本发明涉及制药领域，具体涉及一系列三萜化合物在制备用于抑制肠道apoB48合成、分泌的药物中的应用。特别是在制备抗高血脂症药物、抗心脑血管疾病药物、抗动脉粥样硬化疾病药物等方面的用途。
背景技术：
高血脂症是指血清脂质水平异常升高的状态，主要表现为血清总胆固醇、甘油三酯、低密度脂蛋白水平过高以及高密度脂蛋白水平过低，被认为是诱发心脑血管疾病如脑中风、冠心病、动脉粥样硬化、心肌梗塞等重要的危险因素。全球每年因高血脂诱发的心脑血管疾病死亡率占所有疾病死亡率的30～40％。
人体血脂来源于内源性自身合成以及外源性从膳食中摄入。随着生活水平的提高，人们倾向于摄入过多的高脂饮食。因此，外源性脂质过度吸收已成为引发高血脂症的重要原因，而控制外源性脂质摄入成为调控血脂水平的重要策略之一。临床上抑制脂质吸收的药物如依折麦布、阿伐麦布等，均可通过选择性抑制胆固醇的吸收起到降血脂作用。但上述药物仍存在一定的毒副作用，如肝肾毒性、肌肉毒性以及各种胃肠道反应，临床应用存在一定局限性。因此，开发新的调控脂质吸收的药物具有重要的临床意义和应用前景。
载脂蛋白B48(apoB48)是小肠吸收脂质所必须的载脂蛋白。膳食中的脂质由小肠上皮细胞摄取，与apoB48合成乳糜微粒后，经淋巴循环分泌入血。apoB48是肠源性脂蛋白公认的的特征标志。研究表明在某些病理情况下，如高脂血症、冠心病、胰岛素抵抗、糖尿病等代谢疾病，患者表现为空腹血浆apoB48水平异常。血浆apoB48水平升高，引起富含甘油三酯脂蛋白残粒在血管壁沉积，形成动脉粥样硬化斑块。因此，调节小肠apoB48水平有助于改善外源性脂质吸收，从而降低高脂血症引起的心血管疾病等发生危险。而目前针对调控肠道apoB48的药物开发有限，并没有特征性抑制apoB48水平的药物。
技术实现要素：
本发明针对目前调控肠道apoB48的药物开发的局限性，公开了青钱柳三萜化合物在制备用于抑制肠道apoB48合成、分泌的药物中的应用。
本发明所涉及的三萜化合物，其特征在于：从青钱柳中获得或从商业途径购买得到，具有由通式I、II或III所示的三萜化合物。
更优选的通式I、II、III所述的三萜化合物是下述三萜化合物中的任一种或多种的组合。
13：(12R，20S，24S)-20，24-dihydroxy-3，4-secodammara-2(28)，25-dien-3-oic acid-12-O-α-L-arabino pyranoside
14：(20S，24R)-(3β，12β)-20，24-epoxydammara-25-ol-12-O-β-D-quinovopyranosyl-3-O-α-L-arabinopyranoside
15：(20S，24R)-(3α，12β)-20，24-epoxydammara-25-ol-12-O-β-D-quinovopyranosyl-3-O-α-L-arabinopyranoside
16：(23E)-(12R，20S)-20-hydroxy-3，4-secodammarane-4(28)，23，25-trien-3-oic acid-12-O-β-D-quinovopyranoside
其中：Ra：β-D-Xyl(p)-(1→3)-α-L-Rha-(1→2)-α-L-Ara(p)；Rb：α-L-Rha-(1→4)-β-D-Glu-(1→6)-β-D-Glu
本发明提供抑制肠道apoB48合成、分泌的药物包括权利要求2通式I、II、III或权利要求3所述的三萜化合物中任意一种或多种的组合与药学上可接受的辅料或辅助性成分制备成药学上常用的制剂。
本发明提供抑制肠道apoB48合成、分泌的药物可以是片剂、胶囊、颗粒剂、散剂、糖浆剂、口服液或注射剂。
附图说明
图1为青钱柳三萜单体化合物对Caco-2细胞分泌(A)和胞内(B)的apoB48的影响
具体实施方式
下面通过实施例具体说明本发明的内容。在本发明中，一下所述的实施例是为了更好的阐述本发明，而不是用来限制本发明的范围。
实施例1 青钱柳三萜化合物的制备
干燥的青钱柳叶48.5kg，用80％乙醇加热回流提取3次，每次提取2h，合并提取液，减压浓缩至无醇味，残留物加水混悬后，依次用氯仿、乙酸乙酯萃取，分别回收溶剂后得氯仿部位(3.65kg)、乙酸乙酯部位(120g)和剩余水部位。
取氯仿部位浸膏3kg，经减压硅胶柱色谱，以三氯甲烷-甲醇(100∶0、100∶5、5∶1、0∶100)梯度洗脱，每个梯度为合并到一起，得4个流分(Fr.1～4)。Fr.2(400g)再经硅胶柱色谱，以三氯甲烷-甲醇(100∶3→0∶100)梯度洗脱，TLC检视，合并得4个亚流分(Fr.2a～2d)。Fr.2a经硅胶柱色谱以三氯甲烷-甲醇(100∶0→1∶1)梯度洗脱，Sephadex LH-20柱色谱以三氯甲烷-甲醇(1∶1)洗脱，制备HPLC(85％甲醇-水)分离，经氯仿-甲醇反复重结晶，得化合物23(15mg)、32(10mg)、30(700mg)、34(35mg)、35(900mg)、37(600mg)、47(20mg)。Fr.2b经硅胶柱色谱以三氯甲烷-甲醇(100∶3→1∶1)梯度洗脱，得5个亚流分(Fr.2b-1～Fr.2b-5)。其中Fr.2b-2经Sephadex LH-20柱色谱以三氯甲烷-甲醇(1∶1)洗脱，ODS反相柱色谱以甲醇-水(50∶50→100∶0)梯度洗脱，经氯仿-甲醇反复重结晶，得化合物31(1000mg)、36(4mg)、46(15mg)、48(30mg)。Fr.2b-3经ODS反相柱色谱以甲醇-水以(50∶50→100∶0)梯度洗脱，制备HPLC以甲醇-水73％等度洗脱，得化合物50(5mg)、51(2mg)。Fr.2c经Sephadex LH-20柱色谱以三氯甲烷-甲醇(1∶1)洗脱，ODS反相柱色谱，甲醇-水(50∶50→100∶0)梯度洗脱，通过制备HPLC(65％甲醇-水)等度洗脱，得49(3mg)。Fr.3(100g)经硅胶柱色谱，以三氯甲烷-甲醇(100∶5、7∶1、5∶1、1∶1、0∶100)梯度洗脱，TLC检视合并样品，得5个亚流分(Fr.3a～3e)。Fr.3b经ODS反相柱色谱以甲醇-水(40∶60→100∶0)梯度洗脱，合并得4个亚流分(Fr.3b-1～3b-4)。Fr.3b-1经硅胶柱色谱三氯甲烷-甲醇(20∶1)等度洗脱，得化合物22(18mg)。Fr.3b-2经Sephadex LH-20柱色谱以三氯甲烷-甲醇(1∶1)洗脱，反复硅胶柱以三氯甲烷-甲醇(10∶1)等度洗脱，得化合物4(35mg)、11(60mg)、14(25mg)。Fr.3b-3上5％减活硅胶柱，以三氯甲烷-甲醇(100∶5→0∶100)梯度洗脱，制备HPLC(80％甲醇-水)等度洗脱，得到化合物20(10mg)、21(5mg)。Fr.3c反复经ODS反相柱色谱甲醇-水(60∶40)等度洗脱，硅胶柱以氯仿-甲醇(10∶1)等度洗脱，制备HPLC(50％乙腈-水)制备得化合物18(60mg)、19(40mg)。
实施例2 化合物结构鉴定数据
50 3β，23-二羟基-1，12-二氧-齐墩果酸(3β，23-dihydroxy-1，12-dioxo-olean-28-oic acid)
白色粉末(甲醇)，mp 287～289℃，(c 0.095MeOH)，易溶于氯仿、甲醇、乙腈等有机溶剂，Liebermann-Burchard反应阳性，香草醛-浓硫酸显蓝紫色。IR(KBr)cm-1：3441，2946，1696，1050；UVλmax(CH3OH)：203nm。HR-TOF-MS m/z：501.3218[M-H]-(C30H45O6，calcd.501.3216)，分子式为C30H46O6，分子量为502。UV光谱显示在处有最大吸收峰。IR光谱显示有强的羟基吸收峰(cm-1)、C-H键伸缩振动吸收峰(cm-1)、羰基吸收峰(cm-1)和C-O键伸缩振动吸收峰(cm-1)。1H NMR(C5D5N，600MHz)和13C NMR(C5D5N，125MHz)数据见表1。
51 3β，23，27-三羟基-1-氧-12-烯-28-齐墩果酸(3β，23，27-trihydroxy-1-oxo-olean-12-ene-28-oic acid)
白色粉末(甲醇)，mp 261～263℃，(c 0.063，MeOH)。易溶于氯仿、甲醇、乙腈等有机溶剂，Liebermann-Burchard反应阳性，香草醛-浓硫酸显蓝紫色。IR(KBr)cm-1：3441，2945，1696，1633；UVλmax(CH3OH)：204nm。HR-ESI-MS m/z：520.3625[M+NH4]+(C30H50NO6，calcd.520.3633)，分子式为C30H46O6，分子量为502。1H NMR(C5D5N，500MHz)和13C NMR(C5D5N，125MHz)数据见表1。
表1 化合物50和51NMR数据(C5D5N，J in Hz)
20 20S，24-内酯-达玛-(3α，12β)-12-O-β-D-鸡纳吡喃糖基-3-O-α-L-阿拉伯呋喃糖苷[20S，24-lactone-dammar-(3α，12β)-12-O-β-D-quinovopyranosyl-3-O-α-L-arabinofuranoside]
白色粉末(甲醇)，mp 140～142℃，(c 0.081，MeOH)，易溶于甲醇、乙腈，Liebermann-Burchard和Molish反应均呈阳性，香草醛-浓硫酸显紫红色。IR(KBr)cm-1：3439，2929，1640，1070；UVλmax(CH3OH)：203nm。HR-ESI-MS m/z：728.4607[M+NH4]+(C38H66NO12，calcd.728.4580)，分子式为C38H62O12，分子量为710。1H NMR(C5D5N，500MHz)和13C NMR(C5D5N，125MHz)见表2和表3。
21 20S，24-内酯-达玛-(3α，12β)-12-O-β-D-鸡纳吡喃糖基-3-O-(5′-O-乙酰基)-α-L-阿拉伯呋喃糖苷[20S，24-lactone-dammar-(3α，12β)-12-O-β-D-quinovopyranosyl-3-O-(5′-O-acetyl)-α-L-arabinofuranoside]
白色粉末(甲醇)，mp 136～138℃，(c 0.104，MeOH)，易溶于甲醇、乙腈，Liebermann-Burchard和Molish反应均呈阳性，香草醛-浓硫酸显紫红色。IR(KBr)em-1：3442，2929，1643，1068；UVλmax(CH3OH)：224、203nm。HR-ESI-MS m/z：775.4277[M+NH4]+(C40H68NO13，calcd.770.4716)，分子式为C40H64O13，分子量为752。1H NMR(C5D5N，600MHz)和13C NMR(C5D5N，150MHz)见表2和表3。
22(20S，24R)-环氧-达玛烷(3β，12β)-25-羟基-12-O-β-D-吡喃鸡纳糖基-3-O-(4′-O-乙酰基)-β-D-呋喃鸡纳糖苷[(20S，24R)-epoxydammarane(3β，12β)-25-hydroxyl-12-O-β-D-quinovopyranosyl-3-O-(4′-O-acetyl)-β-D-quinovopyranoside]
白色无定形粉末(甲醇)，mp 146～148℃，(c 0.086，MeOH)，易溶于甲醇、乙腈，Liebermann-Burchard和Molish反应均呈阳性，浓硫酸-香草醛反应显紫红色。IR(KBr)cm-1：3441，1642，1071；UVλmax(CH3OH)：225、203nm。HR-ESI-MS m/z：828.5473[M+NH4]+(C44H78NO13，calcd.828.5468)，分子式为C44H74O13，分子量为810。1H NMR(C5D5N，500MHz)和13C NMR(C5D5N，125MHz)见表2和表3。
表2 化合物20～22苷元NMR数据(C5D5N，J in Hz)
表3 化合物20～22糖基NMR数据(C5D5N，J in Hz)
实施例3 青钱柳三萜化合物调节Caco-2细胞分泌apoB48的活性
1.材料
1.1 供试品
供试品为青钱柳中分离得到的22个三萜化合物，编号为4、11、14、18～23、30～32、34～37和46～51，结构式如前所述。供试品储备液：取三萜化合物1mg，溶解于100μL的二甲基亚砜(DMSO)中，再用PBS稀释10倍，于4℃保存，待用。
1.2 药品与试剂
Caco-2细胞株购自南京凯基生物科技发展有限公司(批号20151019)。
表4 实验试剂及药品
2.实验方法
2.1 Caco-2细胞模型的建立
(1)Caco-2细胞的复苏
将前期冻存的Caco-2细胞放入37℃温水中使其融化，用含10％FBS的完全DMEM高糖培养基稀释，1000rpm离心10min，弃掉上清，重新加入含10％FBS的DMEM吹匀后，转移至25cm2透气培养瓶中于5％CO2、37℃条件下静置培养。如培养基若发生pH值、颜色变化，更换新鲜培养基。
(2)Caco-2细胞的培养与传代
细胞传代：细胞接种后，每天观察生长密度，待汇合度80～90％(5～7d)，PBS清洗细胞；用0.25％胰蛋白酶消化(37℃孵育4～5min)，显微镜观察，至细胞间隙变大、细胞质收缩，快速加入血清终止消化；加培养基后适度吹打细胞至细胞完全脱落，离心，均匀接种于干净的培养瓶中继续培养。
(3)Transwell小室模型的建立
当Caco-2细胞生长至细胞融合时，胰酶消化后制备细胞悬液，将4×104～5×105个细胞/cm2接种于6孔Transwell培养槽中(24mm，0.4μm)，向顶孔和基底孔小室(分别对应肠腔侧及浆膜侧)各加入定量的完全DMEM培养基，隔天换液，于接种后15～20d，通过细胞电阻仪测定跨上皮细胞电阻，确定细胞单层的完整性。
2.2 MTT筛选三萜化合物给药剂量
用PBS配制MTT储存液(5mg/mL)，过0.22μm滤膜除菌，于4℃保存，待用。
收集对数生长期的Caco-2细胞，接种到96孔板上，每孔加入细胞悬液200μl，使密度为5×103～1×104，于37℃、5％CO2条件培养至细胞贴壁，加入三萜单体化合物(梯度浓度：10～100μM)，各浓度设4个复孔，放入培养箱中，37℃、5％CO2及饱和湿度条件下继续培养24h后，每孔加入10μL MTT(10mg/mL)，继续孵育3h，洗掉上清液，加入100μL DMSO，震荡10min使晶体物充分溶解，在490nm处，用酶标仪测定490nm处结晶溶液的OD值。根据调零孔、空白孔及样品孔OD值，计算给药组细胞存活率(高于90％)，确定三萜化合物无细胞毒活性的剂量小于25μM。
2.3 Elisa测定apoB48含量
(1)细胞培养和药物干预
用不完全培养基或PBS清洗细胞，按照以下各组给予对应药物处理：空白对照组(Blank)，模型组(Control)，三萜单体化合物(10μM)，阳性组辛伐他汀(Statin，10μM)。取已培养于Transwell小室内的分化Caco-2细胞，对照组用0.1％牛血清白蛋白的不完全培养基孵育，模型组、给药组和阳性组用不完全培养基溶解的油酸-牛血清白蛋白(4∶1)孵育细胞，刺激apoB48的合成与分泌。同时，给药组于顶孔中分别加入待测化合物，37℃、5％CO2的条件下，在不完全DMEM培养基中共培养24h。
(2)蛋白提取和含量测定
细胞共培养24h后，分别收集顶室和底室的培养基，PBS清洗细胞2次，加入细胞裂解缓冲液，用移液枪吹打细胞至细胞完全脱落、裂解并释放蛋白，离心(10,000～14,000g)约3～5min，取上清液于-80℃保存待测。
(3)ELISA测定Caco-2细胞apoB48的分泌
取细胞分泌液及裂解上清液，参照apoB48ELISA试剂盒说明书，用酶标仪在450nm下测定OD值，分别计算胞内及胞外分泌的apoB48含量。
3.结果
青钱柳中三萜单体化合物对Caco-2细胞分泌和胞内的apoB48调节作用如图1所示。相比空白组，油酸刺激能够增加Caco-2细胞分泌(图1A)和胞内合成(图1B)的apoB48。图1A中，与模型组比较，三萜苷元23、30、31、35、36、37、50和三萜皂苷14、18、19、22能显著降低apoB48的分泌水平(p＜0.05)，其中化合物14、22、34、36、37、50降低apoB48水平达25.3％、26.8％、27.5％、25.1％、27.1％、27.3％，阳性对照辛伐他汀同样能显著降低apoB48分泌水平(p＜0.05)；而34增加apoB48的分泌水平约27.5％(p＜0.01)。化合物18、19和50显著降低Caco-2细胞胞内apoB48水平约29.7％、33.5％和35.3％(p＜0.05)，辛伐他汀给药后，具有相似结果(p＜0.05)；而化合物47增加胞内合成apoB48约17.8％(p＜0.05)；其它三萜化合物对胞内apoB48水平影响较小，均无显著性影响，如图1B所示。