本发明属于生物医用技术领域，更具体地，涉及一种高效止血海绵及其制备方法。
背景技术：
在突发性事故的创伤救治与临床手术中的止血，特别是在战争中受伤人员的现场救护中，快速而高效的止血可有效降低人员伤亡和减轻后期的并发症。传统的止血材料对于不规则形状、深、窄、动脉破裂等创伤的止血效果很不理想。因此需要一种适用于现场和临床急救用的，快速、安全、高效的止血材料来代替传统止血材。
壳聚糖是甲壳素脱乙酰后产生的一种天然生物多糖，迄今是自然界唯一的碱性多糖，其自然资源十分丰富。由于具有优良的生物相容性、广谱抗菌性、促伤口愈作用，且可生物降解安全无毒，被广泛应用于医药、食品、生物工程等领域。海藻酸盐是存在于褐藻类中的天然高分子多糖，无亚急性/慢性毒性或致癌性反应，具备良好的生物相容性、生物降解性、凝胶性等，可广泛应用于食品、医药、化工等领域。壳聚糖和海藻酸盐都具有一定的止血性能。2002年，美国食品药品监督管理局（fda）批准了一种壳聚糖基外用止血产品hemcon，并将其应用在了伊拉克和阿富汗战场上，止血效果非常理想；美国celox止血粉2006年通过了fda的认证，用于紧急条件下的皮肤表面局部出血；英国courtaulds公司在上世纪80年代就将商品名为sorbsan的海藻酸盐纤维敷料应用于止血领域。这些止血材料在轻度出血创面的应用中效果显著，但对于严重出血创面的止血效果不稳定如止血速度慢、局部炎性反应、存在进入血液循环系统引起末梢血栓的风险等，使用存在争议。
技术实现要素：
本发明的目的在于根据现有技术中的不足，提供了一种高效止血海绵。
本发明的另一目的在于提供上述高效止血海绵的制备方法。
本发明的目的通过以下技术方案实现：
本发明提供了一种高效止血海绵，由如下按质量百分比的原料组成：35%-60%壳聚糖、0.1%-0.5%凝血酶、1%-3%聚谷氨酸、9%氯化钠、20%-35%海藻酸钠、5%-15%透明质酸钠、1%-5%氯化钙；
所述高效止血海绵由表层和里层组成，
表层为抗菌止血层，由壳聚糖、凝血酶、聚谷氨酸和氯化钠组成；
里层为凝胶层，由海藻酸钠、透明质酸钠和氯化钙组成；
所述壳聚糖为水溶性的壳聚糖。
优选地，所述壳聚糖的分子量为3~50kda、脱乙酰度为75%~95%。
优选地，所述凝血酶为每1mg效价不少于50单位的凝血酶。
更优选地，本发明凝血酶是从牛血或猪血中提取的凝血酶原，经激活而得的无菌冻干制品。
优选地，所述聚谷氨酸分子量700~1000kda。
本发明还提供所述的高效止血海绵的制备方法，包括如下步骤：
s1.将海藻酸钠和透明质酸钠分别制成海藻酸钠溶液和透明质酸钠溶液，混匀，得到混合溶液，向混合液中添加一定质量的氯化钙，混匀，静置30min，即得里层溶液，将里层溶液装入模具中，-30℃预冻成型；
s2.用生理盐水分别溶解一定质量的壳聚糖和一定质量的聚谷氨酸，配制壳聚糖溶液和聚谷氨酸溶液，将一定质量的凝血酶添加到壳聚糖溶液中，混匀；再将聚谷氨酸溶液添加到壳聚糖混合溶液中，混匀，静置30min，即得表层溶液；
s3.将s2中表层溶液倾入s1中经过预冻成型的里层溶液中，-30℃预冻过夜；冷冻干燥、包装、灭菌，即得所述高效止血海绵。
优选地，静置的时间为30min，预冻的温度为-30℃。
与现有技术相比，本发明具有以下优点及有益效果：
本发明的止血海绵里层与创面直接接触，吸收血液中水分形成凝胶，封堵创面，初步止血；被浓缩后的血液穿透凝胶层进入表层，在凝血酶和壳聚糖共同作用下进一步快速凝血；止血海绵中外层固定化的凝血酶增强了稳定性，保持着高效止血活性，且不易进入血液引起血栓风险；特别适用于创伤深、动脉破裂等严重出血的快速止血；此外，本发明的止血海绵制备工艺简单，易于工艺化生产。
附图说明
图1为本发明制备的高效止血海绵图。
具体实施方式
以下结合具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。
除非特别说明，本发明所用试剂和材料均为市购。
实施例1
用100ml纯净水分别溶解3.5g海藻酸钠和1.5g透明质酸钠，配制海藻酸钠溶液和透明质酸钠溶液，混匀，向混合液中添加0.45g氯化钙，混匀，静置30min，即得里层溶液，将里层溶液装入模具中，-30℃预冻成型；接着，用100ml生理盐水（0.9%氯化钠）分别溶解3.5g壳聚糖（分子量50kda，脱乙酰度95%）和0.1g聚谷氨酸（分子量1000kda），配制壳聚糖溶液和聚谷氨酸溶液，将0.05g凝血酶添加到壳聚糖溶液中，混匀，再将聚谷氨酸溶液添加到壳聚糖混合溶液中，混匀，静置30min，即得表层溶液；将表层溶液倾入盛有里层溶液已冻结的模具中，-30℃预冻过夜；最后，冷冻干燥、包装、灭菌，即得成品。
实施例2
用100ml纯净水分别溶解3.5g海藻酸钠和1.0g透明质酸钠，配制海藻酸钠溶液和透明质酸钠溶液，混匀，向混合液中添加0.5g氯化钙，混匀，静置30min，即得里层溶液，将里层溶液装入模具中，-30℃预冻成型；接着，用100ml生理盐水（0.9%氯化钠）分别溶解3.8g壳聚糖（分子量20kda，脱乙酰度85%）和0.29g聚谷氨酸（分子量700kda），配制壳聚糖溶液和聚谷氨酸溶液，将0.01g凝血酶添加到壳聚糖溶液中，混匀，再将聚谷氨酸溶液添加到壳聚糖混合溶液中，混匀，静置30min，即得表层溶液；将表层溶液倾入盛有里层溶液已冻结的模具中，-30℃预冻过夜；最后，冷冻干燥、包装、灭菌，即得成品。
实施例3
用100ml纯净水分别溶解2.0g海藻酸钠和0.86g透明质酸钠，配制海藻酸钠溶液和透明质酸钠溶液，混匀，向混合液中添加0.1g氯化钙，混匀，静置30min，即得里层溶液，将里层溶液装入模具中，-30℃预冻成型；接着，用100ml生理盐水（0.9%氯化钠）分别溶解6.0g壳聚糖（分子量3kda，脱乙酰度75%）和0.1g聚谷氨酸（分子量900kda），配制壳聚糖溶液和聚谷氨酸溶液，将0.04g凝血酶添加到壳聚糖溶液中，混匀，再将聚谷氨酸溶液添加到壳聚糖混合溶液中，混匀，静置30min，即得表层溶液；将表层溶液倾入盛有里层溶液已冻结的模具中，-30℃预冻过夜；最后，冷冻干燥、包装、灭菌，即得成品。
实施例4
用100ml纯净水分别溶解3.0g海藻酸钠和0.5g透明质酸钠，配制海藻酸钠溶液和透明质酸钠溶液，混匀，向混合液中添加0.27g氯化钙，混匀，静置30min，即得里层溶液，将里层溶液装入模具中，-30℃预冻成型；接着，用100ml生理盐水（0.9%氯化钠）分别溶解5.0g壳聚糖（分子量10kda，脱乙酰度80%）和0.3g聚谷氨酸（分子量800kda），配制壳聚糖溶液和聚谷氨酸溶液，将0.03g凝血酶添加到壳聚糖溶液中，混匀，再将聚谷氨酸溶液添加到壳聚糖混合溶液中，混匀，静置30min，即得表层溶液；将表层溶液倾入盛有里层溶液已冻结模具中，-30℃预冻过夜；最后，冷冻干燥、包装、灭菌，即得成品。
实施例5
用100ml纯净水分别溶解3.2g海藻酸钠和0.98g透明质酸钠，配制海藻酸钠溶液和透明质酸钠溶液，混匀，向混合液中添加0.2g氯化钙，混匀，静置30min，即得里层溶液，将里层溶液装入模具中，-30℃预冻成型；接着，用100ml生理盐水（0.9%氯化钠）分别溶解4.5g壳聚糖（分子量30kda，脱乙酰度90%）和0.2g聚谷氨酸（分子量850kda），配制壳聚糖溶液和聚谷氨酸溶液，将0.02g凝血酶添加到壳聚糖溶液中，混匀，再将聚谷氨酸溶液添加到壳聚糖混合溶液中，混匀，静置30min，即得表层溶液；将表层溶液倾入盛有里层溶液已冻结模具中，-30℃预冻过夜；最后，冷冻干燥、包装、灭菌，即得成品。
对比例1：
用100ml纯净水分别溶解3.2g海藻酸钠和0.98g透明质酸钠，配制海藻酸钠溶液和透明质酸钠溶液，混匀，向混合液中添加0.2g氯化钙，混匀，静置30min，即得里层溶液，将里层溶液装入模具中，-30℃预冻成型；接着，用100ml生理盐水（0.9%氯化钠）分别溶解4.5g壳聚糖（分子量30kda，脱乙酰度90%）和0.2g聚谷氨酸（分子量850kda），配制壳聚糖溶液和聚谷氨酸溶液，将聚谷氨酸溶液添加到壳聚糖混合溶液中，混匀，静置30min，即得表层溶液；将表层溶液倾入盛有里层溶液已冻结模具中，-30℃预冻过夜；最后，冷冻干燥、包装、灭菌，即得无凝血酶的海绵。
对比例2：
用100ml纯净水分别溶解3.2g海藻酸钠和0.98g透明质酸钠，配制海藻酸钠溶液和透明质酸钠溶液，混匀，向混合液中添加0.2g氯化钙，混匀，静置30min，即得里层溶液，将里层溶液装入模具中，-30℃预冻成型；接着，用100ml生理盐水（0.9%氯化钠）溶解0.2g聚谷氨酸（分子量850kda），配制聚谷氨酸溶液，将0.02g凝血酶添加到聚谷氨酸溶液中，混匀，静置30min，即得表层溶液；将表层溶液倾入盛有里层溶液已冻结模具中，-30℃预冻过夜；最后，冷冻干燥、包装、灭菌，即得无壳聚糖的海绵。
对比例3：
用100ml纯净水分别溶解3.2g海藻酸钠和0.98g透明质酸钠，配制海藻酸钠溶液和透明质酸钠溶液，混匀，标记为a溶液；接着，用100ml生理盐水（0.9%氯化钠）分别溶解4.5g壳聚糖（分子量30kda，脱乙酰度90%）和0.2g聚谷氨酸（分子量850kda），配制壳聚糖溶液和聚谷氨酸溶液，将0.02g凝血酶添加到壳聚糖溶液中，混匀，再将聚谷氨酸溶液添加到壳聚糖混合溶液中，混匀，标记为b溶液；然后，在搅拌状态下，将b溶液倾入到a溶液中，同时添加0.2g氯化钙，混匀，静置30min，装入模具中，-30℃预冻过夜；最后，冷冻干燥、包装、灭菌，即得不分表里层的共混海绵。
实施例6：大鼠断尾止血实验：
sd成年大鼠分成10组，每组6只，雌雄各半，设定一组空白对照组，一组为云南白药阳性对照组，其余为样品实验组（实施例1~5和对比例1~3的产品，分别记作样品1#~8#）。每只鼠腹腔注射3%的戊巴比妥钠麻醉剂，按照30mg/kg的剂量进行麻醉。麻醉成功后将大鼠固定在试验台上，在距尾部末端0.5cm处，横向切断，立即施以20mg止血材料处理，空白组不给予任何药物。止血时间从剪断尾部开始计时，记录每组止血时间，结果见下表。
从大鼠断尾止血数据可以看出，本发明的止血海绵样品1#~5#的止血时间都少于阳性对照组，说明止血效果都优于云南白药阳性对照组；样品6#和7#是与海绵样品5#（凝血酶和壳聚糖共存）相比，其止血时间都大大延长，同时，样品8#中即便添加有壳聚糖和凝血酶的存在，其抗凝血时间仍然不能达到本发明效果，由此说明，采用本发明特定的处理方法，将凝血酶和壳聚糖在海绵中共存，呈现显著的协同增效作用。
这些实例仅用来说明本发明，并不限制本发明的范围。本发明具体制备的高效止血海绵如图1所示。