一种复方丹参有效成分组合物及其制备方法和应用与流程

本发明属于中药制备技术领域。具体涉及一种复方丹参有效成分组合物及其制备方法和应用。

二、

背景技术：

早老性痴呆(Alzheimer’s Disease，AD)是伴随老龄化社会出现的高发病，是一种常见的神经系统退行性疾病，主要以神经元纤维缠结(NFT)、β-淀粉样斑块的积累、神经元损失和炎症为病理标记，以记忆力减退、认知障碍等神经功能障碍为主要表现。目前，我国的老年痴呆患者有600万左右，而且患病率逐年增加，已成为仅次于心脏病、癌症和脑卒中的第四位导致患者死亡的疾病。2050年，估计全球老年痴呆患者将超过一亿。AD患者的生活不能完全自理，伴有精神和行为障碍，需要长期监护，无疑给全球医疗、经济、社会尤其是患者家属带来巨大的负担。目前，美国每年用于老年痴呆患者的治疗费用已经达到57000美元/人。现在，获准用于治疗AD的药物全球市场销售额也在逐年增加，这潜在的市场对企业也存在巨大的吸引力。

近年来，AD药物研究进展非常迅速，主要涉及改善认知功能的药物和防止或延缓病程的药物两大类，前者包括胆碱能激动剂、促智药、钙拮抗剂、神经生长因子等，后者主要有抗炎药、抗氧化剂、抗β淀粉样蛋白(amyloid-β，Aβ)聚集药物等。而用于临床的AD药物主要包括胆碱脂酶抑制剂(如石杉碱甲、多奈哌齐等)和NMDA(N-甲基-D-天冬氨酸)受体拮抗剂(如盐酸美金刚等)；减少氧化应激和胞内钙超载的药物如维生素E、司来吉兰以及艾地苯醌，在临床上均有一定效果；干扰Aβ形成和沉积的药物，如β-环糊精、利福霉素、层粘连蛋白、蒽环类抗生素、褪黑激素等均可抑制Aβ的纤维形成；Aβ免疫疗法可望成为AD的一种新的治疗方法。

目前市场上虽然有多种药物，但治疗效果却不明显，因此寻找能修复大脑学习和记忆功能的药物，对于改善AD患者的病情具有十分重要的临床意义。已有研究表明，复方丹参在对AD的治疗中表现出巨大潜力，作为改善冠状动脉和脑部循环的经典中药处方，复方丹参能够提高心脑血管功能、保护神经系统、改善机体微循环，且对脑局部慢性缺血具有代偿性的修复功能。

中国药典2005年版记载，复方丹参片由丹参450g、三七141g和冰片8g组成。其功效为活血化瘀，理气止痛。用于气滞血瘀所致的胸痹，症见胸闷、心前区刺痛；临床用于胸中憋闷、冠心病、心绞痛等。

阐明复方配伍的化学物质成分以及多靶点效应机制，是解决中药与国际医药发展趋势接轨问题的必经之路。现代研究中药方剂配伍组方的方法，主要是在组分层次上研究中药有效组分的配伍组方，能够实现药物配伍组方的定量分析，有助于明确中药有效组分的作用靶点，探讨中药方剂的可能作用机制，为中药现代化研究奠定基础，为中药拓展国际市场提供依据。

目前，海外中药市场上，中国拥有专利权的中药仅为0.3％；全球中药市场销售额一年约800亿美元，中国仅占10％。日本汉药企业借组中医药占领了国际中成药市场的80％，赚取高额利润。将西药的标准用于对中药的研究开发，将药效和化学成分予以标准化呈现，这令全球各国更易接受日本生产的中成药，即“汉药”，这也是日本“汉药”走向世界的根本。

因此，继承和发展传统中药，并与现代医药技术相结合，是中药步入国际市场的关键所在。

三、

技术实现要素：

本发明需要解决的问题是：提供一种复方丹参有效成分组合物及其制备方法和应用。

本发明的技术方案：

1.复方丹参有效成分组合物的组成

本发明所述复方丹参有效成分组合物由丹参酮IIA(Tanshinone IIA，Tan IIA，C₁₉H₁₈O₃)、三七皂苷R1(Notoginsenoside R1，NG-R1，C₄₇H₈₀O₁₈)和龙脑(borneol，C₁₀H₁₈O)，三者按照不同的比例给出范围进行组合，产生复方丹参有效成分组合物。

丹参的主要有效成分为丹参酮IIA(Tanshinone IIA，C₁₉H₁₈O₃)，具有改善冠状动脉血循环、血管内皮细胞修复、抗动脉粥样硬化(AS)形成、抗心肌肥厚等作用；主要用于冠心病、心绞痛、心肌梗死的医治，也可用于室性早搏。三七的主要有效成分为三七皂苷R1(Notoginsenoside R1，C₄₇H₈₀O₁₈)，具有散瘀止血、消肿定痛的功能。冰片的主要有效成分为龙脑(borneol，C₁₀H₁₈O)，具有发 汗、兴奋、镇痉、驱虫和腐蚀等功效。

本发明所述复方丹参有效成分组合物由2mg-4mg丹参酮IIA，10mg-20mg三七皂苷R1，10mg-20mg龙脑混和均匀组成，混和溶液中各有效组分的终浓度分别为丹参酮IIA 0.2-0.4mg/ml，三七皂苷R1 1.0-2.0mg/ml，龙脑1.0-2.0mg/ml。

2.本发明所述复方丹参有效成分组合物的制备方法：

分别称取丹参酮IIA(2mg-4mg)、三七皂苷R1(10mg-20mg)和龙脑(10mg-20mg)，混合均匀，加入200μl 95％乙醇置于超声(功率250W，频率33kHz)处理30min促进药物溶解，然后加入2％Tween-20的生理盐水至10ml，置于超声(功率250W，频率33kHz)处理30min，配制成丹参酮IIA、三七皂苷R1和龙脑的混和溶液，混和溶液中各有效组分的终浓度分别为丹参酮IIA0.2-0.4mg/ml，三七皂苷R1 1.0-2.0mg/ml，龙脑1.0-2.0mg/ml。

本发明的有益效果是：

本发明基于临床使用的中药复方进行改造，将其有效成分进行合理组合，产生全新的组合药物，即复方丹参有效成分组合物。该组合物既保留了复方丹参的有效成分，又明确了药物的组成，确保质量的可控性。由于复方丹参片、复方丹参滴丸等为临床使用药物，因此，该组合物又具有可靠的安全性。该组合物具备了创新药物所具有的特征，可制备成治疗老年性痴呆、冠心病、心绞痛、心肌梗死的药物，也可以制备成治疗月经不调、经闭痛经、关节疼痛、疮疡肿痛的药物，还可在制备治疗镇静催眠、慢性肝炎、慢性胆囊炎药物或辅助药物中应用。本发明将中药与现代科学技术相结合，将西药的标准用于中药的研究开发，将药效和化学成分予以标准化呈现，并研究开发出安全、稳定、质量可控的现代中药。该组合物具备了药品的安全性、有效性和质量可控性三大要素。这有利于解决中药与国际医药发展趋势接轨问题，有助于实现中药的现代化和国际化。继承和发展传统中药，并与现代医药技术相结合，是中药步入国际市场的关键所在。

四附图说明

图1、模型小鼠的水迷宫训练期测试结果。在时长为60s的训练期中，实验小鼠的逃离潜伏期(秒)，模型组小鼠到达平台所用时间显著增加，经石杉碱甲和复方丹参组合物处理后，相比于模型组小鼠，到达平台所用时间显著下降。数据以均值±SD显示，**p<0.01， compared with control；#p<0.05，##p<0.01，compared with model。

图2模型小鼠在水迷宫空间搜索实验中的检测结果。A:目标平台撤走后，小鼠穿越目标平台位置的次数，模型组小鼠穿越次数明显减少，经石杉碱甲或复方丹参组合物处理后，小鼠穿越平台的次数有所增加；B:小鼠在目标象限所用时间占总测试时间的比例，模型小鼠在目标象限停留时间占比显著减少，而经石杉碱甲或复方丹参组合物处理后，目标象限停留时间占比显著升高。数据以均值±SD显示，*p<0.05。

图3、实验小鼠血清中INF-γ和IL4的ELISA检测结果。A:相比于正常组，模型组小鼠血清中的INF-γ水平显著升高，经石杉碱甲或复方丹参组合物处理后，小鼠血清中的INF-γ水平显著下降；B:各组小鼠血清中IL4含量均没有显著的变化。数据以均值±SD显示，*p<0.05，**p<0.01，ns p>0.05。

图4、复方丹参组合物对D-gal和AlCl₃引起的AD小鼠神经细胞的影响。A:经D-gal和AlCl₃诱导后，小鼠脑部皮层区的神经细胞着色浅、边缘模糊、形态萎缩，接受石杉碱甲或复方丹参组合物处理后，这一情况得到明显改善；B:模型小鼠海马CA1区的椎体细胞边缘模糊、结构松散，经石杉碱甲或复方丹参组合物处理后，细胞的边缘清晰、排列紧密。

图5、MIF诱导SH-SY5Y细胞的MTT检测结果。为了观察MIF对SH-SY5Y细胞的作用，加入梯度剂量的MIF诱导36h，呈剂量依赖性使细胞活力下降。数据以均值±SD显示，***p<0.001，compared with control。

图6、复方丹参组合物及其组分孵育SH-SY5Y的MTT检测结果。为了观察复方丹参组合物及其组分对细胞活力是否有影响，分别以梯度剂量的丹参酮IIA(Tan IIA)、三七皂苷R1(NG-R1)、龙脑(Borneol)以及复方丹参有效组分复合物(Danshen Compound)诱导36h，A-D：分别为Tan IIA，NG-R1，Borneol及Danshen Compound孵育SH-SY5Y细胞的MTT检测结果，显示细胞的活力均没有显著的影响。数据以均值±SD显示。

图7、复方丹参有效组分及其组合物对MIF诱导SH-SY5Y细胞损伤的MTT检测。预先分别使用4μg/ml Tan IIA、20μg/ml NG-R1、20μg/ml Borneol以及Danshen Compound孵育SH-SY5Y细胞1h，然后加入50ng/ml的MIF进行诱导，Tan IIA以及Danshen Compound能够显著地减缓MIF抑制细胞活力的效果。数据以均值±SD显示，*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001。

图8、MIF诱导SH-SY5Y细胞凋亡的流式细胞术检测结果。50ng/ml MIF诱导SH-SY5Y细胞24h，细胞向右偏移，细胞膜通透性增加，Annexin V进入胞质，意味着细胞处于前期凋亡期，呈现出与4μM Aβ_1-42相似的促细胞凋亡作用；MIF与Aβ共孵育，向右偏移更加严重，表现出更强的促细胞凋亡作用

图9复方丹参组合物及其组分与MIF共同孵育SH-SY5Y细胞的凋亡实验结果。分别加入4μg/ml丹参酮IIA(Tan IIA)、20μg/ml三七皂苷R1(NG-R1)、20μg/ml龙脑(Borneol)以及复方丹参有效组分复合物(Danshen Compound)预孵育SH-SY5Y细胞1h，然后加入50ng/ml MIF诱导24h，丹参酮IIA、三七皂苷R1以及组合物可显著的减缓MIF促进细胞向右偏移，抑制MIF的促凋亡作用。

图10、MIF诱导SH-SY5Y细胞Bad的蛋白量上调。加入梯度剂量的MIF 诱导SH-SY5Y细胞6h，MIF呈现出剂量依赖性促进Bad含量的上调。数据以均值±SD显示，**p<0.01，***p<0.001，compared with control。

图11、复方丹参组合物及其组分抑制MIF诱导SH-SY5Y的Bad上调作用。分别加入4μg/ml丹参酮IIA(Tan IIA)、20μg/ml三七皂苷R1(NG-R1)、20μg/ml龙脑(Borneol)以及复方丹参有效组分复合物(Danshen Compound)预培养SH-SY5Y细胞30min，然后加入50ng/ml MIF诱导细胞6h，Tan IIA、NG-R1以及Danshen Compound呈现出显著抑制MIF促进Bad水平上调的作用。数据以均值±SD显示，*p<0.05，***p<0.001。

五、具体实施方式

1.药理实验

(1)复方丹参有效成分组合物对AlCl₃和D-半乳糖诱导的AD小鼠的空间学习及记忆能力研究

所有研究均获得实验动物伦理委员会许可，并遵循实验动物伦理学指南相关要求。使用AlCl₃和D-半乳糖腹腔注射10mg/kg AlCl₃和60mg/kg D-半乳糖，持续90天，构建Alzheimer小鼠模型。

在此基础上，分别对模型组、石杉碱甲阳性药物组、复方丹参有效成分组合物给药组的实验小鼠，灌胃给药持续两周。

32只三周龄的雄性BALB/c小鼠(购于南京大学模式动物研究所)，体重16±2g，随机分成4组，分别标记为A、B、C和D四组，每组8只。A为正常组，腹腔注射生理盐水，B-D为AlCl₃和D-半乳糖干预组，腹腔注射10mg/kg AlCl₃和60mg/kg D-半乳糖，持续90天。造模结束后，A、B组灌胃注射生理盐水，C组灌胃给药0.05mg/kg石杉碱甲(Hupeizine A)，D组灌胃给药复方丹参有效成分组合物，每只小鼠每天给药一次，每次0.2ml，实际给药量为4mg/kg丹参酮IIA、20mg/kg三七皂苷R1和20mg/kg龙脑。造模和治疗期间，正常供给水和食物，定期称量体重；给药结束后，进行行为学以及生化指标的检测。

小鼠给药结束后，通过水迷宫实验进行行为学检测，观察小鼠的学习、记忆和信息整理情况。测试开始前5天，每天通过4次训练和引导，帮助实验鼠记忆水池中平台的位置，并记录他们的行经和到达平台所需的时间；第6天测试学习和记忆能力，移除平台，观察和记录模型鼠在目标想象的停留时间和经过次数，以及记录原平台位置的穿越次数。通过分析穿越平台数、目标象限停留时间和路程，判断模型鼠的学习和记忆能力是否受损。

(2)复方丹参有效成分组合物对AlCl₃和D-半乳糖诱导的AD小鼠血清中IL-4和IFN-γ含量的影响

使用乙醚麻醉小鼠，采用小鼠摘眼球方法取血，取血前先将小鼠胡须剪去以免溶血发生。血液室温静置2h，然后在12000rpm，4℃条件下离心15min，取离心后得到的上层血清进行ELISA检测。

实验采用双抗体夹心ELISA，使用ELISA检测盒(Mouse IL-4ELISA Kit 96T，Mouse IFN-gamma ELISA Kit，联科生物技术有限公司)，分别检测血清中IL4和INF-γ的含量并进行统计分析。用待测因子的高特异性单克隆抗体，提前包被在高亲和力的酶标版上，加入适度稀释的样本和标准品，其中的因子会与其单抗结合，洗去游离成分；加入生物素化的抗小鼠单克隆抗体，其余结合在单抗上的因子形成免疫复合物，洗去未结合的成分；加入辣根过氧化物酶标记的亲和素，生物素与亲和素特异性结合，洗去未游离的酶结合物；然后加入显色液，若反应孔中有待测因子，辣根过氧化酶会致无色的显色液呈蓝色；加终止液后变黄。在Safire酶标仪上检测在波长450nm下的OD值(OD ₄₅₀)。待测因子浓度与OD值呈正比。通过绘制标准曲线，计算出样本中待测因子浓度。

(3)复方丹参有效成分组合物对AlCl₃和D-半乳糖诱导的AD小鼠大脑皮层和海马区的中枢神经细胞形态的影响

小鼠断颈处死后，采用尼氏染色法观察小鼠大脑皮层和海马区的中枢神经细胞的形态，了解小鼠脑部的健康状况。小鼠处死后灌注4％多聚甲醛并取整脑浸泡24h固定。将脑组织用石蜡包埋，用冰冻切片机冠状切片，片厚4-6μm。二甲苯脱蜡，分别用无水乙醇、90％乙醇和70％乙醇浸泡。清洗后置于尼氏体染色液中浸泡5min，接着分别浸泡于95％乙醇和70％乙醇，脱水晾干，中性树胶封片。在普通光学显微镜下拍照并观察神经细胞的形态变化。

(4)复方丹参有效成分及其组合物对MIF诱导的人神经瘤母细胞SH-SY5Y损伤的保护作用

通过外源加入MIF诱导人神经瘤母细胞SH-SY5Y，使用MTT细胞活力检测方法、流式细胞技术及Western blot技术检测MIF对神经细胞凋亡作用及其机制。同时，加入复方丹参有效成分及其组合物，检测其是否具有保护作用。

人神经瘤母细胞SH-SY5Y获赠于张辰宇实验室(南京大学生命科学学院)。 细胞培养液使用DMEM/F12细胞培养液、胎牛血清、双抗(青霉素、链霉素)按89:10:1的比例配制而成。细胞在37℃、含5％CO₂的培养箱中培养至汇合度80％时，用胰酶消化细胞1min，加入细胞培养液终止消化，在1000rpm条件下离心5min，弃上清。

加入细胞培养液重悬细胞并混匀，分至6孔(Western blot实验)或96孔细胞板(MTT实验和细胞凋亡实验)中，待细胞贴壁后，弃掉细胞培养液。分别加入1ml(6孔板)或100μl(96孔板)预先配制的、工作浓度为4μg/ml丹参酮IIA、20μg/ml三七皂苷R1、20μg/ml龙脑以及复方丹参有效成分组合物溶液(含4μg/ml丹参酮IIA、20μg/ml三七皂苷R1、20μg/ml龙脑)，处理1h(MTT实验和细胞凋亡实验)或30min(Western blot实验)，然后每孔加入5μl(6孔板)或0.5μl(96孔板)10μg/ml MIF(实际工作浓度为50ng/ml)诱导6h(Western blot实验)、24h(细胞凋亡实验)以及36h(MTT实验)。接下来，进一步进行MTT检测、细胞凋亡检测和Western blot检测。

(A)MTT检测

采用MTT方法，使用Safire酶标仪测定光吸收值OD ₅₇₀值，间接反映活细胞的数量。

在上述细胞培养液中，再加入10μl浓度为5mg/ml的MTT溶液(用无菌PBS配制，135mM NaCl，2.7mM KCl，1.5mM KH₂PO₄，8mM K₂HPO₄，pH 7.4)，继续培养4h。终止培养，小心吸弃孔内培养上清液。每孔加入150μl DMSO低速震荡混匀10min，使结晶充分溶解。选择570nm波长，在Safire酶标仪上检测各孔光吸收值OD ₅₇₀，记录结果，以时间为横坐标，吸光值为纵坐标绘制细胞生长曲线。

(B)细胞凋亡检测

采用Annexin V/PI双染色法，使用BD Accuri C6流式细胞仪检测细胞凋亡。Annexin V是一种Ca²⁺依赖性的磷脂结合蛋白，与磷脂酰丝氨酸(PS)有高度亲和力，通过与凋亡早期细胞的外侧暴露的PS结合。对Annexin V进行荧光素(FITC)标记，利用流式细胞仪可检测细胞早期凋亡的发生。碘化丙啶(Propidium Iodide,PI)是一种核酸染料，不能透过完整的细胞膜，却可透过凋亡中晚期的细胞和死细胞，而将细胞核染色。将Annexin V与PI合用，可区分处于不同凋亡 时期的细胞。

在上述细胞培养液中，用无EDTA胰酶消化贴壁细胞1min，加入培养液终止消化，轻轻吹打至细胞脱落。在300g，4℃条件下离心5min，弃上清，收集细胞。然后用预冷的PBS(135mM NaCl，2.7mM KCl，1.5mM KH₂PO₄，8mM K₂HPO₄，pH 7.4)洗涤细胞两次，每次在300g，4℃条件下离心5min，收集细胞。根据AnnexinV-FITC/PI细胞凋亡试剂盒(Vazyme Biotech Co.,Ltd)的操作步骤，加入100μl Binding buffer重悬细胞，然后加入5μl AnnexinV-FITC和5μl PI Staining Solution，轻轻混匀；避光，室温反应10min。补加400μl Binding buffer混匀，样品在1小时内用BD Accuri C6流式细胞仪检测。

激发波长为488nm，Annexin V-FITC在FL1通道检测，PI在FL3通道检测。运用BD Accuri C6流式细胞仪自带的CFlow软件进行分析，绘制单色散点图，FL1为横坐标，FL3为纵坐标。

(C)Western Blot检测

在上述细胞培养液中，将培养液吸出，用预冷的PBS(135mM NaCl，2.7mM KCl，1.5mM KH₂PO₄，8mM K₂HPO₄，pH 7.4)洗一遍，每孔加入500μl胰酶消化1min，加入培液终止消化，将细胞收集到1.5ml EP管中，1000rpm离心5min；弃上清，再加入1ml预冷的PBS重悬，同条件离心5min；弃上清，加入80-100μl含蛋白酶抑制剂的细胞裂解液混匀，置于冰上裂解30min，离心取蛋白上清。

通过BCA法进行蛋白定量，选择562nm波长，在Safire酶标仪上检测各孔光吸收值OD₅₆₂，将数据制作成标准曲线，计算出每个样品的总蛋白量。

全蛋白经过SDS-PAGE电泳分离后，采用半干法转至PVDF膜。之后，将PVDF膜置于1×TBS缓冲液中洗5min，加入含5％脱脂奶粉的1×TBS室温封闭1h。裁剪含目标蛋白和内参蛋白的PVDF膜，用1×TBST缓冲液漂洗5×3min。将一抗用含5％BSA的1×TBST稀释，孵育一抗，4℃缓慢摇动过夜，用1×TBST洗膜5×3min。用含5％BSA的1×TBST稀释二抗，加入二抗，室温孵育1h，用1×TBST洗膜5×3min。使用ECL显影液，在Tanon5200全自动化学发光成像分析系统显示蛋白条带；用Image J v4.7软件分析并获得蛋白灰度值。

(5)数据统计分析

利用GraphPad Prism 5.0软件进行统计分析。实验数据用均值±标准差(SD) 表示。水迷宫的组间逃离潜伏期数据使用two-way ANOVA分析，其他数据多组间差异使用one-way ANOVA分析，两两间差异使用T检验。结果p值小于0.05表示比较差异具有统计学意义。

(6)实验结果

(A)复方丹参有效成分组合物对D-gal和AlCl₃诱致小鼠学习记忆障碍的改善作用

水迷宫实验结果如图1和2所示。研究结果表明，模型组小鼠的逃避潜伏期并没有明显的趋势变化，说明学习和记忆能力受到损害；经过石杉碱甲和复方丹参有效成分组合物治疗后，小鼠找到目标平台的所使用的时间均比模型组短，表明复方丹参有效成分组合物可以修复小鼠受损的空间学习能力(p<0.01)(图1)。

实验小鼠经过5天的学习记忆训练后，进行空间摸索实验。撤出目标平台后，图2A显示AD鼠穿越目标平台的次数比正常组显著减少，接受石杉碱甲和复方丹参有效成分组合物治疗后，穿越平台位置的次数较模型组增多。图2B显示石杉碱甲和复方丹参有效成分组合物组较AD组，在目标象限的时间显著增长，说明复方丹参有效成分组合物可修复小鼠因长期摄入AlCl₃及D-Gal而受损的学习及记忆能力(p<0.01)。

(B)复方丹参有效成分组合物对D-gal和AlCl₃诱导小鼠INF-γ相关炎症的缓解作用

炎症反应伴随着AD的发生和发展。ELISA检测结果显示，AD模型小鼠血浆里的INF-γ水平显著升高(图3A)，而IL4含量无明显变化(图3B)，说明AlCl₃及D-Gal的慢性诱导会引起小鼠体内INF-γ相关的炎症反应，而对IL4相关的炎症作用并无显著影响。石杉碱甲和复方丹参有效成分组合物能够显著降低AD小鼠血清中IFN-γ的含量(p<0.05)(图3A)。这说明复方丹参组合物可缓解AD小鼠体内与INF-γ相关的炎症反应。

(C)复方丹参有效成分组合物对D-gal和AlCl₃致小鼠神经损伤的修复作用

神经元丢失是AD发生和发展的病因之一，通过观察尼氏体可以了解模型动物脑部的神经元形态。

尼氏染色结果显示，正常小鼠大脑皮层的尼氏体着色深、神经元形态清晰，表示神经细胞的蛋白质合成作用旺盛；模型组的尼氏体着色浅、形态萎缩。石杉 碱甲和复方丹参有效成分组合物组的AD小鼠大脑皮层的尼氏体着色深，神经元形态清晰、分布均匀，神经细胞数量较模型组显著增多，形态更充盈(图4A)；而且，AD小鼠脑部海马CA1区的神经元结构比模型组更紧凑，边缘更清晰，染色较深，细胞的形态得到明显的改善(图4B)。

(D)复方丹参有效组分及其组合物对MIF诱导SH-SY5Y细胞损伤的影响

(a)复方丹参有效组分及其组合物对MIF诱导SH-SY5Y细胞损伤的作用

首先，使用不同浓度的MIF处理SH-SY5Y细胞，孵育36h。之后，采用MTT方法检测MIF对SH-SY5Y细胞生长的影响。图5显示，MIF显著地呈剂量依赖性抑制SH-SY5Y细胞的生长。而且，MIF浓度为50ng/ml时，能够显著抑制SH-SY5Y细胞的生长。

其次，使用不同浓度的复方丹参有效组分及其组合物，处理SH-SY5Y细胞，孵育36h之后，采用MTT方法，检测复方丹参有效组分及其组合物对SH-SY5Y细胞生长的影响。图6显示，在一定浓度范围内，复方丹参有效组分及其组合物对细胞几乎没有毒性。而且，丹参酮IIA、三七皂苷R1和龙脑的浓度分别为4μg/ml、20μg/ml和20μg/ml时可能有效较小。

最后，进一步使用终浓度为4μg/ml丹参酮IIA、20μg/ml三七皂苷R1、20μg/ml龙脑以及复方丹参有效组分复合物(含4μg/ml丹参酮IIA、20μg/ml三七皂苷R1和20μg/ml龙脑)，分别孵育SH-SY5Y细胞1h，再加入50ng/ml MIF诱导细胞36h，MTT检测复方丹参有效组分及其组合物对MIF诱导SH-SY5Y细胞损伤的作用。结果如图7所示，丹参酮IIA与组合物组对MIF诱导SH-SY5Y细胞损伤具有显著的保护作用。

(b)复方丹参有效组分及其组合物对MIF诱导SH-SY5Y细胞凋亡的影响

MIF是一种炎症介导因子，有研究显示，AD患者的脑部MIF含量比正常人高。为了研究MIF对神经元的影响，采用流式细胞技术检测MIF对细胞的凋亡作用。寡聚化的Aβ_1-42对神经细胞有显著的毒性作用，可作为神经细胞凋亡实验的阳性指标。图8显示，分别用4μM寡聚化的Aβ_1-42和50ng/ml MIF孵育以及共孵育细胞24h，采用Annexin V-FITC/PI双染方法进行检测，发现Aβ_1-42和MIF能够分别促进SH-SY5Y细胞发生早期凋亡，共孵育可诱导细胞发生大部分早期凋亡以及少部分晚期凋亡。可见，终浓度为50ng/ml的MIF能够诱导SH-SY5Y 细胞凋亡。

类似地，采用Annexin V-FITC/PI双染方法检测复方丹参有效组分及其组合物对MIF诱导SH-SY5Y细胞凋亡的作用。分别加入终浓度为4μg/ml丹参酮IIA、20μg/ml三七皂苷R1、20μg/ml龙脑以及复方丹参有效成分组合物(含4μg/ml丹参酮IIA、20μg/ml三七皂苷R1和20μg/ml龙脑)，孵育SH-SY5Y细胞1h，然后加入50ng/ml MIF诱导刺激细胞24h。图9显示，丹参酮IIA、三七皂苷R1以及组合物可以改善MIF对细胞的损伤作用，能够有效地保护细胞。以及组合物可显著的减缓MIF促进细胞向右偏移，抑制MIF的促凋亡作用。

(c)复方丹参有效组分及其组合物抑制SH-SY5Y细胞凋亡的分子机制

首先，采用Western Blot方法，检测MIF诱导SH-SY5Y细胞中Bad的表达。使用浓度梯度的MIF孵育SH-SY5Y细胞，6h后收样，通过Western Blot检测细胞的Bad蛋白量。图10显示，MIF呈剂量浓度依赖性促进细胞Bad蛋白量上调。而且，MIF浓度为50ng/ml时，能够显著地诱导SH-SY5Y细胞中Bad表达上升。

其次，采用Western Blot方法，检测复方丹参有效成分及其组合物对MIF诱导SH-SY5Y细胞Bad表达上调的作用。分别加入终浓度为4μg/ml丹参酮IIA、20μg/ml三七皂苷R1、20μg/ml龙脑以及复方丹参有效成分组合物(含4μg/ml丹参酮IIA、20μg/ml三七皂苷R1和20μg/ml龙脑)，预培养SH-SY5Y细胞30min，再加入终浓度为50ng/ml的MIF诱导6h。如图11所示，丹参酮IIA、三七皂苷R1和组合物均能够显著地抑制MIF致SH-SY5Y细胞中Bad表达量的上升。

复方丹参组合物治疗，可显著缓解AlCl₃和D-gal诱致小鼠的神经毒性作用、降低炎症反应、修复小鼠智力。而且，复方丹参组合物能够使MIF诱导人神经瘤母细胞SH-SY5Y的Bad表达量下降，干预MIF诱导的细胞凋亡。结果显示，复方丹参组合物具有一定的神经保护作用。

2动物实验(体内实验)

所有研究均获得实验动物伦理委员会许可，并遵循实验动物伦理学指南相关要求。

BALB/c纯系小鼠(购自南京大学模式动物中心)，清洁级，体重16±2g，雄性。适应性喂养。

32只三周龄的雄性balb/c小鼠(购于南京大学模式动物研究所)，体重16±2g， 随机分成4组，分别标记为A、B、C和D四组，每组8只。

A组为正常组，腹腔注射生理盐水，持续90天；B、C和D三组为AlCl₃和D-半乳糖(D-Galactose，D-Gal)干预组(AD小鼠模型组)，持续90天。

BALB/c小鼠(A组，正常组)

BALB/c纯系小鼠(购自南京大学模式动物中心)，清洁级，体重16±2g，雄性。腹腔注射生理盐水，持续90天。

AlCl₃和D-半乳糖致Alzheimer’s disease小鼠模型的构建(AD小鼠模型组)

分别称取10mg AlCl₃和60mg D-Gal，共溶于10ml生理盐水中，配制成AlCl₃和D-半乳糖混和溶液(含1mg/ml AlCl₃和6mg/ml D-gal)。

实验前一天，剔去小鼠腹部的毛。次日，腹腔注射已经配制的AlCl₃和D-半乳糖混和溶液。每只小鼠每次腹腔注射0.2ml，实际上，小鼠体内的终浓度为10mg/kg AlCl₃和60mg/kg D-Gal。持续90天。

造模结束后，A组灌胃注射生理盐水0.2ml(即正常组)，B组灌胃注射生理盐水0.2ml(即AD模型组)，C组灌胃给药0.2ml石杉碱甲(即阳性药组)，D组灌胃给药0.2ml复方丹参有效成分组合物(即实验用药组)，持续两周。

石杉碱甲(Hupeizine A)阳性药物实验(阳性药物组)

精密称取5mg石杉碱甲，加入1ml 95％乙醇置于超声(功率250W，频率33kHz)处理30min促进药物溶解。然后加入2％Tween-20的生理盐水至10ml，置于超声(功率250W，频率33kHz)处理30min，制成100×的石杉碱甲溶液0.5mg/ml，使用时用含2％Tween-20的生理盐水稀释至0.005mg/ml。

取AD小鼠8只，每只小鼠每天灌胃给药一次，每次0.2ml，实际给药浓度为10mg/kg。持续两周。

复方丹参有效成分组合物的制备与给药(简称组合物给药组)

根据中国药典2015年版第一部规定，每片复方丹参片规格要求如下：丹参以丹参酮IIA计，含量不得少于0.6mg；三七以人参皂苷Rg1、人参皂苷Rb1、三七皂苷R1以及人参皂苷Re总量计不得少于6.0mg；冰片无规定标准。每天推 荐服用9片，按人体重60kg计算，小鼠的药物摄入量应为：丹参酮IIA＝0.6mg/60kg×9×12.33＝1.1097mg/kg；三七皂苷R1＝6mg/kg×9×12.33＝11.097mg/kg。

同时，参考文献数据，进而确定复方丹参有效成分组合物的最终给药浓度为4mg/kg丹参酮IIA、20mg/kg三七皂苷R1和20mg/kg龙脑。

实际上，分别称取4mg丹参酮IIA、20mg三七皂苷R1和20mg龙脑，混合，加入200μl 95％乙醇置于超声(功率250W，频率33kHz)处理30min，促进药物溶解，然后加入2％Tween-20的生理盐水至10ml，置于超声(功率250W，频率33kHz)处理30min，配制成丹参酮IIA、三七皂苷R1和龙脑的混和溶液，混和溶液中各有效组分的终浓度分别为丹参酮IIA0.4mg/ml，三七皂苷R1 2.0mg/ml，龙脑2.0mg/ml。

取AD小鼠8只，每只每次灌胃给药0.2ml药液，每日给药一次。实际给药剂量丹参酮IIA为4mg/kg、三七皂苷R1为20mg/kg和龙脑为20mg/kg。持续两周。

造模和治疗期间，各组小鼠在相同环境下正常饲养，喂食SPF维持型鼠粮和双蒸水，定期称量体重。

3细胞实验(体外实验)

(1)TBS缓冲液的制备

用天平称取6g三羟甲基氨基甲烷(Tris)和9g NaCl。先将6g Tris倒入广口瓶，加蒸馏水约800-900ml，搅动，使Tris充分溶解后，用注射器抽取约5ml 37％浓盐酸，注入约3.8ml，搅动，用pH计测pH值。根据pH值再滴加盐酸，边滴边搅，直至pH值为7.6。再加入9g NaCl搅拌，待完全溶解后加蒸馏水至1000ml。得到由Tris配制的缓冲生理盐水(即TBS缓冲液)。

(2)PBS缓冲液的配制

称7.9g NaCl、0.2g KCl、0.24g KH2PO4和1.8g K2HPO4，溶于800ml蒸馏水中，用HCl调节溶液的pH值至7.4，最后加蒸馏水定容至1L，得到PBS(135mM NaCl,2.7mM KCl,1.5mM KH2PO4,8mM K2HPO4，pH 7.4)缓冲液。保存于4℃冰箱中即可。

(3)MTT溶液的配制

称取MTT 0.5克，溶于100ml的磷酸缓冲液(PBS)中，用0.22μm滤膜过滤以除去溶液里的细菌，得到浓度为5mg/ml的MTT溶液。4℃避光保存待用。

(4)细胞培养液的配制

使用DMEM/F12细胞培养基、胎牛血清和双抗(青霉素、链霉素)按89:10:1的比例配制而成。

(5)诱导剂配制

将0.1mg Aβ_1-42干粉溶于DMSO配制为浓度4mM的母液，于-20℃储存；使用前取5μl母液加入35μl 1×PBS稀释成浓度为500μM，并于37℃静置3天，使其寡聚化；使用时取8μl浓度为500μM的Aβ_1-42与1ml细胞培养液混匀，制成4μM寡聚化的Aβ_1-42溶液。

将2μg MIF溶于0.2ml含有0.1％BSA的无菌1×PBS中，混匀制成浓度为10μg/ml的母液，于-20℃储存，使用时取5μl浓度10μg/ml的MIF溶液与1ml细胞培养液混匀制成50ng/ml的MIF溶液。

(6)药物配制

称取2mg丹参酮IIA、10mg NG-R1和10mg龙脑，分别加入2ml 95％乙醇溶解，超声(功率250W，频率33kHz)处理30min以促溶，配制成浓度为1mg/ml丹参酮IIA溶液、5mg/ml三七皂苷R1溶液和5mg/ml龙脑溶液，储存待用。使用时，取4μl丹参酮IIA、4μl三七皂苷R1、4μl龙脑溶液，分别与1ml细胞培养液混匀，制成4μg/ml丹参酮IIA工作液、20μg/ml三七皂苷R1工作液和20μg/ml龙脑工作液。

称取2mg丹参酮IIA、10mg三七皂苷R1和10mg龙脑，混合均匀，加入2ml95％乙醇溶解，采用超声处理(功率250W，频率33kHz)30min以促溶，制备出复方丹参有效成分组合物溶液(含1mg/ml丹参酮IIA、5mg/ml三七皂苷R1、5mg/ml龙脑)。取4μl复方丹参有效成分组合物溶液与1ml细胞培养液混匀，制成复方丹参有效成分组合物工作液(含4μg/ml丹参酮IIA、20μg/ml三七皂苷R1、20μg/ml龙脑)。

(7)人神经瘤母细胞SH-SY5Y

人神经瘤母细胞SH-SY5Y获赠于张辰宇实验室(南京大学生命科学学院)。细胞培养液使用DMEM/F12细胞培养液、胎牛血清、双抗(青霉素、链霉素)按89:10:1的比例配制而成。细胞在37℃、含5％CO₂的培养箱中培养至汇合度80％时，用胰酶消化细胞1min，加入细胞培养液终止消化，在1000rpm条件下离心5min，弃上清。

加入细胞培养液重悬细胞并混匀，分至6孔(Western blot实验)或96孔细胞板(MTT实验和细胞凋亡实验)中，待细胞贴壁后，弃掉细胞培养液。分别加入1ml(6孔板)或100μl(96孔板)预先配制的、工作浓度为4μg/ml丹参酮IIA、20μg/ml三七皂苷R1、20μg/ml龙脑以及复方丹参有效成分组合物溶液(含4μg/ml丹参酮IIA、20μg/ml三七皂苷R1、20μg/ml龙脑)，处理1h(MTT实验和细胞凋亡实验)或30min(Western blot实验)，然后每孔加入5μl(6孔板)或0.5μl(96孔板)10μg/ml MIF(实际工作浓度为50ng/ml)诱导6h(Western blot实验)、24h(细胞凋亡实验)以及36h(MTT实验)。接下来，进一步进行MTT检测、细胞凋亡检测和Western blot检测。

(8).实验检测

(A)空间学习及记忆能力检测

小鼠给药治疗结束后，将其安置在已经设定好的水迷宫实验室内24h，熟悉环境；小鼠虽然天生就会游泳，但其厌恶处于水中的状态，将其放入水中，会本能找到平台休息。通过水迷宫的检测，来观察模型鼠的学习、记忆和信息整理情况。测试开始前5天，每天通过4次不同方位的训练和引导，每次训练时间为60s，在平台逗留时间为15s，帮助实验鼠记忆水池中平台的位置，并记录他们的行经和到达平台所需的时间；第6天测试学习和记忆能力，移除平台，观察和记录模型鼠在目标想象的停留时间和经过次数，以及记录原平台位置的穿越次数。通过分析穿越平台数、目标象限停留时间和路程，判断模型鼠的学习和记忆能力是否受损。

(B)血清中INF-γ及IL4的含量检测

采用小鼠摘眼球方法取血，取血前先将小鼠胡须剪去以免溶血发生。取血前，使用乙醚麻醉小鼠，然后用左手抓住小鼠身体，并用拇指和食指抓紧头部使眼球充血突出，然后用小镊子夹住眼球迅速取出，使血液流入EP管并轻按小鼠心脏部位，以获取更多血液，取血完毕后进行断颈处死小鼠。血液室温静置2h，然后在12000rpm，4℃条件下离心15min，小心吸取上清进行ELISA实验。

实验采用双抗体夹心ELISA，使用ELISA检测盒(Mouse IL-4ELISA Kit96T，Mouse IFN-gamma ELISA Kit，联科生物技术有限公司)，测定IL4及INF-γ的表达量。

试剂准备

提前20分钟从冰箱中取出试剂盒，平衡至室温；

洗涤液的配制：取2.5ml浓缩洗涤液，加入47.5ml ddH₂O，配制成ddH₂O洗涤液，涡旋混匀待用；

标准曲线：取0.5ml标准品/标本稀释液(1b)加入冻干标准品(1a)中，制成浓度2000pg/ml，涡旋、待彻底溶解后静置15min。然后进行梯度稀释至标准曲线下的浓度：2000、1000、500、250、125、62.5、31.25、0pg/ml；

生物素化抗体工作液：用生物素化抗体稀释液(2b)稀释浓缩生物素化抗体(2a)，稀释比例1:100，待用；

酶结合物工作液：以酶结合物稀释液(3b)稀释浓缩酶结合物(3a)，比例为1:100，待用。

实验操作

从平衡至室温的密封袋中，取出所需96孔板；

除空白孔外，分别取血清和不同浓度的标准品100μl加入孔中，用封板胶纸封住反应孔，在37℃孵箱中反应90min；

手动洗板4次：将板中液体倒掉，在卫生纸上拍去孔内残留的液体，每孔加入350μl洗涤液，30s后倒掉，在卫生纸上拍去残留洗液，重复4次；

除空白对照孔外，加入100μl/生物素化抗体工作液，用封板胶纸封住反应孔， 在37℃孵箱中孵育60min；

重复手动洗板4次；

除空白孔外，加入100μl酶结合物工作液。用封板胶纸封住反应孔，在37℃条件下孵育30min；

重复手动洗板4次；

每孔加入100μl显色剂，板子外部包上一层锡箔纸，避光37℃孵箱孵育10-20min。每孔加入100μl终止液，混匀后5min内即刻在Safire酶标仪上测量OD 450值。

(C)脑组织尼氏染色

小鼠断颈处死后，灌注4％多聚甲醛并取整脑浸泡24h固定。将脑组织用石蜡包埋，用冰冻切片机冠状切片，片厚4-6μm。二甲苯脱蜡，分别用无水乙醇、90％乙醇和70％乙醇浸泡。清洗后置于尼氏体染色液尼氏染色液(货号C0117，碧云天生物技术有限公司)中浸泡5min，接着分别浸泡于95％乙醇和70％乙醇，脱水晾干，中性树胶封片。在普通光学显微镜下拍照并观察神经细胞的形态变化。

(D)MTT检测

加入细胞培养液重悬细胞并混匀，分至96孔细胞板中，，每孔约3000个细胞。培养至细胞贴壁后，弃掉培养液，然后分别加入100μl预先配制好的、工作浓度为4μg/ml丹参酮IIA、20μg/ml三七皂苷R1、20μg/ml龙脑和复方丹参有效成分组合物溶液(含4μg/ml丹参酮IIA、20μg/ml三七皂苷R1、20μg/ml龙脑)，处理1h，然后加入0.5μl浓度为10μg/ml的MIF到细胞中至工作浓度为50ng/ml诱导36h。

再加入10μl浓度为5mg/ml的MTT溶液(用无菌PBS配制，pH＝7.4)，继续培养4h。终止培养，小心吸弃孔内培养上清液。每孔加入150μl DMSO低速震荡混匀10min，使结晶充分溶解。选择570nm波长，在Safire酶标仪上检测各孔光吸收值OD₅₇₀，记录结果，以时间为横坐标，吸光值为纵坐标绘制细胞生长曲线。

(E)细胞凋亡检测

加入细胞培养液重悬细胞并混匀，分至96孔细胞板中，每孔约3000个细胞。培养至细胞贴壁后，弃掉培养液，然后分别加入100μl预先配制好的、工作浓度为4μg/ml丹参酮IIA、20μg/ml三七皂苷R1、20μg/ml龙脑和复方丹参有效成分组合物溶液(含4μg/ml丹参酮IIA、20μg/ml三七皂苷R1、20μg/ml龙脑)，处理1h，然后加入0.5μl浓度为10μg/ml的MIF到细胞中至工作浓度为50ng/ml诱导24h。

用无EDTA胰酶消化贴壁细胞1min，加入细胞培养液终止消化，轻轻吹打至细胞脱落。在300g，4℃条件下离心5min，弃上清，收集细胞。然后用预冷的PBS洗涤细胞两次，每次在300g，4℃条件下离心5min，收集细胞。根据AnnexinV-FITC/PI细胞凋亡试剂盒(Vazyme Biotech Co.,Ltd)的操作步骤，加入100μl Binding buffer重悬细胞，然后加入5μl AnnexinV-FITC和5μl PI Staining Solution，轻轻混匀；避光，室温反应10min。补加400μl Binding buffer混匀，样品在1小时内用BD Accuri C6流式细胞仪检测。

激发波长为488nm，Annexin V-FITC在FL1通道检测，PI在FL3通道检测。运用BD Accuri C6流式细胞仪自带的CFlow软件进行分析，绘制单色散点图，FL1为横坐标，FL3为纵坐标。

2.6Western blotting检测

蛋白提取

加入细胞培养液重悬细胞并混匀，分至6孔中，每孔约10⁶个细胞。培养至细胞贴壁后，弃掉培养液，然后分别加入1ml预先配制好的、工作浓度为4μg/ml丹参酮IIA、20μg/ml三七皂苷R1、20μg/ml龙脑和复方丹参有效成分组合物溶液(含4μg/ml丹参酮IIA、20μg/ml三七皂苷R1、20μg/ml龙脑)，处理30min，然后加入5μl浓度为10μg/ml的MIF到细胞中至工作浓度为50ng/ml诱导6h。

然后，将培养液吸出，用预冷的PBS(135mM NaCl，2.7mM KCl，1.5mM KH₂PO₄，8mM K₂HPO₄，pH 7.4)洗一遍，每孔加入500μl胰酶消化1min，加入培液终止消化，将细胞收集到1.5ml EP管中，1000rpm离心5min；弃上清，再加入1ml预冷的PBS重悬，同条件离心5min；弃上清，加入80-100μl含蛋白酶抑制剂的细胞裂解液混匀，置于冰上裂解30min，离心取蛋白上清。

蛋白定量

从BCA试剂盒中取A、B液根据50:1的比例，配制3ml BCA工作液，并混匀待用，200μl分装，按表1加入标准品和样品；

取8μl浓度为5mg/ml的蛋白质标准品(BSA Standard)与72μl PBS(135mM NaCl，2.7mM KCl，1.5mM KH₂PO₄，8mM K₂HPO₄，pH 7.4)配制成浓度为0.5mg/ml混匀待用；

在96孔板上，按表1方案加入样品；

表1 BCA蛋白质定量加样方案

置于摇床上，37℃摇30min，充分反应；

然后在562nm波长下，放入酶标仪测OD值，将数据制作成标准曲线，计算出每个样品的总蛋白量。

目标蛋白检测

按表2的配方制作SDS-PAGE，待胶凝结后，将蛋白样品加至上样孔中，加入电泳液，在浓缩胶90V、分离胶120V的条件下，分离目的蛋白。电泳结束后，使用PVDF膜湿转，加入含15％甲醇的预冷转膜液，置于冰盒中，在300mA恒流条件下转膜90min。转膜结束后，将PVDF膜置于TBS中洗5min，而后加入含5％脱脂奶粉的1X TBS室温封闭1h，根据目标蛋白和内参蛋白的大小，裁剪PVDF膜，然后用1X TBST漂洗3次，每次5min。将目标蛋白的一抗(1:1000for Bad)或内参抗体(1:3000forβ-Actin)按产品说明书中的比例用含5％的BSA的1X TBST稀释，4℃过夜，回收一抗，用1X TBST洗涤蛋白膜3次，每次5min；按1:5000的比例用含5％BSA的1X TBST稀释二抗，室温孵育1h，回收二抗，用1X TBST洗涤蛋白膜3次，每次5min。使用ECL显影液，使用Tanon5200全自动化学发光成像分析系统检测蛋白的丰度。用Image J v4.7软件分析蛋白灰度值。

表2分离胶及浓缩胶配方

10％Separation Gel

(F)统计学处理

利用GraphPad Prism 5.0软件进行统计分析。实验数据用均值±标准差(SD)表示。水迷宫的组间逃离潜伏期数据使用two-way ANOVA分析，其他数据多组间差异使用one-way ANOVA分析，两两间差异使用T检验。结果p值小于0.05表示比较差异具有统计学意义。