本发明涉及一种使用全悬浮技术生产猪瘟疫苗的方法，属于兽用生物制品领域。
背景技术：
：猪瘟(classicalswinefever，CSF)是由猪瘟病毒(classicalswinefevervirus，CSFV)引起的高度接触性、多系统出血性猪传染病。我国对于猪瘟的防控主要以猪瘟兔化弱毒疫苗大规模免疫为主。但是点状散发的猪瘟疫情仍时有发生，并且在我国分布广泛，流行态势日趋复杂。ST细胞，即猪睾丸细胞，属于成纤维细胞，体外可连续传代贴壁培养，该细胞系对多种病毒敏感，如：猪细小病毒、猪伪狂犬病毒、猪瘟病毒、猪传染性胃肠炎病毒等，是疫苗生产中繁殖病毒的主要原辅材料之一。ST细胞培养是病毒类疫苗生产的关键工艺环节，直接影响到疫苗的质量，如何稳定获得足量的细胞对于保证生产能力和产品质量尤为重要。转瓶培养ST细胞技术是目前兽用病毒类疫苗生产中使用最为普遍的细胞培养方法，优势是工艺简单、成本低廉，然而生产效率低、劳动强度高、产品均一度差等问题一直很难从根本上得以解决。(陈文庆,王建超,刘华杰等。悬浮培养工艺与转瓶培养工艺的比较分析.中国兽药杂志,2010,44(10):37-41)。基于转瓶培养的弊端，悬浮培养开始应用于生产实际之中。ST细胞悬浮培养工艺可控制一系列细胞培养参数，具有培养病毒含量高，无须混合，批间差异小，培养方式自动化，无须大量生产人员，培养需求面积小、污染小、成本低等优点，且避免了BVDV等外源病原污染，是疫苗制备中首选的细胞培养技术。目前悬浮培养应用主要是微载体悬浮培养。全悬浮培养在兽用疫苗方面，率先应用于口蹄疫疫苗的生产，之后悬浮培养工艺在生物制药行业引发一定的效应，疫苗生产企业越来越关注新工艺。本发明涉及ST细胞全悬浮生产猪瘟疫苗的工艺。其关键技术在于细胞驯化，ST细胞全悬浮驯化成功后，可用于猪瘟病毒、猪传染性胃肠炎病毒、猪伪狂犬病毒、猪细小病毒等的培养。较其它微载体悬浮培养系统，该系统具有操作简单、可控性强、培养效率和自动化程度高、不需要载体等优势，为细胞或疫苗的规模化生产提供了一条新的路径。技术实现要素：本发明的目的是提供一种ST细胞全悬浮生产猪瘟活疫苗的工艺，从而降低生产成本，进行规模化、均一性生产，以应对目前国内猪瘟流行形势。本发明的技术方案1.一种使用全悬浮技术生产猪瘟疫苗的方法，其特征在于其制备方法包括细胞培养、更换细胞培养液并接毒和收获工序，即先将ST细胞用摇瓶进行悬浮培养，生长至大规模培养密度后对细胞进行离心，然后用培养液将经离心的细胞进行再悬浮后接入生物反应器进行悬浮培养，当细胞密度至病毒接种密度后更换一部分细胞培养液并接入病毒种子液，在生物反应器内继续培养至结束后收获病毒液，加入适宜的冻干保护剂混匀分装后经真空冻干而成。2.如权利要求1所述一种使用全悬浮技术生产猪瘟疫苗的方法，其特征在于所述更换细胞培养液并接毒工序为使用ST细胞在生物反应器中悬浮培养至可接毒状态时，将细胞培养液的1/3换成新的细胞培养液，并接种猪瘟病毒。3.如权利要求1所述一种使用全悬浮技术生产猪瘟疫苗的方法，其特征在于所述方法具体为：(1)将ST细胞用摇瓶悬浮培养48h～72h后离心，用细胞培养液将经离心的细胞再悬浮后以密度3×105～3×106/ml接入生物反应器，得到ST细胞全悬浮培养液；(2)待ST细胞全悬浮培养至密度为6×105/ml～6×106/ml，生物反应器15℃沉降2小时，泵出上层1/3的原培养液注入新的细胞培养液，并接种1％～5％(V/V)猪瘟病毒种毒；(3)在生物反应器中继续培养悬浮细胞96～120h，收获病毒液，收获病毒液，加入适宜的耐热冻干保护剂混匀后分装、经冷冻真空干燥制成疫苗。4.如权利要求1-3所述一种使用全悬浮技术生产猪瘟疫苗的方法，其特征在于所述的病毒为保藏号为CVCCNo.AV1412的猪瘟病毒兔化弱毒株。5.如权利要求1所述一种使用全悬浮技术生产猪瘟疫苗的方法，其特征在于所述ST细胞株的建立，是由猪睾丸传代细胞系(ST细胞系)经贴壁培养阶段的低血清驯化过程和低血清培养基的悬浮驯化过程而获得，该株细胞被命名为猪睾丸细胞系(SwineTestis)悬浮适应株(简称ST-1株)，该株细胞已于2016年08月23日送交北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏编号为此CGMCCNo.12698。以上本发明所述的细胞培养液系指低血清细胞培养液，其血清含量(V/V)为：0.5％～2％。本发明使用的生物反应器为APPLIKON公司30L～2000L生物反应器。本发明公开的ST细胞全悬浮培养猪瘟疫苗的工艺，其操作简单、可控性强、培养效率和自动化程度高、不需要载体，可以在低血清培养基中悬浮培养，为细胞或疫苗的规模化生产提供了一条新的路径。具体实施方式一、全悬浮培养的ST细胞株的建立驯化过程1.ST细胞贴壁培养阶段的驯化(降低血清)从液氮罐中取ST贴壁细胞种子(ST细胞，CVCCNo.CL27，购自中国兽医药品监察所，中国微生物菌种保藏管理中心)，在T75培养瓶中加入10％小牛血清的细胞生长液，进行ST细胞复苏，并贴壁培养，使用逐步降低血清的贴壁培养基进行传代培养驯化。血清含量从10％、8％、5％、3％、2％、1％降至0.5％。2.ST细胞(低血清培养基)的悬浮驯化将驯化成功的ST细胞F39代的一部分收获，并冻存，记为ST-1F0。ST细胞驯化过程可以看出，该细胞在贴壁阶段血清含量由10％降至低血清水平(0.5％～2.0％)，细胞的数量和活力均能达到实验要求。而从贴壁到悬浮，通过39代的驯化培养，细胞才能适应悬浮培养状态，并能稳定增值到1.2×106/ml，细胞活力达到90％以上。通过对全悬浮培养条件(pH、转速)的工艺优化，确定了pH7.0±0.1、转速120r/min，实现了ST细胞从三角培养瓶到生物反应器的扩大培养，并对生物反应器中的溶氧量进行了改进，从而完成了ST细胞从贴壁到全悬浮的整个驯化过程，并将驯化成功后的悬浮细胞命名为猪睾丸细胞系(SwineTestis)悬浮适应株，简称ST-1株，该株细胞已于2016年08月23日送交北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏编号为此CGMCCNo.12698。(详见实施例1)二、全悬浮细胞的制备1、细胞摇瓶扩大培养：细胞复苏后以5×105/ml的密度接入到125ml三角培养瓶中，以120r/min转速于37℃、5％CO2培养箱中培养。待细胞生长至1.2×106/ml时，进行传代，按照比例补加新鲜培养基，使细胞初始密度为5×105/ml。2、细胞接种：细胞接种前矫正溶氧电极，通CO2调整pH至7.0±0.1，取需要量的摇瓶细胞(密度约1.2×106/ml)离心后，用200ml(200ml/1000ml)培养基回悬后接入生物反应器培养。三、制苗用毒液的制备、配苗1、接毒：待ST-1细胞全悬浮培养至密度约6×105/ml～6×106/ml，生物反应器15℃沉降2小时，泵出上层1/3的原培养液，注入新的细胞培养液，同时接入1％～5％(V/V)的猪瘟病毒兔化弱毒株(又称C株，购自中国兽医药品监察所，中国微生物菌种保藏管理中心，保藏编号为CVCCNo.AV1412)种毒液。2、收获病毒液：在生物反应器中继续培养悬浮细胞96～120h，收获病毒液，加入适宜的耐热冻干保护剂混匀后分装、经冷冻真空干燥制成疫苗。四、猪瘟疫苗的检验(1)性状淡黄色海绵状疏松团块，易与瓶壁脱离，加稀释液后迅速溶解。(2)无菌检验按现行《中国兽药典》(中国兽药典委员会，中华人民共和国兽药典，二〇一〇年版三部，中国农业出版社，2011，以下称《中国兽药典》)附录进行检验，应无菌生长。(3)支原体检验按现行《中国兽药典》附录进行检验，应无支原体生长。(4)外源病毒检验将疫苗与猪瘟特异性抗血清中和后，接种Vero细胞、MDBK细胞、ST细胞单层，按现行《中国兽药典》附录进行检验，应无外源病毒污染。(5)鉴别检验将疫苗稀释至200TCID50/0.1ml，与等量1:10稀释的抗猪瘟病毒特异性血清混合，置37℃中和1小时后，接种已长成单层的ST细胞96孔微量细胞培养板，共接种12孔，每孔100μl。同时设不中和对照组(将疫苗稀释至200TCID50/0.1ml，与等量培养液混合)和正常细胞对照组，各接种6孔，每孔100μl。每孔补加含2％新生牛血清的细胞培养液100μl。将细胞培养板置37℃、含5％CO2培养箱中培养96～120小时，进行间接免疫荧光化学染色。置于倒置荧光显微镜下观察，中和组和细胞对照组应不出现特异性亮绿色荧光，不中和对照组应全部出现特异性亮绿色荧光。(6)安全检验选用21～28日龄健康易感猪，接种前观察5～7日，每日上、下午各测体温1次。挑选体温、精神、食欲正常的使用。每批疫苗按瓶签注明头份用灭菌生理盐水稀释成每毫升含6头份，肌肉注射猪5头，每头5ml(含30头份)。接种后，每日上、下午各观察并测体温1次，观察21日。体温、精神、食欲与接种前相比没有明显变化；或体温升高超过0.5℃，但不超过1.0℃，稽留不超过4个温次；或减食不超过1日，疫苗可判为合格。如果有1头猪体温升高1℃以上，但不超过1.5℃，稽留不超过2个温次，疫苗也可判为合格。如果有1头猪的反应超过上述标准；或出现可疑的其他体温反应和其他异常现象时，可用5头猪重检1次。重检的猪仍出现同样反应，疫苗应判为不合格。也可在猪高温期采血复归猪2头，每头肌肉注射可疑猪原血5ml，测温观察16日。如果均无反应，疫苗可判合格。如果第1次检验结果已经确证疫苗不安全，则不应进行重检。(7)效力检验将疫苗稀释至1头份/ml后，免疫5头21～28日龄健康易感仔猪，每头肌肉接种疫苗1头份，同时设对照仔猪5头。免疫后14日，连同对照猪用猪瘟病毒石门系强毒株(105.0MLD)攻毒，每头肌肉注射1ml，攻毒后观察16日。对照猪应全部发病，且至少死亡4头，免疫猪应全部健活或稍有体温反应，但无猪瘟临床症状。(8)真空度测定按《中国兽药典》附录进行测定，应符合规定。(9)剩余水分测定按《中国兽药典》附录进行测定，应符合规定。本发明涉及的生物材料资源信息本发明涉及到的猪瘟病毒(classicalswinefevervirus，CSFV)兔化弱毒株(C株)，为中国兽医药品监察所鉴定、保管和供应，保藏编号为CVCCNo.AV1412(请见中国兽医药品监察所、中国兽医微生物菌种保藏管理中心编著，中国兽医菌种目录(第二版)，中国农业科学技术出版社，2002年，p144)；猪睾丸传代细胞ST株，保藏编号为CVCCNo.CL27(中国微生物菌种保藏管理中心编著《中国兽医菌种目录》(第二版)，中国农业出版社，2002，p171)，购自中国兽医药品监察所；猪睾丸细胞系(SwineTestis)悬浮适应株，简称ST-1株，该细胞株已于2016年08月23日送交北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心CGMCCNo.12698。本发明的积极意义本发明一种使用全悬浮技术生产猪瘟疫苗的方法。本发明涉及的ST细胞全悬浮培养的工艺，其关键技术在于ST细胞全悬浮驯化成功后可在生物反应器进行猪瘟病毒的大规模培养，具有操作简单、可控性强、培养效率和自动化程度高、不需要载体等优势，为细胞或疫苗的规模化生产提供了一条新的路径。实施例以下是本发明具体的实施方案，以进一步阐述本发明，但不能解释为限制本发明的范围。本领域技术人应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改或替换均落入本发明的保护范围内。实施例1——全悬浮培养的ST细胞株的建立1.ST细胞贴壁培养阶段的驯化(低血清驯化过程)从液氮罐中取ST贴壁细胞种子，在T75培养瓶中加入10％MEM细胞生长液，进行细胞复苏培养，接种比例为1:1，24h后换液。待细胞长成致密单层且生长状态良好时，0.05％胰酶消化2遍，用移液管轻轻吹打成单细胞悬浮液，按照1:3的比例传代，进行ST细胞贴壁培养，并向下继续传代至F3。用0.05％胰酶消化液将细胞进行分离，500～1000r/min离心，使用低血清贴壁培养基重新混合均匀，以3×105～5×105个/ml进行传代培养驯化。血清含量从10％、8％、5％、3％、2％、1％降至0.5％，每个血清含量细胞状态稳定后继续传代三代，然后转到下一个血清含量。观察细胞的生长情况。见表1。经过缓慢(37代)的细胞驯化传代培养，试验结果显示用10％～5％血清含量的培养基培养细胞，48h左右即可长成致密细胞单层；从3％降至0.5％血清含量的培养基培养细胞，传第1代时，有少许死细胞，但不影响细胞贴壁和生长，传3到5代后可按照常规方法进行分瓶传代，驯化稳定后，72h左右长成致密细胞且细胞状态良好。考虑到生产成本问题，将细胞生长液的血清含量定为0.5％～2％。表1ST细胞贴壁培养低血清驯化试验结果血清含量接种密度贴壁情况生长状况数量活力10％3.2×105++++++++3.4×10698％8％2.7×105++++++++3.5×10699％5％2.9×105+++++++3.0×10696％3％3.0×105+++++++3.1×10697％2％2.8×105+++++++2.9×10697％1％3.1×105+++++++2.8×10696％0.5％3.1×105+++++++3.0×10698％2.ST细胞(含0.5％～2％新生牛血清的细胞培养液)的悬浮驯化(1)不同代次细胞悬浮培养的驯化将驯化好的低血清培养基(0.5％～2％新生牛血清的细胞培养液)培养的长成致密单层的ST贴壁细胞稳定传代3代后，记为STF0。1)待驯化好的低血清细胞培养液培养ST贴壁细胞(F5)生长成致密细胞单层时，0.05％胰酶消化，用移液管轻轻吹打成单细胞悬浮液，以5×105个/ml的密度接入到125ml三角培养瓶中，用低血清培养液补足至40ml，以120r/min转速于37℃、5％CO2培养箱中培养。每隔72h离心换液(含2％新生牛血清的MEM)，并依此方法连续培养传代，直至50代，培养过程中对每代细胞取样计数并观察细胞形态。2)待驯化好的低血清细胞培养液培养ST贴壁细胞(F8)生长成致密细胞单层时，0.05％胰酶消化，用移液管轻轻吹打成单细胞悬浮液，以5×105个/ml的密度接入到125ml三角培养瓶中，用低血清培养液补足至40ml，以120r/min转速于37℃、5％CO2培养箱中培养。每隔72h离心换液(含2％新生牛血清的MEM)，并依此方法连续培养传代，直至50代，培养过程中对每代细胞取样计数并观察细胞形态。3)待驯化好的低血清细胞培养液培养ST贴壁细胞(F11)生长成致密细胞单层时，0.05％胰酶消化，用移液管轻轻吹打成单细胞悬浮液，以5×105个/ml的密度接入到125ml三角培养瓶中，用低血清培养液补足至40ml，以120r/min转速于37℃、5％CO2培养箱中培养。每隔72h离心换液(低血清培养基)，并依此方法连续培养传代，直至50代，培养过程中对每代细胞取样计数并观察细胞形态。试验结果：从“2)”F8开始将贴壁细胞驯化为悬浮细胞，刚开始细胞死亡数较多，经过不断地离心换液传代，“2)”传至F39时，全悬浮培养72h，细胞密度达到2.26×106/ml，细胞活力达到94％。1)和3)均未驯化成功。将驯化成功的ST细胞F39的一部分收获，并冻存，记为ST-1F0。(2)培养液pH对悬浮培养细胞的影响在其他培养条件一致的条件下，将MEM培养液的pH分别设置为6.8±0.1、7.0±0.1、7.2±0.1和7.4±0.1，37℃培养72h后，取样计数并观察细胞形态。当ST细胞培养液pH为7.0±0.1时，培养液的pH下降较快，细胞生长快，细胞密度比同期其他试验组高，细胞活性也较好。当pH在6.8±0.1或7.4±0.1时，培养48h后细胞生长缓慢，细胞密度显著低于其他试验组。所以ST细胞培养液理想pH为7.0±0.1。(3)转速对悬浮培养细胞的影响培养条件同“(2)”，以不同转速进行悬浮培养，第1种:80r/min，第2种:120r/min，均在37℃培养72h后，取样计数并观察细胞形态。80r/min转速培养ST细胞，细胞聚团严重，细胞贴覆在罐壁和罐底的情况较多，而采用120r/min转速更有利于ST细胞的生长。3.低血清全悬浮培养ST-1细胞在生物反应器中放大细胞接种前一天，生物反应器中打入800ml(800ml/1000ml)培养基(含2％血清)，通饱和空气过夜。用常规方法从液氮中复苏驯化好的2％MEMST-1悬浮细胞，经500～1000r/min进行离心，将细胞加入到250ml三角瓶内，加入0.5％～2％MEM悬浮培养液，将细胞密度调整为5×105/ml，置于37℃，120rpm在摇床内进行培养。细胞生长到1.2×106/ml以上即可进行传代培养，以此方法进行放大培养。待细胞培养体积达到200ml时，可以将悬浮细胞转至3L生物反应器中进行培养。依此将细胞转入10L、30L生物反应器中，摸索细胞生长的最佳条件。将pH分别设定为7.0±0.1，溶氧量设定为40％、80％，观察在两种情况下低血清悬浮细胞ST-1在生物反应器中的增殖情况。溶氧量为40％与80％时，最高细胞密度均大于2.0×106/ml，且活力均能达到90％以上，二者相差不大。因此，选择40％溶氧量作为ST细胞悬浮培养通气量。试验结果见表2。表2ST-1悬浮细胞在各反应器中生长试验结果从ST细胞驯化过程可以看出，该细胞在贴壁阶段血清含量由10％降至低血清水平(0.5％～2％)，细胞的数量和活力均能达到实验要求。而从贴壁到悬浮，通过39代的驯化培养，细胞才能适应悬浮培养状态，并能稳定增值到1.2×106/ml，细胞活力达到90％以上。通过对全悬浮培养条件(pH、转速)的工艺优化，确定了pH7.0±0.1、转速120r/min，实现了ST细胞从三角培养瓶到生物反应器的扩大培养，并对生物反应器中的溶氧量进行了改进，从而完成了ST细胞从贴壁到全悬浮的整个驯化过程，并将驯化成功后的悬浮细胞命名为猪睾丸细胞系悬浮适应株(简称ST-1株)，该株细胞已于2016年08月23日送交北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏编号为此CGMCCNo.12698。实施例2——适应全悬浮培养的ST细胞株的扩增培养将液氮保存的猪睾丸细胞悬浮适应株ST-1复苏传代培养，后接种到生物反应器中进行全悬浮放大培养，得到ST-1细胞悬浮培养液。具体步骤如下：1.取液氮冻存的ST-1细胞株，快速复苏后加入装有培养液的摇瓶中，于36～37℃培养60～72h，按照1:3～1:5的比例传代放大培养；2.细胞接种前一天，生物反应器中打入800ml(800ml/1000ml)培养基(含2％血清)，通饱和空气过夜。3.细胞接种：细胞接种前矫正溶氧电极，通CO2调整pH至7.0±0.1，培养温度为36～37℃，取需要量的摇瓶细胞(密度约1.2×106/ml)离心后，用200ml(200ml/1000ml)培养基回悬后接入生物反应器中进行悬浮培养。实施例3——ST细胞全悬浮生产猪瘟疫苗的制备1.生产用毒种制备：取生长良好的ST细胞单层，弃去生长液，换以含1％～5％毒种的维持液，置37℃继续培养96～120h。定量分装，注明收获日期、毒种代数等，冷冻保存。2.制苗用毒液的繁殖(1)生物反应器清洗、灭菌：将生物反应器清洗干净，121℃灭菌30min。(2)细胞接种：在摇瓶中悬浮培养扩增ST-1细胞，达到一定密度1.2×106/ml后，接种入生物反应器，细胞培养条件为：反应器工作体积30升，细胞接种前矫正溶氧电极，通CO2调整pH至7.0±0.1，培养温度为36～37℃，取需要量的摇瓶细胞(密度约1.2×106/ml)离心后，用细胞培养液回悬后接入生物反应器中进行悬浮培养，连续培养2～3日。(3)接毒及收获：待ST-1细胞全悬浮培养至密度约1.2×106/ml，生物反应器15℃沉降2小时，泵出上层1/3的原培养液，注入新的细胞细胞培养液，并按细胞培养液终体积的2.0％接种猪瘟病毒C株，病毒培养条件为：温度36～37℃，pH值为7.0±0.1，溶氧为45％，培养96小时第一次收获病毒液，继续加注病毒维持液连续培养病毒96～120h，共收获4批病毒液，病毒滴度按照《中华人民共和国兽用生物制品规程》中华人民共和国农业部2000年颁布家兔定型热反应标准进行判定，收获每1ml病毒液含病毒≥5×106RID。3.半成品检验(1)无菌检验按现行《中国兽药典》附录进行检验，应无菌生长。(2)病毒含量每毫升病毒含量均≥5×106RID。4.配苗及分装将检验合格的病毒液与适宜保护剂按一定比例混合均匀后，定量分装。每头份疫苗含猪瘟病毒≥3×104RID。5.冻干分装后迅速进行冷冻真空干燥。实施例4——猪瘟疫苗成品检验1.性状淡黄色海绵状疏松团块，易与瓶壁脱离，加稀释液后迅速溶解。2.无菌检验按现行《中国兽药典》附录进行检验，均无菌生长。3.支原体检验按现行《中国兽药典》附录进行检验，均无支原体生长。4.外源病毒检验将疫苗与猪瘟特异性抗血清中和后，接种Vero细胞、MDBK细胞、ST细胞单层，按现行《中国兽药典》附录进行检验，均无外源病毒污染。5.鉴别检验将疫苗稀释至200TCID50/0.1ml，与等量1:10稀释的抗猪瘟病毒特异性血清混合，置37℃中和1小时后，接种已长成单层的ST细胞96孔微量细胞培养板，共接种12孔，每孔100μl。同时设不中和对照组(将疫苗稀释至200TCID50/0.1ml，与等量培养液混合)和正常细胞对照组，各接种6孔，每孔100μl。每孔补加含2％新生牛血清的细胞培养液100μl。将细胞培养板置37℃、含5％CO2培养箱中培养96～120小时，进行间接免疫荧光化学染色。置于倒置荧光显微镜下观察，中和组和细胞对照组未出现特异性亮绿色荧光，未中和对照组全部出现特异性亮绿色荧光。6.安全检验选用21～28日龄健康易感猪，接种前观察5～7日，每日上、下午各测体温1次。挑选体温、精神、食欲正常的使用。每批疫苗按瓶签注明头份用灭菌生理盐水稀释成每毫升含6头份，肌肉注射猪5头，每头5ml(含30头份)。接种后，每日上、下午各观6.安全检验用3～4周龄健康易感仔猪5头，每头肌肉接种疫苗10头份，观察14日，仔猪全部健活。7.效力检验将疫苗稀释至1头份/ml后，免疫5头21～28日龄健康易感仔猪，每头肌肉接种疫苗1头份，同时设对照仔猪5头。免疫后14日，连同对照猪用猪瘟病毒石门系强毒株(105.0MLD)攻毒，每头肌肉注射1ml，攻毒后观察16日。对照猪全部发病，死亡4头，免疫猪全部健活或稍有体温反应，但无猪瘟临床症状。8.真空度测定按《中国兽药典》附录进行测定，均符合规定。9.剩余水分测定按《中国兽药典》附录进行测定，均符合规定。当前第1页1 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