乳铁蛋白在制备帕金森治疗药物中的应用的制作方法

本发明属于蛋白质药物领域，具体地涉及乳铁蛋白在制备帕金森治疗药物中的应用。

背景技术：

帕金森病(Parkinson’s disease,PD)是一种常见的中枢神经系统退行性疾病，临床表现主要有静止性震颤、肌僵直、运动减少和姿势反射障碍等症状。PD的神经病理学基础是黑质致密带(substantia nigra pars compacta，SNpc)多巴胺(dopamine,DA)能神经元的变性脱失以及由此而导致的纹状体DA含量降低。PD的病因目前尚未完全明了，但黑质(substantia nigra,SN)铁聚积被认为参与了PD的发病。PD患者的中脑SNpc有大量的激活的小胶质细胞，这些激活的小胶质细胞和残存的DA能神经元又有大量的铁沉积，然而小胶质细胞激活和铁聚积之间的关系尚未阐明。

乳铁蛋白(lactoferrin，Lf)是一种铁结合性糖蛋白，属于转铁蛋白家族成员之一，由许多外分泌腺分泌，存在于人类和其他哺乳动物的泪液、唾液、乳汁和嗜中性粒细胞中。乳铁蛋白受体(lactoferrin receptor，LfR)广泛存在于人体内的不同组织和细胞类型中，其作用是通过受体介导的内吞参与Lf内化。Lf可以结合转运三价铁离子，是铁在机体内代谢及转运的关键载体。Lf还具有广泛的生物学功能：抗氧化应激，抗癌，调控免疫炎症反应等，可能与其铁结合特性无关。在体内Lf主要以两种形式存在：不含铁形式(apo-lactoferrin，apo-Lf)和铁饱和形式(holo-lactoferrin，holo-Lf)。在脑内只有激活的小胶质细胞合成释放Lf，1-甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氢吡啶(1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridine，MPTP)模型小鼠中Lf mRNA的表达水平升高。LfR主要在神经元上表达，脑组织染色发现PD患者中脑的神经元和微血管中LfR反应性表达增加，提示Lf/LfR与PD铁聚积和神经元进行性退化之间有一定关联性。乳铁蛋白(lactoferrin，Lf)是一种铁结合性糖蛋白，属于转铁蛋白家族成员之一，由许多外分泌腺分泌，存在于人类和其他哺乳动物的泪液、唾液、乳汁和嗜中性粒细胞中。乳铁蛋白受体(lactoferrin receptor，LfR)广泛存在于人体内的不同组织和细胞类型中，其作用是通过受体介导的内吞参与Lf内化。Lf可以结合转运三价铁离子，是铁在机体内代谢及转运的关键载体。Lf还具有广泛的生物学功能：抗氧化应激，抗癌，调控免疫炎症反应等，可能与其铁结合特性无关。在体内Lf主要以两种形式存在：不含铁形式(apo-lactoferrin，apo-Lf)和铁饱和形式(holo-lactoferrin，holo-Lf)。在脑内只有激活的小胶质细胞合成释放Lf，1-甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氢吡啶(1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridine，MPTP)模型小鼠中Lf mRNA的表达水平升高。LfR主要在神经元上表达，脑组织染色发现PD患者中脑的神经元和微血管中LfR反应性表达增加，提示Lf/LfR与PD铁聚积和神经元进行性退化之间有一定关联性。我们以前的研究结果表明，Lf对体外培养的神经元具有保护作用。本实验的目的是在体研究Lf是否影响了PD中枢神经系统和外周的铁代谢，并探讨两种形式的Lf—铁游离形式(Apo-Lf)和铁饱和形式(Holo-Lf)的区别。在具体的机制方面，我们研究了Lf是否来通过调节铁转运蛋白表达的影响铁在中枢以及外周的分布，以及它是否发挥了抗氧化和抗凋亡的保护作用。

中国专利申请200410004604.X公开了活化乳铁蛋白的制造方法。中国专利申请200880114714.8公开了脱铁乳铁蛋白组合物及其用于治疗病毒性丙型肝炎的方法。这些现有技术都公开了脱铁乳铁蛋白对于治疗的疾病的重要性。然而，现有技术关于脱铁乳铁蛋白对于治疗帕金森病的疗效未见报道。

技术实现要素：

为解决上述现有技术存在的问题，本发明的目的在于提供一种用于治疗帕金森病的乳铁蛋白。

为达到上述目的，本发明的技术方案为：

乳铁蛋白在制备帕金森治疗药物中的应用，所述药物用于治疗或预防MPTP的毒理学作用。

乳铁蛋白在制备帕金森治疗药物中的应用，所述药物用于治疗或预防帕金森病。

所述乳铁蛋白是脱铁乳铁蛋白或全铁乳铁蛋白，这两种药物均能降低脑内黑质铁的水平，发挥对PD的神经保护作用，APO-Lf与HOLO-Lf对外周铁水平均没有影响，既不螯合铁造成贫血，也不增加铁造成铁负载，APO-Lf与HOLO-Lf降低脑内黑质铁的作用与铁螯合不相关，通过调节铁转运蛋白的表达而实现降低脑铁的功能，即降低铁转入蛋白DMT1的表达，增加铁转出蛋白Fpn1表达。

所述脱铁乳铁蛋白的浓度为10mg/kg；所述全铁乳铁蛋白的浓度为15mg/kg。

其中，APO-Lf与HOLO-Lf除了降低脑铁水平发挥神经保护作用之外，还能通过抗凋亡，增加Bcl-2，Bcl-2/Bax及降低CleavedCaspase-3，抗氧化，增加SOD1发挥神经保护作用。

其中所述乳铁蛋白减轻MPTP所致实验动物脾脏质量的丢失。

其中所述乳铁蛋白拮抗MPTP对黑质DA能神经元的神经毒作用。

其中所述乳铁蛋白可拮抗MPTP导致脾脏铁减少的毒性作用，从而维持脾脏内的铁储存量；但对肝脏铁的水平没有影响。

其中所述乳铁蛋白减轻MPTP所致纹状体内DA含量的降低。

其中所述乳铁蛋白降低MPTP处理组黑质的铁沉积水平。

相对于现有技术，本发明的有益效果为：

本发明基于以下意料不到的发现：脱铁乳铁蛋白和乳铁蛋白促进了帕金森病的治疗。

1.乳铁蛋白在制备药物中的用途，所述药物用于治疗或预防MPTP的毒理学作用。

2.乳铁蛋白在制备药物中的用途，所述药物用于治疗或预防帕金森病。

3.项1或2的用途，其中所述乳铁蛋白是脱铁乳铁蛋白或全铁乳铁蛋白。

4.项3的用途，其中所述脱铁乳铁蛋白Apo-Lf的浓度为10mg/kg。

5.项3的用途，其中所述全铁乳铁蛋白Holo-Lf的浓度为15mg/kg。

6.项1的用途，其中所述乳铁蛋白减轻MPTP所致实验动物脾脏质量的丢失。

7.项1的用途，其中所述乳铁蛋白拮抗MPTP对黑质DA能神经元的神经毒作用。

8.项1的用途，其中所述乳铁蛋白减轻MPTP所致纹状体内DA含量的降低。

9.项1的用途，其中所述乳铁蛋白降低MPTP处理组黑质的铁沉积水平。

附图说明

图1:MPTP组小鼠在接受Lf处理后体重损失减轻(Figure.1A)，爬竿实验时间缩短(Fugure.1B)。*P<0.05,与对照相比；#P<0.05,与MPTP组相比；n＝6。

图2 MPTP小鼠在接受Lf处理后脾脏组织重量损失程度降低，高剂量Lf的效果更为显著。*P<0.05,与对照相比；#P<0.05,与MPTP组相比；n＝6。

图3 Lf通过拮抗MPTP所致的小鼠黑质TH阳性细胞数量减少发挥对DA神经元的保护作用。15mg/kg Holo-Lf和10mg/kgApo-Lf均表现出最佳保护作用。*P<0.05,与对照相比；#P<0.05,与MPTP组相比；n＝6。

图4 Lf拮抗MPTP所致的纹状体中DA与其代谢产物含量下降。图示各组小鼠纹状体中DA水平(A)，DOPAC水平(B),HVA水平(C)以及DA([DOPAC+HVA]/DA)的数值(D)。*P<0.05,与对照相比；#P<0.05,与MPTP组相比；n＝6。

图5免疫组织化学铁着色阳性细胞在黑质的分布(A)。MPTP组小鼠在Lf处理后铁着色细胞减少。15mg/kg Holo-Lf和10mg/kgApo-Lf均表现出最佳效果。*P<0.05,与对照相比；#P<0.05,与MPTP组相比；n＝8.

图6 MPTP组小鼠血清铁(A)与血清铁蛋白(B)均显著升高，TIBC(C)则降低。15mg/kg Holo-Lf和10mg/kg Apo-Lf均能逆转MPTP组小鼠血清铁的上升趋势，并降低血清铁蛋白的水平。*P<0.05,与对照相比；#P<0.05,与MPTP组相比；n＝6.

图7免疫组化铁着色并未发现铁在各组间小鼠肝组织中的分布有明显差异。*P<0.05,与对照相比；#P<0.05,与MPTP组相比；n＝6.

图8脾组织普鲁士蓝染色示小鼠脾组织铁分布(A)。MPTP小鼠在经Lf处理后脾组织铁的特征性分布明显减轻(B)。*P<0.05,与对照相比；#P<0.05,与MPTP组相比；n＝6.

图9 Western blot检测Lf表达量(A)。MPTP组与Lf组均出现Lf表达量的升高(B)。*P<0.05,与对照相比；#P<0.05,与MPTP组相比；n＝6.

图10 Western blot示DMT1与Fpn1的表达量(A and C)。Lf使MPTP组小鼠的DMT1(B)表达量上升，是Fpn1(D)表达量降低。*P<0.05,与对照相比；#P<0.05,与MPTP组相比；n＝6.

图11 Western blot示小鼠黑质中Bcl-2水平(A),Bax水平(B),Bcl-2/Bax比值(C)和Cleaved Caspase-3水平(D)。与MPTP组相比，Apo和Holo-Lf处理均能使Bcl-2和Bcl-2/Bax比值上调，同时使Cleaved Caspase-3水平下降。各组间Bax表达量未见明显差异。*P<0.05,与对照相比；#P<0.05,与MPTP组相比；n＝6.

图12 Western blot示黑质中SOD1水平(A)。Lf可通过减轻SOD1表达量的降低拮抗MPTP毒性作用(B)。*P<0.05,与对照相比；#P<0.05,与MPTP组相比；n＝6.

具体实施方式

下面结合附图和具体实施方式对本发明技术方案做进一步详细描述：

本发明提供以下内容以便于本领域技术人员理解本发明，但是这些仅仅是例示性的，而非限制性的。本发明应当以所附权利要求书为限。

如图1-12所示：

图1:MPTP组小鼠在接受Lf处理后体重损失减轻(Figure.1A)，爬竿实验时间缩短(Fugure.1B)。*P<0.05,与对照相比；#P<0.05,与MPTP组相比；n＝6。

图2MPTP小鼠在接受Lf处理后脾脏组织重量损失程度降低，高剂量Lf的效果更为显著。*P<0.05,与对照相比；#P<0.05,与MPTP组相比；n＝6。

图3Lf通过拮抗MPTP所致的小鼠黑质TH阳性细胞数量减少发挥对DA神经元的保护作用。15mg/kg Holo-Lf和10mg/kgApo-Lf均表现出最佳保护作用。*P<0.05,与对照相比；#P<0.05,与MPTP组相比；n＝6。

图4Lf拮抗MPTP所致的纹状体中DA与其代谢产物含量下降。图示各组小鼠纹状体中DA水平(A)，DOPAC水平(B),HVA水平(C)以及DA([DOPAC+HVA]/DA)的数值(D)。*P<0.05,与对照相比；#P<0.05,与MPTP组相比；n＝6。

图5免疫组织化学铁着色阳性细胞在黑质的分布(A)。MPTP组小鼠在Lf处理后铁着色细胞减少。15mg/kg Holo-Lf和10mg/kgApo-Lf均表现出最佳效果。*P<0.05,与对照相比；#P<0.05,与MPTP组相比；n＝8.

图6MPTP组小鼠血清铁(A)与血清铁蛋白(B)均显著升高，TIBC(C)则降低。15mg/kg Holo-Lf和10mg/kg Apo-Lf均能逆转MPTP组小鼠血清铁的上升趋势，并降低血清铁蛋白的水平。*P<0.05,与对照相比；#P<0.05,与MPTP组相比；n＝6.

图7免疫组化铁着色并未发现铁在各组间小鼠肝组织中的分布有明显差异。*P<0.05,与对照相比；#P<0.05,与MPTP组相比；n＝6.

图8脾组织普鲁士蓝染色示小鼠脾组织铁分布(A)。MPTP小鼠在经Lf处理后脾组织铁的特征性分布明显减轻(B)。*P<0.05,与对照相比；#P<0.05,与MPTP组相比；n＝6.

图9Western blot检测Lf表达量(A)。MPTP组与Lf组均出现Lf表达量的升高(B)。*P<0.05,与对照相比；#P<0.05,与MPTP组相比；n＝6.

图10Western blot示DMT1与Fpn1的表达量(A and C)。Lf使MPTP组小鼠的DMT1(B)表达量上升，是Fpn1(D)表达量降低。*P<0.05,与对照相比；#P<0.05,与MPTP组相比；n＝6.

图11Western blot示小鼠黑质中Bcl-2水平(A),Bax水平(B),Bcl-2/Bax比值(C)和Cleaved Caspase-3水平(D)。与MPTP组相比，Apo和Holo-Lf处理均能使Bcl-2和Bcl-2/Bax比值上调，同时使Cleaved Caspase-3水平下降。各组间Bax表达量未见明显差异。*P<0.05,与对照相比；#P<0.05,与MPTP组相比；n＝6.

图12Western blot示黑质中SOD1水平(A)。Lf可通过减轻SOD1表达量的降低拮抗MPTP毒性作用(B)。*P<0.05,与对照相比；#P<0.05,与MPTP组相比；n＝6.

在体内Lf主要以两种形式存在：不含铁形式(apo-lactoferrin，apo-Lf)和铁饱和形式(holo-lactoferrin，holo-Lf)。

在本文中，不含铁形式的乳铁蛋白与脱铁乳铁蛋白或apo-Lf可互换使用。

在本文中，铁饱和形式的乳铁蛋白与全铁乳铁蛋白或holo-Lf可互换使用。

帕金森病是一种常见的神经系统变性疾病，老年人多见，平均发病年龄为60岁左右，40岁以下起病的青年帕金森病较少见。我国65岁以上人群PD的患病率大约是1.7％。大部分帕金森病患者为散发病例，仅有不到10％的患者有家族史。帕金森病最主要的病理改变是中脑黑质多巴胺(dopamine,DA)能神经元的变性死亡，由此而引起纹状体DA含量显著性减少而致病。导致这一病理改变的确切病因目前仍不清楚，遗传因素、环境因素、年龄老化、氧化应激等均可能参与PD多巴胺能神经元的变性死亡过程。

实施例

方法：我们的实验动物采用出生10周后的雄性C57BL/6小鼠。每天记录体重，隔天进行一次爬竿实验测定。我们用铁染色和普鲁士蓝染色的方法对黑质，肝脏和脾脏中的非血红素铁进行了免疫组化染色，用免疫荧光的方法对黑质中的表达酪氨酸羟化酶(TH)细胞进行染色，用高效液相的方法对纹状体多巴胺(dopamine，DA)含量极其代谢产物进行了测定。血清铁(serum iron，SI)、血清铁蛋白(serum ferritin，SI)和总铁结合力(total iron binding capacity,TIBC)用ELISA法检验。用Western blot的方法检测Lf、乳铁蛋白受体(lactoferrin receptor,LfR)、二价金属离子转运体(divalent metal transporter,DMT1)，膜铁转运蛋白(ferriportin1，Fpn1)，Bcl-2、Bax以及caspase-3在黑质中的表达。

Lf减轻MPTP所致体重损失与行为异常：

MPTP的毒理学作用导致了实验动物体重的损失，而应用高剂量Lf(如10mg/kg Apo-Lf或15mg/kg Holo-Lf)处理MPTP组之后，体重损失明显减轻。爬竿实验用于测定运动迟缓程度。MPTP组爬竿时动作缓慢、僵硬，不能纠正姿态，停留在爬竿上的时间显著延长，这可能与严重的肌紧张有关。经10mg/kg Apo-Lf或15mg/kg Holo-Lf处理后的MPTP组，爬竿时间明显缩短。同时，单纯应用Lf灌胃处理与进行对照的组别间并无显著差异。

Lf减轻MPTP所致实验动物脾脏质量的丢失：

凡经MPTP处理的实验组与对照组相比均有不同程度的脾脏质量减小。而应用10mg/kg Apo-Lf或15mg/kg Holo-Lf可以减轻这种影响，其原因可能是Lf的抗炎作用与抗毒性作用保护脾脏免受MPTP的毒性损伤。同时，仅给予Lf处理的实验组并未表现出较对照组更好的保护作用。

Lf拮抗MPTP对黑质DA能神经元的神经毒作用：

DA能神经元均呈酪氨酸羟化酶阳性(TH-ir)，能将酪氨酸转化为多巴——多巴胺的前体。我们使用免疫荧光技术检测黑质中TH-ir细胞发现，与对照组相比，单纯MPTP损伤组可减少约40个神经元，其变化显著。10mg/kg Apo-Lf组或15mg/kg Holo-Lf组与单纯MPTP损伤组相比，损失的神经元可减少至约10个，而5mg/kg Apo-Lf组和5mg/kg Holo-Lf组的黑质神经元数量并无明显回升，这显示高剂量Lf能拮抗MPTP的神经毒作用。另外，单纯应用Lf灌胃处理与进行对照的组别间差别不明显。

Lf减轻MPTP所致纹状体内DA含量的降低：

我们使用高效液相色谱法及电化学技术测定DA及其代谢产物DOPAC与HVA在纹状体内含量，并以[DOPAC+HVA]/DA作为DA代谢指标。结果提示，MPTP显著降低C57BL/6小鼠纹状体内DA、DOPAC和HVA的含量，且明显提高[DOPAC+HVA]/DA(即DA代谢率)。同时，应用高剂量Lf(如10mg/kg Apo-Lf或15mg/kg Holo-Lf)可减轻MPTP的毒性作用，使DA及其代谢率恢复至接近正常。而低剂量(5mg/kg Apo-Lf或5mg/kg Holo-Lf)发挥的保护作用有限，并且对照组与仅用Lf处理组之间没有明显差异。

Lf降低MPTP处理组黑质的铁沉积水平：

为探索Lf的铁螯合能力，我们使用免疫组化技术测定了黑质的铁沉积水平。结果证实经MPTP处理的小鼠，黑质中的铁着色细胞可增加约25个；而应用Lf处理的MPTP组，铁沉积水平有所下降，10mg/kg Apo-Lf组和15mg/kg Holo-Lf组下降尤为明显，与单纯MPTP损伤组相比可减少约20个。同时，单纯Lf处理组与对照组相比铁沉积水平无明显改观，提示Lf可能不具备铁螯合能力。

Elisa检测血清铁、血清铁蛋白及总铁结合力(TIBC)的结果：

血清铁指示了血清或血浆中Fe3+的含量，其来源于食物摄取、红细胞破坏和肝、脾储存铁的释放。我们观察到MPTP可使血清铁升高，而高剂量Lf(如10mg/kg Apo-Lf或15mg/kg Holo-Lf)可减弱MPTP的作用。血清铁蛋白是Fe3+与游离铁蛋白的结合体，也是体内铁的一种储存形式，其作用包括调节铁水平，及通过结合或释放血清铁以维持血红蛋白稳定性。我们发现在MPTP损伤后，血清铁蛋白可反应性升高，同时高剂量Lf对MPTP有拮抗作用。TIBC代表血清转铁蛋白尚能结合铁的最大量，反映了转铁蛋白的真实水平。Lf处理的MPTP组与单纯MPTP组相比，TIBC升高。单纯应用Lf灌胃处理与进行对照的组别间差别不明显。

肝组织铁含量测定显示组间铁沉积水平无差异：

我们使用免疫组化技术探索肝脏铁的分布，结果显示，铁的沉积主要表现在肝小叶的边缘区及肝脏血管内皮，而在汇管区少有铁沉积。各实验组间并无明显差别，提示MPTP可能不会导致肝脏铁代谢紊乱。

普鲁士蓝染色显示Lf处理的MPTP小鼠脾脏中铁颗粒增加：

普鲁士蓝染色可将铁颗粒染为蓝色，将脾脏细胞染为红色。结果显示，铁颗粒主要分布于含有大量红细胞的白髓。周围被铁颗粒环绕的区域为红髓，包括脾索和脾窦。铁颗粒含量的分析使用Image J，结果显示与对照组相比，MPTP可导致铁颗粒减少约0.7％。高剂量Lf可使MPTP损伤后的铁颗粒数量有所回升，从而维持脾脏内的铁储存量。

Lf处理后的MPTP小鼠黑质中Lf表达量上升：

Lf表达水平可由Western Blot测定，结果表明单纯MPTP损伤组较对照组Lf有升高趋势，同时体外补充Lf也可以提高黑质内Lf的含量。但应用Lf处理的MPTP组与单纯Lf灌注组之间并无Lf含量的明显差别。

黑质中DMT1与Fpn1表达量的改变与铁稳态相关：

DMT1是细胞主要的铁转入蛋白，而Fpn1是主要的铁转出蛋白，两种蛋白在黑质中的含量均可由Western Blot测得。我们观察到Lf可降低DMT1的表达量，提高Fpn1的表达量，从而降低黑质中铁的沉积。单纯Lf灌胃处理与进行对照的组别间差别不明显。

Apo-Lf与Holo-Lf对Bcl-2，Bax，Bcl-2/Bax及Cleaved Caspase-3表达量的影响：

细胞调往途径被公认为PD中DA能神经元丢失的重要原因。我们使用Western Blot测定Bcl-2，Bax，Bcl-2/Bax及Cleaved Caspase-3的表达量，以探索Apo-Lf或Holo-Lf诱导的抗凋亡作用。腹腔注射MPTP可降低Bcl-2水平及Bcl-2/Bax，并提高Cleaved Caspase-3水平，而高剂量Lf可明显拮抗MPTP的作用。然而各组间Bax水平并无明显变化，此外，单纯Lf处理组与对照组相比改变也不明显。

Lf通过提高SOD1的表达量拮抗MPTP：

SOD1可将·O2-转化为H2O2，因此在神经元中发挥重要的抗氧化作用。其含量可通过Western Blot进行测定。MPTP可导致SOD1表达量下降，而Lf，尤其是高剂量Lf，可减弱MPTP此效应，使SOD1表达量有所上升，以保护神经元。单纯应用Lf灌胃处理与进行对照的组别间无显著差别。

结果：Lf的保护作用随着剂量增高而上升，最高剂量的Apo-Lf和Holo Lf之间的保护效果并无差异，但Holo-Lf的保护作用上升的比Apo-Lf的慢。我们发现Lf能减少MPTP导致的多巴胺能神经元丢失，降低黑质的铁沉积以及增加纹状体DA的含量。血清铁、血清铁蛋白在MPTP组中均增加，TIBC降低，Lf可以拮抗这种损伤现象。肝脏铁含量没未发现明显的变化，脾脏组织铁染色在MPTP组中呈减少状态，而高剂量Lf可以逆转这种现象。在黑质，乳铁蛋白能够降低DMT1的表达，增加Fpn1表达。它还增加了黑质SOD1和Bcl-2蛋白水平以及降低caspase-3的表达。

结论：我们的研究结果表明，Lf通过增加黑质多巴胺能神经元的数量，纹状体多巴胺含量，以及降低黑质铁沉积发挥了良好的神经保护作用。它通过降低DMT1的表达来降级黑质中铁转入，通过增加Fpn1的表达来增加黑质的铁转出，因此能够降低黑质的铁沉积。MPTP的老鼠血清铁水平、铁蛋白含量的升高可能是黑质中过多沉积的铁的来源，而脾脏非血红素铁的含量降低意味着血清中的铁很可能来自于脾脏，从而导致了体内系统性的铁代谢的紊乱。此外，Lf在中枢通过上调SOD1的表达，上调bcl-2的表达以及降低caspase-3的表达发挥了它的抗氧化、抗凋亡作用。中枢和外周的铁含量在仅给药Lf的保护组和对照组之间无明显差异，表明apo-Lf在整体水平并没有铁螯合作用,而holo-Lf并没有造成铁的蓄积，说明不管哪种形式的Lf对机体是无害的。。

以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何不经过创造性劳动想到的变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应该以权利要求书所限定的保护范围为准。