一种缓解妇科炎症提高免疫力的组合物的制作方法

本发明属于生物
技术领域：
，特别涉及一种缓解妇科炎症提高免疫力的组合物。
背景技术：
：妇科炎症是指妇女生殖系统感染所引起的疾病，妇科炎症在日常生活中是个常见疾病也是个顽固疾病，尤其在已婚妇女中病发率高，常见的症状有月经不调、痛经、附件炎、盆腔炎、宫颈炎、子宫内膜炎、阴道分泌物异常有异味等，有的甚至引起不孕不育。妇科炎症患病率高，复发率高，严重影响着女性的身心健康。多种女性下生殖道疾病是由于阴道微生态系统平衡失调所致,如细菌性阴道炎，霉菌性阴道炎，滴虫性阴道炎等。目前治疗阴道感染的措施主要是运用抗生素、灭滴灵、雌激素以及酸化阴道的制剂等来杀灭阴道内的病原微生物。但是，上述疗法在某种程度上会抑制正常的菌群,引起致病菌或条件致病菌的过度繁殖,从而造成反复感染或多重感染,增加治疗的的难度和成本。药物使用时间过长就会产生耐药性，对肝肾功能有一定的副作用，对患者危害较大。而使用中药或中成药治疗时间长，治疗效果不甚理想。目前，调节生殖道菌群，如果使用益生菌，一般是通过内用栓剂，口服品种较少，使用不方便。技术实现要素：技术问题：为了解决现有技术的缺陷，本发明提供了一种缓解妇科炎症提高免疫力的组合物。技术方案：本发明提供的一种缓解妇科炎症提高免疫力的组合物，包括水苏糖2-8份，菊粉3-9份，蔓越莓提取物1-4份，低聚异麦芽糖2-6份，胶原蛋白0.5-2.5份，植物乳杆菌30-40亿CFU，罗伊氏乳杆菌(Lactobacillusreuteri)TR0235-40亿CFU，鼠李糖乳杆菌(L.rhamnosus)TR0835-45亿CFU，嗜酸乳杆菌10-15亿CFU。作为优选，包括水苏糖4-6份，菊粉5-7份，蔓越莓提取物2-3份，低聚异麦芽糖3-5份，胶原蛋白1-2份，植物乳杆菌33-37亿CFU，罗伊氏乳杆菌(Lactobacillusreuteri)TR0237-39亿CFU，鼠李糖乳杆菌(L.rhamnosus)TR0839-41亿CFU，嗜酸乳杆菌11-13亿CFU。作为另一种优选，包括水苏糖5份，菊粉6份，蔓越莓提取物2.5份，低聚异麦芽糖4份，胶原蛋白1.5份，植物乳杆菌35亿CFU，罗伊氏乳杆菌(Lactobacillusreuteri)TR0238亿CFU，鼠李糖乳杆菌(L.rhamnosus)TR0840亿CFU，嗜酸乳杆菌12亿CFU。本发明还提供了上述缓解妇科炎症提高免疫力的组合物的制备方法，包括以下步骤：分别称取水苏糖、菊粉、蔓越莓提取物、低聚异麦芽糖、胶原蛋白，混匀；再加入植物乳杆菌、罗伊氏乳杆菌(Lactobacillusreuteri)TR02、鼠李糖乳杆菌(L.rhamnosus)TR08、嗜酸乳杆菌，混匀，即得。本发明还提供了上述组合物在制备治疗妇科炎症药物中的应用。本发明还提供了上述组合物在制备提高免疫力药物中的应用。有益效果：本发明提供的组合物制备工艺简单、原料来源广泛、成本低廉、使用方便，可大大提高人体免疫力，治疗妇科炎症效果好。附图说明图1为罗伊氏乳杆菌(Lactobacillusreuteri)TR02的菌落图。图2为罗伊氏乳杆菌(Lactobacillusreuteri)TR02的菌落放大图。图3为鼠李糖乳杆菌(Lactobacillusrhamnosus)TR08的菌落图。图4为鼠李糖乳杆菌(Lactobacillusrhamnosus)TR08的菌落放大图。具体实施方式本发明中：水苏糖购自山东西王集团菊粉购自山东百龙创园生物科技股份有限公司蔓越莓提取物购自山东百龙创园生物科技股份有限公司低聚异麦芽糖购自山东西王集团胶原蛋白购自山东西王集团植物乳杆菌购自山东百龙创园生物科技股份有限公司嗜酸乳杆菌购自山东百龙创园生物科技股份有限公司罗伊氏乳杆菌(Lactobacillusreuteri)TR02，其分类命名为罗伊氏乳杆菌(Lactobacillusreuteri)TR02，在中国典型培养物保藏中心(简称CCTCC)保藏，保藏单位地址：湖北省武汉市武昌区武汉大学，邮政编码为430072，其保藏编号为：CCTCCNo.2016546，保藏日期为2016年10月10日。菌株的分离1、菌种和培养基和培养条件(1)菌源来自中国某军区健康士兵粪便。(2)培养基平板培养基：1000mL蒸馏水，蛋白胨10g，葡萄糖20g，酵母粉9g，乙酸钠5g，磷酸氢二钾2g，柠檬酸三铵2g，半胱氨酸0.5g，硫酸镁0.2g，硫酸锰0.05g，吐温1ml，琼脂粉15-20g，pH5.5-6.5。2、菌株的分离和鉴定(1)菌株的分离预先经灭菌处理后的手套箱中取适量新鲜粪便置于盛装有无菌培养基的无菌试管中，充分震荡涡旋混匀；以上述充分震荡涡旋混匀的粪便溶液为原液，做十倍梯度稀释至合适梯度，取100μl均匀涂布于MRS+0.05％半胱氨酸固体平板培养基上，随后取出置于厌氧罐中，37℃厌氧培养过夜。次日可见平板上长有形态大小各异的菌落，结合罗伊氏乳杆菌典型菌落形态特征，挑取若干有代表性的菌落作二代划线纯化处理，平板厌氧活化1天，得培养物，随后做菌株鉴定。(2)菌株的鉴定革兰氏染色形态学鉴定：a、涂片：取灭过菌的载玻片于实验台上，在玻片上用记号笔做记号，便于观察，随后将玻片倒置，然后用移液器吸取10μl无菌生理盐水均匀涂布在记号处，继而用移液枪挑取纯培养物均匀溶于生理盐水中，涂布面不宜过大。b、干燥：将标本面向上，手持载玻片一端的两侧，小心地在酒精灯上高处微微加热，使水分蒸发，但切勿紧靠火焰或加热时间过长，以防标本烤枯而变形。c、固定：固定常常利用高温，手持载玻片的一端，标本向上，在酒精灯火焰处尽快的来回通过2-3次，共约2-3秒种，并不时以载玻片背面加热触及皮肤，不觉过烫为宜(不超过60℃)，放置待冷后，进行染色。d、初染：在涂片薄膜上滴加草酸铵结晶紫1-2滴，使染色液覆盖涂片，染色约1min。e、水洗：斜置载玻片，在自来水龙头下用小股水流冲洗，直至洗下的水呈无色为止。f、媒染：用100-1000ul移液枪吸取约300ul碘液滴在涂片薄膜上，使染色液覆盖涂片，染色约1min。g、水洗：斜置载玻片，在自来水龙头下用小股水流冲洗，直至洗下的水呈无色为止。h、脱色：斜置载玻片，滴加95％乙醇脱色，至流出的乙醇不现紫色为止，大约需时20-30S，随即水洗。i、复染：在涂片薄膜上滴加沙黄染液1-2滴，使染色液覆盖涂片，染色约1min。j、水洗：斜置载玻片，在自来水龙头下用小股水流冲洗，直至洗下的水呈无色为止。k、干燥、观察：用吸水纸吸掉水滴，待标本片干后置显微镜下，用低倍镜观察，发现目的物后滴一滴浸油在玻片上，用油镜观察细菌的形态及颜色，紫色的是革兰氏阳性菌，红色的是革兰氏阴性菌。结果显示：该菌株为革兰氏阳性菌。16SrRNA序列的测定：16SrRNA基因的PCR扩增使用的引物是一般细菌的引物——8F(5′-CACGGATCCAGAGTTTGAT(C/T)(A/C)TGGCTCAG-3′)和1510R(5′-GTGAAGCTTAGGG(C/T)TACCTTGTTACGACTT-3′)产物委托有资质的第三方实验室进行sanger测序。应用BLAST算法在GenBank数据库中把序列和16SrRNA基因进行比较，应用MEGA4.0程序建立邻接树。BLAST分析(如SEQIDNo.1所示)表明TR02菌十分接近罗伊氏乳杆菌(99％亲缘性)。鼠李糖乳杆菌(L.rhamnosus)TR08，其分类命名为鼠李糖乳杆菌(Lactobacillusrhamnosus)TR08，在中国典型培养物保藏中心(简称CCTCC)保藏，保藏单位地址：湖北省武汉市武昌区武汉大学，邮政编码为430072，其保藏编号为：CCTCCNO.M2016548，保藏日期为2016年10月10日。菌株的分离1、菌种和培养基和培养条件(1)菌源来自中国某军区健康士兵粪便(2)培养基平板培养基：1000mL蒸馏水，蛋白胨10g，葡萄糖20g，酵母粉9g，乙酸钠5g，磷酸氢二钾2g，柠檬酸三铵2g，半胱氨酸0.5g，硫酸镁0.2g，硫酸锰0.05g，吐温1ml，琼脂粉15-20g，pH5.5-6.5。2、菌株的分离和鉴定(1)菌株的分离预先经灭菌处理后的手套箱中取适量新鲜粪便置于盛装有无菌培养基的无菌试管中，充分震荡涡旋混匀；以上述充分震荡涡旋混匀的粪便溶液为原液，做十倍梯度稀释至合适梯度，取100μl均匀涂布于MRS+0.05％半胱氨酸固体平板培养基上，随后取出置于厌氧罐中，37℃厌氧培养过夜。次日可见平板上长有形态大小各异的菌落，结合乳杆菌典型菌落形态特征，挑取若干有代表性的菌落作二代划线纯化处理，平板厌氧活化1天，得培养物，随后做菌株鉴定。(2)菌株的鉴定革兰氏染色形态学鉴定：a、涂片：取灭过菌的载玻片于实验台上，在玻片上用记号笔做记号，便于观察，随后将玻片倒置，然后用移液器吸取10μl无菌生理盐水均匀涂布在记号处，继而用移液枪挑取纯培养物均匀溶于生理盐水中，涂布面不宜过大。b、干燥：将标本面向上，手持载玻片一端的两侧，小心地在酒精灯上高处微微加热，使水分蒸发，但切勿紧靠火焰或加热时间过长，以防标本烤枯而变形。c、固定：固定常常利用高温，手持载玻片的一端，标本向上，在酒精灯火焰处尽快的来回通过2-3次，共约2-3秒种，并不时以载玻片背面加热触及皮肤，不觉过烫为宜(不超过60℃)，放置待冷后，进行染色。d、初染：在涂片薄膜上滴加草酸铵结晶紫1-2滴，使染色液覆盖涂片，染色约1min。e、水洗：斜置载玻片，在自来水龙头下用小股水流冲洗，直至洗下的水呈无色为止。f、媒染：用100-1000ul移液枪吸取约300ul碘液滴在涂片薄膜上，使染色液覆盖涂片，染色约1min。g、水洗：斜置载玻片，在自来水龙头下用小股水流冲洗，直至洗下的水呈无色为止。h、脱色：斜置载玻片，滴加95％乙醇脱色，至流出的乙醇不现紫色为止，大约需时20-30S，随即水洗。i、复染：在涂片薄膜上滴加沙黄染液1-2滴，使染色液覆盖涂片，染色约1min。j、水洗：斜置载玻片，在自来水龙头下用小股水流冲洗，直至洗下的水呈无色为止。k、干燥、观察：用吸水纸吸掉水滴，待标本片干后置显微镜下，用低倍镜观察，发现目的物后滴一滴浸油在玻片上，用油镜观察细菌的形态及颜色，紫色的是革兰氏阳性菌，红色的是革兰氏阴性菌。结果显示：该菌株为革兰氏阳性菌。16SrRNA序列的测定：16SrRNA基因的PCR扩增使用的引物是一般细菌的引物——8F(5′-CACGGATCCAGAGTTTGAT(C/T)(A/C)TGGCTCAG-3′)和1510R(5′-GTGAAGCTTAGGG(C/T)TACCTTGTTACGACTT-3′)产物委托有资质的第三方实验室进行sanger测序。应用BLAST算法在GenBank数据库中把序列和16SrRNA基因进行比较，应用MEGA4.0程序建立邻接树。BLAST分析(如SEQIDNo.2所示)表明TR02菌十分接近鼠李糖乳杆菌(99％亲缘性)。下面对本发明作出进一步说明。实施例1缓解妇科炎症提高免疫力的组合物，包括水苏糖2份，菊粉9份，蔓越莓提取物1份，低聚异麦芽糖2份，胶原蛋白0.5份，植物乳杆菌40亿CFU，罗伊氏乳杆菌(Lactobacillusreuteri)TR0235亿CFU，鼠李糖乳杆菌(L.rhamnosus)TR0835亿CFU，嗜酸乳杆菌10亿CFU。其制备方法，包括以下步骤：分别称取水苏糖、菊粉、蔓越莓提取物、低聚异麦芽糖、胶原蛋白，混匀；再加入植物乳杆菌、罗伊氏乳杆菌(Lactobacillusreuteri)TR02、鼠李糖乳杆菌(L.rhamnosus)TR08、嗜酸乳杆菌，混匀，即得。实施例2缓解妇科炎症提高免疫力的组合物，包括水苏糖8份，菊粉3份，蔓越莓提取物4份，低聚异麦芽糖6份，胶原蛋白2.5份，植物乳杆菌30亿CFU，罗伊氏乳杆菌(Lactobacillusreuteri)TR0240亿CFU，鼠李糖乳杆菌(L.rhamnosus)TR0845亿CFU，嗜酸乳杆菌15亿CFU。其制备方法，包括以下步骤：分别称取水苏糖、菊粉、蔓越莓提取物、低聚异麦芽糖、胶原蛋白，混匀；再加入植物乳杆菌、罗伊氏乳杆菌(Lactobacillusreuteri)TR02、鼠李糖乳杆菌(L.rhamnosus)TR08、嗜酸乳杆菌，混匀，即得。实施例3缓解妇科炎症提高免疫力的组合物，包括水苏糖4份，菊粉7份，蔓越莓提取物3份，低聚异麦芽糖3份，胶原蛋白2份，植物乳杆菌33亿CFU，罗伊氏乳杆菌(Lactobacillusreuteri)TR0239亿CFU，鼠李糖乳杆菌(L.rhamnosus)TR0839亿CFU，嗜酸乳杆菌11亿CFU。其制备方法，包括以下步骤：分别称取水苏糖、菊粉、蔓越莓提取物、低聚异麦芽糖、胶原蛋白，混匀；再加入植物乳杆菌、罗伊氏乳杆菌(Lactobacillusreuteri)TR02、鼠李糖乳杆菌(L.rhamnosus)TR08、嗜酸乳杆菌，混匀，即得。实施例4缓解妇科炎症提高免疫力的组合物，包括水苏糖6份，菊粉5份，蔓越莓提取物2份，低聚异麦芽糖5份，胶原蛋白1份，植物乳杆菌37亿CFU，罗伊氏乳杆菌(Lactobacillusreuteri)TR0237亿CFU，鼠李糖乳杆菌(L.rhamnosus)TR0841亿CFU，嗜酸乳杆菌13亿CFU。其制备方法，包括以下步骤：分别称取水苏糖、菊粉、蔓越莓提取物、低聚异麦芽糖、胶原蛋白，混匀；再加入植物乳杆菌、罗伊氏乳杆菌(Lactobacillusreuteri)TR02、鼠李糖乳杆菌(L.rhamnosus)TR08、嗜酸乳杆菌，混匀，即得。实施例5缓解妇科炎症提高免疫力的组合物，包括水苏糖5份，菊粉6份，蔓越莓提取物2.5份，低聚异麦芽糖4份，胶原蛋白1.5份，植物乳杆菌35亿CFU，罗伊氏乳杆菌(Lactobacillusreuteri)TR0238亿CFU，鼠李糖乳杆菌(L.rhamnosus)TR0840亿CFU，嗜酸乳杆菌12亿CFU。其制备方法，包括以下步骤：分别称取水苏糖、菊粉、蔓越莓提取物、低聚异麦芽糖、胶原蛋白，混匀；再加入植物乳杆菌、罗伊氏乳杆菌(Lactobacillusreuteri)TR02、鼠李糖乳杆菌(L.rhamnosus)TR08、嗜酸乳杆菌，混匀，即得。将实施例1至5的组合物用于治疗妇科炎症：将实施例1-5中制得的妇科炎症治疗液用于临床试验，每个实施例治疗：40例患者，其中，20例患者为宫颈糜烂重度患者，20例患者为阴道粘膜炎症重度患者；并且各组患者按医学分为轻度、中度和重度，每种程度的患者人数相等；对照例以蛋黄油治疗。将上述组合物配制成浓度5％的药液，将药液抽入给药器中，每次6-8ml，患者仰卧，双腿高抬，将药液注入生殖器相应部位，静躺30-50分钟。一个疗程为五天；同样的方法使用蛋黄油；最多治疗3个疗程。治疗的效果按医学分为四类：治愈、显效、有效、无效。得到的治疗效果如表1所示。表1组别病症治愈显效有效无效实施例1宫颈糜烂20000阴道粘膜炎症19100实施例2宫颈糜烂19100阴道粘膜炎症20000实施例3宫颈糜烂20000阴道粘膜炎症20000实施例4宫颈糜烂20000阴道粘膜炎症18200实施例5宫颈糜烂20000阴道粘膜炎症19100对比例宫颈糜烂00119阴道粘膜炎症01019将实施例1至5的组合物用于提高免疫力实验将上述组合物配制成浓度5％的药液，将60只昆明种小鼠(雌雄各半，8周龄左右，约25-30g)随机平均分成六组(具体分组方法见表2)，采用灌胃给药，给药8周后，考察各组对免疫器官的影响。考察指标为脾指数和胸腺指数，两者的增加有助于免疫力的提高。表2对照组同体积0.9％生理盐水实施例14mg·kg-1·d-1实施例24mg·kg-1·d-1实施例34mg·kg-1·d-1实施例42mg·kg-1·d-1实施例56mg·kg-1·d-1野山参组4mg·kg-1·d-1党参组4mg·kg-1·d-1黄芪组4mg·kg-1·d-1天麻组4mg·kg-1·d-1按照2∶50∶50∶15的重量比例分别称取野山参(党参、黄芪或天麻)5份，粉碎成100-200目的药粉混合物，用100份50％的乙醇置于带盖的容器中浸泡10小时，然后回流提取3次，每次3小时。3次回流提取结束后，合并提取液，减压浓缩，即得野山参(党参、黄芪或天麻)组。表3各组小鼠不同器官指数比较脾指数＝脾脏重量/体重，胸腺指数＝胸腺重量/体重通过表3可以看出实施例组和野山参、党参组、黄芪组和天麻与对照组比较具有显著的增加脾指数和胸腺指数的作用。SEQUENCELISTING<110>天益健康科学研究院（镇江）有限公司<120>一种缓解妇科炎症提高免疫力的组合物<130>SC20161025001<160>2<170>PatentInversion3.3<210>1<211>1490<212>DNA<213>Lactobacillusreuteri<220><221>misc_feature<222>(1)..(1490)<400>1gggtacgcggcggtgtgctatacatgcaagtcgtacgcactggcccaactgattgatggt60gcttgcacctgattgacgatggattaccagtgagtggcggacgggtgagtaacacgtagg120taacctgccccggagcgggggataacatttggaaacagatgctaataccgcataacaaca180aaagccacatggcttttgtttgaaagatggctttggctatcactctgggatggacctgcg240gtgcattagctagttggtaaggtaacggcttaccaaggcgatgatgcatagccgagttga300gagactgatcggccacaatggaactgagacacggtccatactcctacgggaggcagcagt360agggaatcttccacaatgggcgcaagcctgatggagcaacaccgcgtgagtgaagaaggg420tttcggctcgtaaagctctgttgttggagaagaacgtgcgtgagagtaactgttcacgca480gtgacggtatccaaccagaaagtcacggctaactacgtgccagcagccgcggtaatacgt540aggtggcaagcgttatccggatttattgggcgtaaagcgagcgcaggcggttgcttaggt600ctgatgtgaaagccttcggcttaaccgaagaagtgcatcggaaaccgggcgacttgagtg660cagaagaggacagtggaactccatgtgtagcggtggaatgcgtagatatatggaagaaca720ccagtggcgaaggcggctgtctggtctgcaactgacgctgaggctcgaaagcatgggtag780cgaacaggattagataccctggtagtccatgccgtaaacgatgagtgctaggtgttggag840ggtttccgcccttcagtgccggagctaacgcattaagcactccgcctggggagtacgacc900gcaaggttgaaactcaaaggaattgacgggggcccgcacaagcggtggagcatgtggttt960aattcgaagctacgcgaagaaccttaccaggtcttgacatcttgcgctaaccttagagat1020aaggcgttcccttcggggacgcaatgacaggtggtgcatggtcgtcgtcagctcgtgtcg1080tgagatgttgggttaagtcccgcaacgagcgcaacccttgttactagttgccagcattaa1140gttgggcactctagtgagactgccggtgacaaaccggaggaaggtggggacgacgtcaga1200tcatcatgccccttatgacctgggctacacacgtgctacaatggacggtacaacgagtcg1260caagctcgcgagagtaagctaatctcttaaagccgttctcagttcggactgtaggctgca1320actcgcctacacgaagtcggaatcgctagtaatcgcggatcagcatgccgcggtgaatac1380gttcccgggccttgtacacaccgcccgtcacaccatgggagtttgtaacgcccaaagtcg1440gtggcctaacctttatggagggagccgcctaaggcggacagagactgggt1490<210>2<211>1474<212>DNA<213>Lactobacillusrhamnosus<220><221>misc_feature<222>(1)..(1474)<400>2cgctggcggcgtgcctaatacatgcaagtcgaacgagttctgattattgaaaggtgcttg60catcttgatttaattttgaacgaatggcggaagggtgaataacccgtgggtaacctggcc120ttaaatgggggataacctttggaaaccgaagctaataccgcataaatcccaaaaccgcat180ggttcttggctgaaagatggggtaaactatcccttttggatggacccccggcgtattaac240ttgttggtgaggtaacggctccaccagggaatgatacctaacccaactgaaaggttgatc300ggccaccttgggactgagacccggcccaaactcctaccggagggagcaatagggaatctt360ccccaatggacgccagtctgaaggaacaaccccccgtgggtgaaaaagggtttccggtcc420taaaactctgttgttggaaaaaaatggtccgcaaaataactggtggccgcgtggccgtat480ccaacccgaaagccacggctaactacctgcccagcaccgcggtaataccgaggtggcaag540cgttatccggatttattgggcgtaaagcgagcgcaagcgggttttttagtctgatgggaa600agccctcggcttaaccgaagaagtgcatcggaaactgggaaacttgaatgcagaagaaga660cagtggaactccatgtgtagcggtgaaatgcctagatatatggaagaacaccagtggcga720aagccgctgtctggtctgtaactgacgctgaagctccaaagcctgggtagcgaacaggat780tagataccctgggagtccatgccgtaacgatgaatgctagtggtggaaggtttccgccct840tcaatgccgagcttacgcaataagcaatccgcctgggggaatacgaccggcaggttgaaa900cttcaaagaatttgaccggggccgcacaagccggtggagcattgtggtttaattcgaagc960acgcgaagaacttaccaggtcttgacatcttttgatcacttgaagatcaagtttcccttc1020gggcaaatgacagtggtgcatggttgtcgtcagctccgtgtcgtgagatgttgggttaag1080tcccgcaacgagcgcaacccttatgactagttgccagcatttagttgggcactctagtaa1140gactgccggtgacaaaccggaggaaggtggggatgacgtcaaatcatcatgccccttatg1200acctgggc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