铬细胞瘤细胞(PC12细胞)存活率，减轻细胞膜的损伤，其机制可能是远志皂苷有效成分进入细胞后提高了SOD活性，进而阻止H₂O₂介导的氧化损伤，降低了脂质、蛋白质及DNA的损伤，以发挥抗氧化作用[中药材，2007，30（8）：991-993]。远志皂苷能明显地减轻 Aβ_1-40诱发的神经元毒性，对线粒体的超微结构与功能有较好的保护作用，可能与其通过保护线粒体内膜上的呼吸链复合物与 ATP 合酶的结构，维持脑细胞线粒体膜电位的稳定，降低内膜上的细胞色素 C 的泄漏，保持线粒体氧化磷酸化的偶联程度，提高抗氧化酶活性与减少自由基的产生，从而达到保护线粒体结构和功能的稳定，抑制细胞凋亡的作用机制有关。[中药药理与临床 2015,31(1):93-96]。电离辐射通过直接或间接的作用于机体引发机体非特异性反应，导致细胞损伤、机体功能发生异常、组织器官发生器质性改变甚至死亡。射线直接或间接作用于细胞，会引起细胞内DNA的结构和稳定性发生改变以及产生大量的ROS，从而激细胞内多种凋亡信号分子，导致细胞凋亡。远志皂苷有抗氧化作用，防止过多的氧自由基对机体的损害。本发明提供了远志皂苷 B的电离辐射防护新用途，现有技术未见报道。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供远志皂苷B预防及治疗电离辐射损伤的新用途。

本发明通过细胞、动物水平对远志皂苷B的抗电离辐射活性进行反复验证，实验结果表明远志皂苷B可以抑制X射线照射导致的胸腺细胞活力丧失，并能提高X射线6 Gy一次全身照射昆明种小鼠的活存率，从而完成了本发明。

远志皂苷B可与药学上可接受的载体按本领域已知方法制备成各种药物组合物，如片剂、胶囊剂、颗粒剂、注射剂等各种固体、液体制剂等；或和其他中药有效成分组合制成各种不同的剂型，通过不同的给药途径用于预防及治疗电离辐射损伤。

本发明的优点：

1.发现了远志皂苷B新的医疗用途。

2.远志皂苷B来源广，毒副作用小、价格低、易于获得，药用前景广阔。

3.本发明将成为高效低毒抗电离辐射药物的有益补充。

附图说明

图1 远志皂苷B对胸腺细胞的细胞毒性

图2不同浓度的远志皂苷 对X射线6 Gy照射的胸腺细胞活力丧失的保护作用

图3 远志皂苷B对X射线6 Gy照射的胸腺细胞DNA的保护作用。

具体实施方式

下面结合实施案例对本发明作进一步的说明：

[实施例一] 远志皂苷B对胸腺细胞的细胞毒性检测

小鼠胸腺细胞的制备：小鼠摘眼球后，脱颈椎处死，75%酒精浸泡3 min，超净台内小心摘取小鼠胸腺，用消毒过的PBS清洗血迹；在200目细胞筛上用注射器芯轻轻研磨，用RPMI 1640培养液（含10%胎牛血清、10万单位青霉素钠、10万单位硫酸链霉素）冲洗制备细胞悬液，调整细胞密度1×10⁶/mL。

药物准备：将用RPMI 1640培养液溶解，超声助溶，配置储存浓度100 μg/mL母液备用。

毒性检测：取胸腺细胞悬液，细胞(1×10⁶个/mL)接种于96孔培养板，100 μL/孔，每孔药物100 μL，使终浓度为1.25、2.5、5、10、20、40、80、160、320 μg/mL (简称药物组)，每浓度5孔，另设空白对照组细胞悬液。于药物作用48 h后，加入MTT溶液，于多功能酶标仪490 nm处测定各孔吸光值。细胞存活率%= 实验组/正常组×100% ，数据用spss 19.0进行统计分析，与正常组相比：#，P<0.05。表明，远志皂苷B在1.25-40 μg/mL无明显细胞毒性。（见附图1）

[实施例二] 远志皂苷B对X 射线导致的胸腺细胞活力丧失的保护作用

取胸腺细胞(1×10⁵个/mL)接种于96孔培养板，100 μL/孔，每孔药物100μL，使终浓度为40、20、10、5、2.5、1.25 μg/mL，每浓度5孔，另设空白对照组细胞悬液、辐照组细胞悬液。于药物作用2 h后6 Gy辐照，照后8 h于每孔中加入MTT溶液20 μL，继续培养4 h，于多功能酶标仪490 nm处测定各孔吸光值。与辐照组相比：#，P<0.05。结果表明，远志皂苷B在1.25-20 μg/mL对X射线6 Gy照射的胸腺细胞活力丧失呈剂量依赖的保护作用，对胸腺细胞电离辐射防护的最优浓度为20 μg/mL。（见附图2）

[实施例三] 远志皂苷B对X 射线6 Gy一次全身照射昆明种小鼠存活率的影响

将雄性昆明种种小鼠适应环境后根据需要分为正常组、照射组、阳性药组和药物组，每组10只。正常组和照射组灌胃给予蒸馏水，用药组照前灌胃给予相应药物，连续3天，阳性药组照前24 h灌胃给予“E523”一次，剂量5 mg/kg，给药后全身一次性照射，剂量为6 Gy，照后连续观察30天。结果表明，远志皂苷B 20 mg/kg给予小鼠，30天存活率可达到90%，动物实验再次表明刺梨黄酮的较强的电离辐射防护作用。（见表1）

[实施例四]彗星实验检测远志皂苷B对DNA双链断裂的影响

按上述细胞分组和照射方式，辐射后2 h收集细胞，离心后去上清，用PBS重悬，调整细胞密度1×10⁶/mL。

铺胶取干净的载玻片使用具有磨砂的一面，第1层胶，0.8%的正常琼脂糖凝胶50 μL，4 ℃凝固；第2层胶，0.4%低熔点琼脂糖（LMRA）50 µL与10 µL细胞悬液混匀后铺第二层胶，4 ℃凝固；第3层胶，0.4%的低熔点琼脂糖（LMPA）50 µL，4 ℃凝固20 min。

裂解将凝胶玻片进入新鲜配制的细胞裂解液中，4 ℃裂解1.5 h。

碱化电泳放置20 min使DNA解链。恒压19 V，300 mA电泳20 min。

中和取出玻片，Tris缓冲液冲洗3 min×3次

染色PI（20 μg/mL）滴于载玻片上，染色15 min，洗去染液。

荧光显微镜下采集图像，实验结果如附图3A所示，辐射后的胸腺细胞出现明显的拖尾现象，给予远志皂苷B保护组细胞其彗星尾的长度比单纯辐射组明显缩短，显示对远志皂苷B辐射损伤小鼠胸腺细胞的DNA具有较好的保护作用。

[实施例五] DNA ladder实验检测远志皂苷B对DNA损伤的保护作用

细胞凋亡会引起DNA链的断裂，凋亡晚期DNA在核小体间断裂形成一些DNA片段，不同的DNA片段在凝胶电泳上移动的速度不同，会产生类似于阶梯状的条带，称之为DNA ladder。按上述细胞分组和照射方式，辐射后3h收集细胞，参照试剂盒方法提取DNA进行凋亡检测：a. 离心收集5×10⁵个细胞（2000 r，4 ℃，7 min）PBS洗两遍；b. 沉淀的细胞中每管加入20 μL Lysis Buffer，轻轻混匀细胞沉淀；c. 每管加入10 μL Enzyme A溶液，轻轻混匀，30℃孵育30-120 min；d. 制备1.5%琼脂糖凝胶30 mL (含EB染料0.5 μg/mL)，在上述孵育步骤结束后，每管加入5 μL loading buffer 混匀，干胶上样；e. 75 v电泳至1/2处；f. 紫外灯拍照观察。DNA ladder显示结果如附图3B所示，与正常组相比，6 Gy辐射组细胞的DNA断裂明显，呈特征性DNA凋亡条带，阶梯条带辉度较高。给予远志皂苷B保护组与单纯辐射组相比，阶梯条带模糊，灰度减弱，能够减轻辐射损伤细胞的晚期凋亡。