白细胞介素33在制备治疗心肌炎疾病药物中的应用的制作方法

本发明属于免疫学与心血管疾病药物制备领域，涉及白细胞介素33在制备治疗心肌炎疾病药物中的应用。

背景技术：

心肌炎是一种以心肌局限性或弥漫性的炎性病变为主要表现的疾病。Lieberman 根据心肌活检的组织学改变与临床表现，将心肌炎分为暴发性心肌炎、急性心肌炎、慢性活动性心肌炎和慢性迁延性心肌炎（参见：Lieberman EB et al., J Am Coll Cardiol, 1991, 18(7): 1671-1626）。心肌炎的病理生理机制不清。大鼠肠道病毒心肌炎模型显示，病毒进入急性损伤的心肌细胞，通过复制导致心肌坏死，细胞内抗原暴露及宿主免疫系统激活。该期持续数周至数月，以病毒特异性Ｔ淋巴细胞激活为特征，造成靶器官损伤。细胞因子如肿瘤坏死因子、 白细胞介素1和6、病毒抗体及心肌蛋白激活，加速心肌及其收缩功能损伤。多数心肌炎患者， 通过免疫反应清除病毒而减轻心肌损害， 左室功能完全恢复。也有部分患者，自身免疫过程不依赖心肌病毒存在，导致心肌重构形成扩张型心肌病，尸检结果显示，8.6～12%的年轻猝死者合并心肌炎。 对急性心肌炎患者的长期随访结果显示，3年后扩张型心肌病的患病率达21%。扩张型心肌病合并慢性心力衰竭是心肌炎晚期的主要结局。所以说心肌炎是潜在的严重危害生命的疾病。

心肌炎的病因包括感染性与非感染性两大类，感染性因素包括细菌、真菌、原虫、寄生虫、螺旋体、立克次体及病毒；非感染性因素有以下几个方面：（1）免疫介导性疾病（变应原、同种抗原、自身抗原）；（2）中毒性（药物、重金属、生物毒性物质、物理损伤等）。其中最常见的病因为病毒感染，随着聚合酶链式反应（PCR） 及原位杂交等分子生物学技术应用， 分离出与心肌炎相关性病毒包括肠道病毒、 腺病毒、 细小病毒 B19及人类疱疹病毒6，其他因素少见。目前心肌炎的治疗目前尚无特效药物，由于多数心肌炎由病毒感染导致，主要是通过抗病毒治疗和免疫治疗。动物研究结果显示，干扰素IFN能够有效抑制肠道病毒、减少炎症细胞浸润，减轻心肌炎心肌损伤、改善左室功能。多项有关免疫抑制、免疫调节、抗炎药及免疫吸附治疗心肌炎研究结果显示，免疫抑制治疗尚不能作为炎症性心肌病的标准治疗。强的松联用硫唑嘌呤或环孢霉素治疗1年，并未显著降低死亡率、改善心功能。免疫相关性心肌炎，如特发性巨细胞性心肌炎、心脏结节病、嗜酸粒细胞性心肌炎等，也可考虑免疫抑制剂治疗。因此，找到一种合适的药物，能够有效的缓解心肌炎症状，延长或者存活期是迫切需要解决的一个问题。

技术实现要素：

本发明提供一种白细胞介素33的新用途，具体为在制备治疗心肌炎疾病药物中的应用。

本发明在柯萨奇病毒B3诱导的病毒性心肌炎模型中，利用上调表达白细胞介素33的DNA质粒，在小鼠发病时期在小鼠体内给予白细胞介素33治疗，能够显著地改善心肌炎症和心脏功能，提高小鼠存活率，从而达到治疗心肌炎疾病的目的。

本发明进一步公开了一种治疗心肌炎疾病的药物，其活性成分为白细胞介素33。

上述技术方案中，所述治疗心肌炎疾病的药物还包括药物辅料。

上述技术方案中，所述治疗心肌炎疾病的药物为注射制剂。

可以将白细胞介素33克隆入载体，得到表达白细胞介素33的质粒，用于治疗心肌炎疾病；因此本发明进一步公开了表达白细胞介素33的质粒在制备治疗心肌炎疾病药物中的应用。

本发明还公开了一种治疗心肌炎疾病药物的制备方法，为将白细胞介素33与药物辅料混合，得到治疗心肌炎疾病药物，优选的，所述白细胞介素33以表达白细胞介素33质粒的形式存在，即将表达白细胞介素33的质粒与药物辅料混合，得到治疗心肌炎疾病药物。

本发明中，心肌炎疾病包括感染性与非感染性两大类，比如病毒引起的心肌炎疾病、自身免疫性心肌炎疾病。

本发明中，白细胞介素33具体应用步骤可以为：

1.建立CVB3诱导的病毒性心肌炎模型

(1) 在Hela细胞中，扩增CVB3（Nancy strain）病毒并且计算病毒滴度；

(2) 在6-8周龄的Balb/c雄性小鼠中，腹腔注射10³TCID₅₀剂量的CVB3病毒；

(3) 在病毒感染的第一天，第三天分别用眼眶静脉注射的方式，给予每只小鼠 50ug的 白细胞介素33上调表达的质粒， 不表达白细胞介素33的质粒载体pDisplay为对照。

2. 治疗效果的观察与统计分析

7天后，检测小鼠心肌病理损伤指标血清肌酸激酶CK的酶活性、心肌组织切片、心脏小动物超声成像、小鼠存活率，通过T检测统计分析，来判断白细胞介素33是否对于病毒性心肌炎有显著的改善作用。

3.有益效果

本发明以白细胞介素33为有效成分，公开了一种治疗心肌炎的药物；本发明在健康Balb/c雄性小鼠中，通过建立心肌炎模型，当给予心肌炎小鼠表达白细胞介素33的质粒2次，就能明显的减少炎症反应，改善心脏功能，提高小鼠存活率；本发明建立的健康Balb/c雄性小鼠模型是广泛接受并应用的心肌炎动物模型，适合临床应用研究；所以本发明对于心肌炎的药物研发具有重要的应用推广价值。

附图说明

图1 是携带白细胞介素33基因的DNA表达质粒pDisplay-IL-33示意图；

图2是CVB3感染小鼠心肌损伤血清指标肌酸激酶CK的酶活检测结果图；

图3是CVB3感染小鼠心脏组织切片免疫组化染色和病理评分图；

图4是CVB3感染小鼠心脏小动物超声图；

图5是CVB3诱导的小鼠病毒性心肌炎模型生存率图；

图6是给予白细胞介素33治疗后心肌组织中白细胞介素33的检测结果图；

图7是CVB3感染小鼠给予白细胞介素33治疗后心肌损伤血清指标肌酸激酶CK的酶活检测结果图；

图8是CVB3感染小鼠通过白细胞介素33治疗后心脏组织切片免疫组化染色和病理评分图；

图9是CVB3感染小鼠通过IL-33治疗后心脏二维超声图；

图10是白细胞介素33治疗后CVB3感染病毒性心肌炎小鼠的生存率图。

具体实施方式

实施例一 携带白细胞介素33基因的表达质粒的构建

利用聚合酶链式反应（PCR）技术，设计引物，以IL-33-pMD-18T质粒（义翘神州生物有限公司，货号： MG50118-M）为模板，扩增白细胞介素33片段， 并克隆至pDisplay (Invitrogen) 的Bgl II(Takara) 和PstI(Takara)位点，获得表达白细胞介素33的真核表达质粒pDisplay-IL-33。

图1 是携带白细胞介素33基因的DNA表达质粒pDisplay-IL-33示意图；白细胞介素33基因通过PCR扩增的方法，从IL-33-pMD-18T质粒扩增得到， 然后通过酶切位点Bgl II 和 Pst I，连接到载体pDisplay中，在pDiplay载体中有蛋白分泌的信号肽signal peptide 与白细胞介素33 N端连接，保证细胞表达的白细胞介素33能够分泌到胞外。

实施例二 CVB3诱导的病毒性心肌炎模型的构建

(1) 取6-8周龄的雄性Balb/c小鼠，每组8只， 分别以腹腔注射的方式给每只老鼠10³TCID₅₀剂量的CVB3病毒， PBS组为对照；

(2) 在病毒感染后7天，观测CVB3小鼠心肌炎指标和对照组相比，CK的酶活性明显增加, 从395IU/L增加到 894IU/L，见图2，为CVB3感染小鼠心肌损伤血清指标肌酸激酶CK的酶活检测结果图；在病毒感染的0, 3, 5, 7天取感染小鼠心脏组织，用苏木素(Hematoxylin)-伊红(Eosin)染色浸润的炎性细胞（图3A），根据图3A，计算免疫组化切片的病理评分（图3B）；心肌组织切片免疫组化显示，第3天小鼠心肌组织开始出现少量的炎性细胞浸润，并且在第5天和第7天逐渐加重，心肌评分也逐渐升高；在病毒感染的0、3、5、7天使用二维超声M-mode心动图检测心脏功能(图4A)，左心室射血分数和收缩分数显示(图4B)；心脏小动物超声成像表明, 检测结果表明，从CVB3感染第1天开始，小鼠的心脏功能就开始改变，并持续到第7天。小鼠心脏射血分数（EF%）从第0天的86%持续下降到第7天的55%，而心脏短轴缩短率（FS%）从第0天的50%下降到第7天的30%左右；这说明小鼠心脏的舒张和收缩力减弱，心功能紊乱。

最后统计了小鼠的生存情况，见图5，相对于正常组，发病组小鼠从第四天开始死亡，到第七天生存率为37.5%（3/8），这表明我们的小鼠模型建立成功，符合预期。

实施例三 白细胞介素33对于CVB3诱导的病毒性心肌炎的治疗作用

(1) 取6-8周龄的雄性Balb/c小鼠，分2组， 每组8只，以腹腔注射的方式给每只老鼠10³TCID₅₀剂量的CVB3病毒，诱导病毒性心肌炎。在病毒感染的第一天和第三天分别以眼眶静脉注射的方式给予小鼠pDisplay-IL-33质粒50ug/只，注射pDisplay的质粒为对照组。在感染的1至7天中，利用白细胞介素33酶联免疫吸附反应（ELISA）检测各个时间点心肌研磨组织中白细胞介素33的含量，见图6。和对照组相比，注射了pDisplay-IL-33质粒的小鼠，其心肌组织中白细胞介素33的含量在感染后第三天有了显著增加，达到650pg/100mg, 并一直延续到第七天，说明本发明以注射的方式给予小鼠白细胞介素33的表达质粒，能够在心肌炎发病过程中提高心肌组织的白细胞介素33的含量。

(2) 取6-8周龄的雄性Balb/c小鼠，分2组， 每组8只，以腹腔注射的方式给每只老鼠10³TCID₅₀剂量的CVB3病毒，诱导病毒性心肌炎。在病毒感染的第一天和第三天分别以眼眶静脉注射的方式给予小鼠pDisplay-IL-33质粒50ug/只，注射pDisplay的质粒为对照组。在感染的第7天，观测小鼠心肌炎指标和对照组相比，给予小鼠白细胞介素33治疗之后，血清心肌损伤指标CK酶活性为517IU/L, 而对照组的CK酶活为928IU/L，见图7。

在感染后第7天取感染小鼠心脏组织，用苏木素(Hematoxylin)-伊红(Eosin)染色浸润的炎性细胞（图8A），根据图8A，计算免疫组化切片的病理评分（图8B），Sdudents T test, **P<0.01；小鼠心脏病理切片同样表明，白细胞介素33治疗组小鼠心脏在第7天未见明显炎症,对照组相对于对照组小鼠心脏炎症加重，有大量淋巴细胞浸润，心脏呈弥漫性坏死，同样小鼠心脏心肌坏死评分与心脏病理切片一致。

在感染第7天使用二维超声M-mode心动图检测心脏功能(图9A)，左心室射血分数(Ejection Fraction)和收缩分数(Fractional shortening) 显示(图9B)；对各组小鼠做小动物心脏超声实验，检测结果表明，给予白细胞介素33上调质粒组，小鼠心脏舒张收缩正常，M modle下，心脏泵血正常，并且没有看到心脏体积膨大，而下调组小鼠，心脏收缩舒张能力减弱，心脏造影明显，心律不齐，并且心脏体积有膨大趋势，心脏左心室射血分数和短轴缩短率变低和心超生理功能吻合。

观察各组小鼠每天的生存情况，参见图10；结果显示，白细胞介素33上调组能有效提高小鼠的生存率达到75%，而下调组小鼠的生存率只有50%。

实施例四 白细胞介素33对于自身免疫性心肌炎的治疗作用

取6-8周龄的雄性Balb/c小鼠，分2组， 每组8只，直接给小鼠皮下注射心肌肌球蛋白和完全弗氏佐剂乳化的制剂，诱导小鼠心肌炎发病。分别在第一天、第十天以眼眶静脉注射的方式给予小鼠pDisplay-IL-33质粒50ug/只，注射pDisplay的质粒为对照组。观察各组小鼠每天的生存情况，结果显示，第21天，白细胞介素33注射组能有效提高小鼠的生存率达到78%，而对照组小鼠的生存率只有39%。