蓝光‑全反式维甲酸‑纳米金刚石协同治疗白血病的装置的制作方法

本实用新型属于医疗器械的技术领域，特别涉及一种全反式维甲酸药物和纳米金刚石的复合并联合蓝光LED照射治疗白血病的装置。

背景技术：

白血病是危害人类健康和生命的重大疾病，尚没有完全治愈的药物和技术。急性早幼粒细胞白血病(APL)属于急性髓系白血病(AML)的一种，目前全反式维甲酸(ATRA)作为靶向治疗APL的药物并且获得了较好的疗效。但是ATRA长时间单一使用会产生维甲酸毒副作用以及复发性。将ATRA联合砷化合物(ATO)治疗APL是一种新的治疗技术，可在较短时间获得完全缓解率同时保证了较长的无病生存率，但是ATO的长期使用会对人体产生不良反应或毒副作用。光动力学治疗近年来也用于APL的治疗的作用，如红光作用光敏剂Purpurin-18可促进肿瘤细胞HL60的凋亡，但是光敏剂的使用存在细胞毒性以及细胞摄入量低的问题。还有用UV紫外灯光照核黄素抑制HL60细胞的生长，而紫外光照对人会产生皮肤致癌的作用，不宜于临床应用。利用光(特别是蓝光)直接照射HL60细胞，可明显地提高其抑制率，但没有药物的配合，该方法不具备靶向治疗的特点，无法获得更好的临床治疗效果。

和本实用新型接近的现有技术是申请号为03142238.1名称为“一种可治愈急性早幼粒白血病的组合药物”的发明专利，通过ATRA诱导未正常分化的细胞分化同时联合砷剂As₂O₃共同诱导细胞凋亡，利用这两种药物联合治疗APL，虽然提高APL治愈率。但是，化疗药物的长时间使用会对人体产生毒性，研究表明As₂O₃对细胞毒性存在短期的副作用及长期的细胞毒性。

技术实现要素：

本实用新型要解决的技术问题是，设计了一种ATRA/ND纳米金刚石载药复合物协同蓝光治疗装置，利用无毒纳米金刚石(ND)提高ATRA药物作用效果的同时减少药物的使用剂量，再协同温和蓝光作用，增强对人早幼粒白血病细胞的杀伤作用，从而达到更好的临床治疗效果。通过体外细胞增殖抑制、凋亡实验及体内动物抑瘤实验，证明了三者协同增强抑制作用，可比单独使用ATRA的效果大幅提高，同时可以减少药物毒副作用。

将ATRA和ND按照摩尔质量比5～10:1配制成纳米金刚石载药复合物药物。

体内动物实验每天按照5mg/kg/d的接种量，腹腔注射，治疗7天，同时给予0.25mW/cm²蓝光体外照射8h/d，达到90％以上的抑瘤率。同时研究证明细胞凋亡主要是通过线粒体凋亡途径实现的，其中ATRA是诱导分化促进细胞凋亡，纳米金刚石作为一种载体具有富集、缓释药物的作用。蓝光作为绿色光源替代As₂O₃促进细胞凋亡。基于以上的研究，本实用新型公开一种新型的高效率、低毒副作用的APL联合治疗的装置。

本实用新型设计的一种蓝光照装置，波长为400～500nm的商用蓝光LED包覆于透明的血流管上，当含有HL60细胞的血液流经加药口时，给予一定剂量的ATRA和ND(5～10:1的摩尔质量比)制成的纳米金刚石载药复合物ATRA/ND，之后将含有药物的血液流经蓝光照射装置，最终获得最大的抑制效果。具体的技术方案如下。

一种蓝光-全反式维甲酸-纳米金刚石协同治疗白血病的装置，其中的药物成分有全反式维甲酸(ATRA)，其特征在于，在一条两端分别是血液入口7和血液出口6的血循环管路8中间串接透明的血流管5，血流管5外部被蓝光LED阵列1包覆；血循环管路8中间不同位置分别接装有蠕动泵3、肝素囊4、药物盒2；药物盒2内装有以全反式维甲酸和纳米金刚石粉为成分的纳米金刚石载药复合物。

其中，全反式维甲酸和纳米金刚石粉按摩尔质量比5～10:1。

其中，所述的纳米金刚石粉，平均粒径为3～15nm；所述的金刚石粉，是经过酸化回流处理的。

其中，蓝光可以使用发光二极管LED光源，白光加蓝光滤光片等，波长范围为400～500nm。

本实用新型的ARTA/ND纳米金刚石载药复合物的用量按全反式维甲酸的量计，等于或低于现有的单独使用全反式维甲酸的量。

本实用新型的纳米金刚石载药复合物是以纳米金刚石粉作为载体，负载ATRA，纳米金刚石粉在药物中主要起富集和缓释ATRA的作用，利用无毒、生物兼容性好的纳米金刚石粉(ND)负载ATRA药物，制成ATRA纳米金刚石载药复合物(ATRA/ND)，证明可以降低药物给药量；蓝光-ATRA-ND的协同抑制细胞增殖效果分别高于任何单独的组合，同时证明通过线粒体凋亡途径实现细胞凋亡，可以大幅提高对HL60细胞的增殖抑制，体内实验证明能够明显抑制肿瘤的生长，获得更好的临床治疗效果。

附图说明

图1是本实用新型的蓝光-全反式维甲酸-纳米金刚石协同治疗白血病装置示意图。

图2是实施例2的CCK8实验检测蓝光-ATRA-ND协同增强细胞增殖抑制与对照组、ATRA-ND、蓝光照组的对比图。

图3实施例2流式细胞仪检测蓝光-ATRA-ND协同诱导HL60细胞凋亡与对照组及分别使用蓝光、ATRA-ND作用的对比图。

图4实施例3各种方式对小鼠的HL60肿瘤抑瘤曲线图。

具体实施方式

以下结合具体实施例，对本实用新型做进一步说明。以下实施例仅用于说明本实用新型而非用于限制本实用新型的范围。

实施例1、本实用新型的蓝光-全反式维甲酸-纳米金刚石协同治疗白血病装置的整体结构。

如图1所示，1为蓝光LED阵列，2为药物盒，3为蠕动泵，4为肝素囊，5为血流管，6为血液出口，7为血液入口，8为血循环管路。其中，血循环管路8两端开有血液入口7和血液出口6，中间串通血流管5和接通蠕动泵3，血液入口7、蠕动泵3、血循环管路8、血流管5和血液出口6构成血液的循环系统；血流管5外部放置蓝光LED阵列1；血循环管路8中间分别接通药物盒2和肝素囊4；药物盒2内装有以全反式维甲酸和纳米金刚石粉为成分的纳米金刚石载药复合物。

其中的纳米金刚石粉，最好是经过酸化回流处理，形成ND表面羟基化，有利于分散以及与全反式维甲酸药物偶联，形成纳米金刚石载药复合物。

将波长为400～500nm的商用蓝光LED阵列1环置于透明的血流管5周围，距离和光剂量可以优化，使血流管5处于蓝光照射下。血液经过血液入口7进入血循环管路8，当含有HL60细胞的血液流经过肝素囊4与血循环管路8的通口处时，给予一定的肝素防止血液发生凝集，血液经过蠕动泵3继续循环，在药物盒2内的药物输入到血流管5，给予一定剂量的ATRA和ND(5～10:1的摩尔质量比)制成的ATRA/ND纳米金刚石载药复合物，血液继续流经透明的血流管5，此时含有ATRA/ND纳米金刚石载药复合物的血液经外层管壁上的蓝光LED进行照射后，血液通过血循环管路8流至血液出口6重新回至人体。

所述的ATRA/ND纳米金刚石载药复合物，ATRA与ND的摩尔质量比在5～10:1的范围内，对肿瘤细胞HL60的增殖抑制和凋亡效果基本相同。

实施例2、蓝光照ATRA和ND协同促进细胞增殖抑制以及凋亡实验。

1)细胞增殖抑制实验

取对数期的HL60细胞计数，控制细胞密度10⁵个/ml。接种于96孔板中(10⁴个/孔)，实验组1：50uM ATRA和50ug/LND形成的纳米金刚石载药复合物药物；实验组2：蓝光照组；实验组3：蓝光照50uM ATRA和50ug/LND形成的纳米金刚石载药复合物；对照组:RPMI-1640培养基(含0.1％二甲基亚砜)，培养24h后，测试蓝光照ATRA和ND对HL60细胞增殖抑制影响。加入10ul CCK8孵育4h，酶标仪450nm检测吸光度。

2)细胞凋亡实验

取对数期HL60细胞接种于100mm培养皿中，细胞密度为1.2×10⁶个，设置实验组1：50uM ATRA和50ug/LND形成的纳米金刚石载药复合物药物；实验组2：蓝光照组；实验组3：蓝光照50uM ATRA和50ug/LND形成的纳米金刚石载药复合物；对照组:RPMI-1640培养基(含0.1％二甲基亚砜)，每天光照12h，连续实验3天，每天测试细胞凋亡情况。1000rpm 5min收集细胞，PBS清洗细胞一遍，将细胞重悬于50ul结合缓冲液中，分别加入2ul Annexin-V-FITC和2ul PI染料，4℃染色，过300目滤网，流式细胞仪1h小时内完成测试。

实验结果细胞增殖抑制如图2(*P<0.05相对对照组具有显著统计学差异,#P<0.05相对ATRA/ND纳米金刚石载药复合物组具有显著统计学差异)，细胞凋亡如图3。

图2结果表明蓝光照ATRA/ND纳米金刚石载药复合物，细胞增殖抑制率相比较空白组抑制率增加75％，比蓝光或不加蓝光ATRA/ND的抑制率都高。图3结果表明，蓝光照ATRA/ND的情况下，在24h的凋亡率54％，48h时凋亡率78％，72h的细胞凋亡率98％，随着光剂量的增加细胞的凋亡率逐渐增加，都高于蓝光、ATRA和ND单独作用的凋亡率。

实施例3、体内动物抑瘤实验。

为了测试蓝光治疗APL的效果，建立HL-60细胞裸鼠皮下肿瘤模型。选择BALB/c裸鼠(体重20-24g约5周龄)，小鼠皮下注射1×10⁷个细胞，观察10天左右，出现明显瘤体后。按照肿瘤大小随机分组。分别设置空白组，ATRA组、ATRA和ND组、蓝光照组：光照8小时/天，实验7天。蓝光ATRA组和蓝光照ATRA和ND组：每天腹腔注射5mg/kg ATRA(含1％羟甲基纤维素钠)，共作用7天。实验过程中每天测量瘤体积和小鼠体重。瘤体积用数显卡尺测量计算公式：瘤体积(mm³)V＝长*宽*宽/2，长：瘤长径宽：瘤短径。实验结束后，处死小鼠取肿瘤，根据肿瘤抑制率％＝1－((给药组平均瘤重(T)/对照组平均瘤重(C))×100％，计算抑瘤率。如图4。可以看出肿瘤生长受到抑制。蓝光照ATRA和ND组相对空白组抑瘤率依次为95％。蓝光照ATRA和ND可以最大程度地抑制肿瘤的生长。

实施例4、蓝光/ATRA/ND协同机制。

通过线粒体凋亡通路的标志分子ROS，线粒体膜上的凋亡抑制蛋白Bcl-2mRNA的表达情况，以及凋亡效应蛋白Caspase3蛋白活性进行细胞凋亡的机制的研究。实验结果表明，蓝光照ATRA和ND，活性氧增加，相应的Bcl-2mRNA的表达量降低，Caspase3蛋白活性升高。可以推断细胞通过线粒体通路走向凋亡。

综上所述，本实用新型研制的一种安全、方便易制作的可见光-蓝光协同最有效的治疗药物ATRA以及生物相容性较好的纳米金刚石材料，制作一种新的装置，通过协同作用用于白血病的临床治疗，提高治疗效果，预期可取得重要的临床应用。