盐酸小檗碱和水苏糖组成的组合物及其应用的制作方法

本发明属于医药技术领域，具体涉及一种由盐酸小檗碱和水苏糖组成的药物组合物及在防治2型糖尿病、高血脂症和/或2型糖尿病并发症中的应用。

背景技术：

糖尿病是严重威胁人类健康的内分泌代谢紊乱疾病，以高血糖、高血脂为主要特征。其中2型糖尿病发病率占糖尿病患者90％以上，表现为胰岛素抵抗，并伴有糖尿病并发症的发生，继发于糖尿病的心血管并发症是导致糖尿病患者死亡的首要原因。流行病学调查发现，糖尿病患者有70-80％死于心血管并发症。糖尿病性心肌病是糖尿病患者的主要心脏并发症，该病由代谢紊乱及微血管病变引发心肌广泛灶性坏死及纤维化进而导致心脏重构，并最终发展为心功能异常和心力衰竭。

目前，2型糖尿病的治疗方法主要包括降糖、降脂和改善胰岛素抵抗；糖尿病性心肌病的治疗则主要包括强心药应用和手术等对症治疗方法，普遍存在不良反应较多，成本昂贵等弊端，从具有代谢调节潜力的天然产物中寻找能够有效的改善2型糖尿病及其心脏并发症，结构明确且更为安全的单体或配伍成分，将为糖尿病性心肌病的临床治疗提供有效且崭新的手段。

水苏糖(英文名：stachyose，分子式C₂₄H₄₂O₂₁)，是一种天然的功能性寡糖，可以强效增殖人体肠道内有益菌群(双歧杆菌和乳酸菌等)，具有良好的生理功能。另外，水苏糖是中药鲜地黄中含量最高(含量高达50％，折干计)的化学成分，在加工炮制过程中发生降解从而药性发生改变。

盐酸小檗碱(即黄连素，英文名：berberine，分子式C₂₀H₁₈ClNO₄)，为常用的抗菌药物，临床上用于治疗肠道感染，例如胃肠炎等，也有用于治疗糖尿病方面的报道。盐酸小檗碱是中药黄连的主要化学成分，含量约9％(干品计)。

唐代医家孙思邈所著的《备急千金要方》中有多种治疗消渴的良方，例如：

一曰黄连丸，方载：黄连一斤，生地黄(即鲜地黄)一斤，右两味，绞地黄取汁，浸黄连，出曝之燥，复纳之，令汁尽干之，捣末，蜜丸如梧子。服二十丸，日三，食前后无在。亦可为散，以酒服方寸匕。此方治渴。

二曰地黄丸，方载：生地黄汁，生栝楼根汁，各二升，牛羊脂三升，白蜜四升，黄连一斤，末之。又五味，合煎令可丸。饮服如梧子大五丸，日二，加至二十丸。若苦冷而渴，渴瘥即别服温药也。此方治岭南山瘴，风热毒气入肾中，变寒热脚弱，虚满而渴。又治面黄，手足黄，咽中干燥，短气，脉如连珠，除热、止渴利、补养。

三曰茯神丸，方载：茯神，黄耆，栝楼根，麦门冬，人参，甘草，黄连知母各三两，干地黄，石膏各六两，菟丝子三合，苁蓉四两。右十二味，末之，以牛胆三合，和蜜丸如梧子，以茅根汤服三十丸，日二服，渐加至五十丸。治肾消渴，小便数者。

所查专利“一种治疗糖尿病的药物组合物及其应用”(专利申请号201210586831.2)分别对黄连和鲜地黄两味药材进行乙醇回流提取，再把二者的提取物混合，以期说明此提取方法比传统工艺的千金黄连丸在转移率方面具有优势。上述专利与本发明提出的单体成分配伍不同。

所查专利“盐酸小檗碱用于制备抑制食欲的药物”(专利申请号201410286415.X)公开了盐酸小檗碱用于制备抑制食欲的药物，尤其是用于减少糖尿病或肥胖症患者进食量。上述专利采用的是盐酸小檗碱单一成分，与本发明盐酸小檗碱和水苏糖配伍组合不同，针对的应用是减少食欲，与本发明提出的应用范围也不同。

所查专利“一种组合物及其在医药中的用途”(专利申请号201410260301.8)公开了一种由大黄酸、盐酸小檗碱混合组成的组合物，用于预防和治疗糖尿病、肾病。上述专利采用的是盐酸小檗碱和大黄酸组合物，与本发明盐酸小檗碱和水苏糖组合物不同。

文献“梓醇与盐酸小檗碱及其配伍对胰岛素抵抗3T3-L1脂肪细胞的影响”考察了梓醇与盐酸小檗碱及其配伍对地塞米松诱导的胰岛素抵抗3T3-L1脂肪细胞葡萄糖消耗、转运及这一过程中过氧化物体增殖物激活受体(PPAR-C)mRNA表达的影响。文献中提出的梓醇与盐酸小檗碱配伍与本发明提出的盐酸小檗碱和水苏糖配伍不同。

中国药典(2010版)规定梓醇为生地黄药材的质量控制指标，因此学者多以梓醇为研究对象来开展地黄相关的研究和开发，与此不同，我们把地黄中的活性成分水苏糖作为研发对象。

前期研究发现鲜地黄中的水苏糖具有一定的降糖和降脂等作用并且细胞毒性低。本发明进一步发现水苏糖和盐酸小檗碱联合用药对高脂饮食加STZ诱导的ICR小鼠糖尿病模型有明显的降糖、降脂和改善糖尿病心肌病相关指标的作用，而且多数情况下两者联合用药比分别单独使用效果更佳，首次提出以水苏糖和盐酸小檗碱组合物进行2型糖尿病及相关心脏并发症的适药性研究，所用原料来源丰富，化学结构清楚，克服了中药复方物质复杂难以阐明的问题，以期通过符合现代医药学规律的研发使之成为一种创新性药物。

参考文献：

刘芳芳,杨明炜,王晓强,等.梓醇与盐酸小檗碱及其配伍对胰岛素抵抗3T3-L1脂肪细胞的影响.中草药,2007,38(10):1523-1526.

技术实现要素：

本发明解决的技术问题是提供一种由盐酸小檗碱和水苏糖组成的组合物、及其在制备预防和/或治疗2型糖尿病、高血脂症和/或2型糖尿病并发症药物、保健品或食品中的应用。

本发明的技术方案一方面提供了一种由盐酸小檗碱和水苏糖组成的组合物，盐酸小檗碱和水苏糖配方重量份数配比为1:0.1～50，优选重量份数配比为1:0.2～25，最优选重量份数配比为1:1。

本发明的技术方案第二方面提供了一种由盐酸小檗碱和水苏糖组成的组合物，其中所述组合物还包括药学上可接受的盐或赋形剂。

所述组合物可根据本领域公知的方法制备。用于此目的时，可将本发明组合物与一种或多种固体或液体药物赋形剂和/或辅剂结合，制成可作为人药或兽药使用的适当的施用形式或剂量形式。给药剂型可以是液体剂型、固体剂型，如液体剂型可以是真溶液类、胶体类、微粒剂型、乳剂剂型、混悬剂型。其他剂型例如片剂、胶囊、滴丸、气雾剂、丸剂、粉剂、溶液剂、混悬剂、乳剂、颗粒剂、栓剂、冻干粉针剂，口含片、口崩片、胶丸、软胶囊、分散片、溶液剂、气雾剂或喷雾剂等。所述组合物可以制成普通制剂，也可以是缓释制剂、控释制剂、靶向制剂及各种微粒给药系统。此外，也可以向药物制剂中添加着色剂、防腐剂、香料、矫味剂、甜味剂或其它材料。

本发明技术方案的第三方面提供了一种由盐酸小檗碱和水苏糖组成的组合物在制备预防和/或治疗2型糖尿病、高血脂症和/或2型糖尿病并发症药物、保健品或食品中的应用。所述的2型糖尿病表现为高血糖或胰岛素抵抗；所述的2型糖尿病并发症选自糖尿病心肌病；所述的2型糖尿病心肌病为2型糖尿病引起的心室异常重构，2型糖尿病引起的心力衰竭，2型糖尿病引起的心脏组织纤维化。

有益技术效果：

本发明将盐酸小檗碱和水苏糖以一定比例进行配伍能够不同程度治疗2型糖尿病的血糖或胰岛素抵抗，以及血脂代谢紊乱、并可明显改善和治疗2型糖尿病并发症，尤其是2型糖尿病心肌病的心脏重构与失能，同时可提高2型糖尿病模型小鼠生存率。尤其是盐酸小檗碱和水苏糖重量份数配比为1:1的组合物在提高2型糖尿病模型小鼠生存率、降低血糖、降低甘油三酯和总胆固醇、改善胰岛素抵抗，改善心肌功能等多方面相对于分别单独给药效果更佳，证明盐酸小檗碱和水苏糖配伍有一定程度的协同作用。

附图说明

图1：链脲菌素(streptozocin，STZ)加高脂饮食诱导2型糖尿病小鼠模型制备、动物分组、盐酸小檗碱和水苏糖按各1:0、5:1、1:1、1:2.5、1:5、1:10、1:25和0:1进行配伍给药安排。

图2：盐酸小檗碱和水苏糖各种配伍组合物(分别为1:0、5:1、1:1、1:2.5、1:5、1:10、1:25和0:1)对STZ加高脂饮食诱导2型糖尿病小鼠生存率的影响。

图3：盐酸小檗碱和水苏糖各种配伍组合物对STZ加高脂饮食诱导2型糖尿病小鼠糖耐量的影响。

图4：盐酸小檗碱和水苏糖各种配伍组合物对STZ加高脂饮食诱导2型糖尿病小鼠稳态胰岛素抵抗评价指数的影响。

图5：盐酸小檗碱和水苏糖各种配伍组合物对STZ加高脂饮食诱导2型糖尿病小鼠血清甘油三酯的影响。

图6：盐酸小檗碱和水苏糖各种配伍组合物对STZ加高脂饮食诱导2型糖尿病小鼠血清总胆固醇的影响。

图7：盐酸小檗碱和水苏糖各种配伍组合物对STZ加高脂饮食诱导2型糖尿病小鼠血清高密度脂蛋白的影响。

图8：盐酸小檗碱和水苏糖各种配伍组合物对STZ加高脂饮食诱导2型糖尿病小鼠血清低密度脂蛋白的影响。

图9：盐酸小檗碱和水苏糖各种配伍组合物对STZ加高脂饮食诱导2型糖尿病小鼠心室壁厚度和心功能的影响。从左到右，从上到下依次为对照组、模型组、1:0、5:1、1:1、1:2.5、1:5、1:10、1:25和0:1配伍组合物给药组小鼠的典型超声心动图。

图10：盐酸小檗碱和水苏糖各种配伍组合物对STZ加高脂饮食诱导2型糖尿病小鼠舒张期左心室前壁(LVAWd)的影响。

图11：盐酸小檗碱和水苏糖各种配伍组合物对STZ加高脂饮食诱导2型糖尿病小鼠舒张期左心室后壁(LVPWd)的影响。

图12：盐酸小檗碱和水苏糖各种配伍组合物对STZ加高脂饮食诱导2型糖尿病小鼠心脏射血分数(EF)的影响。

图13：盐酸小檗碱和水苏糖各种配伍组合物对STZ加高脂饮食诱导2型糖尿病小鼠心脏短轴缩短率(FS)的影响。

图14：盐酸小檗碱和水苏糖各种配伍组合物对STZ加高脂饮食诱导2型糖尿病小鼠心脏组织纤维化的影响。从左到右，从上到下依次为对照组、模型组、1:0、5:1、1:1、1:2.5、1:5、1:10、1:25和0:1配伍组合物给药组小鼠心脏组织胶原经Masson三色染色后的代表性图片。

图15：盐酸小檗碱和水苏糖各种配伍组合物对STZ加高脂饮食诱导2型糖尿病小鼠心脏组织胶原面积影响的统计结果。

具体实施方式

下面通过实施例的方式进一步说明本发明，但并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法和条件，或按照商品说明书选择。

下述实施例中，盐酸小檗碱和水苏糖均由黄连和地黄中人工分离提取。

下述实施例中，部分物质的全称或相应的中文名称如下：

STZ：链脲菌素

PBS：磷酸盐缓冲液

下述实施例中所述室温如本领域常规所述，一般指15～25℃。

实施例1盐酸小檗碱和水苏糖不同比例的配伍对STZ和高脂饮食诱导的ICR小鼠糖尿病模型的影响

(一)模型制备、实验分组及给药方案

SPF级ICR小鼠(雌雄各半，3-4周龄)购自北京维通利华实验动物技术有限公司，饲养于中国医学科学院药物研究所实验动物中心，恒温恒湿，自由饮食。小鼠适应性饲养一周后，按性别和体重随机分为2组：①对照组10只，持续给予基础饲料直到实验结束；②高脂+STZ组90只，给予高脂高糖饲料(含有35％脂肪，18％蛋白质，47％碳水化合物)，持续4周后腹腔注射链脲菌素STZ 100mg/kg(溶于0.1M柠檬酸缓冲液，PH 4.5)，并继续给予高脂高糖饲料；对照组腹腔注射溶剂0.1M柠檬酸缓冲液。持续8周后尾静脉取血检测血糖(BG)，将高脂+STZ组动物按血糖>11.1mM的小鼠随机分为9组并持续给予高脂高糖饲料：模型组(糖尿病)和给药组(盐酸小檗碱和水苏糖配伍比例分别为1:0、5:1、1:1、1:2.5、1:5、1:10、1:25和0:1的组合物)。

给药组的最大给药剂量参考临床和日常保健常用剂量确定，具体如下：盐酸小檗碱(成人1.2g/日，折合为成人剂量为18mg/kg，再折合为小鼠的最大给药剂量设为200mg/kg。水苏糖(成人保健剂量为6g/日，折合为成人剂量为85mg/kg，再折合为小鼠最大给药剂量设为1000mg/kg)。本实验给药组共分为8组，具体各组给药剂量设计表见表1。

具体给药方案为：各给药组分别按上述剂量将组合物溶于纯水中，每天灌胃给药1次；模型组给予对照溶剂PBS，每天灌胃给药1次，图1为具体造模及给药时间安排。持续给药8周。

表1

(二)实验结果

(1)盐酸小檗碱和水苏糖不同比例的配伍对2型糖尿病小鼠生存率的影响

图2为盐酸小檗碱和水苏糖按1:0、5:1、1:1、1:2.5、1:5、1:10、1:25和0:1配伍比例治疗后小鼠的生存率与对照组、模型组小鼠生存率进行比较的结果。

结果表明，持续给药八周后，模型组的小鼠有最大程度的死亡，而盐酸小檗碱和水苏糖分别单独给药及大部分不同配伍比例治疗后也均有不同程度的死亡，但盐酸小檗碱和水苏糖1:1配伍比例的给药组没有死亡，生存率最高，在一定程度上说明二者以一定比例配伍的优势所在。

(2)盐酸小檗碱和水苏糖不同比例的配伍对2型糖尿病小鼠血糖、血脂、胰岛素指标的影响

小鼠禁食12h后，尾静脉取血，使用血糖检测仪测定空腹血糖，按2g/kg灌胃葡萄糖溶液，并与30、60、120min时间点尾静脉取血测量血糖，依据公式AUC(mmol/L/h)＝(0min血糖值+30min血糖值)×0.5/2+(30min血糖值+60min血糖值)×0.5/2+(60min血糖值+120min血糖值)×1/2计算曲线下面积评价小鼠的糖耐量(图3)。小鼠通过眼球取血1mL，室温静置30min，3000rpm离心，分离血清，按ELISA试剂盒说明书检测胰岛素含量(图4)，按生化检测试剂盒说明书使用日立7600-020全自动生化分析仪检测甘油三酯(图5)、总胆固醇(图6)、高密度胆固醇(图7)、低密度胆固醇(图8)等血脂指标，具体测定和统计数值见表2。

检测结果发现：STZ加高脂饮食诱导的糖尿病模型组小鼠出现明显的血糖、总胆固醇、甘油三酯升高和胰岛素抵抗增加。盐酸小檗碱和水苏糖按1:0、5:1、1:1、1:2.5、1:5和1:10配伍比例均显示显著降低血糖作用，尤其二者按1:1配伍最佳。盐酸小檗碱和水苏糖按1:0、5:1、1:1、1:2.5、1:5、1:10和1:25配伍比例均显示显著改善胰岛素抵抗作用，尤其二者按1:1配伍最佳。盐酸小檗碱和水苏糖按1:0、5:1、1:1、1:5、1:10和1:25配伍比例均显示显著降低甘油三酯水平的作用。盐酸小檗碱和水苏糖按1:0、5:1、1:1、1:2.5、1:5和1:10配伍比例均显示显著降低总胆固醇水平的作用，尤其二者按1:1配伍最佳。结果显示二者以一定比例配伍有协同作用。

表2

(3)盐酸小檗碱和水苏糖不同比例的配伍对2型糖尿病小鼠心脏功能和形态的影响

实验结束前，小鼠按45mg/kg剂量腹腔注射戊巴比妥钠进行麻醉后，对其胸腹部进行脱毛处理，仰卧位固定于超声检测台，使用VisualSonics Vevo 770(VisualSonics，加拿大)超声系统进行检测：先用10M Hz超声探头对小鼠心脏长轴方向进行B型超声监测，确定左心室乳头肌位置后，再转为心脏短轴方向进行监测，并记录其10～20个心动周期的M型超声变化图；用Vevo 770软件分别测量舒张末期左室前壁厚度(LVAWd)、左室后壁厚度(LVPWd)、室间隔厚度(LVSd)、射血分数(Ejection Fraction，EF)、短轴缩短率(Fractional Shortening，FS)等各项心脏结构和心功能指标。

心室异常重构是糖尿病性心肌病重要的心脏结构病理改变。VasualSonics超声心动检测结果发现：STZ加高脂饮食诱导糖尿病性心肌病后第20周，模型组小鼠出现明显的心室壁变厚和心功能降低等病理改变。盐酸小檗碱和水苏糖按1:1配伍可以显著抑制LVAWd的增加。盐酸小檗碱和水苏糖按1:1和1:10配伍可以显著抑制LVPWd的增加。盐酸小檗碱和水苏糖按1:1和1:10配伍可以显著改善心脏的FS和EF指标。结果进一步显示二者以一定比例配伍有协同性。图9为代表性超声心动图，图10和图11为心脏结构指标LVAWd和LVPWd统计结果，图12、图13为心功能指标EF和FS统计结果，具体测定和统计数值见表2。

(4)盐酸小檗碱和水苏糖不同比例的配伍对2型糖尿病小鼠心脏组织纤维化的影响

由实施例实验结果(3)获得的小鼠心脏经4％多聚甲醛固定，石蜡包埋并进行横切，经苏木素-伊红(HE)染色，评价整体心脏结构改变。组织切片经Masson染色后在显微镜下观察，确定心脏胶原沉积情况判断纤维化程度，并应用高清晰彩色病理图文分析系统Spot Advanced 3.0获得高清晰的Masson染色的病理图片(400倍放大)。使用Image-Pro Plus 5.1测量每个视野胶原着色面积。每组分析6-8个标本，每个标本随机选取10个视野，取均值代表一个动物胶原组织在心脏组织内的含量和表达强度。通过非参数方差分析比较各组“胶原绝对面积”。

心脏组织纤维化是心脏病致死的重要原因之一。胶原绝对面积百分率是评价组织纤维化程度的可靠指标，利用Masson染色检测心脏组织胶原沉积可以在一定程度反映心肌纤维化的情况。正常组心肌组织胶原组织相对较少，STZ加高脂饮食诱导糖尿病性心肌病小鼠心肌组织胶原明显增加，形成严重心肌纤维，胶原绝对面积百分率增至正常值的3倍，盐酸小檗碱和水苏糖按照1:0、5:1、1:1、1:2.5、1:5、1:10、1:25配伍比例均可以显著降低STZ加高脂饮食诱导糖尿病性心肌病小鼠心肌组织胶原沉积，尤其二者按1:1配伍最佳。结果进一步说明盐酸小檗碱和水苏糖以一定比例配伍有协同性。图14为Masson染色代表图片，图15为各组胶原面积统计结果，具体测定和统计数值见表2。