本发明涉及牛蒡子苷元异亮氨酸酯盐酸盐在制备抗肿瘤药物中的应用。
背景技术：
随着人类生活环境、生活水平和生活方式的变化以及医学的进步，疾病谱发生了显著的变化，一般性传染病逐渐被控制，而恶性肿瘤则成为日益常见且严重威胁人类生命和生活质量的主要疾病之一。目前在中国乃至全世界，癌症已成了导致人类死亡的第二大原因。恶性肿瘤是机体自身细胞变得不受控制的增殖和扩散的疾病，是一类细胞增殖、分化异常的疾病。因此，世界卫生组织和各国政府卫生部门都把攻克癌症列为一项首要任务。
化疗是一种全身治疗的手段，无论采用什么途径给药（口服、静脉和体腔给药等），化疗药物都会随着血液循环遍布全身的绝大部分器官和组织。因此，对一些有全身播撒倾向的肿瘤及已经转移的中晚期肿瘤，化疗都是主要的治疗手段。化疗是化学药物治疗的简称，这些化学药物的抑瘤效果显著，但其不仅会杀死癌细胞，对机体内的正常细胞也会造成危害，影响身体各个器官的功能，对免疫系统也有极大的伤害。因此，一些抗癌效果好，毒副作用小的药物正在逐渐被开发出来。
牛蒡子苷元，一种木脂内酯化合物，是菊科植物牛蒡(arctiumiappal.)的干燥成熟果实牛蒡子的主要活性成分，现有技术已经公开了牛蒡子苷元用于抗肿瘤的用途，但其口服生物利用度低，严重制约了在临床上的应用。通过对牛蒡子苷元进行结构修饰，合成其氨基酸衍生物，一方面可改善药物的生物溶解度；另一方面，提高了药物生物活性。
本发明提供的4-(4-(3,4-二甲氧苯甲基)-2-羰基)四氢呋喃甲基-2-甲氧基苯酚3-甲基-2-氨基-戊酸酯盐酸盐即为牛蒡子苷元异亮氨酸酯盐酸盐。
本发明属于首次发现4-(4-(3,4-二甲氧苯甲基)-2-羰基)四氢呋喃甲基-2-甲氧基苯酚3-甲基-2-氨基-戊酸酯盐酸盐的抗肿瘤活性。
技术实现要素：
本发明提供一种4-(4-(3,4-二甲氧苯甲基)-2-羰基)四氢呋喃甲基-2-甲氧基苯酚3-甲基-2-氨基-戊酸酯盐酸盐，其结构式为：
本发明还提供了4-(4-(3,4-二甲氧苯甲基)-2-羰基)四氢呋喃甲基-2-甲氧基苯酚3-甲基-2-氨基-戊酸酯盐酸盐的合成方法。
本发明还提供了4-(4-(3,4-二甲氧苯甲基)-2-羰基)四氢呋喃甲基-2-甲氧基苯酚3-甲基-2-氨基-戊酸酯盐酸盐的抗肿瘤作用。
具体实施方式
下面的实施例可以对本发明进一步的描述，然而，这些实施例不应该作为对本发明的范围的限制。
实施例14-(4-(3,4-二甲氧苯甲基)-2-羰基)四氢呋喃甲基-2-甲氧基苯酚3-甲基-2-氨基-戊酸酯盐酸盐的合成
称取0.20g（0.54mmol）牛蒡子苷元、0.25g（1.08mmol）boc-l-异亮氨酸、0.21g（1.08mmol）1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(edci)、0.03g（0.27mmol）4-二甲氨基吡啶（dmap）置于100ml旋瓶中，加入10ml乙腈溶液，冰水浴下搅拌溶解，再室温反应1-2小时，tlc检测反应至反应完毕，减压蒸去溶剂，得到浅黄色粘稠物。将粘稠物用ymc反相填料进行柱层析分离，用乙腈/水(55:45)混合溶剂洗脱，收集所需组分，回收有机溶剂，冷冻干燥，得白色粉末状化合物。将上述得到白色粉末状化合物（按m:v=1:20）溶于乙酸乙酯，通入氯化氢气体，冰水浴反应，用装有碳酸氢钠溶液的烧杯处理尾气，通气时间为1-3h，tlc检测至其完全反应，回收乙酸乙酯得白色颗粒状结晶，即化合物4-(4-(3,4-二甲氧苯甲基)-2-羰基)四氢呋喃甲基-2-甲氧基苯酚3-甲基-2-氨基-戊酸酯盐酸盐。
实施例2牛蒡子苷元及4-(4-(3,4-二甲氧苯甲基)-2-羰基)四氢呋喃甲基-2-甲氧基苯酚3-甲基-2-氨基-戊酸酯盐酸盐在水中的溶解度
由上表可以看出，牛蒡子苷元经结构修饰后，其修饰产物4-(4-(3,4-二甲氧苯甲基)-2-羰基)四氢呋喃甲基-2-甲氧基苯酚3-甲基-2-氨基-戊酸酯盐酸盐水溶性大大增加，改善了牛蒡子苷元溶解度低的缺点，有助于提高生物利用度。
实施例34-(4-(3,4-二甲氧苯甲基)-2-羰基)四氢呋喃甲基-2-甲氧基苯酚3-甲基-2-氨基-戊酸酯盐酸盐对h22移植瘤小鼠的抑瘤作用和免疫功能的影响
1.材料与方法
1.1材料
1.1.1实验动物和细胞株
spf级icr小鼠（雄性），体重19-21g，动物合格证号:scxk（吉）-2011-0004，购自长春市亿斯实验动物技术有限责任公司。小鼠质量检测单位：吉林省实验动物质量检测中心。
1.1.2药品和试剂
牛蒡子苷元提取分离制备
牛蒡子苷元异亮氨酸酯盐酸盐合成制备
环磷酰胺(ctx)上海华联制药有限公司
尿素氮(bun)测试盒南京建成生物工程研究所
肌酐(cr)测试盒南京建成生物工程研究所
肿瘤坏死因子-α(tne-α)测试盒上海活乐生物科技有限公司
白细胞介素-2(il-2)测试盒上海活乐生物科技有限公司
其他试剂均为分析纯
1.1.3仪器
超净工作台美国bekman公司
al-104型电子分析天平梅特勒-托利多公司
spectramax190全波长酶标仪美谷分子仪器（上海）有限公司
1.2方法
1.2.1h22荷瘤小鼠肿瘤模型制备
从液氮中取出h22细胞冻存管，迅速浸入36℃～38℃水浴中，并不时摇动，使冻存管内细胞快速完全解冻（要在1分钟内）。解冻后用75%酒精擦拭冻存管外表面，去除封口膜，打开冻存管盖，用吸管吸出细胞悬液，放于离心管中，补加生理盐水10ml左右，用吸管轻轻吹打均匀悬浮细胞。低速离心5min（1000r/min），弃上清液。再重复上述方法洗涤细胞2次，加适量生理盐水均匀悬浮细胞，计数，调整细胞浓度至1.0×107个/ml。吸取0.25ml细胞悬液注射到小鼠腹腔内，连续传两代。
无菌条件下抽取h22腹水瘤小鼠的腹水，用无菌生理盐水稀释后，低速离心5min（1000r/min）。再用生理盐水洗涤、离心两次，调整细胞密度为1.0×107个/ml。将小鼠右肩皮肤用75%酒精局部消毒，无菌操作接种0.25ml细胞悬液于右肩，构建小鼠h22肿瘤模型。
1.2.2动物分组及处理
75只spf级icr小鼠（雄性，体重19-21g）适应性饲养1周后，随机取15只小鼠作为空白对照组，正常饲养。剩下60只小鼠右肩接种瘤细胞悬液，每只0.2ml。接种次日，将各笼小鼠混匀，随机分为模型组，环磷酰胺（ctx，25mg/kg）阳性对照组，牛蒡子苷元（40mg/kg）组（a组），牛蒡子苷元异亮氨酸酯盐酸盐（40mg/kg）组（b组），每组15只。采用灌胃方式给药，每日1次，模型组和空白对照组以等量的生理盐水灌胃。各组动物给药连续给药14d，最后一次给药后禁食不禁水16h后断颈处死，收集血液及组织。
1.2.3检测小鼠h22肝癌皮下移植瘤的抑瘤率、免疫器官指数以及血清相关指标
分别称取小鼠体重、瘤重量，计算抑瘤率。眼球取血后颈椎脱臼处死后，分离血清，按照试剂盒说明书进行操作，定血清中尿素氮（bun）、肌酐（cr）水平，并按照elisa试剂盒的说明测定tnf-α、il-2的水平。完整剥离瘤体、脾、胸腺，分别称质量，计算胸腺指数和脾脏指数。
抑瘤率=(模型组瘤重量-药物组瘤重量)/模型组瘤重量
免疫器官指数=免疫器官重量/体重。
1.2.4统计学方法
统计学处理采用spss11.5统计分析软件，数据用均数标准差（x±s）表示以x±s表示。组间均数比较采用单因素方差分析，p＜0.01或p＜0.05为差异具有统计学意义。
2.实验结果
2.1牛蒡子苷元异亮氨酸酯盐酸盐对小鼠肿瘤生长的影响
a、b两组的h22移植瘤的生长明显受到抑制。如表2所示，与模型组相比，a、b两组的瘤重有显著减轻，差异极显著(p＜0.01)。同a组相比，b组差异显著（p<0.05），说明b组抑瘤效果较a组好。ctx组、a组、b组的抑瘤率分别为72.06%，26.26%，43.58%。
2.1.2牛蒡子苷元异亮氨酸酯盐酸盐对小鼠免疫器官指数的影响
如表3所示，模型组的胸腺、脾脏指数与空白组相比均有极显著升高(p＜0.01)，说明模型组造模成功，数据有统计学意义。对于胸腺指数，与ctx组相比，a、b两组均升高，且a组有显著差异（p<0.05），b组有极显著差异(p＜0.01)，说明a、b两组对胸腺有一定的保护作用；与a组相比，b组差异极显著(p＜0.01)，说明b组对胸腺的保护作用较a组好。对于脾脏指数，与ctx组相比，a、b两组均升高，a组差异极显著(p＜0.01)，b组差异显著（p<0.05），说明a、b两组对脾有一定的保护作用；与a组相比，b组差异极显著(p＜0.01)，说明b组对脾的保护作用较a组好。ctx组胸腺指数和脾指数均显著低于模型组和a、b两组。说明ctx对机体的免疫器官有一定的抑制作用，而a、b两组对机体免疫器官有一定的保护作用，且b组对免疫器官的保护作用比a组好。
2.1.3牛蒡子苷元异亮氨酸酯盐酸盐对小鼠血清相关指标的测定
2.1.3.1牛蒡子苷元异亮氨酸酯盐酸盐对小鼠尿素氮（bun）、肌酐（cr）水平的影响
ctx会使肾有较低的毒性。如表4所示，模型组的bun和cr水平均明显高于空白组(p<0.01),说明h22肝癌瘤株给小鼠肾功能造成了明显的损伤。
对于bun、cr水平，与模型相比，a、b两组均有降低，差异极显著(p<0.01)；与cxt组相比，a、b两组均有降低；与a组相比，b组有降低，说明b组降低bun、cr水平的能力较a组好。且b组数据较接近空白组。从对肾功能的影响来看，a、b两组对小鼠的肾无明显毒害作用，且能使小鼠已损伤的肾功能有所提高。
2.1.3.2牛蒡子苷元异亮氨酸酯盐酸盐对小鼠tnf-α、il-2水平的影响
如表5所示，与空白组相比，模型组的tnf-α水平升高，il-2水平降低，说明造模成功。
与模型组相比，ctx组和a、b两组tnf-α水平均降低，且ctx组、a组、b组差异极显著(p<0.01)；与ctx组相比，a、b两组tnf-α水平均升高，差异极显著(p<0.01)。ctx组的tnf-α水平明显低于空白组,而a、b两组的tnf-α水平虽然降低，但较接近空白组。与a组相比，b组tnf-α水平较高。
与模型组相比，ctx组il-2水平下降，差异显著（p<0.05）；与ctx组相比，a、b两组均升高，b组差异极显著(p<0.01)，且a、b两组il-2水平接近空白组。与a组相比，b组il-2水平较高。说明a、b两组能使机体中异常升高的tnf-α水平相应降低，异常降低的il-2水平相应升高，且b组的作用效果较a组好。
牛蒡子苷元异亮氨酸酯盐酸盐有很好的的抑瘤效果，同浓度的牛蒡子苷元异亮氨酸酯盐酸盐抗肿瘤作用明显好于牛蒡子苷元。同时，牛蒡子苷元异亮氨酸酯盐酸盐在一定程度上可以保护肝癌小鼠机体的免疫器官，增强机体的免疫功能。该结果为新药的开发提供了依据，也为牛蒡子苷元异亮氨酸酯盐酸盐的深入开发奠定基础。
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。