一种复合型生物套管及其制备方法和应用与流程

本发明属于医用生物材料
技术领域：
，涉及一种复合型生物套管及其制备方法和应用。
背景技术：
：临床上对周围神经离断伤的常规治疗方法是神经外膜缝合或神经束膜缝合术。Cajal等人证明近断端神经纤维是选择性地长入神经远断端，而不会长入其它组织，这就是周围神经再生的趋向性(也称为选择性再生理论)。基于以上理论有人提出新的修复周围神经方法：小间隙套接缝合技术。即用管型材料将离断的近远端周围神经套接缝合，套接缝合时在两神经断端之间形成相对封闭的神经再生室，有利于内源性神经营养因子发挥作用，为神经再生提供有利的微环境，促进神经轴突的生长，提高神经再生的效率，减少神经轴突逃逸，降低缝合口处神经瘤的形成。例如中国专利文献CN1416914A和CN1411873A报道了以甲壳胺或海藻酸钠为主要原料制成的人工生物套管；美国专利文献US4534349A采用聚乳酸、聚乙醇酸、聚(乙交酯一丙交酯)、聚酯酰胺等合成聚合物及其共聚、共混物制备神经修复导管；PCT国际专利文献W09844020Al和W09844021Al报道了含磷酸酯基团的合成聚合物用于制作神经生长的导管。但是，由于缺乏有效的促神经生长药物支持，诸如上述神经导管的神经缝合技术虽然有了很大的提高，但临床周围神经修复效果仍不能让人满意。此外，有些上述公开的神经导管存在制备困难、或者在可吸收性和组织相容性方面存在缺陷，从而未能在临床上取得实际应用。而目前通常采用手术中损伤点局部喷洒促神经生长药物、术后口服促神经生长药物的方式来治疗周围神经离断伤。前者虽为局部给药，但药物短期内即代谢，难以发挥促神经生长效果；后者全身口服给药，局部浓度较低，并容易引起不良反应和并发症。因此局部缓释给药是周围神经损伤修复的较理想给药方式，然现有技术中的局部缓释给药都不甚理想。有研究应用微量泵向损伤局部泵入促神经生长药物，但是这项技术需要特制微量泵植入损伤局部，操作复杂、费用较高，很难达到普及应用。此外，中国专利文献CN1589913A报道了一种用于修复周围神经缺损的组织工程化周围神经，其中生物导管内添加了神经胶质细胞或可向神经胶质细胞分化的肝细胞作为种子细胞、和缓释促神经生长物质等。但是，该现有技术主要用于周围神经缺损的修复，而不是用于周围神经小间隙套接缝合。并且该现有技术在神经导管中注入神经胶质细胞和多种神经营养因子，其目的是为套接缺损提供支架材料、营养因子和细胞学支撑，而由于充填多种物质，该修复用围神经缺损的组织工程化周围神经构造复杂，同时由于其制造和保存的条件要求严格，导致其难于在临床应用中推广。此外，相关实验也证实这种应用于神经缺损的人工神经仍不能很好的解决再生神经轴突有效通过神经缺损的问题，目前仍无法达到自体神经移植的修复效果，故临床极少应用。本领域技术人员一致致力于寻求一种能很好的解决再生神经轴突有效通过神经缺损的问题，并且制备和保存方便的应用于周围神经小间隙套接缝合的产品。为此，中国专利文献CN103371875A公开一种复合型生物套管及其制备方法和应用，该现有技术可以一定程度上解决再生神经轴突有效通过神经缺损的问题，并且制备和保存方便，然由于其仅仅公开了生物套管中的生物导管甲壳质部分的内径及厚度，并未公开促神经生长物质的厚度及其所占用的体积而神经生长物质的厚度及其所占用的体积的不同能导致其在使用性能上的巨大差异，而且其公开的复合型生物套管在小间隙套接修复动物周围神经缺损方面效果还不甚理想。技术实现要素：因此，针对现有技术中的复合型生物套管未涉及到促神经生长物质的厚度及其所占用的体积，并且其在小间隙套接修复动物周围神经缺损方面效果也不甚理想的缺陷，本发明提供一种复合型生物套管及其制备方法和应用。为了解决上述技术问题，本发明提供如下的技术方案:一种复合型生物套管，包括中壁的生物导管和在所述中壁的生物导管的内壁上的缓释微囊层；所述生物导管内径0.8mm～9mm，所述生物导管的管壁厚度为O.1～2.5mm，所述缓释微囊层的厚度为0.05mm～0.5mm。所述生物套管的长度为4mm～18cm。所述缓释微囊层为含有促进神经生长的物质的缓释微囊层，所述中空的生物导管为由生物降解材料制成的中空的生物导管。所述促进神经生长的物质选自神经生长因子和脑源性神经生长因子中的至少一种；所述生物降解材料是选自甲壳胺、几丁质、胶原、壳聚糖、聚乳酸、聚羟基乙酸中的至少一种。所述生物可降解材料是甲壳胺，其中由甲壳胺制成的中空的生物导管的脱乙酰度为27％，在0.9％的氯化纳水溶液中无溶解，在湿态下穿针无脆裂。一种制备复合型生物套管的方法，包括如下步骤：(1)将生物可降解材料溶解于溶剂中，形成生物可降解材料的无泡纺丝原液；(2)从中空喷丝孔中挤出该纺丝原液，获得中空的生物导管；(3)通过复乳法制备包含神经生长因子的缓释微球的液体；(4)将浓度为0.5～9μg/mL的3～50mL上述缓释微球的液体注入到所述中空的生物导管的内腔，干燥，获得在所述中空的生物导管的内壁上具有微囊层的复合型生物套管；所述干燥是指在-30～-10℃条件下，真空冷冻干燥机上冷冻干燥20h～60h，所述干燥前还需-30～-10℃提交下冷冻10h～30h。本发明通过对制备工艺的改进从而实现将缓释胶囊层调节到特定的厚度，进而实现对不同直径神经缺损的修复。所述促进神经生长的物质是选自神经生长因子和脑源性神经生长因子中的至少一种；所述生物降解材料是选自甲壳胺、几丁质、胶原、壳聚糖、聚乳酸、聚羟基乙酸中的至少一种。所述生物可降解材料是甲壳胺，且所述溶剂是醋酸的水溶液。所述复合型生物套管由中壁的生物导管和在所述中壁的生物导管的内壁上的缓释微囊层组成；所述生物导管内径0.8mm～9mm，所述生物导管的管壁厚度为O.1～2.5mm，所述缓释微囊层的厚度为0.05mm～0.5mm，所述生物套管的长度为4mm～18cm。上述的复合型生物套管用于周围神经小间隙套接缝合且在损伤局部为受损神经提供长期促神经生长物质中的应用。优选地，所述缓释微球为含有促进神经生长物质的缓释微球。本发明与现有技术相比的优点为：1、本发明提供的复合型生物套管，其中生物导管内径0.8mm～9mm，所述生物导管的管壁厚度为O.1～2.5mm，所述缓释微囊层的厚度为0.05nm～0.5mm，所述生物套管的长度为4mm～18cm。既可用于周围神经小间隙套接缝合，同时又可实现促神经生长物质局部长期持久释放的复合型生物套管，可提高对不同直径神经缺损的修复。2、本发明提供的复合型生物套管的长度为4mm～18cm，该长度范围内的生物套管可以修复不同程度的周围神经损伤，并且短管可以减少异物感，长管可以提供更多的神经再生保护空间长度。3、本发明提供的复合型生物套管在中空的生物导管的内壁上具有缓释微囊层，当将此复合型生物套管应用于小间隙套接修复周围神经的时，术后套管内壁缓释微囊还能为受损神经长期提供促神经生长物质，有利于提高周围神经损伤修复效果。4、本发明提供的复合型生物套管通过将小间隙套接缝合技术与药物缓释技术有效结合，即在套接缝合所形成的小间隙内添加促神经生长缓释物质，由此既可以完成周围神经损伤的修复，同时其中的局部缓释系统又可以为神经再生提供长期的刺激冈子和营养物质，极大地提高了周围神经的修复效果。附图说明为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。图1是根据本发明复合型生物套管的截面示意图；图2是根据本发明的实施例1所制备的缓释微球的扫描电镜图；图3是根据本发明的实施例1的缓释微球的累积释放曲线图:附图标识如下：1-复合型生物套管，2-中空的生物导管，3-缓释微囊层。具体实施方式提供下述实施例是为了更好地进一步理解本发明，并不局限于所述最佳实施方式，不对本发明的内容和保护范围构成限制，任何人在本发明的启示下或是将本发明与其他现有技术的特征进行组合而得出的任何与本发明相同或相近似的产品，均落在本发明的保护范围之内。实施例中未注明具体实验步骤或条件者，按照本领域内的文献所描述的常规实验步骤的操作或条件即可进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规试剂产品。根据本发明的一个实施方式，提供一种复合型生物套管，其包括中空的生物导管和在该中空的生物导管的内壁上存在的缓释微囊层。本发明在复合型生物套管的中空的生物导管内壁上附上缓释微囊层，当将此复合型生物套管应用于小间隙套接修复周围神经时，术后套管内壁上的缓释微囊能够为受损神经长期提供促神经生长物质，有利于提高周围神经损伤的修复效果。根据本发明的优选实施方式，所述复合型生物套管中的生物导管的内径为0.8mm～9mm。进一步优选为1mm～8mm，甚至优选为1.5mm～7mm0.例如，所述复合型生物套管中的生物导管的内径可以为2mm，3mm，4mm，5mm或6mm。根据本发明的述复合型生物套管的长度是根据实际使用的需要来确定的。一般优选所述复合型生物套管的长度为4mm～18cm。例如，所述复合型生物套管的长度可以选择为4mm、5mm、6mm、7mm、8mm、9mm、10mm、2cm、5cm、7cm、10cm、15cm、或18cm。根据本发明的一个优选实施方式，所述复合型生物套管的管壁厚度为O.1～2.5mm。进一步优选其管壁厚度为O.1～2mm。甚至优选其管壁厚度为O.15～1.5mm；更优选其管壁厚度为O.15～1.Omm；最优选其管壁厚度为O.15～0.85mm。根据本发明的一个优选实施方式，所述复合型生物套管的缓释微囊层的厚度为0.05mm～0.5mm。进一步优选其厚度为O.08～0.46mm。甚至优选其厚度为O.15～0.3mm；更优选其厚度为O.15～0.2mm；最优选其厚度为O.2mm。实施例1：复合型生物套管的制备1.制备中空的生物导管将市售脱乙酰度为82％、重均分子量为37.7万的甲壳胺(购买自上海佳和生物科技有限公司)按4％浓度(W/W，重量比)溶解于2％(重量比)的稀醋酸水溶液中，得到高粘度溶液。抽真空脱泡12小时得到无泡纺丝原液。将纺丝原液以O.6MPa(兆帕)的空气压力从釜中压出，经纺丝计量泵计量，从中空喷丝孔的皮层挤出，与此同时，以O.2MPa的空气压力将5％NaOH(W/W)水溶液(作为凝固剂)从中空喷丝孔的芯层挤出。纺丝原液挤出后直接进入5％NaOH(W/W)水溶液凝固浴，在外界和芯层凝固剂的同时作用下甲壳胺得以析出凝固。然后经导辊引出后牵伸1.25倍，得到连续的甲壳胺中空管，导管内径0.95mm，导管管壁厚度O.15mm。将甲壳胺中空管用水洗涤至pH＝7，用甲醇脱水后置于40℃、5％醋酸酐-甲醇溶液(V/V，体积比)中，50分钟后取出，用甲醇洗涤。然后置于1％稀醋酸水溶液中浸洗，风干，再以75％乙醇洗涤，洗涤后浸泡于75％乙醇中消毒备用。其中，所得甲壳质中空导管的脱乙酰度为27％，在生理盐水(质量分数为0.9％的NaCl水溶液)中无溶解，湿态下穿针无脆裂。2.制备缓释微球及其性能测试2.1复乳法制备对照PLGA微球采用W/O/W复乳溶剂挥发法制备缓释微球。将50μL的表面活性剂聚乙二醇400溶于100μL的去离子水中得到内水相(W1)；将50mg的PLGA(poly(lactic-co-glycolicacid，聚乳酸-羟基乙酸共聚物)溶于3mL二氯甲烷中得到油相(0)；外水相(W2)为1.5％的聚乙烯醇溶液30ml；将W1倒入0中，超声处理30秒得到初乳(W1/0)，将初乳倒入W2中，在悬臂式搅拌机上以1000转/分钟搅拌6分钟，得到W1/0/W2复乳。将复乳在室温(～25℃)下于悬臂式搅拌机以500转/分钟搅拌4小时挥发残余有机溶剂，通过13800转/分钟离心收集微球，并用去离子水洗涤3次，密封放在零下20℃冰箱中，真空冷冻干燥机上冷冻干燥，得到空白缓释微球，置于40℃下保存。2.2复乳法制备NGF-β-PLGA缓释微球采用W/O/W复乳溶剂挥发法制备缓释微球。将10μg的NGF-β、5mg的牛血清白蛋白以及50μL的表面活性剂聚乙二醇400溶于100μL的去离子水中得到内水相(W1)；100mg的PLGA溶于4mL二氯甲烷中得到油相(0)；外水相(W2)为1.5％的聚乙烯醇溶液；将W1倒入0中超声处理30秒得到初乳(W1/0)，将初乳倒入W2中在悬臂式搅拌机上以1000转/分钟搅拌6分钟，得到W1/0/W2复乳，将复乳倒入400mL的10％去离子水氯化钠溶液中，室温下磁力搅拌机上搅拌4小时挥发残余有机溶剂，通过13800转/分钟离心收集微球，并用去离子水洗涤5次，真空冷冻干燥机上冷冻干燥48小时，得到NGF-β-PLGA缓释微球，置于4℃的温度下保存。2.3缓释微球的性能测试2.3.1缓释微球的形态和粒径取少量制备的NGF-β-PLGA缓释微球，在扫描电子显微镜中观察缓释微球微观结构，具体参见说明书附图2。2.3.2缓释微球的载药量和包封率NGF-β-PLGA缓释微球的载药量和包封率的测量取10mgNGF-β-PLGA缓释微球溶于O.5mL的乙二酸乙酯中，然后加入2mL的去离子水，在振荡器上充分混匀，静置，取下清液，萃取乙酸乙酯中的NGF-β，重复3次，用ELISA法在490nm波长下测定所得NGF-β溶液的吸光度，以空白微球降解液作为空白对照，代入标准曲线，计算NGF-β的含量。多次重复测量结果显示：本实例制备的缓释微球中NGF-β的平均含量为0.0047％，包封率均值为18.2％。2.3.3缓释微球的体外释放的测定准确称取20mg缓释微球置于透析袋中，密闭封口，然后置于60mL作为降解介质的PBS缓冲液(pH7.4)，放入37℃的恒温振荡水浴摇床中，以150转/分钟的速度进行振摇，分别在2、4、8、12、24小时及2、4、7、10、14、21和28天时，分别取出2mL放入-20℃冰箱冷冻保存，其余补充等量的新鲜PBS液后放回缓释装置中。最后采用ELISA法测定NGF-β质量浓度，计算每次取样时释放的NGF-β总量，并绘制微球累积释放曲线。微球累积释放曲线参见说明书附图3。本发明中NGF-β释放周期在2周左右，这与小间隙套接缝合技术修复周围神经再生规律相符合，能够长期为神经再生提供良好的营养物质支持。2.3.4微球中NGF-β活性的检测通过对PCI2细胞突起的计数来检测NGF的活性。将生长良好的PCI2细胞接种于预先经鼠尾胶原包被的6孔培养板中，接种密度为2×104/cm2，每孔加入2mL含体积分数10％马血清和体积分数为5％胎牛血清的DMEM培养基，在37℃、体积分数为5％CO2及饱和湿度条件下培养3h后随机分组，分为NGF组(阳性对照组)、不含NGF的空白微球组(阴性对照组)、含NGF缓释微球组(实验组)，分别以50pg/L的NGF、空白微球的缓释液、含NGF缓释微球组的缓释液(所有微球缓释液均用0.22μm滤器过滤除菌)各2mL替换原细胞培养液，继续培养48小时后，在显微镜上随机选取视野，计数100个细胞，并计算每组中细胞最长突起长度大于胞体直径的细胞(即阳性细胞)的比例，阳性细胞比例(％)＝阳性细胞数/计数细胞数，每组实验重复3次。培养结果显示：NGF组(阳性对照组)和含NGF缓释微球组(实验组)细胞生长情况类似，较不含NGF的空白微球组(阴性对照组)，培养的细胞密度较大、数量较多，细胞突起长度较长。NGF组(阳性对照组)、不含NGF的空白微球组(阴性对照组)、含NGF缓释微球组(实验组)阳性细胞比率分别为：57.3％、29.6％、54.2％。结果表明缓释微球能够达到充分释放功能，并能保证NGF的生物学活性。3.复合型生物套管的制备将上述新鲜制备的缓释微球置于去离子水中(缓释微球与去离子水重量比为1:100)，制成缓释微球混悬液，取配制好的混悬液3～50mL注入到所述中空的生物导管的内腔，所述干燥前还需。然后将此导管置于-30～-10℃提交下冷冻10h～30h，所述干燥在-30～-10℃条件下，真空冷冻干燥机上冷冻干燥20h～60h，使得微球贴于中雪管内壁，从而获得在所述中空的生物导管的内壁上具有微囊层的复合型生物套管。实施例2-7.实施例2-7的复合生物套管的制备方法跟实施例1相同，其中各实施例制备的复合生物套管的具体结果参数见表1。对比例根据中国专利文献CN103371875A实施例中所公开的内容制备的复合型生物套管，并通过检测得出其复合生物套管的结构参数见表1。实施例1-7以及对比例所制备的复合生物套管的结构参数实施例2-7以及对比例与实施例1的制备以及检测过程相同，其中各实施例的复合生物套管的结构参数如表1表1.实施例1-7制备的复合生物套管的结构参数试验例：实施例1制备的复合型生物套管小间隙套接修复动物周围神经缺损选用SPF级健康雄性SD大鼠30只(220-250g)，随机分为A、B、C、D、E组，采用戊巴比妥纳(2ml/kg(毫升/千克)，腹腔注射)麻醉，无菌条件下暴露右侧坐骨神经。A组：在坐骨神经分叉处下10mm处切断胫神经，用10-0显微缝线膜缝合；B组：在坐骨神经分叉处下10mm处切断腔神经，用10-0尼龙线2针外膜缝合。缝合后缝合点局部喷洒含神经生长因子、神经营养因子混合液2ml；C组：在坐骨神经分叉处下10mm处切断胫神经，用10-0尼龙线2针单纯套管小间隙套接缝合；D组：在坐骨神经分叉处下10mm处切断胫神经，用10-0尼龙线2针单纯套管小间隙套接缝合，用微量注射器向套接间隙内注入含神经生长因子、神经营养因子混合液50ul(微升)；E组：在坐骨神经分叉处下10mm处切断胫神经，用10-0尼龙线2针复合套管小间隙套接缝合。观察项目及检测方法：1)一般情况观察：大鼠一般情况、于术侧患肢活动情况及溃病情况。2)术后12周分别进行：a.大鼠胫神经功能评分：应用墨迹法测量大鼠胫神经功能评分。评分公式为：胫神经功能指数＝-37.2×足印长度冈子+104.4足印宽度因子+中间足趾宽度因子。b.电生理测量；结果采用spss11.0软件进行单因素方差分析，进行组间比较。c.双侧神经取材，饿酸染色，有髓神经纤维组织学观察及计数。结果统计处理：单位视野有髓神经纤维计数结果采用SPSS11.0进行单因素方差分析，进行组间比较。d.胫神经支配肌肉组织学观察。观察以及检测的实验结果如下:1)一般情况：所有实验大鼠均手术顺利，无一只死亡，所有大鼠患肢均无出现足部溃殇。2)大鼠胫神经功能评分：平均值E组>C组>D组>B组>A组(值越高代表功能恢复越好)其中A、B、C，D组之间没有统计学差异，E组与其他四组均有统计学差异。3)电生理结果：E组神经传导速度明显高于其他A，B、C、D4组，差异具有统计学意义，其他四组之间没有统计学差异。4)饿酸染色：E组有髓神经纤维较其他四组均一，且髓鞘厚度也较厚，其他四组之间无明显差异。有髓神经纤维计数E组明显高于其他四组，差异具有统计学意义。5)肌肉组织学观察，各组伤侧肌肉均较健侧肌肉有一定程度的萎缩，肌纤维直径均一度也较正常差，但各组之间无明显差异。利用本发明的复合型生物套管应用于小间隙套接修复周围神经的时不会出现溃疡，电生理结构优异，并且有髓神经纤维较均一，且髓鞠厚度也较厚，有髓神经纤维计数高。实施例2-6以及对比例制备的复合型生物套管小间隙套接修复动物周围神经缺损的数据与实施例1的复合型生物套管小间隙套接修复动物周围神经缺损的数据的测试手段是完全一样的，具体测试数据见表2表2.实施例2-6以及对比例制备的复合型生物套管小间隙套接修复动物周围神经缺损的数据实施例功能评分最优组溃疡状况神经电生理检测值120mm无32.17m/s24mm无32.15m/s318cm无31.98m/s415cm无32.33m/s510mm无32.05m/s610cm无32.82m/s715cm无32.20m/s对比例13cm无32.66m/s从上表可以看出，根据不同注入量制得缓释微囊层的厚度不同的复合生物套管应用于小间隙套接修复周围神经的时不会出现溃疡，电生理结构优异，并且有髓神经纤维较均一，且髓鞘厚度也较厚，有髓神经纤维计数高，均表现出良好的促神经修复能力，可实现对不同直径神经的修复。显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。当前第1页1 2 3