一种羊栖菜多糖的应用的制作方法

本发明涉及医药技术领域，具体涉及羊栖菜多糖在制备在抑制呼吸道合胞病毒(Respiratory Syncytial Virus，RSV)、肠道病毒71型(Human enterovirus 71，EV71)药物中的应用。

背景技术：

羊栖菜为马尾藻科(Sargassceae)马尾藻属植物羊栖菜(Sargassum fusiforme(Harv.)Setchell)的干燥藻体。羊栖菜习称“小叶海藻”，又名海菜、鹿角尖、海大麦等。主产于辽宁、山东、福建、浙江、广东等地海域，多为野生，夏、秋两季采捞，其干燥藻体全体入药。列于《本草纲目》草部海藻项下，记载：“羊栖菜咸能润下，寒能泄热饮水。故能消瘿瘤、结核，而除浮肿、脚气、留饮、痰气之湿热，使邪气从小便而出也”。始载于《神农本草经》，将该药列为中品，谓其主治“瘿瘤结气，散颈下硬核痛，痈肿症瘕坚气，腹中上下雷鸣，下十二水肿”。本品味苦，咸，寒，无毒。归肝、胃、肾经。有消痰软坚、利水消肿、泄热化湿的功效。性状鉴别：全体皱缩呈卷曲的团状物，黑褐色，表面被白霜，长15～40cm，质脆易碎。浸软后肉质粘滑、柔韧，主轴圆柱形，表面粗糙，具短枝，分枝互生，无刺状突起，叶状突起呈线形、棍棒状，略扁，有时先端膨大中空成气泡，或成盾状。腋间有纺锤形或球形的气囊，长5～10cm，丛生，囊柄较长。生殖托圆柱形或长椭圆形。气腥，味咸。

羊栖菜多糖(SPF)是从全藻羊栖菜中提取得到的一种水溶性多糖，羊栖菜藻体的主要成分，主要有褐藻胶和褐藻多糖硫酸酯组成。现代药理学研究表明羊栖菜多糖具有抗肿瘤、降血糖、降血脂、增强机体免疫力、延缓衰老等功效。羊栖菜的多种药理活性与其多糖结构密切相关。SPF是一类组成结构相似的酸性多糖混合物，水溶性好，粘度高，主要包括褐藻酸(Acidic Polysaccharidesof Algae，APA)、褐藻糖(Fucoidan polysaccharide sulfate，FPS)及褐藻淀粉(Laminaran)，羊栖菜中多糖的含量分析是对羊栖菜药效研究和开发利用的重要依据。

RSV是世界范围内婴幼儿病毒性下呼吸道感染最重要的病毒病原。近年来又发现RSV感染是免疫抑制成人和老年人的重要病原。绝大部分RSV感染为上呼吸道感染，但很多婴儿可发展为肺炎和下呼吸道感染。

EV71是人类手足口病(HFMD)主要病原体之一，是一类急性病毒性疾病，现已成为世界范围内的公共卫生问题。

技术实现要素：

本发明旨在提供一种羊栖菜多糖的应用。

为实现上述目的，本发明的技术方案为：

一种羊栖菜多糖的应用，所述羊栖菜多糖具有抗病毒活性，所述羊栖菜多糖的应用是指具有抗病毒活性的羊栖菜多糖在制备抗为RSV或EV71病毒药物中的应用。

优选的，羊栖菜多糖制备方法为水提醇沉法。

进一步优选的，所述水提醇沉法的具体步骤为，将羊栖菜粉末(45℃干燥2h)与蒸馏水混合后水煮、换液提取，将提取后的滤液浓缩后，加入5％三氯乙酸，离心去除蛋白质，然后将得到的溶液透析后冷冻，加入95％乙醇沉淀多糖，离心取沉淀，真空干燥即可得到羊栖菜多糖粉末。

更进一步优选的，羊栖菜粉末与蒸馏水的质量比为1:30。

更进一步优选的，换液提取次数为3次。

更进一步优选的，离心速度为5000r/min，离心时间为20-30min。

更进一步优选的，透析时间为2.5-3.5天。

本发明的有益效果是：

本发明首次发现羊栖菜多糖对RSV及EV71病毒均有显著的抑制作用，其药物抑毒指数(TI)可达1000左右，并公开了羊栖菜多糖应用于制备抗病毒药物，能够抑制RSV、EV71病毒，从而不仅可消痰软坚、利水消肿、泄热化湿，而且在治疗RSV、EV71病毒感染性疾病领域存在潜在的应用价值。

附图说明

图1为RSV病毒对照的显微镜图片：MA104细胞出现完全CPE示意图(200×)；

图2为EV71病毒对照显微镜图片：RD细胞出现完全CPE示意图；(200×)；

图3为受到保护的MA104细胞显微镜图片(200×)；

图4为受到保护的RD细胞显微镜图片(200×)。

具体实施方式

下面结合附图对本发明作进一步说明。

羊栖菜粗多糖对病毒的作用研究：

(1)制备羊栖菜多糖粗提物：

取羊栖菜粉末：蒸馏水＝1：30(g/g)，水煮4.5-6h，中间换液共提取3次。取滤液，旋蒸浓缩为原体积的1/4后，加入5％三氯乙酸调整pH为5.0-6.5，5000r/min离心20min以除去粗多糖溶液中的蛋白质，所得溶液装入透析袋中透析(3d左右)，将溶液冷冻过夜，加入4倍体积的95％乙醇沉淀多糖，离心取沉淀，真空干燥即可得到粗多糖粉末。将上述提取物分别溶于细胞维持液(含2％新生牛血清的1640，GIBICO公司产品)中备用。

(2)细胞株与病毒株：

均由山东省医学科学院基础医学研究所微生物室提供：MA104(恒河猴胚胎肾细胞，为RSV敏感细胞，如图3所示)，RD(横纹肌肉瘤细胞，为EV71敏感细胞，如图4所示)；EV71(分离自济南市传染病医院手足口病患者，经全序列测定证实为EV71)，RSV(long株，2000年10月引自中国预防医学科学院病毒所毒种室)。

(3)细胞毒性测定：

参照文献王小燕，张美英，王亚峰等，槟榔提取物体外抗柯萨奇病毒B3及单纯疱疹病毒1型和乙型肝炎病毒的研究，时珍国医国药，2008；19(12)：2954～2955的方法，点在96孔板上的细胞长成单层，将药物用细胞维持液从第1孔开始2倍比稀释12个浓度，接种在96孔板上，每个稀释度设重复3孔，在37℃、5％CO₂条件下培养，显微镜下观察其CPE，持续观察药物毒性。CPE大于50％视为毒性。然后用中性红染色，设定测定波长为540nm，测其OD值，细胞存活率为实验组与细胞对照组OD值相比结果，用Reed-Muench方法计算得到其半数中毒浓度(toxic concentration 50％，TC₅₀)。

TC₅₀＝[Antilog(log高于50％病变率药物稀释度的值－pd)]×C_{首孔药物浓度}。

(4)抑毒试验：

参照文献王小燕，张美英，王亚峰等，槟榔提取物体外抗柯萨奇病毒B3及单纯疱疹病毒1型和乙型肝炎病毒的研究，时珍国医国药，2008；19(12)：2954～2955的方法，点在96孔板上的细胞长成单层，将药物用细胞维持液从第1孔开始2倍比稀释12个浓度，接种在96孔板上(50μL/孔)，每个稀释度设重复3孔，设细胞对照、病毒对照。除细胞对照外，各孔加100TCID50的病毒50μL。35℃、5％CO₂条件下培养，显微镜下持续观察细胞病变直至病毒对照CPE达到90％后终止培养。用酶标仪测定吸光度A值，CPE50％的稀释度视为药物半数有效浓度(concentration for 50％of maximal effect，EC₅₀)。

EC₅₀＝[Antilog(log高于50％存活率药物稀释度的值－pd)]×C_{首孔药物浓度}。根据所测药物半数中毒浓度(TC₅₀)及药物半数有效浓度(EC₅₀)，二者相比获得抑毒指数(TI)，TI大于4者判为有效。

(5)结果：

①药物半数中毒浓度TC₅₀的测定：在显微镜下观察对照组细胞形态良好、贴壁生长致密。药物组细胞破碎、呈现中毒形态，测得OD值，根据公式计算药物的TC₅₀。羊栖菜多糖的TC₅₀在MA104为2^-1.3；在RD为2^-1.6。

②药物抗病毒试验：显微镜下观察发现，对照组的细胞形态良好、贴壁致密；而RSV、EV71病毒对照组均在24h左右出现90％以上的CPE，RSV在MA104中CPE以坏死、破碎为主要特征(如图1所示)；EV71在RD中CPE以折光性增强、变圆、脱落为主要特征(如图2所示)。

而抗病毒试验的各组细胞，按照药品稀释梯度(每次稀释一倍，共12次)，梯度规律出现CPE：

a.RSV试验组：RSV-MA104在第5稀释度之前细胞完全被保护，之后出现CPE，并且CPE呈现随药品浓度减小逐渐显著的规律。

b.EV71试验组：EV71-RD在第9稀释度之前细胞完全被保护，之后出现CPE，并且CPE呈现随药品浓度减小逐渐显著的规律。

将试验的96孔板用1％中性红染色、在540nm处用酶标仪测吸光度值A，各组A值减掉病毒对照组A值后，各实验组A值与细胞对照组A值相比获得EC₅₀，EC₅₀与TC₅₀相比获得TI，如表1所示：

a.RSV试验组：抑制RSV在MA104细胞发生CPE，EC₅₀为2^-11.2μg/mL，TI为955.43。

b.EV71试验组：抑制EV71在RD细胞发生CPE，EC₅₀为2^-11.8μg/mL，TI为1176.27。

为便于观察与比较，上述内容详见表1。

表1羊栖菜多糖抑毒试验结果

从上表可以看出，羊栖菜多糖粗提物对RSV、EV71两种病毒均有显著的抑制作用，这提示羊栖菜多糖不仅可消痰软坚、利水消肿、泄热化湿，而且在治疗RSV、EV71病毒感染性疾病领域存在潜在的应用价值。本发明为羊栖菜多糖临床用于治疗病毒感染性疾病提供实验依据，对研制抗RSV和EV71病毒的药物提供了一定的指导意义，具有重要的参考价值。

上述虽然结合附图对本发明的具体实施方式进行了描述，但并非对发明保护范围的限制，所属领域技术人员应该明白，在本发明的技术方案的基础上，本领域技术人员不需要付出创造性劳动即可做出的各种修改或变形仍在本发明的保护范围内。