本发明涉及医药，特别是一种肉苁蓉苯乙醇苷在制备治疗围绝经期综合征药物中的应用。
背景技术：
肉苁蓉(学名：Cistanche deserticola Ma)，别名疆芸、寸芸、苁蓉、查干告亚(蒙语)，味甘，咸；性温，归肾、大肠经，补肾阳；益精血；润肠道。主肾阳虚衰，精血不足之阳痿，遗精，白浊，尿频余沥，腰痛脚弱，耳鸣目花，月经衍期，宫寒不孕，肠燥便秘。
围绝经期综合征是指妇女绝经前后的一段时期(从45岁左右开始至停经后12个月内的时期)，包括从接近绝经出现与绝经有关的内分泌、生物学和临床特征起至最后1次月经后1年，也就是卵巢功能衰退的征兆，一直持续到最后1次月经后1年，是正常的生理变化时期。但在围绝经期易发生不适，临床表现为月经改变，面部潮红、阵阵发热、出汗等血管舒张症状。情绪不稳定、激动易怒、抑郁多烦、记忆力减退、工作能力下降等，皮肤皱纹逐渐增多，有的出现瘙痒、毛发开始变白脱落。腹部和臀部脂肪增多，容易发胖，血压易波动，常出现高血压、心前区闷痛不适、心悸、气短，动脉硬化发生率增加，冠心病发病率也上升，骨质疏松，上述症状被称为围绝经期综合征。
现虽有治疗围绝经期综合征的多种药物，但至今未见有从蛇床子中提取的肉苁蓉苯乙醇苷在制备治疗围绝经期综合征药物中的应用。
技术实现要素：
针对上述情况，为克服现有技术之缺陷，本发明之目的就是提供一种肉苁蓉苯乙醇苷在制备治疗围绝经期综合征药物中的应用，可有效解决肉苁蓉苯乙醇苷作为唯一活性成分在制备围绝经期综合征药物中的应用问题。
本发明解决的技术方案是，肉苁蓉苯乙醇苷作为唯一活性部位(成分)在制备治疗围绝经期综合征药物中的应用，该肉苁蓉苯乙醇苷是将肉苁蓉粉碎成粗粉，加乙醇浸泡，回流提取，滤过，滤液减压回收乙醇至无醇味，加蒸馏水分散，得药液；药液上AB-8型大孔吸附树脂，先用蒸馏水洗脱，弃去水洗脱液；再质量浓度20％乙醇洗脱，弃去洗脱液；再用质量浓度的80％乙醇洗脱，收集80％乙醇洗脱液，减压回收乙醇至无醇味，冷冻干燥，粉碎，得肉苁蓉苯乙醇苷。
本发明制备的肉苁蓉苯乙醇苷作为唯一活性成分在制备治疗围绝经期综合征药物中的应用，制备方法简单，易操作，生产效率高，有效用于制备治疗围绝经期综合征的药物，开拓了蛇床子的新用途，是中药上的创新，有显著的经济和社会效益。
具体实施方式
以下结合具体情况对本发明的具体实施方式作详细说明。
本发明在具体实施中，肉苁蓉苯乙醇苷作为唯一活性部位(成分)在制备治疗围绝经期综合征药物中的应用，该肉苁蓉苯乙醇苷是将肉苁蓉粉碎成过20-30目筛的粗粉，加肉苁蓉10倍重量、质量浓度70％乙醇浸泡0.5h，回流提取1h，滤过，得第一次滤液；药渣加肉苁蓉10倍重量、质量浓度70％乙醇浸泡0.5h，回流提取1h，滤过，得第二次滤液，合并两次滤液，减压回收乙醇至无醇味，加蒸馏水分散至相当于含药量0.3g/ml，得药液；药液上AB-8型大孔吸附树脂，先用2倍柱体积蒸馏水洗脱，弃去水洗脱液；再用4倍柱体积、质量浓度20％乙醇洗脱，弃去洗脱液；再用8倍柱体积、质量浓度的80％乙醇洗脱，收集80％乙醇洗脱液，减压回收乙醇至无醇味，冷冻干燥，粉碎，得肉苁蓉苯乙醇苷。
本发明经试验，肉苁蓉苯乙醇苷作为唯一活性成分，可有效用于制备治疗围绝经期综合征的药物，有关试验资料如下：
1实验材料
1.1实验动物
SPF级小鼠，昆明种，雌性，20-25g，由武汉生物制品研究所提供。合格证编号：42000400000611；实验室合格证号SYXK(豫)2010-001。
1.2实验药物
本发明肉苁蓉苯乙醇苷，质量含量>55％；更年安胶囊(地黄、熟地黄、泽泻、麦冬、玄参、牡丹皮、茯苓、珍珠母、仙茅、五味子、磁石、首乌藤、钩藤、浮小麦、制何首乌。功能主治：滋阴潜阳，除烦安神。用于更年期潮热汗出，眩晕耳鸣，烦躁失眠。规格：每粒装0.3g。用法用量：口服，一次3粒，一日3次)，山西天星制药有限公司生产。大豆异黄酮维E软胶囊(大豆异黄酮粉、维生素E、葵花籽油、明胶、甘油、水、柠檬黄、二氧化钛。标志性成分及含量：每100g含大豆异黄酮(以金雀异黄素计)55.2mg、维生素E608.5mg。保健功能：增加骨密度。食用方法及食用量：每日2次，每次1粒，温水送服。规格：500mg×100粒)，威海紫光生物科技开发有限公司生产。
1.3实验试剂
羧甲基纤维素钠，天津市恒星化学试剂制造有限公司生产；注射用青霉素钠(规格：400万单位)，华北制药有限公司生产，；甲醛溶液(分析纯)，烟台市双双化工有限公司生产；0.9％氯化钠注射液(规格：250ml)，辰欣药业股份有限公司生产生产；水合氯醛，天津市光复精细化工研究所生产；小鼠E2ELISA检测试剂盒，R&D公司生产；小鼠T ELISA检测试剂盒， R&D公司生产；小鼠LH ELISA检测试剂盒，R&D公司生产；小鼠FSH ELISA检测试剂盒，R&D公司生产。
1.4实验仪器
电子称，上海民桥医疗器械有限公司，型号JY601；电子分析天平，奥豪斯(上海)公司，型号AR1140/C；高速台式离心机，上海安亭科学仪器厂，型号TGL-168；电热恒温水浴锅，上海一恒科学仪器有限公司，型号HWS12；小鼠自主活动测试仪，成都泰盟科技有限公司，型号ZZ-6；小鼠避暗仪，成都泰盟科技有限公司，型号BA-200；高速冷冻离心机，科大创新股份有限公司中佳分公司，型号KDC-160HR；可调式移液器，上海雷勃分析仪器有限公司；酶标仪，美国BIO-RAD公司，型号680；电动显微镜，日本OLYMPUS公司，型号BX61。
2实验方法
2.1造模与给药
造模方法：取体重23～25g雌性昆明小鼠100只，随机取12只作为空白组外，做假手术处理，其余小鼠造更年期模型。小鼠称重后腹腔注射10％水合氯醛(0.03ml/10g)麻醉后腹位固定，然后从小鼠背部最末肋骨下，在腋中线和距脊柱外侧约1cm交叉处剪毛，消毒后切开皮肤和背肌约0.5～1cm，切口视野中可见一乳白色发亮的脂肪团，卵巢即包埋其中。用小镊子轻轻夹住脂肪团拉出切口外，分离脂肪团，即可见到一团细线状不规则呈黄红色的卵巢。剪取时先将卵巢下输卵管(包括脂肪)用细线结扎，再摘除卵巢，术后顺势将子宫角放回腹腔中，缝合肌肉及皮肤，同法摘除双侧卵巢。术后精心饲养，肌肉注射青霉素20万u/kg(每只0.1mL)以防感染，连续3d，每天1次。手术5d后开始逐只进行小鼠阴道涂片检查，每天1次，连续5d，以确定卵巢是否完全切除。涂片呈现动情反应的小鼠弃去不用，选择72只去势完全的小鼠随机均匀分为6组供实验用，分别为模型组，更年安胶囊组，大豆异黄酮软胶囊组，大、中、小剂量肉苁蓉苯乙醇苷组。
配药方法：0.5％CMC配制方法：称取羧甲基纤维素钠4g，用蒸馏水配成800ml。大、中、小剂量肉苁蓉苯乙醇苷组给药剂量分别为200mg/kg、100mg/kg、50mg/kg(给药体积0.1ml/10g)。配置方法：用0.5％CMC配成肉苁蓉苯乙醇苷浓度为20mg/ml、10mg/ml、5mg/ml，更年安胶囊(675mg/kg，用蒸馏水配成67.5mg/ml，0.1ml/10g，相当于临床用量的15倍)；配置方法：取更年安胶囊9粒，先用少量的0.5％CMC溶解，然后再定容到40ml，混匀，即为更年安胶囊混悬液的剂量(675mg/kg)。大豆异黄酮维E软胶囊(250mg/kg，用蒸馏水配成25mg/ml，0.1ml/10g，相当于临床用量的15倍)；配置方法：取大豆异黄酮胶囊2粒，先用少量的0.5％CMC溶解，然后再定容到40ml，混匀，即为大豆异黄酮胶囊混悬液的剂量(250mg /kg)。
储存方法：冷藏，用时隔水温热。
给药方法：各组动物于手术后第10天给予相应药物。更年安胶囊组灌服更年安胶囊混悬液675mg·kg-1，大豆异黄酮软胶囊组灌服大豆异黄酮软胶囊混悬液250mg·kg-1，大、中、小剂量肉苁蓉苯乙醇苷组分别按组别灌服大、中、小剂量肉苁蓉苯乙醇苷200mg·kg-1、100mg·kg-1、50mg·kg-1，0.1ml/10g。空白组和模型组分别灌服同体积0.5％CMC溶液，每日灌胃给药1次，连续给药21d。
2.2观察项目及检测方法
各组小鼠于给药18天时测定5min内自主活动次数，于给药19-20天时测定小鼠首次进入暗室的潜伏期及5min内进入暗室遭电击的次数。于末次给药后2h(禁食不禁水12h)，小鼠称重后摘眼球取血，分离血清，测定血清中E2、T、LH、FSH的含量；然后脱颈椎处死小鼠，解剖小鼠，摘除胸腺、脾脏、子宫组织，称量其湿重并计算脏器指数(脏器指数＝脏器湿重mg/小鼠体重g)，然后取垂体；将胸腺、脾脏、子宫、垂体固定于10％福尔马林溶液中，石蜡包埋，切片，HE染色，光镜下观察各组的组织形态学变化。
2.2.1自主活动次数测试
将各组小鼠放入自主活动仪中，先适应环境1min，然后测定5min内自主活动次数。
2.2.2避暗法测试
将各组小鼠尾部对着进入暗室的小口放入测定盒中，进行训练，24h后重新测定小鼠首次进入暗室的潜伏期及5min内进入暗室遭电击的次数。
2.2.3试剂盒测定方法
血清标本的获取：使用不含热原和内毒素的试管，操作过程中避免任何细胞刺激，收集血液后，3000转离心10分钟将血清和红细胞迅速小心的分离。
小鼠雌二醇(E2)ELISA检测试剂盒测定方法：从室温平衡20min后的铝箔袋中取出所需板条，剩余板条用自封发袋密封放回4℃。设置标准品孔和样本孔，标准品孔各加入不同浓度的标准品50μL。样本孔中先加入待测样本10μL，再加样本稀释液40μL(即样本稀释5倍)；空白孔不加。除空白孔外，标准品孔和样本孔中每孔加入辣根过氧化物酶标记的检测抗体100μL，用封板膜封住反应孔。37℃水浴锅或恒温箱温育60min。弃去液体，吸水纸上拍干，每孔加满洗涤液，静置1min。甩去洗涤液，吸水纸上拍干，如此重复洗板5次。每孔先加入底物A、B各50μL，37℃避光孵育15min。取出酶标板，每孔加终止液50μL，15min内，在450nm波长测量各孔的吸光值(OD值)。根据标准品的浓度及对应的OD值，绘制出标 准品回归曲线，按曲线方程计算各样本浓度值。最终浓度为实际测定浓度乘以稀释倍数。其中，标准品(S0-S5)浓度依次为：0、4、8、16、32、64pmol/L。
小鼠(Mouse)睾酮(T)ELISA检测试剂盒标准品(S0-55)浓度依次为：0、50、100、200、400、800pg/mL；
小鼠(Mouse)黄体生成素(LH)ELISA检测试剂盒标准品(S0-55)浓度依次为：0、0.5、1、2、4、8mIU/mL；
小鼠(Mouse)促卵泡素(FSH)ELISA检测试剂盒标准品(S0-55)浓度依次为：0、5、10、20、40、80mIU/mL。
2.3统计学处理方法
数据分析用SPSS17.0医用统计包进行数据资料的统计学处理，计量资料用平均数±标准差表示，各组间比较采用单因素方差分析，方差检验齐者用LSD法，方差不齐者用Games-Howell法检验，等级资料采用Ridit检验。
实验结果
3.1对小鼠围绝经期模型自主活动的影响
实验各组小鼠自主活动测试结果，见表1。
表1肉苁蓉苯乙醇苷对围绝经期模型小鼠自主活动的影响
注：与模型组比较，*P<0.05，**P<0.01
由表1可看出，与空白组比，模型组小鼠的活动次数、站立次数均显著减少(P<0.01)，说明围绝经期模型小鼠对新鲜环境的好奇程度降低。与模型组比，大、中、小剂量肉苁蓉苯乙醇苷组、大豆异黄酮软胶囊组和更年安胶囊组均可显著提高小鼠的活动次数和站立次数(P<0.01)，小剂量肉苁蓉苯乙醇苷组可明显提高小鼠的活动次数和站立次数(P<0.05)。
3.2对小鼠围绝经期模型避暗实验潜伏期和被电击次数的影响
实验各组小鼠避暗实验测试结果，见表2。
表2肉苁蓉苯乙醇苷对小鼠围绝经期模型避暗实验潜伏期和电击次数的影响
注：与模型组比较，*P<0.05，**P<0.01
由表2可看出，与空白组比，模型组小鼠的潜伏期、电击次数均显著减少(P<0.01)，反映了小鼠围绝经期模型记忆力下降。与模型组比，更年安胶囊、大豆异黄酮软胶囊、大、中剂量肉苁蓉苯乙醇苷均可显著提高小鼠的避暗实验的潜伏期，降低电击次数(P<0.01)，提高小鼠记忆力；小剂量肉苁蓉苯乙醇苷可明显降低电击次数(P<0.05)。
3.3对小鼠围绝经期模型脏器指数的影响
实验各组小鼠胸腺、脾脏、子宫指数，见表3。
表3肉苁蓉苯乙醇苷对小鼠围绝经期模型胸腺、脾脏、子宫指数的影响
注：与模型组比较，*P<0.05，**P<0.01
由表3可以看出，与空白组比，模型组小鼠的子宫指数显著降低(P<0.01)，说明摘除卵巢导致围绝经期模型小鼠子宫萎缩，摘除卵巢从而雌激素分泌不足导致围绝经期小鼠免疫器官萎缩。与模型组比，大豆异黄酮软胶囊、更年安胶囊、大、中剂量肉苁蓉苯乙醇苷均可显著提高胸腺、脾脏、子宫指数(P<0.01)。
3.4对小鼠围绝经期模型血清性激素水平的影响
各组小鼠血清中E2、T、FSH、LH含量。见表4～5。
表4肉苁蓉苯乙醇苷对小鼠围绝经期模型血清中E2、T水平的影响
注：与模型组比较，*P<0.05，**P<0.01
表5锁胶囊对小鼠围绝经期模型血清中FSH、LH水平的影响
注：与模型组比较，*P<0.05，**P<0.01
从表4～5可以看出，与空白组比，模型组小鼠血清中E2、T水平显著下降(P<0.01)，LH、FSH水平均显著升高(P<0.01)，说明摘除卵巢导致围绝经期模型小鼠血清中的性激素水平紊乱，围绝经期小鼠模型复制成功。大、中剂量肉苁蓉苯乙醇苷与更年安胶囊、大豆异黄酮软胶囊可显著升高小鼠围绝经期模型血清中E2、T水平(P<0.01)和降低血清中升高的FSH、LH水平。小剂量肉苁蓉苯乙醇苷可明显降低血清中的FSH水平和T水平(P<0.05)。
3.5对围绝经期模型小鼠器官组织形态的影响
实验各组小鼠子宫、胸腺、脾脏、垂体的病理组织学观察结果如下，病理照片见附录1中围绝经期型小鼠病理照片。
3.5.1对围绝经期模型小鼠子宫组织形态的影响
根据实验各组小鼠子宫内膜、腺体、肌层出现的不同程度的改变，采用半定量标准，将病理组织形态分为四个级别，对实验各组小鼠子宫进行测定，观察结果见表6。
表6肉苁蓉苯乙醇苷对围绝经期模型小鼠子宫病理变化的影响 单位：只
“-”子宫内膜上皮细胞、腺体、肌层、浆膜均正常；“+”子宫内膜上皮细胞、腺体少部分萎缩，肌层浆膜均正常；“++”子宫内膜上皮细胞、腺体部分萎缩，肌层稍有萎缩，浆膜正常；“+++”子宫内膜上皮细胞、腺体明显萎缩，浆膜正常。
经Ridit检验，从上表可知，与空白组比，模型组小鼠子宫出现显著的病理组织病变(P<0.01)。与模型组比，大豆异黄酮维E软胶囊、更年安胶囊、中剂量肉苁蓉苯乙醇苷均可显著的改善小鼠的子宫病理组织病变(P<0.01)，大剂量肉苁蓉苯乙醇苷可明显的改善小鼠的子宫病理组织病变(P<0.05)。
3.5.2对小鼠围绝经期模型胸腺、脾脏组织形态的影响
采用测微尺，对实验各组每只小鼠胸腺皮质最厚处和最窄处测定其厚度求得均数；采用测微尺的基线落在脾小结上，以中央动脉为中心分别测定两侧的脾小结厚度大小，求均数；结果见表7。
表7锁胶囊对围绝经期模型小鼠胸腺、脾脏病理变化的影响
注：与模型组比较，*P<0.05，**P<0.01
从表7可看出，与空白组比，模型组小鼠胸腺皮质厚度、脾小结体积显著减少(P<0.01)，说明小鼠造围绝经期模型后胸腺、脾脏体积萎缩。与模型组比，大剂量肉苁蓉苯乙醇苷可显著增厚胸腺皮质厚度和脾小结体积(P<0.01)，中剂量肉苁蓉苯乙醇苷可明显增厚胸腺皮质厚 度(P<0.05)。
3.5.3对小鼠围绝经期模型垂体组织形态的影响
高倍视野下落在面积为10000μm2测微矩形框内嗜碱性细胞数量和垂体前叶细胞数量。结果见表8。
表8肉苁蓉苯乙醇苷对围绝经期模型小鼠垂体病理变化的影响
注：与模型组比较，*P<0.05，**P<0.01
由表8可以看出，与空白组比，模型组嗜碱性细胞数量和垂体前叶细胞数量显著降低(P<0.01)，说明小鼠造围绝经期模型后，分泌促性腺激素的细胞源减少。与模型组比，大、中剂量肉苁蓉苯乙醇苷组可显著增加垂体嗜碱性细胞数量和垂体前叶细胞数量(P<0.01)。
围绝经期综合征是从45岁左右开始至停经后12个月内的时期，包括从接近绝经出现与绝经有关的内分泌、生物学和临床特征起至最后1次月经后1年，也就是卵巢功能衰退的征兆，一直持续到最后1次月经后1年，是正常的生理变化时期。但在围绝经期易发生不适，临床表现为月经改变，面部潮红、阵阵发热、出汗等血管舒张症状。情绪不稳定、激动易怒、抑郁多烦、记忆力减退、工作能力下降等，皮肤皱纹逐渐增多，有的出现瘙痒、毛发开始变白脱落。腹部和臀部脂肪增多，容易发胖，血压易波动，常出现高血压、心前区闷痛不适、心悸、气短，动脉硬化发生率增加，冠心病发病率也上升，骨质疏松，上述症状被称为围绝经期综合征。凡具有上述症状者，均作为选择病例的标准。选择符合上述标准的88例围绝经期综合征患者，应用由本品制成的治疗围绝经期综合征的药物(胶囊)，临床应用取得了显著的治疗效果。患者每日服用3次，每次2-3粒，每粒含肉苁蓉苯乙醇苷0.5g，连服60天。除2人外，其余临床症状消失或临床症状有明显改善或改善者86人，有效率高达97.7％，效果之好是未曾料到的，是治疗围绝经期综合征药物上的创新，开拓了肉苁蓉的新用途，经济和社会效益显著。