本发明涉及软骨细胞组合物。
背景技术：
关节软骨(articular cartilage，AC)损伤是骨关节炎(osteoarthritis，OA)发生的一个主要危险因素，OA是不可逆的，当病情发展到晚期时要通过关节置换来减轻痛苦和恢复功能。由于关节软骨的修复能力是有限的，必须早期干预以防止发展成为OA。当前的治疗方式旨在通过主要治疗、邻近组织刺激和移植来修复关节软骨。通过合理的修复治疗可以在短期到中期获得较理想的结果，但较长一段时间后，容易复发。近年来，基于生物工程组织的细胞水平的组织工程技术得到广泛的研究，这种生物工程组织可以重现透明软骨的特性，并与原来的组织融为一体，对于修复关节软骨损伤意义重大。
然而，目前的生物工程组织修复软骨损伤方面的研究仍有待加强。
技术实现要素：
本发明旨在至少解决现有技术中存在的技术问题之一。为此，本发明的一个目的在于提出一种方便获得、安全可靠，能够有效修复软骨损伤的手段。
需要说明的是，本发明是基于发明人的下列发现而完成的：
目前应用较广泛的细胞水平的软骨修复技术之一是自体软骨细胞移植(Autologous chondrocyte implantation，ACI)技术。该技术包含体内手术治疗和体外细胞培养技术：首先，在受损关节的非承重区域进行手术获取软骨切片，并将其转移到可储存及运输的无菌营养液中；然后，在细胞培养室中使用胶原酶消化软骨组织，得到软骨细胞，采用单层培养将软骨细胞培养扩增至可用于移植的数量，由外科医生来进行软骨缺陷的填充。在该手术过程中，将体外扩增的软骨细胞注射到缺陷处。为了使软骨细胞停留在移植部位，防止大量漂走，可以进一步将滑膜瓣缝合在损伤部位。然而，发明人发现，自体软骨细胞移植存在以下缺陷：1、自体软骨细胞移植需要两次侵入性手术，对病人伤害较大。2、软骨细胞在体外单层扩增期间，这些细胞群失去了它的表型，胶原蛋白的生产由II型(典型的透明软骨)向I型和III型(典型的纤维软骨)的转变。这些表型的改变的结果是具有较差的生物机械性能的细胞外基质的产生。3、供体部位提供大量的软骨细胞的能力有限。4、供体部分的发病率也是自体软骨细胞的主要障碍。
而自体骨髓间充质干细胞移植也是目前应用较广泛的细胞水平的软骨修复技术。该技术在病人的髂骨进行骨髓穿刺，收集骨髓；将样品转移至洁净室进行细胞分离；向骨髓穿刺液中添加磷酸盐缓冲液，然后转移至淋巴细胞分离液中，离心并收集单个核细胞并计数，用PBS洗涤，然后接种至培养瓶中培养，以便将所得细胞扩增培养，传到第二代准备移植；移植前采用集落形成单位(Colony-forming unit,CFU)以及流式细胞术检测细胞的克隆形成能力以及细胞表面标记的表达；然后，将第二代的MSCs用胰酶消化下来，并重悬于生理血清中，并装载到无菌注射器中，透视下，将细胞注射到病人的膝盖损伤处。然而，发明人发现，自体骨髓间充质干细胞移植存在以下缺陷：1、骨髓穿刺给病人带来痛苦。2、细胞直接注射到损伤处，没有做其他措施，细胞可能会大量漂走。3、短中期效果理想，但长时间之后病人的损伤处疼痛有所上升，行动能力也有所下降。
而间充质干细胞(mesenchymal stem cells，MSCs)移植是一种很有前景的策略，因为MSCs具有高增殖能力并且具有分化为软骨细胞的潜能，进而形成软骨。MSCs是梭形细胞，具有快速增殖和自我更新能力，存在于大量组织中，包括骨髓、滑膜组织、血液、脂肪组织和骨膜组织。它们具有多系分化潜能，可以分化为多种细胞类型以创建和修复间充质组织。MSCs可以向成软骨、成骨、脂肪发生途径分化。调节因子可以促进MSC的软骨发生，例如转化生长因子(TGF-β)和地塞米松，这已经用简单的体外模型得到了证实。
进而，发明人通过一系列研究发现，采用脐带来源的间充质干细胞(Umbilical Cord Mesenchymal stem cells,UCMSC)移植到病人的膝关节损伤处，能够有效治疗软骨损伤。并且，目前已有成熟的UCMSC分离培养方法，并且脐带易获取，不需要对病人采取侵入性手术，也不需要在其它位置提取软骨，能够有效减少病人的痛苦。且MSC能够快速增殖和自我更新，具有成软骨分化的潜能，能够保证新生软骨细胞的活力，并且不存在发病率的隐患。
进一步，发明人在移植前，对部分UCMSC进行成软骨诱导分化，以促进UCMSC向软骨方向分化，并将UCMSC和诱导的软骨细胞与胶原以及温敏型水凝胶复合，结果能够有效防止细胞大面积迁移，达到长期治疗的效果。其中，温敏型聚乳酸水凝胶在37℃以下为液体，在达到37℃后将形成凝胶，起着外源性细胞载体的作用，可以促进细胞的移动、黏附、增殖及分化，并提供结构支持，使得细胞在缺损处活动，不会大面积移动。
因而，在本发明的一个方面，本发明提供了一种软骨细胞组合物。根据本发明的实施例，该软骨细胞组合物包括：细胞悬液和温敏型水凝胶，其中细胞悬液是通过将间充质干细胞和软骨细胞混合并重悬于胶原溶液形成的。
发明人惊奇地发现，本发明的软骨细胞组合物方便获得、安全可靠，并且，向软骨细胞分化的效率高，能够为软骨损伤部位提供组织修复所必需的细胞，而温敏型水凝胶具有很好的外源性细胞载体的作用，能够使组合物中的细胞充分填充软骨损伤处且不向其它地方迁移，从而能够有效促进软骨损伤部位快速、有效地修复及愈合。
根据本发明的实施例，在所述细胞悬液中，所述间充质干细胞和所述软骨细胞的混合比例为1:1～4:1。由此，软骨分化效率高，能够为软骨损伤部位提供组织修复所必需的细胞。
根据本发明的实施例，在所述细胞悬液中，胶原的含量为1质量％～8质量％。由此，细胞混合物与胶原以及温敏型水凝胶的复合效果好，能够有效防止细胞大面积迁移，从而可以达到长期治疗的效果。
根据本发明的实施例，所述胶原为Ⅱ型胶原蛋白。由此，细胞混合物与胶原以及温敏型水凝胶的复合效果好，能够有效防止细胞大面积迁移，从而可以达到长期治疗的效果。
根据本发明的实施例，所述胶原溶液的浓度为1质量％～8质量％。由此，细胞混合物与胶原以及温敏型水凝胶的复合效果好。
根据本发明的实施例，所述细胞悬液和所述温敏型水凝胶的体积比为1:1～2。由此，温敏型水凝胶对细胞悬液中的间充质干细胞和软骨细胞混合物的承载效果好，进而能够使组合物中的细胞充分填充软骨损伤处且不向其它地方迁移，从而能够有效促进软骨损伤部位快速、有效地修复及愈合。
根据本发明的实施例，所述温敏型水凝胶为温敏型聚乳酸水凝胶。由此，能够有效承载间充质干细胞和软骨细胞混合物，并使其充分填充软骨损伤处且不向其它地方迁移。
根据本发明的实施例，所述温敏型聚乳酸水凝胶为MPEG-PLGA。由此，其作为外源性细胞载体的作用好，能够使组合物中的细胞充分填充软骨损伤处且不向其它地方迁移，从而能够有效促进软骨损伤部位快速、有效地修复及愈合。
根据本发明的实施例，所述间充质干细胞为脐带间充质干细胞。由此，间充质干细胞来源广泛，易获得，安全无害，且向软骨分化的效率高。
根据本发明的实施例，所述软骨细胞是通过间充质干细胞优选脐带间充质干细胞诱导获得的。并且，软骨细胞的诱导方法不受特别限制，只要能够从间充质干细胞优选脐带间充质干细胞有效诱导获得软骨细胞即可。由此，软骨细胞组合物，向软骨细胞分化的效率高，能够为软骨损伤部位提供组织修复所必需的细胞。
此外，还需要说明的是，本发明具有下列优点的至少之一：
1、本发明由废弃物脐带获取间充质干细胞，来源广泛，可大量获取，且不会对病人造成伤害。
2、本发明对部分UCMSC进行软骨细胞方向的诱导分化，促进了UCMSC向软骨分化的效率。
3、温敏型水凝胶能够起到很好的外源性细胞载体的作用，使得细胞能够充分填充软骨损伤处，而又不向其它地方迁移。
本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的方案进行解释。本领域技术人员将会理解，下面的实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件的，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。
实施例1
按照以下步骤制备软骨细胞组合物，并对软骨损伤病人进行移植修复：
1、UCMSC的分离培养
将取到的新鲜脐带送入GMP生产车间，分离得到UCMSC。将UCMSC培养扩增；并取出部分细胞进行成软骨细胞诱导，得到一定数量的软骨细胞后扩增，准备移植。
2、移植前准备
将上述得到的UCMSC与诱导分化得到的软骨细胞，用0.25％的胰酶消化下来，并用生理盐水洗涤，然后将UCMSC与软骨细胞按照1:1～4:1的比例混合并重悬于Ⅱ型胶原蛋白溶液(胶原蛋白溶液的浓度为1-8质量％)中，以便得到细胞悬液，其中细胞悬液中胶原的含量为1-8质量％。将该细胞悬液与温敏型聚乳酸水凝胶MPEG-PLGA以1∶1～2的体积比混合，置于摇床一段时间使其充分混匀，以便得到本发明的软骨细胞组合物。
然后，对本发明的软骨细胞组合物中的细胞取样进行微生物、病毒五项、支原体、内毒素以及细胞功能检测，以确保安全性。
3、移植
采用关节腔注射法。其中，病人在接受注射前进行关节镜检查，确定关节损伤处的大小、厚度等，以每平方厘米5×106细胞的密度进行注射。
4、移植后效果观察
治疗后，定期采用核磁共振成像检查膝关节功能的改善情况。
结果发现，本发明的软骨细胞组合物中的细胞能够充分填充软骨损伤处且不向其它地方迁移，软骨损伤部位修复愈合快速、有效。
对比例1
按照实施例1的方法制备软骨细胞组合物，并对软骨损伤病人进行移植修复，区别仅在于：
不对UCMSC进行软骨诱导，即细胞悬液中的细胞全部采用UCMSC。
移植后观察到，病人软骨损伤部位软骨样组织，病人疼痛缓解，损伤有一定程度愈合。
对比例2
按照实施例1的方法制备软骨细胞组合物，并对软骨损伤病人进行移植修复，区别仅在于：
细胞悬液中的UCMSC与软骨细胞的比例为1：3。
移植后观察到，病人软骨损伤部位修复愈合速度慢。
对比例3
按照实施例1的方法制备软骨细胞组合物，并对软骨损伤病人进行移植修复，区别仅在于：
细胞悬液与温敏型聚乳酸水凝胶MPEG-PLGA的比例为1∶3。
移植后观察到，病人软骨损伤部位软骨细胞形成效率较低，从而修复愈合速度慢。
对比例4
按照实施例1的方法制备软骨细胞组合物，并对软骨损伤病人进行移植修复，区别仅在于：
细胞悬液与温敏型聚乳酸水凝胶MPEG-PLGA的比例为1：3。
移植后观察到，病人软骨损伤部位软骨细胞形成效率较低，修复愈合速度慢。
对比例5
按照实施例1的方法制备软骨细胞组合物，并对软骨损伤病人进行移植修复，区别仅在于：
不采用温敏型聚乳酸水凝胶MPEG-PLGA(即仅采用细胞悬液进行注射移植)。
移植后观察到，组合物中的细胞大量漂走，病人软骨损伤部位软骨细胞形成效率较低，修复愈合速度慢。
对比例6
按照实施例1的方法制备软骨细胞组合物，并对软骨损伤病人进行移植修复，区别仅在于：
采用生理盐水替代胶原溶液。
移植后观察到，组合物中的细胞大量漂走，病人软骨损伤部位软骨细胞形成效率较低，修复愈合速度慢。
在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不一定指的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任何的一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。
尽管已经示出和描述了本发明的实施例，本领域的普通技术人员可以理解：在不脱离本发明的原理和宗旨的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由权利要求及其等同物限定。