本发明属于医药
技术领域：
，具体涉及一种天麻素的新应用。
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：组织或器官在一定时间缺血后会造成损害,经恢复血流灌注后不但不能使其功能和结构恢复，反而使损伤进一步加重称为缺血后再灌注损伤(ischemia-reperfusioninjury,I/RI)。再灌注后有大量Ca2+内流，并生成大量氧自由基，是广泛组织细胞损伤的主要发病机制。临床上多种疾病如迟发性神经元坏死、不可逆性休克、心肌梗死、急性脏器功能衰竭及器官移植排斥反应等的发生、发展都与缺血再灌注有关。肝脏缺血再灌注损伤（HIRI）是肝脏外科常见的病理状态。由于肝脏的解剖结构复杂，血供丰富，在肝脏外科手术中为减少术中出血常需阻断肝脏血供。但是肝脏血流阻断后在减少出血的同时也会导致HIRI。该损伤常发生于肝癌切除、肝移植、严重的创伤和感染等病理过程。HIRI可导致肝功能损伤，严重者可致肝衰竭，甚至死亡。目前的研究表明HIRI的发病机制尚不十分清楚，可能有以下因素参与：氧化应激损伤、炎症细胞浸润、钙超载、酶的作用、肝细胞凋亡等。随着研究的深入在改善HIRI方面有了很大进展，但效果仍不理想。HIRI是引起术后原发性移植物无功能、导致肝移植失败的重要原因。因此如何减轻HIRI是目前肝脏外科特别是移植外科急需解决的棘手问题!目前人们公认HIRI是许多不同的机制相互作用的结果,因此其防治也就有不同的方法。常用的方法主要有缺血预处理(IP)和药物预处理。（GongNQ,YeQF,JangHY,eta.lProtectionofgraftsbymedicinepreconditioningandIschemiapreconditioninginlivertransplantation[J].ChinJHepaSurg,2000,6:282-284.）然而,肝脏IP的这种保护作用毕竟有限，Schulz等（SchulzR,WalzMK,BehrendsM,eta.lMinimalprotectionoftheliverbyischemicpreconditioninginpigs[J].AmJPhysiolHeartCircPhysiol,2001,280:H198-H207.）发现IP保护作用能维持1～2h，在经历200min较长时间缺血后IP作用消失，因此限制了其在临床的应用。对于如何提高肝脏外科手术中肝脏的自身保护能力，阻断肝脏血流存在HIRI的问题，调动其内源性保护机制，减轻肝脏I/RI，是肝脏外科的临床需求。在肝移植过程中缺血预处理实施比较受限，因此运用药物预处理来诱导IP及模拟IPC的延迟保护作用或直接保护I/RI后的肝脏,具有广阔的临床应用前景,值得进一步研究。药物预处理是利用某些活性物质直接或间接的药理作用来达到类似缺血预处理的保护作用，增强组织或细胞对缺血再灌注损伤的耐受性，从而减轻损伤。对HIRI具有预处理效果的药物主要有钙通道阻滞剂、自由基清除剂、改善微循环或细胞能量代谢的药物等。但其中许多药物具有较大的毒副作用，影响了其在临床上的应用，难以满足临床需要。因此，开发一种能解决上述难题的药物是非常必要的。技术实现要素：本发明的目的在于提供一种天麻素的新应用。本发明的目的是这样实现的，所述的天麻素在制备预防/治疗肝脏缺血再灌注损伤药物中的应用。天麻（Ｇａｓｔｒｏｄｉａｅｌａｔａ．ＢＬ）为兰科植物天麻的干燥块茎，是名贵中药，性甘、平，归肝经。中医认为其主要功效有熄风止痉，平抑肝阳，祛风通络。从天麻中提取出的化学成分有天麻苷、天麻苷元、香荚兰醇、香荚兰醛、β-甾谷醇、胡萝卜苷等，其中活性成分含量最高的有效单体是天麻苷，化学名为对-羟甲基苯-β-D-吡喃葡萄糖苷半水合物（β-Ｄ-Ｇｌｕｃｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ），又称天麻素。现代药理学研究显示，天麻素具有增加中央及外周动脉血管顺应性，降低外周血管阻力，增加心脑血管血流量，产生温和降压作用，而且对心肌细胞、脑组织均有保护作用，同时具有镇静、催眠、镇痛、增强免疫等作用，在临床上广泛用于治疗心脑血管、微循环系统疾病，疗效显著，且无明显副作用。目前市面上常用制剂剂型有天麻素注射液、天麻素片、天麻素胶囊。天麻素(即对羟甲基苯-β-D-吡喃葡萄糖苷)是天麻的有效单体成分之一。现代药理研究表明，天麻素具有镇静、镇痛、安眠作用,亦能抗惊厥、抗焦虑,能增加脑血流量、减少血管阻力、改善椎-基底动脉供血不足,具有神经保护作用，（鞠桂春.天麻及其制剂的药理作用和临床应用研究进展〔J〕.中国药业，2008，17(1):64-66.）动物实验研究显示天麻素可以抑制脑缺血诱导的细胞凋亡，具有神经保护作用，对体外培养的大鼠脑微血管内皮细胞(BMEC)缺血损伤具有一定的保护作用。（杨杰,赵朝华,宗长宏,等.短暂性MCAO大鼠注射天麻素具有神经保护作用〔J〕.第四军医大学学报,2008,29(4):295-297.；胡京红,司银楚,洪庆涛.天麻素对体外模拟脑缺血损伤大鼠脑微血管内皮细胞的保护作用〔J〕.中华中医药杂志(原中国医药学报),2007,22(2):124-126.；ZengXH.ZhangY,ZhangSM,etalAmicrodialysisisstudyofeffectsofgastrodinonneurochemicalchangesintheischemic/reperfusedretcerebralhippocampus〔J〕.BiolPhamBull,2007,30(4):801.）研究表明天麻素还具有促智抗衰老作用。（王昭君,习杨彦彬,刘佳.天麻素对快速衰老小鼠大脑组织衰老相关基因表达的影响〔J〕.解剖科学进展,2007,13(4):353-357.）国外研究表明天麻素是有效的抗焦虑药。（JungJW,YoonBH,OhHR.etal.Anxiolvtie-likeeffectsofGastrodiaelataanditsphenolieconstituentsinmice〔J〕.BiolPharmBull,2006,29(2):261-265.）天麻素在临床上应用广泛,治疗眩晕、椎基底动脉供血不足、缺血性脑卒中、血管性状头痛等疾病,疗效显著,用于高血压、糖尿病周围神经病变的辅助治疗，作用肯定，值得临床重视。已有研究表明天麻素能增强血管的顺应性,改善脏器缺氧状态,对一些由脑供血不足造成的中枢神经系统疾病有较好的治疗作用。目前已有研究表明，天麻素对大脑及心脏缺血再灌注损伤具有保护作用，但对肝脏缺血再灌注损伤的作用尚未见报道。本发明对天麻素进行了体内药效学研究。实验结果显示，天麻素能降低模型大鼠血清脂质过氧化产物含量，具有较强的抗氧化活性；对炎性因子的释放具有明显抑制作用；具有抑制肝内细胞凋亡活性；能明显升高NO浓度改善肝脏微循环，对肝脏缺血再灌注损伤有明显保护作用。本发明天麻素可以直接单独应用，也可相互组合应用，可以与其他药物包括植物提取物组成复方形式使用，也可以以常规方式使用。具体实施方式下面结合实施例对本发明作进一步的说明，但不以任何方式对本发明加以限制，基于本发明教导所作的任何变换或替换，均属于本发明的保护范围。本发明所述的天麻素的新应用为所述的天麻素在制备预防/治疗肝脏缺血再灌注损伤药物中的应用。所述的天麻素的新应用中的天麻素制剂为所述的天麻素中加入药学上可接受的辅料制成片剂、颗粒剂、胶囊剂、丸剂、混悬剂或注射剂。下面以具体实施例对本发明做进一步说明：实施例1天麻素对大鼠肝脏缺血再灌注损伤的影响：1、试剂及动物天麻素，含量98.8%，批号：JT20161014，昆药集团生产。雄性SD大鼠40只，250-300g，由昆明医科大学实验动物中心提供，生产许可证：SCXK（滇）K2015-0002，发证机关：昆明市科学技术局。实验动物室温度20~25℃（日温差≤3℃），湿度40%~70%，照明12h:12h明暗交替，照度150~300lx，噪声≤60Db；实验动物使用许可证：SYXK（滇）K2014-0001，发证单位：昆明市科学技术局。丙二醛(MDA)测试盒，超氧化物歧化酶(SOD)测试盒，谷草转氨酶(AST)测试盒，谷丙转氨酶(ALT)，谷胱甘肽(GSH)测试盒，超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽（GSH）、丙二醛（MDA）试剂盒购自南京建成生物试剂公司；TUNEL试剂盒：来源：Roche，批号：10348000；抗CleavedCaspase-3抗体，CellSignalingTechnology,批号：19；AlexaFluor568驴抗兔IgG(H+L)，MolecularProbes，批号：1134929；AlexaFluor568羊抗大鼠IgG(H+L)，MolecularProbes，批号：1259374；TritonX-100，Sigma，批号：031M0301V；BCA蛋白定量试剂盒，上海威奥生物科技有限公司，批号：WB0123；白介素1β（IL-1β）：批号DZE30419；白介素6（IL-6）：批号DZE30646；肿瘤坏死因子α（TNF-α）：批号DZE30635；以上试剂均购自上海哈灵生物科技有限公司。2、实验方法2.1动物模型与分组实验动物被随机均分为假手术组、肝I/RI模型组（模型组）和天麻素预处理低剂量和高剂量组（60、120mg/kg）+肝I/RI模型组（天麻素预处理低、高剂量组）。术前12h禁食，自由饮水。用1%的戊巴比妥钠（30mg/kg）溶液腹腔注射麻醉大鼠，取腹正中切口约2cm入腹，游离肝十二指肠韧带，用无损伤动脉夹夹闭门静脉、肝动脉及胆总管30min后再灌注6h制作肝脏缺血再灌注动物模型（赵海峰,孔瑞,孙备,等.正丁酸钠对大鼠肝脏热缺血再灌注损伤保护作用的研究[J].中国普通外科杂志,2008,17(1):91-93.）。假手术组游离肝十二指肠韧带而不阻断，天麻素预处理组术前20min通过尾静脉注射天麻素（60、120mg/kg），模型组给予等量生理盐水。各组大鼠于术后6h后从下腔静脉采血约5mL；切取肝左叶，剩余部分置-80℃冻存，待测肝组织生化指标及caspase-3水平。2.2观察指标与检测方法（1）肝功能测定：大鼠静脉血离心后取血清，用各自试剂盒方法检测谷草转氨酶（AST），谷丙转氨酶(ALT)水平。（2）肝组织生化指标检测：用各自试剂盒方法检测肝组织SOD，GSH及MDA水平。（3）肝组织caspase-3水平检测：将大鼠肝脏置入4%的多聚甲醛溶液中固定12-16h。将固定好的肝脏进行冰冻切片，置于冻存保护液中，-20˚C保存备用，以进行CleavedCaspase-3免疫组织化学染色，TUNEL染色。冰冻切片经0.01MPBS漂洗后，置于0.3%TritonX-10030min，后直接与相应一抗孵育(4˚C过夜)。切片以PBS漂洗3遍，每遍5min，再与相应的荧光二抗室温反应1-2h，后继续以PBS漂洗，并用封片剂进行封片。染色结果经尼康荧光显微镜拍照，并以AdobePhotoshop分析；按试剂盒所附的原位细胞凋亡检测说明书进行。具体而言，冰冻切片先以PBS漂洗，接着与0.1%TritonX-100孵育，然后直接与TUNEL反应液(由标记液和酶反应液组成)进行孵育，37度条件下避光反应60min。染色结果在荧光显微镜下直接观察并拍照。（4）炎性因子检测：大鼠静脉血离心后取血清，严格按照试剂盒说明书操作，测定IL-1ß，IL-6，TNF-α。2.3统计学处理数据以平均值及标准差（±SD）表示。统计分析采用单因素方差分析，组间比较应用studentNewman-Keul’stest进行检验分析。P<0.05认为具有统计学差异。3、结果3.1血清ALT和AST的水平检测结果与假手术组比较，模型组大鼠血清ALT和AST水平明显升高（均P<0.05），而与模型组比较，天麻素预处理组的血清ALT和AST水平明显减低（均P<0.05），见表1。表1各组大鼠血清转氨酶水平比较（±SD）,n=10组别ALT（U/L）AST（U/L）假手术组44.5±4.690.1±9.1模型组85.7±6.1*234.3±16.3*天麻素预处理低剂量组69.3±5.3▲163.1±11.4▲天麻素预处理高剂量组61.2±4.0▲140.5±13.8▲▲注：与假手术组比较，*P＜0.05，**P＜0.01；与模型组比较，▲P＜0.05，▲▲P＜0.01。3.2生化指标检测结果与假手术组比较，模型组肝组织中SOD和GSH水平明显降低（P<0.05），而MDA水平明显升高（P<0.01）。与模型组比较，天麻素预处理组肝组织中SOD和GSH水平显著升高，MDA水平显著降低，（P<0.05或P<0.01），见表2。表2各组大鼠各血清生化指标的比较（±SD）,n=10组别SOD（U/mg蛋白）GSH（mg/mg蛋白）MDA（nmol/mg蛋白）假手术组305.1±16.23.13±0.201.98±0.57模型组204.2±34.5*1.88±0.75*4.67±0.89**天麻素预处理低286.5±15.2▲2.64±0.13▲3.56±0.72▲天麻素预处理高377±12.4▲▲3.76±0.65▲▲2.09±0.47▲▲注：与假手术组比较，*P＜0.05，**P＜0.01；与模型组比较，▲P＜0.05，▲▲P＜0.01。而肝脏缺血再灌注损伤的机制与氧自由基的形成、炎症细胞浸润、肝细胞凋亡等多种因素有关。（KangKJ.Mechanismofhepaticischemia/reperfusioninjuryandprotectionagainstreperfusioninjuryl[J].TransplantProc,2002,4(7):2659-2661.）本研究结果显示，肝脏缺血30min，再灌注6h的大鼠缺血再灌注模型中，给予天麻素能明显降低血清ALT和AST水平（P<0.05），减轻肝脏病理损伤。这些结果提示天麻素预处理对肝脏I/RI具有保护作用。有研究也证实在肝脏I/RI动物模型中过表达SOD或给予GSH，（HeSQ,ZhangYH,VenugopalSK,etal.Deliveryofantioxidativeenzymegenesprotectsagainstischemia/reperfusion-inducedliverinjuryinmice[J].LiverTranspl,2006,12(12):1869-1879.；SchauerRJ,GerbesAL,VonierD,etal.Glutathioneprotectstheratliveragainstreperfusioninjuryafterprolongedwarmischemia[J].AnnSurg,2004,239(2):220-231.）或给予自由基清除剂，如依达拉奉可以减轻肝脏I/RI。（石臣磊,秦华东,石铁锋.依达拉奉对大鼠肝I/RI损伤的保护作用[J].中国普通外科杂志,2010,19(1):28-31.）本实验结果显示，给予天麻素后，缺血再灌注的肝组织中SOD和GSH水平明显升高；同时作为氧化应激产物的MDA水平也明显降低，表明天麻素可以提高缺血再灌注肝脏组织的抗氧化能力。3.3对细胞凋亡的影响在本研究中，我们检测了凋亡细胞(TUNE法)以及与凋亡相关的信号分子(如Caspase-3)。如表3所示，肝脏缺血30min，再灌注6h的大鼠缺血再灌注模型中，脑内TUNEL法染色标记的凋亡细胞以及CleavedCaspase-3免疫阳性(CleavedCaspase-3-ir)细胞均出现增多（与假手术组比较，P<0.01），给予天麻素后则可以明显减少脑内TUNEL法染色标记的凋亡细胞以及CleavedCaspase-3免疫阳性(CleavedCaspase-3-ir)细胞（与模型组比较，P<0.05或P<0.01）。表3天麻素对细胞凋亡的影响（±SD），n=10注：与假手术组比较，*P＜0.05，**P＜0.01；与模型组比较，▲P＜0.05，▲▲P＜0.01。在肝脏I/RI中肝细胞凋亡是肝脏损伤的一个重要原因，而在细胞凋亡的过程中caspase-3的激活是最重要的环节，其中caspase-3是最重要的凋亡执行者。caspase-3的激活可直接或间接作用于凋亡执行过程中关键蛋白的酶切（PorterAG,JänickeRU.Emergingrolesofcaspase-3inapoptosis[J].CellDeathDiffer,1999,6(2):99-104.）。本实验表明，在肝脏I/RI的动物模型中，天麻素可以明显抑制大鼠肝内TUNEL法染色标记的凋亡细胞以及CleavedCaspase-3免疫阳性(CleavedCaspase-3-ir)细胞，可减轻肝脏I/RI，提示天麻素可以抑制缺血再灌注后肝细胞的凋亡。3.4对炎性因子的影响再灌注6h后，与假手术组比较，模型组血清TNF-α、IL-1β和NO水平均明显升高（P<0.05或P<0.01），而NO水平明显升高（P<0.05）；与模型组比较，天麻素预处理组TNF-α和IL-1β水平显著降低，而NO水平显著升高（P<0.05或P<0.01），见表4。表4对炎性因子的影响（±SD，n=10）注：与假手术组比较，*P＜0.05，**P＜0.01；与模型组比较，▲P＜0.05，▲▲P＜0.01。本实验观察到，再灌注后：天麻素预处理组的血清ALT和AST水平明显低于模型组；SOD和GSH水平显著高于模型组，血清MDA水平明显较模型组降低。还发现肝脏再灌注后血清TNF-α和IL-1炎性因子水平升高，而天麻素预处理组血清TNF-α和IL-1的释放受到抑制，再灌注损伤的指标也相应下降,通过减少TNF-α和IL-1释放来减轻肝脏再灌注损伤。Bajt等[3]发现枯否细胞分泌的TNF-α可与肝细胞膜上的TNFR1结合形成TNFR-TRADD-FADD复合物并上调Caspase-3基因表达,激活Caspase家族的级联反应,启动细胞凋亡,我们进一步用TUNEL法检测再灌注后肝脏细胞凋亡的情况,结果发现天麻素预处理组的细胞凋亡受到显著抑制,表明天麻素可以抑制肝脏细胞凋亡,而这一作用可能通过抑制枯否细胞激活、减少TNF-α的释放实现。有报道认为肝脏再灌注后早期的微循环紊乱主要与NO的生产有关，NO的浓度失衡是肝脏缺血再灌注后微循环障碍的一个重要原因。我们也观察了肝脏再灌注后NO水平变化,发现再灌注后血中的NO水平显著升高，天麻素预处理组NO水平升高幅度较模型组大,说明天麻素可以通过调整NO浓度比例,改善再灌注后肝脏的微循环，从而发挥保护作用。综上，天麻素能减轻大鼠肝脏缺血再灌注损伤，可能的作用机制包括减少氧自由基的产生、抑制炎性细胞因子释放、减少肝脏细胞凋亡和改善再灌注后微循环等。以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本
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的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。当前第1页1 2 3