利拉鲁肽在制备治疗肾脏纤维化药物中的应用的制作方法

本发明涉及医药制备技术领域，具体指利拉鲁肽在制备治疗肾脏纤维化药物中的应用。

背景技术：

近年来，终末期肾脏病在全球的发病率逐年升高，其预后差、年限长、花费高等特点已成为全球范围内严重危害人类健康、加重经济负担的公共卫生问题。终末期肾脏病是各种肾脏疾病引起的肾脏功能不可逆衰退的终末阶段，而肾纤维化则是各种肾脏疾病进展为终末期肾脏病的共同途径，是决定肾功能恶化的关键因素之一。因此有效的抑制肾纤维化的发生发展将减少终末期肾脏病的发病率。肾纤维化以大量细胞外基质沉积、肾小管上皮细胞丢失、炎性细胞浸润及成纤维细胞聚集为特点。目前临床上使用的治疗肾脏纤维化的药物并没有取得良好的疗效，因此寻找和开发新型抗肾纤维化药物是很有必要的。

利拉鲁肽是一种长效胰高血糖素样肽-1(GLP-1)类似物，目前广泛用于治疗2型糖尿病。利拉鲁肽能够以葡萄糖浓度依赖的模式刺激胰岛素的分泌从而改善2型糖尿病患者的血糖控制，其作用持续时间长达24小时。利拉鲁肽的活性由其与GLP-1受体间特定的相互作用介导。研究表明，GLP-1受体在肾脏、心脏、肺等多种器官组织中也有表达。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供利拉鲁肽在制备治疗肾脏纤维化药物中的应用，为肾纤维化的治疗提供一种新的药品。

本发明通过构建小鼠肾纤维化模型，研究利拉鲁肽对肾脏纤维化的作用，同时在细胞及分子层面上探讨利拉鲁肽对肾小管上皮细胞上皮-间质转化的影响及可能的作用机制。

为实现上述目的，本发明通过利拉鲁肽处理单侧输尿管结扎小鼠，小鼠肾脏的HE、Masson及天狼星红染色结果显示，UUO小鼠给予利拉鲁肽处理后，相比于UUO对照组，肾小管萎缩、凋亡及炎性细胞浸润和胶原沉积明显减少。Western blot、RT-PCR和免疫组化分析结果显示，α-SMA、col-1α、FN在利拉鲁肽处理的UUO小鼠中的表达相比UUO对照组明显下调。本发明的结果证明了，对于经典的肾纤维化模型UUO小鼠，利拉鲁肽可以改善其肾脏纤维化状态，利拉鲁肽可以用于制备肾脏纤维化治疗药物。

本发明所述利拉鲁肽在制备治疗药物时的给药途径为皮下注射。

本发明的有益效果：提供了一种新的肾纤维化药物——利拉鲁肽，利拉鲁肽能明显改善单侧输尿管结扎导致的小鼠肾脏纤维化的发生发展，这种改善作用可能是通过减弱TGF-β/Smad、ERK1/2信号通路的活化从而抑制肾小管上皮细胞发生上皮-间质转化来实现。

附图说明

图1为8周龄C57小鼠行单侧输尿管结扎术和假手术后分别给予利拉鲁肽或生理盐水处理后的肾脏标本的HE、Masson染色分析结果；其中图1-A为HE染色结果对比图片；图1-B为标本损伤评分对比柱状图；图1-C为Masson染色结果对比图片；图1-D为标本中胶原纤维所占面积百分比对比柱状图。

图2为8周龄C57小鼠行单侧输尿管结扎术和假手术后分别给予利拉鲁肽或生理盐水处理后的肾脏标本的免疫组化及Western blot分析结果；其中图2-A为α-SMA免疫组化结果对比图片；图2-B为α-SMA免疫组化表达面积对比柱状图；图2-C为E-Cadherin免疫组化结果对比图片；图2-D为E-Cadherin免疫组化表达面积对比柱状图；图2-E为Western blot结果中E-Cadherin、α-SMA表达量对比图片；图2-F为α-SMA表达量对比柱状图；图2-G为E-Cadherin表达量对比柱状图。

图3为8周龄C57小鼠行单侧输尿管结扎术和假手术后分别给予利拉鲁肽或生理盐水处理后的肾脏标本的天狼星红染色和RT-PCR结果分析；其中图3-A为天狼星红染色结果对比图片；图3-B为染色区域百分比对比柱状图；图3-C、3-D分别为纤维粘连蛋白和Col1α1表达量对比柱状图。

图4为8周龄C57小鼠行单侧输尿管结扎术和假手术后分别给予利拉鲁肽或生理盐水处理后的肾脏标本的RT-PCR结果分析。

图5为8周龄C57小鼠行单侧输尿管结扎术和假手术后分别给予利拉鲁肽或生理盐水处理后的肾脏标本的磷酸化结果分析；图5-A为ERK1/2和Smad3磷酸化程度对比图片；图5-B、5-C分别为ERK1/2、Smad3的磷酸化程度对比柱状图。

图6为大鼠肾小管上皮细胞系NRK-52E经TGF-β1刺激后的免疫荧光、Western blot和RT-PCR结果分析；图6-A为TGF-β1刺激72小时后的α-SMA及E-Cadherin的免疫荧光对比图片；图6-B为TGF-β1刺激后的α-SMA、E-Cadherin表达量电泳图；图6-C、6-D、6-E、6-F、6-G分别为TGF-β1刺激72小时后的α-SMA、E-Cadherin、TGF-β1R、Col1α1和Col3α1的表达量对比柱状图。

图7为大鼠肾小管上皮细胞系NRK-52E经TGF-β1刺激后的Western blot结果分析。图7-A为经TGF-β1刺激1小时后，ERK1/2和Smad3的磷酸化程度对比图片；图7-B、7-C分别为ERK1/2和Smad3的磷酸化程度对比柱状图。

图8为大鼠肾小管上皮细胞系NRK-52E分别在PDTC和利拉鲁肽条件下，经TGF-β1刺激所产生的Col1α1的表达量对比柱状图。

图9为大鼠肾小管上皮细胞系NRK-52E分别在PDTC和利拉鲁肽条件下，经TGF-β1刺激所产生的Col3α1的表达量对比柱状图。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步的详细说明，以下实施例是对本发明的解释，而本发明并不局限于以下实施例。

以下实验将通过研究利拉鲁肽对单侧输尿管结扎(UUO)小鼠肾纤维化程度的影响，以证明利拉鲁肽可作为治疗肾脏纤维化的药物。

实验构思：通过单侧结扎小鼠输尿管建立肾纤维化模型，同时给予连续7天(2次/天)皮下注射利拉鲁肽治疗，以观察利拉鲁肽对肾纤维化小鼠的影响。我们的实验设计共分四组，假手术组、利拉鲁肽组、UUO组、UUO后给予利拉鲁肽处理组。实验选用8周龄的雄性C57小鼠，随机分配入组后进行单侧输尿管结扎术和假手术，术后每天给予利拉鲁肽或生理盐水皮下注射，术后第7天处死小鼠，取肾脏标本进行组织病理学、分子生物学等检测。

实验步骤如下：

1、小鼠实验

1)动物模型构建

实验所用到的小鼠为SPF级C57小鼠，雄性，8周龄，均购于北京华阜康公司，饲养于华中科技大学同济医学院附属同济医院器官移植研究所动物实验中心屏障环境中，受华中科技大学同济医学院动物中心伦理委员会监管。实验小鼠每两只喂养于塑料笼中，给予标准饮食和正常饮水，室温控制在20～25℃，相对湿度50～60％，12小时光照循环。

C57小鼠6周龄进入屏障环境后使其适应2周，于小鼠8周龄时开始实验处理。32只小鼠随机分配入假手术加生理盐水(Veh)组(n＝6)，假手术加利拉鲁肽(Lira)组(n＝6)，单侧输尿管结扎(UUO)组(n＝10)和单侧输尿管结扎加利拉鲁肽干预(UUO+Lira)组(n+10)。

2)单侧输尿管结扎术

各组实验小鼠用1％戊巴比妥钠腹腔注射麻醉(8ml/1kg)后腹部向上固定于无菌手术台上，待小鼠呼吸心跳平稳后行单侧输尿管结扎术。采取腹部正中切口，切口处先予以脱毛处理，并用75％酒精消毒。UUO及UUO+Lira组小鼠开腹后用无菌棉签拨开肠道暴露出左侧肾脏及输尿管，游离左侧输尿管，在输尿管中上1/3处用5-0丝线结扎两道并从中离断。之后还原肠道，并行双层连续缝合关闭腹腔。Veh及Lira组小鼠不结扎输尿管，其余操作与UUO组相同。整个手术过程遵循无菌操作原则，手术器械均高压蒸汽消毒灭菌，小鼠术后肌肉注射青霉素20U/(kg)抗感染。

3)药物干预及结果处置

药物干预时间为7天，Lira及UUO+Lira组小鼠皮下注射利拉鲁肽(300μg/kg，bid)，Veh及UUO组小鼠皮下注射等体积生理盐水。

术后第7天，处死各组小鼠，取左侧肾脏，剔除肾包膜，将肾脏纵切分为两半，一半置于4％中性甲醛固定，随后针对各组样本分别给予HE、Masson、天狼星红和免疫组化(检测α-SMA、E-Cadherin)染色；另一半置于-80℃，后期行Western blot(检测α-SMA、E-Cadherin、p-ERK1/2、ERK1/2、p-Smad3、Smad3)和RT-PCR(检测TGF-β1R、FN、Col1α1)。结果见附图1～6。

其中，图1-A和1-B：HE染色及相应的损伤评分表明，UUO对照组的肾脏损伤评分明显高于假手术组；经利拉鲁肽处理后的UUO小鼠，与UUO对照组相比较，其损伤评分明显降低。图中，****代表<0.0001，##代表<0.01。

图1-C和1-D：Masson染色及相应的胶原纤维所占面积百分比分析表明，UUO对照组的肾脏胶原纤维所占面积百分比明显高于假手术组；经利拉鲁肽处理后的UUO小鼠，与UUO对照组相比较，其胶原纤维所占面积百分比明显降低。图中，**代表<0.01，##代表<0.01。

图2-A、2-B、2-C、2-D：免疫组化结果分析表明，UUO对照组与假手术组相比，其α-SMA的表达量显著升高，而E-Cadherin的表达显著降低；此外，UUO小鼠经利拉鲁肽处理后，相较UUO对照组，其α-SMA的表达量明显下降，而E-Cadherin的表达明显升高。图中，***代表<0.001，##代表<0.01，#代表<0.05。

图2-E、2-F、2-G：Western blot结果分析表明，UUO对照组与假手术组相比，其α-SMA的表达量显著升高，而E-Cadherin的表达显著降低；UUO小鼠经利拉鲁肽处理后，相较UUO对照组，其α-SMA的表达量明显下降，而E-Cadherin的表达明显升高。图中，***代表<0.001，**代表<0.01，###代表<0.001，#代表<0.05。

图3-A、3-B：天狼星红染色结果分析表明，UUO对照组的肾脏胶原蛋白表达量显高于假手术组；经利拉鲁肽处理后的UUO小鼠，与UUO对照组相比较，其胶原蛋白表达量明显降低。图中，**代表<0.01，#代表<0.05。

图3-C、3-D：RT-PCR结果分析表明，纤维连接蛋白(FN)和1型胶原蛋白(Col1α1)在UUO对照组中的表达显著高于假手术组；UUO小鼠经利拉鲁肽处理后，其FN和Col1α1的表达量相比UUO对照组明显降低。图中，***代表<0.001，##代表<0.01。

图4：TGF-β1在UUO对照组中的表达显著高于假手术组；UUO小鼠经利拉鲁肽处理后，其TGF-β1表达量相比UUO对照组明显降低。***代表<0.001，###代表<0.001。

图5-A、5-B、5-C：UUO对照组中ERK1/2的磷酸化程度显著高于假手术组；UUO小鼠经利拉鲁肽处理后，其ERK1/2磷酸化程度相比UUO对照组明显降低。UUO对照组中Smad3的磷酸化程度显著高于假手术组；UUO小鼠经利拉鲁肽处理后，其Smad3的磷酸化程度相比UUO对照组明显降低。**代表<0.01，***代表<0.001，#代表<0.05，##代表<0.01。

2、细胞实验

大鼠肾小管上皮细胞系(NRK-52E)置于含10％胎牛血清、100单位/ml青霉素及100μg/ml链霉素的DMEM培养液中，于37℃、5％CO₂培养箱中孵育，细胞传代用0.25％胰蛋白酶消化细胞。隔天换液，至细胞贴壁生长至亚融合状态(达到底面积的75％～80％)传代，分组，用无血清培养基平衡12小时，然后分组分别给予刺激；

刺激(Ⅰ)TGF-β1刺激72小时后进行免疫荧光、RT-PCR以及α-SMA、E-Cadherin的Western blot检测；

刺激(Ⅱ)TGF-β1刺激1小时后进行p-ERK1/2、ERK1/2、p-Smad3、Smad3的Western blot检测)。

分组类型：①正常对照组；②TGF-β1(10ng/ml)阳性对照组；③TGF-β1(10ng/ml)+利拉鲁肽(100nM)。所有试验均重复3次。

免疫荧光双染、Western blot检测NRK-52E细胞α-SMA、E-Cadherin表达；Western blot检测NRK-52E细胞p-ERK1/2、ERK1/2、p-Smad3、Smad3表达强度；RT-PCR检测NRK-52E细胞TGF-β1R、Col1α1、Col3α1表达强度，结果见：

图6-A、6-B、6-C、6-D：经TGF-β1刺激72小时后，α-SMA的表达量与TGF-β1未刺激组相比较明显升高，而利拉鲁肽处理能够减弱TGF-β1刺激引起的α-SMA表达量升高；经TGF-β1刺激72小时后，E-Cadherin的表达量与TGF-β1未刺激组相比较明显降低，而利拉鲁肽处理能够改善TGF-β1刺激引起的E-Cadherin表达量降低。图中，**代表<0.01，***代表<0.001，#代表<0.05，##代表<0.01。

图6-E、6-F、6-G：经TGF-β1刺激72小时后，TGF-β1R、Col1α1和Col3α1的表达量与TGF-β1未刺激组相比较明显升高；而利拉鲁肽处理后能降低TGF-β1刺激引起的TGF-β1R、Col1α1和Col3α1表达量的升高。图中，*代表<0.05，**代表<0.01，#代表<0.05，##代表<0.01，###代表<0.001。

图7，经TGF-β1刺激1小时后，ERK1/2和Smad3的磷酸化程度与TGF-β1未刺激组相比较明显升高，而利拉鲁肽处理能够减弱TGF-β1刺激引起的ERK1/2和Smad3的磷酸化程度升高。****代表<0.0001，##代表<0.01，####代表<0.0001。

3、与NF-κB活化抑制剂的对比细胞实验

大鼠肾小管上皮细胞系(NRK-52E)置于含10％胎牛血清、100单位/ml青霉素及100μg/ml链霉素的DMEM培养液中，于37℃、5％CO₂培养箱中孵育，细胞传代用0.25％胰蛋白酶消化细胞。隔天换液，至细胞贴壁生长至亚融合状态(达到底面积的75％～80％)传代，分组，用无血清培养基平衡12小时，然后分组分别给予刺激；

然后再以TGF-β1刺激72小时后进行RT-PCR检测Col1α1、Col3α1表达强度；

分组类型：①正常对照组；②TGF-β1(10ng/ml)阳性对照组；③TGF-β1(10ng/ml)+PDTC(100nM)；④TGF-β1(10ng/ml)+利拉鲁肽(100nM)。所有试验均重复3次。

(注：PDTC的全称为Ammonium pyrrolidinedithiocarbamate或Pyrrolidinedithiocarbamic acid,ammonium salt，是一种可以通透细胞膜的NF-κB活化(NF-κB activation)抑制剂，可以在多种细胞中抑制NF-κB的激活。)

实验结果见图8和图9，图8显示，经TGF-β1刺激72小时后，Col1α1的表达量与TGF-β1未刺激组相比较明显升高；PDTC虽能减少TGF-β1刺激引起的Col1α1表达量升高，但这种减少效果没有统计学差异；而利拉鲁肽处理后能降低TGF-β1刺激引起的Col1α1表达量的升高，且与PCTC组有统计学差异。**代表<0.01，#代表<0.05，&代表<0.05。

图9显示，经TGF-β1刺激72小时后，Col3α1的表达量与TGF-β1未刺激组相比较明显升高；PDTC能减少TGF-β1刺激引起的Col3α1表达量升高；而利拉鲁肽处理后同样能降低TGF-β1刺激引起的Col3α1表达量的升高，且减弱效果相比PCTC组有统计学差异。*代表<0.05，#代表<0.05，&代表<0.05。

结论：相同浓度的利拉鲁肽改善TGF-β1刺激引起的NRK-52E发生纤维化转变的效果好于相同浓度的PDTC。

综合上述动物实验及细胞实验数据，说明利拉鲁肽能明显改善单侧输尿管结扎导致的小鼠肾脏纤维化的发生发展，这种改善作用可能是通过减弱TGF-β/Smad、ERK1/2信号通路的活化从而抑制肾小管上皮细胞发生上皮-间质转化来实现。