本发明属于兽用生物制品技术领域，具体涉及一种猪传染性胃肠炎-流行性腹泻二联弱毒疫苗脂质体稀释液冻干制品及其制备方法。
背景技术：
猪传染性胃肠炎病（Transmissible gastroenteritis of swine ,TGE）和流行性腹泻（Porcine epidemic diarrhea , PED）是两种严重危害养猪业的传染性疾病，它们对猪，尤其使2周龄以内仔猪引发呕吐、严重腹泻、脱水和高死亡率（可达100%）为主要特征；5周龄以上的猪感染该两种病后生长缓慢，饲料利用率急剧下降，已给全世界养猪业造成了巨大的经济损失。目前仍缺乏有效的临床药物，疫苗免疫是预防这两种病感染的主要措施之一。
脂质体是一种具有同生物膜性质类似的磷脂双分子层结构载体，而中药脂质体系指将中药的有效成分包封于类脂质双分子层而制成的一种超微型球状药物载体制剂。该药物载体具有靶向、缓释给药的优势，而且脂质体在体内易降解、无毒性和无免疫原性，其作为一种药物载体不仅可以提高药物治疗指数，还能够降低药物毒性和减少药物毒副作用等优点。
红景天苷是发现于红景天中的天然抗氧化剂，具有广泛的药理作用，如神经保护作用，心血管保护作用等，且具有很好的佐剂样作用，能提高机体免疫功能，使免疫功能低下的（如心肌炎或衰老等）动物特异性免疫功能和非特异性免疫功能恢复，也能通过保护造血干细胞的功能，提高机体免疫功能。
多糖是中药活性成分之一，大量研究表明，多糖及糖复合物在生物体内不仅是作为能量资源和构成材料，更重要的是它存在于一切细胞膜结构中，参与生命现象中细胞的各种活动。多糖类物质是所有生命有机体的重要组成部分，具有清除自由基、提高抗氧化酶活性和抑制脂质过氧化的能力
兽用生物制品质量评定最重要的指标之一就是免疫保护期，然而在实际生产过程中弱毒疫苗虽具有产生抗体快，但难以控制其保护时间的长短，本发明宗旨在于解决延长猪传染性胃肠炎病毒-流行性腹泻病毒抗原在体内的作用时间，诱导动物机体的免疫应答反应，进而也大幅度提高疫苗的免疫效果。
技术实现要素：
针对现有技术存在的问题，本发明的目的在于设计提供一种猪传染性胃肠炎-流行性腹泻二联弱毒疫苗脂质体稀释液冻干制品及其制备方法的技术方案。
所述的一种猪传染性胃肠炎-流行性腹泻二联弱毒疫苗脂质体稀释液冻干制品，其特征在于每1000mlPBS溶液含有以下组分：红景天苷5-10g、绿原酸2-6g、猴头菇多糖5-10g、脂质体6-12g、蔗糖10-15g和甘露醇10-15g。
所述的一种猪传染性胃肠炎-流行性腹泻二联弱毒疫苗脂质体稀释液冻干制品，其特征在于每1000mlPBS溶液含有以下组分：红景天苷6-8g、绿原酸3-5g、猴头菇多糖6-8g、脂质体8-10g、蔗糖12-14g和甘露醇12-14g。
所述的一种猪传染性胃肠炎-流行性腹泻二联弱毒疫苗脂质体稀释液冻干制品，其特征在于所述的脂质体通过以下步骤制得：将大豆卵磷脂、胆固醇在PBS溶液中超声功率300-350W，处理5-10min，振荡混合均匀后加入乙醇，再将样品放入超临界CO2萃取釜中，然后将萃取釜放入40℃恒温水浴中，反应前先通入气体吹净釜内空气，加压至25MPa，在超临界状态下孵化10-60min，缓慢释放压力即得脂质体溶液，脱水后用匀浆机制备成脂质体。
所述的一种猪传染性胃肠炎-流行性腹泻二联弱毒疫苗脂质体稀释液冻干制品，其特征在于将大豆卵磷脂4-6g、胆固醇2-6g在200ml PBS溶液中超声振荡混合均匀后加入500ml乙醇。
所述的一种猪传染性胃肠炎-流行性腹泻二联弱毒疫苗脂质体稀释液冻干制品，其特征在于所述的PBS溶液通过以下步骤得到：取氯化钠6-10g、氯化钾0.05-0.5g、磷酸氢二钠1-1.2g、磷酸二氢钾0.05-0.5g、氯化钙0.05-0.2g、含6个结晶水的氯化镁0.05-0.2g；将以上各成分混合后，溶于1000ml双蒸水中，经116℃，高压灭菌30分钟即得。
所述的一种猪传染性胃肠炎-流行性腹泻二联弱毒疫苗脂质体稀释液冻干制品的制备方法，其特征在于包括以下步骤：将所述重量的各组分充分混合后，加入到1000ml pH 7 PBS溶液中振荡水化，形成均一溶液；经过0.22um的滤器进行过滤后，先放置于-40℃低温冰箱快速冷冻，室温缓慢融化，反复进行四次，再置于-40℃预冻4-8h；最后在真空冻干机中进行干燥，即得到猪传染性胃肠炎-流行性腹泻二联弱毒疫苗脂质体稀释液冻干制品。
所述的一种猪传染性胃肠炎-流行性腹泻二联弱毒疫苗脂质体稀释液冻干制品的制备方法，其特征在于所述的PBS溶液通过以下步骤得到：取氯化钠6-10g、氯化钾0.05-0.5g、磷酸氢二钠1-1.2g、磷酸二氢钾0.05-0.5g、氯化钙0.05-0.2g、含6个结晶水的氯化镁0.05-0.2g；将以上各成分混合后，溶于1000ml双蒸水中，经116℃，高压灭菌30分钟即得。
本发明中红景天苷由武汉信嘉和诚药物化学有限公司生产销售；绿原酸由上海迈瑞尔化学技术有限公司生产销售；猴头菇多糖由湖北远成赛创科技有限公司生产销售。
本发明具有以下有益效果：
1.本发明所制备的脂质体稀释液冻干制品可以延长抗原在体内的作用时间，增加免疫保护作用时间。
2.本发明所制备的脂质体稀释液冻干制品在动物机体内可以促进诱导免疫应答反应，进而大幅度提高猪传染性胃肠炎病毒-流行性腹泻病毒的抗体水平，增强疫苗的免疫效果。
具体实施方式
为了使本发明更加容易理解，下面结合具体实施例，进一步阐述本发明的应用理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围，下列实施例中未提及的具体实验方法，通常按常规实验方法进行。
实施例1：PBS溶液制备
取氯化钠6-10g、氯化钾0.05-0.5g、磷酸氢二钠1-1.2g、磷酸二氢钾0.05-0.5g、氯化钙0.05-0.2g、含6个结晶水的氯化镁0.05-0.2g；将以上各成分混合后，溶于1000ml双蒸水中，经116℃，高压灭菌30分钟即得。
实施例2：脂质体制备
将大豆卵磷脂6g、胆固醇2g在200ml的PBS溶液（实施例1制得）中超声功率300W，处理5min，振荡混合均匀后加入500ml的乙醇，再将样品置于超临界CO2萃取釜中，然后将萃取釜放入40℃恒温水浴中，反应前先通入气体吹净釜内空气，加压至25MPa，在超临界状态下孵化40min，缓慢释放压力即得脂质体溶液，脱水后用匀浆机制备成脂质体。
实施例3：脂质体制备
将大豆卵磷脂4g、胆固醇6g在200ml的PBS溶液（实施例1制得）中超声功率为320W，处理6min，振荡混合均匀后加入500ml的乙醇，再将样品置于超临界CO2萃取釜中，然后将萃取釜放入40℃恒温水浴中，反应前先通入气体吹净釜内空气，加压至25MPa，在超临界状态下孵化40min，缓慢释放压力即得脂质体溶液，脱水后用匀浆机制备成脂质体。
实施例4：一种猪传染性胃肠炎-流行性腹泻二联弱毒疫苗脂质体稀释液冻干制品制备
取红景天苷5g、绿原酸2g、猴头菇多糖5g、脂质体（实施例2制得）6g、蔗糖10g、甘露醇10g；
将上述各组分充分混合后，加入到1000ml pH 7 磷酸盐缓冲液（实施例1制得）中振荡水化，形成均一溶液；
经过0.22um的滤器进行过滤后，先放置于-40℃低温冰箱快速冷冻，室温缓慢融化，反复进行四次，再置于-40℃预冻6h；
最后在真空冻干机中进行干燥，即得到猪传染性胃肠炎-流行性腹泻二联弱毒疫苗脂质体稀释液冻干制品。
实施例5：一种猪传染性胃肠炎-流行性腹泻二联弱毒疫苗脂质体稀释液冻干制品制备
取红景天苷6g、绿原酸4g、猴头菇多糖8g、脂质体（实施例3制得）8g、蔗糖12g、甘露醇12g；
将上述各组分充分混合后，加入到1000ml pH 7 磷酸盐缓冲液（实施例1制得）中振荡水化，形成均一溶液；
经过0.22um的滤器进行过滤后，先放置于-40℃低温冰箱快速冷冻，室温缓慢融化，反复进行四次，再置于-40℃预冻4h；
最后在真空冻干机中进行干燥，即得到猪传染性胃肠炎-流行性腹泻二联弱毒疫苗脂质体稀释液冻干制品。
实施例6：一种猪传染性胃肠炎-流行性腹泻二联弱毒疫苗脂质体稀释液冻干制品制备
取红景天苷10g、绿原酸6g、猴头菇多糖10g、脂质体（实施例3制得）12g、蔗糖15g、甘露醇15g；
将上述各组分充分混合后，加入到1000ml pH 7 磷酸盐缓冲液（实施例1制得）中振荡水化，形成均一溶液；
经过0.22um的滤器进行过滤后，先放置于-40℃低温冰箱快速冷冻，室温缓慢融化，反复进行四次，再置于-40℃预冻8h；
最后在真空冻干机中进行干燥，即得到猪传染性胃肠炎-流行性腹泻二联弱毒疫苗脂质体稀释液冻干制品。
试验例1 本发明的应用
1材料
1.1 猪传染性胃肠炎-流行性腹泻二联弱毒疫苗脂质体稀释液冻干制品：按本发明实施例4-6制得
1.2 猪传染性胃肠炎-流行性腹泻二联弱毒疫苗
1.3 试验动物：14～21 日龄健康仔猪20 头，TGE、PED抗体检测阴性（中和抗体效价均不高于1:4）。
2 方法
2.1包封率的测定
分别取空白的冻干脂质体和包封药物的脂质体冻干粉，在磷酸盐缓冲液中进行复溶，超速离心，取上清按一定比例稀释后，测定其吸光度（参考兽药典），平均每个样品测3次，算其平均值。
2.2形态观察和粒径
脂质体稀释液冻干粉在PBS缓冲液复溶后，在透射电镜（×20000）下观察
2.3免疫效果测定
将本发明实施例4-6中制备的脂质体稀释液冻干制品分别置于一定量的PH7的磷酸盐缓冲液中完全溶解，用作疫苗稀释液。把60头21日龄仔猪分为四组，每组15头，A组采用本发明实施例4制备的脂质体稀释液冻干制品进行疫苗稀释；B组采用本发明实施例5制备脂质体稀释液冻干制品进行疫苗稀释；C组采用本发明实施例6制备脂质体稀释液冻干制品进行疫苗稀释；D组，试验对照组，采用疫苗自带稀释液冻干制品进行疫苗稀释。免疫后于7d、14d、21d、28d、35d、42d、49d分别采血，分离血清，测定TGE、PED的中和抗体效价。
3 结果
3.1包封率结果
按照公式：包封率（％）＝系统中包封的药量（A1）/ 系统中包封与未包封的总药量（A2）×100％，结果见表1。
表1包封率测定结果
3.2形态观察和粒径测定
脂质体稀释液冻干制品为多室脂质体，粒度规则，为圆形，粒径基本一致，结果见表2。
表2 形态观察和粒径测定结果
3.2 测定免疫效果
表3 TGE中和抗体测定结果
表4 PED中和抗体测定结果
4 结论
综上所述，本发明猪传染性胃肠炎-流行性腹泻二联弱毒疫苗脂质体稀释液冻干制品的制作工艺具有很好的重复性，该脂质体稀释液冻干制品不仅可以延长猪传染性胃肠炎-流行性腹泻二联弱毒疫苗保护期，还可以大幅度提高猪传染性胃肠炎-猪流行性腹泻二联弱毒疫苗的中和抗体效价。