灵芝孢子油在制备缓解阿霉素心脏毒性的药物中的应用的制作方法

本发明属于医药保健领域，具体涉及到灵芝孢子油在制备缓解阿霉素心脏毒性的药物中的应用。

背景技术：

阿霉素是上世纪60年代初由米兰Farmitalia研究室首次从松链丝菌浅灰色变株提取的蒽环类抗生素，1974年在美国获准临床使用，是对血液系统肿瘤和实体肿瘤具有高效作用的化疗药物，具有抗肿瘤谱广、疗效高的特点，但因其对正常细胞(心脏、肝脏、肾脏等细胞)具有毒性作用，严重制约阿霉素的临床应用，阿霉素对正常细胞的毒性主要来自于线粒体功能破化及产生有损伤作用的氧自由基，阿霉菌进入心肌后，被线粒体NADHP P450还原酶和线粒体NADH氧化还原酶催化为半鲲代谢物，直接损伤细胞核和细胞成分，引起细胞损伤，此外，半鲲代谢物可将电子传递给氧分子和水，使其变成超氧阴离子和超氧化自由基，引起细胞膜脂质和蛋白的氧化。同时抗氧化酶可以将过氧化氢转变成对细胞无害的水和氧气，而心肌细胞内抗氧化酶的含量相对降低，更容易受到自由基的损害。目前，寻找可有效缓解其心脏毒性的物质成为临床上亟待解决的问题。

灵芝Ganoderma lucidum(Leyss.ex.Fr.)Karst是我国著名的高等药用真菌，作为药物已有2000多年的历史了，灵芝的整个生活史包括：灵芝菌丝体、灵芝孢子和灵芝子实体，但三者在化学成分上有显著性差异，于华峥等(2016)研究报道显示：灵芝子实体、菌丝体和孢子粉不仅多糖含量差异较大，灵芝菌丝体多糖含量达3.81％，孢子粉多糖含量为1.8％，灵芝子实体中多糖含量仅为0.59％，且在多糖的组成也有很大差异，通过HPLC分析发现这3种材料所含多糖的种类也不一致，酶解其链接方式也不一致；陈军辉等研究报道：灵芝子实体中含有丰富的灵芝酸、灵赤酸、赤芝酸甲酯、灵芝孢子内酯等三萜类成分，保留时间50min之前的峰多数为灵芝酸类化合物，与灵芝孢子粉相对，灵芝子实体中含有三萜酸类化合物的含量明显比孢子粉中的高。灵芝孢子是灵芝生长成熟期从菌盖弹射出来极其细小的孢子，为灵芝的生殖细胞，具有灵芝的全部遗传活性物质，经萃取后获得灵芝孢子油是灵芝孢子的脂质活性成分，陈体强等研究定量分析结果表明：灵芝孢子油中检出9种已知脂肪酸，不饱和脂肪酸总量为73.6％，其中油酸、亚油酸等含量分别为57.5％、13.4％，还有少量十六碳烯酸、亚麻酸及19.6％饱和脂肪酸棕榈酸。

综上所述，灵芝孢子和子实体虽是灵芝生活史重要生长阶段，但灵芝子实体和灵芝孢子在化学成分种类和含量上有显著性差异，灵芝子实体的脂溶性活性成分集中在总三萜上，其多糖含量低，单糖主要为葡萄糖和半乳糖；而灵芝孢子的脂溶性活性成分集中在不饱和脂肪酸上，其多糖含量高，单糖主要为葡萄糖。截止目前，关于灵芝改善心血管疾病的报道均集中在灵芝子实体提取的三萜类物质和多糖类物质上，而关于灵芝孢子及灵芝孢子油在改善心血管功能的研究尚未见报道。

技术实现要素：

针对上述情况，本发明的目的是提供一种灵芝孢子油在制备缓解阿霉素心脏毒性的药物中的应用。本发明以收缩期和舒张期左室收缩期内径、舒张期内径、心肌组织病理切片、心肌组织TUNEL凋亡检测等作为观测指标，对其心功能进行分析，结果显示，从灵芝孢子中提取分离的活性成分灵芝孢子油与阿霉素联合给药可改善阿霉素对心脏的不良影响，尤其是左心室的舒张能力有明显改变。说明灵芝孢子油可明显缓解阿霉素对心脏的毒性作用，可用于制备消除化疗物质阿霉素对心脏毒副作用的药物或具有与阿霉素协同抗肿瘤作用的药物。

上述应用中，所述的灵芝孢子油可通过索氏萃取法、超临界CO₂萃取法、微波提取法和超声提取法中的一种获得。

所述索氏提取法的萃取条件：以石油醚为溶剂，60-80℃回流提取6-8h，灵芝孢子粉的质量与石油醚的体积比为30-40g/L。

所述超临界CO₂萃取法获取灵芝孢子油的萃取条件是：萃取压力10-40MPa；萃取温度20-50℃；萃取时间0.5-6h；CO₂流量60-150L/h；一级分离压力为8-10MPa、分离温度为25-45℃；二级分离压力5-8MPa、分离温度为30-50℃，萃取过程还可以加入夹带剂，如无水乙醇、乙酸乙酯等，加入量为投入量的5-100％。

所述微波提取法的萃取条件：按料液比4:1-15:1g/mL加入石油醚，微波功率400-1000W、提取时间2-20min、提取温度30-60℃。

所述超声波提取法的萃取条件：按料液比4:1-15:1g/mL加入石油醚，超声波功率400-800W、温度30-60℃、提取时间2-30min。

本发明的优点及应用效果：

(1)本发明为消除化疗物质对心脏的毒副作用提供了一种新的方向，且灵芝孢子油是一种纯天然药物，毒副作用小，既可以用作治疗药物，也可以用作预防药物；

(2)本发明首次验证了灵芝孢子油在防治阿霉素心脏毒性中的应用效果，实现了降低阿霉素毒性的同时，还可以间接提高阿霉素抗肿瘤的疗效。

【附图说明】

图1为本发明实施例试验结束时各处理组中试验小鼠的照片；

图2为本发明实施例试验结束时各处理组中试验小鼠的体重；

图3为本发明实施例中个处理组小鼠胸骨长轴的B-Mode图像；

图4为本发明实施例中各处理组小鼠的心脏射血分数；

图5为本发明实施例中各处理组小鼠的左心室短轴缩短率；

图6为本发明实施例中各处理组小鼠的左心室收缩期内径；

图7为本发明实施例中各处理组小鼠的左心室舒张期内径；

图8为本发明实施例中各处理组小鼠的左心室收缩和舒张最大速率±dp/dtmat；

图9为本发明实施例中各处理组小鼠心肌组织病理检测结果；

图10为本发明实施中各处理组小鼠心肌组织TUNEL凋亡检测显微镜图像；

图11为本发明实施中各处理组小鼠心肌组织TUNEL凋亡检测结果。

【具体实施方式】

为了验证本发明的应用效果，下面结合实施例对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。在未作说明的情况下，本发明采用的试剂、设备和方法均为本技术领域常规市购的试剂、设备和常规使用的方法。

灵芝孢子油的制备：本实施例中所用的灵芝孢子油是采用申请号为200610035574.8发明专利所述的方法获得的，但是本发明中的灵芝孢子油并不局限于此。

实验设计与分组：所有小鼠随机分为3组：正常对照组、阿霉素组和联合给药组，每组小鼠均为15只BALB/c鼠，各组小鼠的处理如下：

正常对照组：小鼠心脏腹腔注射生理盐水，每次腹腔注射25mg/kg，每隔1天注射1次，共计注射10次。

阿霉素组：小鼠心脏腹腔注射阿霉素，每次腹腔注射25mg/kg，每隔1天注射1次，共计注射10次进行诱导建立DOX(阿霉素)小鼠模型；

联合给药组：在阿霉素注射后，进行灵芝孢子油灌胃，剂量为60uL/次，每隔1天灌胃1次，共计灌胃10次。

实验周期为3周，停药次日超声心动检测；计算小鼠存活率，并称重；左心室部分多聚甲醛固定，用于HE病理检测及TUNEL凋亡检测。

灵芝孢子油对小鼠死亡率和平均体重变化值的影响：

在给药3周后，正常组小鼠无死亡，其余组小鼠实验期间均出现死亡。如表1所示，阿霉素组死亡率较高，为60％；联合给药组死亡率为26.7％。如图2-3所示与正常对照组相比，阿霉素组小鼠体重明显下降，而与阿霉素组相比，联合给药组小鼠体重明显有提高，这说明阿霉素对小鼠体重具有较明显的抑制作用。

表1各处理组小鼠的死亡情况

灵芝孢子油对小鼠血流动力学的影响：

小鼠腹腔注射异氟烷麻醉，用褪毛剂将小鼠的胸毛剃光，卧位放置于操作台，调节超声探头部位以获取胸骨长轴的B-Mode图像，然后用血流动力学测定左心室(LV)收缩期内径(LVIDs)、舒张期内径(LVIDd)和左心室收缩和舒张最大速率±dp/dtmax(mmHg/s)指标、计算心脏射血分数，结果如图3-8所示，与对照组比，阿霉素组小鼠左心室短轴缩短率(FS％)、心脏射血分数(EF％)和左心室收缩和舒张最大速率±dp/dtmax(mmHg/s)显著降低，而收缩期内径(LVIDs)和舒张期内径(LVIDd)显著提高；灵芝孢子油与阿霉素联合给药组小鼠与阿霉素组相比，左心室短轴缩短率(FS％)、心脏射血分数(EF％)和左心室收缩和舒张最大速率±dp/dtmax(mmHg/s)显著提高，且左心室收缩期内径(LVIDs)、舒张期内径(LVIDd)显著降低。

灵芝孢子油对小鼠心肌组织影响：

各处理组小鼠在取血后，迅速处死取出心脏，小心切取左心室组织，用10％的福尔马林固定2-3天，经过脱水、透明、浸蜡、包埋后进行石蜡处理切片，HE染色。如图9所示，显微镜观察，与正常对照组相比，阿霉素组小鼠心肌发生明显肿大，而灵芝孢子油联合阿霉素使用，可明显改善心肌肥大现象。

心肌组织TUNEL凋亡检测

心肌组织在固定、切片后，二甲苯中脱蜡5-10分钟。换用新鲜的二甲苯，再脱蜡5-10分钟。无水乙醇5分钟。90％乙醇2分钟。70％乙醇2分钟，蒸馏水2分钟。滴加20μg/ml不含DNase的蛋白酶K，20-37℃作用15-30分钟。PBS或HBSS洗涤3次。在样品上加50μl TUNEL检测液，37℃避光孵育60分钟。用抗荧光淬灭封片液封片后荧光显微镜下观察，如图10-11所示。可以使用的激发波长范围为450-500nm，发射波长范围为515-565nm(绿色荧光)。结果显示：TUNEKL检测表明阿霉素治疗组小鼠心肌凋亡明显，而联合给药组可明显减少心肌细胞的凋亡。

综合以上结果，灵芝孢子油可以有效缓解化疗药物阿霉素对心脏的毒性作用，通过改善左心室舒张能力、心脏射血分数、缓解心肌组织的细胞凋亡和心肌肿大现象，从而降低化疗药物阿霉素的毒副作用，可联合阿霉素用于制备复合抗肿瘤药物。

以上所述，仅为本发明的较佳的具体实施例，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围内。