用于美容护肤的干细胞因子的活性保存方法与流程

本发明涉及干细胞因子的活性保存方法领域，具体涉及一种用于

美容护肤的干细胞因子的活性保存方法。

背景技术：

干细胞是一类具有自我复制能力的多潜能细胞。在一定条件下，它可以分化成多种功能细胞。根据干细胞所处的发育阶段分为胚胎干细胞和成体干细胞。根据干细胞的发育潜能分为三类：全能干细胞、多能干细胞和单能干细胞。干细胞即为起源细胞。干细胞具有自我更新复制的能力，能够产生高度分化的功能细胞。

人体的衰老，皱纹的出现，究其根源实质上都是细胞的衰老和减少。而细胞的衰老和减少则是由干细胞老化引起的。干细胞族群的老化严重减弱了其增殖和分化的能力，新生的细胞补充不足，衰老细胞不能及时被替代，全身各系统功能下降，让人一天天老去。而你的皮肤，也因为皮肤干细胞的衰老而无法及时更新，衰老的皮肤得不到修复，所以，你有了皱纹，失去了青春容颜。

同时研究表明干细胞生长因子可以快速激活休眠的干细胞并促使其生长，同时可以调节机体内微环境，为干细胞提供有利的生长条件。生长因子多为广义的肽激素，有表皮生长因子、成纤细胞生长因子、血小板来源增殖因子等。有研究表明该类生长因子在美容方面功能强大：1）对受损皮肤、敏感皮肤、创伤皮肤以及改建性皮肤具有良好的修复、护理作用；2）美白、淡斑；3）缩短创伤愈合时间以及减少疤痕形成；4）再生血管，促进胶原蛋白合成，延缓衰老等。

但在传统美容护肤的霜膏剂或水乳剂的状态下，干细胞生长因子的活性保存时间很短，达不到美容护肤抗衰的效果，这大大限制了干细胞活性因子的美容护肤方面的作用。而本发明通过脂质体包裹技术加上冻干技术，在保留干细胞生长因子产品美容抗衰效果的同时也大大的增强了干细胞生长因子在产品中的活性保存期，并且该方法适于大规模生产，为干细胞因子服务于美容事业提供了一条新的道路。

技术实现要素：

本发明的目的在于针对现有技术的不足，现提供一种可以保留干细胞生长因子产品美容抗衰效果，同时也大大增强干细胞生长因子在产品中的活性保存期的用于美容护肤的干细胞因子的活性保存方法。

为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案为：用于美容护肤的干细胞因子的活性保存方法，其创新点在于：包括原材料的选择、脂质体的制备和冻干工艺完成对用于美容护肤的干细胞因子的活性保存；具体步骤如下：

（1）干细胞活性因子的选择：选用纯度大于等于99%的干细胞活性因子；

（2）脂质体的制备：包括水合溶剂的选择、药脂比的确定和超声覆膜工艺；

（3）冻干工艺：制得的脂质体按一定的浓度溶于细胞培养上清液中，并加入一定比例的赋形剂，在冻干机中抽真空使得液体升华，形成粉状物质。

进一步的，所述步骤（2）脂质体的制备的具体步骤如下：

a.水合溶剂的选择：选用PH为7.4的PBS溶剂、PH为7.0的二次水溶剂、PH为7.4的D-Hanks、PH为9.5的D-Hanks、浓度为0.9%的Nacl、浓度为5%的葡萄糖中的一种；

b.药脂比的确定：所述干细胞活性因子与脂质体的质量比为1:1；

c.超声覆膜工艺：将卵磷脂、胆固醇和干细胞因子溶解在水合溶剂中，混合均匀后旋转蒸发，去除水合溶剂，将剩下的溶液再经过水浴超声处理，离心后得到脂质体。

进一步的，所述赋形剂的添加量占总体积的22-27%，所述冻干粉溶于精华液中的因子浓度保证在5μg/ml。

进一步的，所述超声覆膜工艺步骤中的卵磷脂、胆固醇的质量比为3:1，所述旋转蒸发的转速为120-160r/min，蒸发温度为33-39℃。

进一步的，所述超声覆膜工艺步骤中的水浴超声的强度为30%，每次超声时间为30s间隔5s，总的水浴超声时间为4min，所述离心速度为2900-3100r/min，所述离心时间为4-6min。

本发明的有益效果如下：

（1）本发明通过采用脂质体的制备和冻干技术，有效延长干细胞活性因子在液体状态下的活性保存期限。

（2）本发明将干细胞活性因子应用于化妆品领域，实现生物化妆品功效，直接作用于皮肤细胞层面，使用效果佳。

（3）本发明通过引用高纯度的干细胞活性因子，实现清除衰老凋亡细胞，激活睡眠的皮肤干细胞，不断分化新生细胞。

附图说明

图1为本发明的水浴超声粒径图；

图2为本发明的探头超声粒径图；

图3为0.01M PH=7.4PBS水合溶剂粒径图；

图4为二次水水合溶剂粒径图；

图5为0.01M PH=7.4D-Hanks水合溶剂粒径图；

图6为0.005mol/L PH=9.5D-Hanks水合溶剂粒径图；

图7为0.9%Nacl水合溶剂粒径图；

图8为5%葡萄糖水合溶剂粒径图。

具体实施方式

以下由特定的具体实施例说明本发明的实施方式，熟悉此技术的人士可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点及功效。

实施例1

用于美容护肤的干细胞因子的活性保存方法，包括原材料的选择、脂质体的制备和冻干工艺完成对用于美容护肤的干细胞因子的活性保存；具体步骤如下：

（1）干细胞活性因子的选择：选用纯度大于等于99%的干细胞活性因子；

（2）脂质体的制备：包括水合溶剂的选择、药脂比的确定和超声覆膜工艺，具体步骤如下：

a.水合溶剂的选择：选用PH为7.4的PBS溶剂、PH为7.0的二次水溶剂、PH为7.4的D-Hanks、PH为9.5的D-Hanks、浓度为0.9%的Nacl、浓度为5%的葡萄糖中的一种；

b.药脂比的确定：干细胞活性因子与脂质体的质量比为1:2；

c.超声覆膜工艺：将卵磷脂、胆固醇和干细胞因子溶解在水合溶剂中，混合均匀后旋转蒸发，去除水合溶剂，将剩下的溶液再经过水浴超声处理，离心后得到脂质体，卵磷脂、胆固醇的质量比为3:1，旋转蒸发的转速为120r/min，蒸发温度为33℃，水浴超声的强度为30%，每次超声时间为30s间隔5s，总的水浴超声时间为4min，离心速度为2900r/min，离心时间为4min；

（3）冻干工艺：制得的脂质体按一定的浓度溶于细胞培养上清液中，并加入一定比例的赋形剂，在冻干机中抽真空使得液体升华，形成粉状物质，赋形剂的添加量占总体积的22%，冻干粉溶于精华液中的因子浓度保证在5μg/ml。

实施例2

用于美容护肤的干细胞因子的活性保存方法，包括原材料的选择、脂质体的制备和冻干工艺完成对用于美容护肤的干细胞因子的活性保存；具体步骤如下：

（1）干细胞活性因子的选择：选用纯度大于等于99%的干细胞活性因子；

（2）脂质体的制备：包括水合溶剂的选择、药脂比的确定和超声覆膜工艺，具体步骤如下：

a.水合溶剂的选择：选用PH为7.4的PBS溶剂、PH为7.0的二次水溶剂、PH为7.4的D-Hanks、PH为9.5的D-Hanks、浓度为0.9%的Nacl、浓度为5%的葡萄糖中的一种；

b.药脂比的确定：干细胞活性因子与脂质体的质量比为1:1；

c.超声覆膜工艺：将卵磷脂、胆固醇和干细胞因子溶解在水合溶剂中，混合均匀后旋转蒸发，去除水合溶剂，将剩下的溶液再经过水浴超声处理，离心后得到脂质体，卵磷脂、胆固醇的质量比为3:1，旋转蒸发的转速为160r/min，蒸发温度为39℃，水浴超声的强度为30%，每次超声时间为30s间隔5s，总的水浴超声时间为4min，离心速度为3100r/min，离心时间为6min；

（3）冻干工艺：制得的脂质体按一定的浓度溶于细胞培养上清液中，并加入一定比例的赋形剂，在冻干机中抽真空使得液体升华，形成粉状物质，赋形剂的添加量占总体积的27%，冻干粉溶于精华液中的因子浓度保证在5μg/ml。

实施例3

用于美容护肤的干细胞因子的活性保存方法，包括原材料的选择、脂质体的制备和冻干工艺完成对用于美容护肤的干细胞因子的活性保存；具体步骤如下：

（1）干细胞活性因子的选择：选用纯度大于等于99%的干细胞活性因子；

（2）脂质体的制备：包括水合溶剂的选择、药脂比的确定和超声覆膜工艺，具体步骤如下：

a.水合溶剂的选择：选用PH为7.4的PBS溶剂、PH为7.0的二次水溶剂、PH为7.4的D-Hanks、PH为9.5的D-Hanks、浓度为0.9%的Nacl、浓度为5%的葡萄糖中的一种；

b.药脂比的确定：干细胞活性因子与脂质体的质量比为1:1；

c.超声覆膜工艺：将卵磷脂、胆固醇和干细胞因子溶解在水合溶剂中，混合均匀后旋转蒸发，去除水合溶剂，将剩下的溶液再经过水浴超声处理，离心后得到脂质体，卵磷脂、胆固醇的质量比为3:1，旋转蒸发的转速为140r/min，蒸发温度为36℃，水浴超声的强度为30%，每次超声时间为30s间隔5s，总的水浴超声时间为4min，离心速度为3000r/min，离心时间为5min；

（3）冻干工艺：制得的脂质体按一定的浓度溶于细胞培养上清液中，并加入一定比例的赋形剂，在冻干机中抽真空使得液体升华，形成粉状物质，赋形剂的添加量占总体积的25%，冻干粉溶于精华液中的因子浓度保证在5μg/ml。

超声方式可以选择水浴超声和探头超声，通过对脂质体的包封率及粒径的测试，测试结果见下表：

采用纳米粒度仪测定两种超声方法制得的PDGF-L的粒径，粒径的分布图如图1和图2所示。

从包封率和粒径综合考虑，探头超声法制备脂质体具有更好的效果。

水合溶剂种类的筛选：考查以下六种水合溶剂对脂质体的包封率、载药量及粒径的影响，结果见下表。

采用纳米粒度仪测定不同水合溶剂制得PDGF-L的粒径，粒径分布图如图3-8所示，由上述图表所示，选用二次水为溶剂制备脂质体为最佳选择。

本发明通过采用脂质体的制备和冻干技术，有效延长干细胞活性因子在液体状态下的活性保存期限，本发明将干细胞活性因子应用于化妆品领域，实现生物化妆品功效，直接作用于皮肤细胞层面，使用效果佳，本发明通过引用高纯度的干细胞活性因子，实现清除衰老凋亡细胞，激活睡眠的皮肤干细胞，不断分化新生细胞。

上述实施例只是本发明的较佳实施例，并不是对本发明技术方案的限制，只要是不经过创造性劳动即可在上述实施例的基础上实现的技术方案，均应视为落入本发明专利的权利保护范围内。