免疫磁性细胞分离的装置和方法与流程

与相关申请的交叉引用

本申请依据35u.s.c.第119(e)节要求如下申请的优先权：美国临时申请no.62/158,845(2015年5月8日提交)；62/174,687(2015年6月12日提交)；62/213,575(2015年9月2日提交)，上述申请公开的全部内容通过引用结合于本文。

本发明着点于磁分离装置，涉及用于生物体大规模磁分离的系统。

背景技术：

使用磁性标记分离生物物质，包括真核细胞和原核细胞，可用于各种研究和临床应用。通过将外部磁场梯度应用于水性悬浮液，可以将磁性标记的生物体与异质群体快速分离。然而，当进行大规模磁分离时，常常难以获得充分富集的靶群体。因此，期望开发一种系统，其可利用磁分离原理针对大体积悬浮液，以最少的操作提高回收较纯的目标群体。

技术实现要素：

本发明提供一种用于分离以磁性颗粒特异标记的物体的磁分离方法和装置。

一方面，本发明提供了一种从目标生物体和无关生物体混和悬液中分离目标生物体的系统。该系统可以包括分离室，磁性元件和用于控制分离室的位置和/或方向的控制器。分离室有入口，用于加入磁化或可磁化的靶生物细胞悬浮液。另外，分离室有收集表面。磁性元件包括用于向分离室施加磁场以吸引目标生物体的一个或多个磁性元件。磁场可将目标生物吸引到收集表面。控制器可与分离室连接，也包括用于枢转分离室的枢轴。

另一方面，本发明提供了一种用于进行生物体磁分离的方法。该方法包括在流体室中输入流体悬浮液的步骤，流体悬浮液包括液体，磁性标记的生物体和无关生物体。流体室可以和水平线成一定角度。将磁场施加于流体室以将标记的生物体吸附到收集表面。此磁场也可以包括其使标记生物体抵抗重力的作用以吸附到收集表面。

附图说明

结合附图以最好地理解本发明的上述概述和以下详细描述的优选实例。

图1，免疫磁分离系统；

图2，图1所示的免疫磁性分离系统的元件；

图3，图1所示的免疫磁分离系统和液体室的另一种方位；

图4示在细胞悬液稀释之后图2所示的免疫磁性分离系统各元件；

图5a，流体室与磁性组件接合的一种方向的示意图；

图5b，流体室与磁性组件接合的替代方向的示意图；

图5c，流体室与磁性组件接合的另一替代方向的示意图；

图6a，免疫磁性分离系统(图1)的磁性系统中磁性元件的第一种设置示意图；

图6b，免疫磁性分离系统(图1)的磁性系统中磁性元件的第二种设置示意图；

图6c，免疫磁性分离系统(图1)的磁性系统中磁性元件的第三种设置示意图；

图7，与替代流体室组合的磁性系统中磁性元件的第四种布置示意图；

图8a-d，分析四种磁体设置的磁梯度示意图和曲线图；

图9a-d，分析四个替代磁体设置的磁梯度示意图和曲线图。

具体实施方式

以下定义将有助于理解本发明的装置和方法。

本文所用的术语“培养基”是指使靶生物和其他本发明所用的试剂维持在活性形式或状态的液体。优选的生物相容的组合物是使用含有盐离子的tris、磷酸或hepes缓冲液。通常盐离子的浓度将与生理水平相似。生物相容的培养基可以包含稳定剂和防腐剂。

本文使用的术语“生物体”是指生物或医学上关注的各种物质，包括真核细胞和原核细胞、亚细胞细胞器、病毒、蛋白质、核酸、碳水化合物、配体或包含核酸、蛋白质、脂质的复合分子和碳水化合物。“目标生物”可以通过本文所述的方法分离。如果目标生物是细胞，则在本文中称为“靶细胞”。

术语“特异性结合”用于指彼此具有特殊特异性的分子之间的相互作用，其在正常条件下的彼此结合优先于其它分子。特异性结合对的实例是抗体和其识别的决定簇/抗原、配体(例如激素等)和受体、亲和素/链霉亲和素蛋白和生物素、凝集素和碳水化合物、以及互补的核苷酸序列。这些分子通常在细胞表面表达。显而易见，各种其它决定簇特异的物质组合也可用于本发明的方法。与磁性颗粒特异性结合的生物被称为“磁性标记的”。

术语“磁性颗粒”在本文中指永久磁化的颗粒和仅在经受磁场时产生磁性的颗粒。后者在本文中也称为“磁响应颗粒”。显示磁响应行为的材料有时被描述为超顺磁性。然而，当晶体直径约为30nm或更小时，某些铁磁材料(例如磁性氧化铁)可以被定义为有磁响应性。磁响应胶体磁铁可指呈现真胶体特性的、聚合物覆盖的、亚微米大小的磁铁颗粒。小磁性颗粒可用于分析各种生物特异性的亲和反应。因为其方便地覆盖有生物功能聚合物(例如蛋白质)，从而拥有非常大的表面积并保证了合理的反应动力学。

术语“抗体”包括免疫球蛋白、单克隆或多克隆抗体、免疫反应性免疫球蛋白片段、嵌合抗体、半抗原和抗体片段、以及抗体等同物分子—特异性结合于感兴趣的抗原决定簇(例如tcr/cd3复合物或cd28)。抗体可以是灵长类动物(例如人源化的)、鼠类、小鼠-人类、小鼠-灵长类动物或嵌合体，并且可以是完整的分子、其片段(例如scfv，fv，fd，fab，fab'和f(ab)'2片段)或完整分子和/或片段的多聚体或聚集体。抗体可以自然产生，或者通过免疫、合成或遗传工程而生产。首选的用于t细胞扩增的抗体片段应能够交联其靶抗原，例如二价片段f(ab)'2。或者，本身不具备将其靶抗原交联的抗体片段(例如fab)可与能交联抗体片段的二次抗体结合使用，从而交联靶抗原。市场已有许多抗人cd3单克隆抗体(mab)，例如由美国atcc杂交瘤细胞制备的okt3，和mabg19-4。

术语“富集”是指增加生物样品中靶细胞与总细胞的比例。如使用外周血为起始物质时，评估浓缩程度时不计数红细胞。

本发明的磁分离装置和方法在各种实验室和临床应用中具有特别的用途。在相关方法中，标记步骤将磁性颗粒特异性地结合于悬浮在非磁性介质中的兴趣生物体。在该标记步骤之后，本方法还通过对混和液施加磁场梯度来进行目标生物体的分离和回收。

磁场分离通常是较平缓的过程并可保持细胞的存活。此外，通过这些方法可以实现高水平的回收和纯度，使其适合于从混合细胞群中除去或分离稀有细胞。这种分离包括但不限于从骨髓或外周血中富集cd34⁺干细胞或免疫细胞，从母体血液中分离胎儿细胞，分离转染的细胞，以及从各种混合细胞群体中去除或分离肿瘤细胞。分离可以通过阳性选择或阴性去除或二者同时来完成，并且通过这种分离方法回收的细胞可用于许多目的，包括进一步的分析或治疗目的(例如，将细胞群重新引入患者)。

有许多变量可以影响磁分离的效率以及磁性标记细胞的回收和富集。包括以下考虑因素：所进行分离的细胞数，细胞表面靶向决定簇的密度，每个细胞的磁性负载，与非目标物质的非特异性结合，磁性标记细胞的方法，容器的特点，容器表面的组成和介质的粘度。

例如，当细胞混合物包括红细胞(rbc)时，在分离细胞时rbcs经常会滞留其中造成问题。在从血液分离的情况下，通常首先使用梯度介质(例如ficoll-paque)进行血液密度分离以去除rbc。该方法需要昂贵的试剂，相当的技术技能，并会减少细胞的回收。另一方面，通过以合适的离心力离心血液来制备含有外周血单核细胞(pbmc)的白细胞层则比较简单。然而，使用简单的白细胞层提出了如何在不收集红细胞的情况下回收全部白细胞层的问题。当用白细胞层进行铁磁流体或其他磁性颗粒分离时，回收部分中总会有红细胞污染。因此，如果有可以用白细胞层以制备无rbc的产品的细胞分离方案则具有相当大的价值，可节省昂贵的试剂和技术时间。也有众所周知的益处，即对期望的细胞进行较少的操作。以下描述报告了一种在有序的层中收集靶细胞的方法，其中无关细胞的滞留减少，并且可以不需要重新悬浮磁性靶物体而完成分离(洗涤而不需要再悬浮：wwor)。

所提供的磁分离装置通过将目标细胞或其他生物体吸引到分离室的一侧(即，容器的内表面)来收集磁性标记的生物体。可以使用各种磁梯度装置。理想的情况下，磁梯度致使收集生物体在收集表面上形成均匀层。此外，包含磁标记生物体的分离室的定位将使得梯度力向上(抵抗重力)吸引标记生物体，以减少rbc的滞留并促进去除或洗脱滞留或粘附在收集表面的无关细胞。在分离室的上表面收集目标生物也有助于使用重力以有效地排空内容物而不干扰收集表面处的目标生物。此外，如果分离室足够窄，则细胞悬液弯液面的移动将产生弯液面洗涤效果，其将通过剪切力帮助从收集表面洗涤非靶细胞。

磁分离装置

参见图1-5c所示，用于免疫磁细胞分离的系统指定为10。系统10包括用于接收细胞悬液150的流体的流体室20。细胞悬液150包括靶细胞152其可被磁场吸引而与无关细胞154分开。因此，系统10包括用于向流体室20施加磁场的磁性组件120。该系统还可包括用于控制流体室的旋转和纵向位置的流体室控制组件50。此外，流体室控制组件50可以控制流体室相对于磁性组件120的角度设定，也可控制流体室20和磁性组件120之间的距离。

参照图1将更详细地描述流体室20的细节。流体室20可以是各种流体容器。腔室壁可以由刚性或柔性材料形成。例如图1所示的实例，腔室包括大致平坦的前壁和后壁。如图5所示，后壁被标记为21，并且与前壁分开距离为“t”。因此，流体室20内的厚度为“t”。如下面进一步讨论的，流体室后壁21的构造成形成收集表面，在细胞分离过程中靶细胞152将会收集到收集表面21。

如上所述，腔室20可具有刚性室壁。例如，室壁可以由刚性的塑料或玻璃制成，使得当相对于地平线旋转或枢转时，室壁不会变形或偏转。或者，室壁可以由一个或多个软壁形成，比如由塑化pvc制成的容器，还有通常见到的血袋。

流体室20具有一个或多个用于将流体注入到腔室中或从腔室排出流体的开口。在图1所示的实例中，流体室具有标记为22的上端和24的下端。下端可以逐渐收缩于一点，使得当腔室至少部分直立时流体可因重力流过该点。填充口或开口26可以在腔室的底端。如图1所示，填充端口26在流体室下端的锥形点处，使得当腔室至少部分直立时，流体将倾向于朝着填充口26流动。除了填充口26之外，第二个端口可在流体室的上端22处。例如，第二端口可以包括释放开口或阀28，其允许气体出入流体室。当通过入口26将流体输入到流体室20，流体室中的空气可以通过释放开口28逸出，以防止流体室中的压力增大。同样，当流体通过填充口26排出时，空气可从释放开口28进入流体室。可用安全阀与释放开口连接，以控制空气进出释放开口。这里则用过滤器连接到释放开口以过滤进入流体室的空气。如图2所示，过滤器的设计也避免了当分离室在水平方向时液体流出流体室。

如上所述，并且参考图3，该系统包括用于向流体室中的流体150施加磁场的磁性组件120。磁性组件包括可操作以产生磁场的磁性元件122。磁性元件可以是具有单个北极和南极的单个磁性元件。或者，磁性元件122可以包括多个磁性元件以各种方式布置。关于磁性元件的类型、磁极的方向以及磁性元件的强度的细节将在下面进一步详细讨论。此外，磁性元件122可以安装在诸如金属板124的导磁元件上。磁性组件可以相对于流体室20移动。磁性组件120也可以安装在支架上使磁性组件保持其预定的位置和方向。支架包括能松弛或锁定的元件，使得磁性元件容易调整并保持在期望的位置和方向。

系统10还包括用于控制流体室20的位置和方向的控制组件50。流体室20的设计可使之直接与控制组件50连接。然而如图1所示，流体室框架30提供了流体室20和控制组件50之间的连接。例如，如果流体腔室20是坚壁，流体室框架30可以是有多个壁的框架以包裹流体室。流体室框架30与流体室的连接，使得当框架旋转或平移时，流体室将随之旋转和/或平移。例如，流体室框架30可以夹在流体室上，或者，围绕或重叠流体室的前后表面以保持流体室的位置。如图1所示，其形成围绕流体室的框架。

参见图1-4，将详细地描述控制组件50的细节。控制系统50的设置使其可控制流体室20于相对地平线的角度。控制系统还可以控制流体室20相对于磁性组件120的角度方向。此外，控制系统50还可以为控制流体室的纵向位置，使得流体室可以做线性平移。特别是控制系统可以控制流体室相对于磁性组件120的线性位置。以这种方式，控制组件50可以控制流体室20和磁性组件120之间的距离。

控制组件50包括旋转控制组件60和线性控制组件90。旋转控制组件60的构造可控制流体室20的角度定向。线性控制组件90的设置则控制流体室20的平移或线性位置。

旋转控制组件包括与流体室20连接的枢转轴62和用于支撑枢转轴的支撑件64。枢转轴62可以是各种元件，例如轴、枢轴销或曲柄臂。如图3所示，这里枢转轴包括偏置曲柄臂62。曲柄臂62包括一对平行杆，通过横向连杆连接以形成“z”形。曲柄臂的第一杆与流体室20连接。例如在这里，曲柄臂62的一杆与流体室框架30固定连接，另一杆接于由安装支架。例如这里，安装支架可包括具有狭槽的轭64，曲柄臂保持在该狭槽中，使得曲柄臂能够相对于轭自由旋转。或者，轭64也可以有摩擦地接合于曲柄臂，提供足够的摩擦力以保持曲柄臂不旋转。以这种方式，当流体室定位在水平或成角度的位置(即，流体室的重量倾向于旋转其方向)时，轭可以保持其位置而不受重力影响。

枢转轴62可以在流体室上下端之间的任何处与流体室连接。如图2和图3所示，枢转轴62在流体室的上下端之间的中点连接，这样流体室可以其中轴线枢转。

旋转控制器60可允许手动定位使流体室处于并保持在需要的方向。本例中，旋转控制器60包括用于控制流体室20的角度定位的旋转驱动器70。旋转驱动器70可以是各种线性或旋转驱动器中的一种，包括但不限于马达、螺线管和液压或气动驱动元件。本例中，系统包括马达，例如驱动曲柄62一臂的电动机80。该系统可以包括单个电机来驱动曲柄臂，或如图3所示，系统可以包括一对同步电机，其中每个电机驱动一个曲柄臂。电机的同步操作使得曲柄臂62同步驱动流体室20枢转。

电机80可以直接驱动曲柄臂，然而，也期望通过一个或多个齿轮与曲柄臂62连接。如图3所示，旋转驱动器包括输入齿轮72和其与电动机80连接的轴以及与曲柄臂连接的输出齿轮74。输入齿轮72与输出齿轮74啮合，使电机通过齿轮72和74驱动曲柄臂62。

该系统还包括用于控制流体室20线性位置的线性控制组件90。操作线性控制组件90可沿线性路径平移流体室20。例如，线性控制组件包括一对托架95，其沿导轨102纵向滑动以引导流体室的位移。每个导轨102安装在基座100上，并且两个基座彼此横向间隔开。特别是，如图1和2所示，底座100的间隔要比流体室20的宽度更宽。每个托架95与流体室一侧的旋转驱动器控制组件60连接，使托架可沿着线性路径移动旋转驱动器。如图2所示，托架90模块的结构设计有与导轨102配合的纵向延伸槽，使得托架跨越于导轨上。

线性控制组件90可以设置以提供摩擦阻力，使得一旦组件沿着导轨的长度移动到特定位置，滑架则停止线性移位。或者，如图2所示，线性控制组件90可包括线性驱动器110，其操作可沿着导轨驱动托架95，以控制其位置。以这种方式，线性驱动器控制流体室的直线位置。具体地，如图1-4所示，线性驱动器110控制流体室的水平位移。线性驱动器110可以是各种驱动器中，包括但不限于电动机，螺线管和液压或气动元件。本例中，线性驱动器还包括沿着导轨102驱动托架95的驱动带。

参考图2，系统10还可以包括流体控制组件40，用于控制流体在流体室的出入。流体控制组件可包括多个流体储存器。每个储存器的构造可接收流体，并与流体室20相通，使得流体可以从储存器流动到流体室，或者从流体室流动到储存器。比如，流体控制组件40可以包括用于接收流体的多个储存器，如细胞悬液，免疫磁性试剂(例如铁磁流体)和缓冲溶液。另外，储存器也可以接收从流体室20收集的目标细胞。举例说明，流体管线可以与入口26连接,并与多位阀或选择阀42连接以控制和选择储存器与流体室20流体的连通。特别强调，阀的设置使得在任何时间只有一个储存器与流体室连通。此外，阀也可以用以阻止储存器和流体室之间的流体流动，使没有流体通过填充口26出入流体室。可以提供诸如泵的驱动元件来输送流体从储存器进入流体室20。或者，可以将储存器设定在一定位置使得流体以重力作用从流体储存器流动到流体室20。

磁性组合

系统中使用磁体置流体室的内容物于磁梯度中。磁体可以是单个磁体或磁体系列。磁体可以具有大致平坦的表面。此外，磁体的一面应具有足够大的表面积以使磁梯度可覆盖大部分的流体室。当磁体接触或接近流体室时，磁性标记的生物体积聚在室的内表面上，形成收集表面。在一些实例中，磁体定位在基座附近，流体室可以线性移动，以接触或接近磁体。这样的磁体可处于固定的成一定角度的位置，或者能够以与流体室基本相同的角度旋转。

系统10中使用的磁体的设置和/或构造将减少生物体在收集表面上堆积收集的可能性。图6a-c描绘了可用于产生指向平面表面的磁场梯度的三种磁体或磁体系列。图6a显示了极性平行于收集平面的磁块阵列，其中磁块排列成相似极相邻的(即，北-北和南-南)形式。由这种阵列形成的磁场向磁性阵列的侧面凸出，并朝向磁体表面形成梯度，特别是在磁铁-磁铁界面附近。该磁列布局的操作可用于收集大的高磁性颗粒，然而，该装置可能导生物体的堆积收集。图6b显示了矩形磁块的横截面，其描绘了用于产生朝向平面的磁梯度的磁体的另一种设置。在这种情况下，箭头所示的极性处于磁体的长度方向。因此，从平面的上方和下方从北向南穿越的场线产生指向表面的梯度力。与图6a的布置相比，这样的梯度可能有强度和距离的限制。图6c显示了用于产生朝向表面的梯度磁力的另一个阵列，其中磁性系列由安装在导磁板上的磁块组成。极性垂直于导磁板，磁块的极性交替变化。这种磁阵列在高磁梯度的局部区域中收集磁性物体。

此外，图6c中所示的磁阵列可以产生强磁场梯度，其强度和场延伸(即“达到”)可随磁体的尺寸，极面形状和的间距而变化。图8a-d和9a-d示出对四种几何形状磁体的计算分析结果，其基本上是矩形横截面，并且设置如图6c，但是阵列中的每个磁体的极面分别是正方形(图8a和9a)、圆形(图8b和9b)、三角形(图8c和9c)或哥特式尖顶形(图8d和9d)。使用有限元分析对这些不同的极面进行计算，作出磁体间距的函数。

图8a示出由四方磁极面磁铁的平均磁场梯度(相对于磁体面)与磁体间距的函数，以及最大值(通常位于磁体之上)和最小值(通常以磁体为中心)之间的差异值(即摆动)与磁体间距的函数。图8a的顶部曲线所示可以看出，平均磁场梯度随着磁体之间的间距变化而达到最大值(注意，这些单独磁体的宽度5mm，高度20mm，并且计算是基于n52级nefeb磁体)。底部曲线显示每个磁体间隔布置(1-10mm)的摆动(即在每个排列的磁性面上梯度的变化)。这些变化(未示出)看起来与正弦波相似，其周期对应于磁阵列中单个磁体的数量。例如，对于间距为1mm、宽5mm的磁块，图8a示平面表面的平均梯度为约5.6kg/cm，该梯度的摆动(下曲线)约1.0kg/cm。对于间隔10mm的磁体，平均梯度约为4.0kg/cm，但摆幅约为3.4kg/cm。因此，1mm间距具有约6.0kg/cm的最大梯度，而对于10mm间距，最大梯度为约5.8kg/cm。由于“近场”梯度表示磁吸引物体的力度，所以显而易见高梯度是可取的。另一方面，为了在这种表面上获得更均匀的收集，较低的梯度摆动可使收集的材料呈现比较不明显的集中定位。图8a的上曲线示出了当磁体块间隔在2-3mm之间时，平均梯度达到最大值，并且摆动在1-3mm的间距时平坦、而在4mm开始上升。从成本的角度来看，希望尽可能少的使用磁铁，这些分析表明，对于该磁体设置，3mm的间距将具有最大的保持强度和最小的局部定位。第二个考虑因素是磁场到达距离，即将远离磁体表面的磁性靶物体吸附到高梯度区域并保持于此的能力。图8b显示了从12mm到7mm计算的梯度结果(相对于磁表面)。上曲线表示平均远磁场梯度(或到达)随着间距的增加而改善，下曲线显示了摆幅，考虑到图的刻度，摆幅相对较小。这些曲线表明，当考虑摆动时，3–4mm间距的远场梯度在0.5-1.0kg/cm之间。从铁磁流体和细胞的实验已经确定这样的梯度足够移动磁性标记的细胞，并且允许使用厚度/深度从磁体表面延伸12mm的腔室。

同样，图8b-d描绘了圆形，三角形和哥特式尖顶形极面的5mm宽的磁体的计算结果。以近场波动为主(上图的下曲线)，除了图8d中的2mm间距大约为0.5kg/cm，与矩形极面和3-4毫米的间距相比，改变极面形状几乎不改善磁场的均匀性。此外，图8d的哥特式尖顶状极面产生的保持力显著减小。

图9a-d示较宽磁体(10mm)的类似计算分析，以确定较大磁体对梯度参数的影响。在这两种情况下，均使用长度为20mm的磁块进行计算。对于这种磁体，一旦磁长度达到约13mm，磁极处的磁通密度就不会显著增加；因此，这些计算使用产生几乎最大通量的磁体进行，如以上5mm宽的磁体，对类似的极面形状进行分析。“近场”和“远场”的磁场梯度结果如图9a-d所示。例如，图9a显示以四方面磁体间距的函数，上曲线表示近场梯度的平均值，该图的下曲线则表示磁场的波动。最大近磁场梯度约为7.4kg/cm，摆动约2.4kg/cm，远高于5mm宽的磁体(图8a，其最大值约为5.9kg/cm，摆动约为0.9kg/cm)。因此，较宽磁体的吸附力明显较高(约25％)，但摆动率变化也较高(10mm宽的磁体为32％，5mm者为15％)。因此，如果在收集时减少细胞聚集是主要关注的话，较窄的磁体优选。另一方面，较宽的磁体作用于更远距离，如远场梯度值(图9a-d下图上曲线)所证明的。例如在图9b中，远场达到接近其极限约2.4kg/cm(摆动为0.8kg/cm)，而5mm磁体的最大距离为约1.4kg/cm(摆动为0.6kg/cm)。因此，与较窄的磁体相比，较宽的磁体产生的磁梯度有较大的吸附力和到达较远的距离，但较宽的摆动会导致更严重的细胞聚集。

从上所述，可以通过计算分析来预测在平面上的最佳磁收集的参数(指收集物的最小聚集)。用根据所计算的磁阵列的构建类型，表明了磁收集的形式与计算的预测相关。如上所示，当吸附力和广度足够时，较窄的磁铁有均匀收集的优点。例如，在深达12mm的腔室中，用5mm宽、间隔3–4mm的磁体系列，可以将磁性标记的生物体吸引到距离磁体的平坦表面2mm远的收集表面上，得到相当均匀的细胞收集，而且使腔室内的所有细胞都处于可被磁回收的距离范围之内。对于10mm宽的磁体，磁体的最佳间距也约为3–5mm以产生强大的吸引力和足够的远程距离。因此，对于更深的腔室，将希望用宽度≥10mm的磁体。

当磁性元件距离收集面11mm时，示例的板式磁性装置可磁性收集标记的靶细胞。该系统所用的收集容器可以是各种形状和尺寸，包括但不限于正方形或长方形(矩形)的横截面。使用与磁体一致的矩形收集容器的一个优点是可将目标生物体吸引到腔室的一侧，即与收集表面是直线关系。因此，细胞聚集在平坦的表面而不是在曲面上–如果使用管状腔室。当使用合适的梯度装置时，平坦的收集表面使得生物体达到均匀的收集。

除了使用平面磁体之外，还有其他方法可产生均匀的收集。例如，通过改变分离室底部的轮廓以匹配磁梯度的周期性，使生物体在收集表面上的任何地方可处于相同的磁梯度。如图7所示，流体室的收集表面有特定的轮廓，并且以交替的方式与磁块及其凹陷间隔相匹配。尽管收集表面不平坦，磁性梯度在表面的每个点都是恒定的。因此，通过适当改变收集表面的轮廓，也可以达到均匀有效地收集生物体。

分离系统中磁体和分离室的定位可有多个角度。有些设置会导致分离期间磁性标记生物体上作用力的差异，即磁力和重力呈现谋种角度和/或至少部分相对的位置。在批量分离时，与流通分离室不同，当腔室以水平定位并且将目标生物体向上拉时，如图5b所示，难以洗涤和回收所收集的目标生物。另一方面，如图5c所示，将磁体放置在>0°的角度上，这里用大约45°角，其中磁体位于分离室上方，可通过底部的出口以填充或排出腔室的液体，同时也最小程度地干扰在收集表面积聚的目标生物。角度越接近垂直方向，容器中可放置液体的体积也越大。图5a-c示三个不同方向的磁体系列和简单矩形分离室的横截面，其中容器的收集表面位于腔室的底部(图5a)，腔室的顶部(图5b)，或者磁体和腔室被设置于谋个角度，这里显示45°角，磁性生物体的收集发生在相对于水平面也成45°角的倾斜“天花板”上(图5c)。

磁分离方法

上述系统可用于需要生物材料磁分离的各种应用。该系统特别适用于从悬浮液中分离细胞。以下实例描述了从白细胞制品分离细胞的方法；然而，该系统可适用于分离磁性标记的生物体的各种分离过程。

如上所述的装置，系统10可用于制备用于免疫磁性细胞分离的细胞悬液。特别地，该系统可通过加入靶细胞和磁性或可磁化成分以标记靶细胞152。具体地，系统标记靶细胞152可通过将一定数量的细胞悬液注入流体室20，然后输入一定量的磁性或可磁化成份，例如铁磁流体可被输入到流体室中。或者，磁性或可磁化成分可先被注入到流体室20中，随后加入细胞悬液。如图1所示，细胞悬液和铁磁流体在流体室中，并且悬浮液有相对较高的细胞浓度。当细胞悬液和铁磁流体输入于流体室20时，流体室20通常处于垂直方向(如图1)。例如，可以输入80ml的无血小板白细胞分离产物(约1.2×10⁸细胞/ml)和20ml的铁磁流体到流体室20中。可以将混合物温育以使靶细胞被标记。理想的情况是，腔室控制系统可控制流体室的角度或横向位置以搅拌室内的流体从而改善温育标记。例如，线性驱动器可以沿着导轨前后驱动流体室以来回摇动混合流体。类似地，旋转驱动器可以顺时针和逆时针地枢转流体室，以搅动流体室中的混合物。另外，除了用线性和旋转驱动器混合流体，也可以用腔室控制系统以手动方式横向和/或有角度地移动流体室以搅拌混合物。

除了用摇动或搅动流体来混合流体混合物，可通过变化流体室与磁性组件120的距离，即朝向和远离磁性组件的移动，以增强标记反应。尤其是腔室控制组件50可以控制流体室相对于磁性元件的位置和/或角度。例如，线性控制系统可被致动(手动地或通过线性驱动器110)以驱动流体室移向磁性组件120，使磁性元件产生的磁场施加于流体混合物。通过将流体室移向和远离磁场以控制磁梯度的强弱，特别是施加到细胞悬液的磁梯度的增加和减少。由于改变了覆盖混合物的磁梯度，磁场将混合物中的铁磁流体重新分布，此流动则导致其与靶细胞的碰撞增加，从而增强靶细胞的磁负载。因此，与没有变化的磁梯度相比，通过移动细胞悬液相对于磁性元件的位置来改变施加到细胞悬液的磁梯度，可加快完成靶细胞标记的过程。

如上所述，系统10可用于标记靶细胞。此外，系统10也可用于将靶细胞152与细胞悬液中的无关细胞分离。将一定体积的细胞悬浮液注入流体室。特别说明，细胞悬液可以是根据上述培养方法处理的混合物，此时细胞悬浮液已经在流体室中(即，孵育之后，细胞悬浮液不需要从流体室中排出)；或者，可将细胞悬浮液先分开孵育然后再输入到流体室20进行靶细胞分离。为了减小细胞滞留，希望稀释细胞以用比相对于孵育过程低的细胞浓度。例如，在上述孵育过程中，细胞悬液的浓度约为1.2×10⁸细胞/ml，需要加一定体积的缓冲液以降低细胞浓度。比如，可能需要加入足够的缓冲液以将总体积增加100％或更多，200％，在一些应用中，甚至增加超过300％。例如本例中，通过加入200ml缓冲液可将细胞悬液150的总体积增加至300ml，其结果使细胞浓度降为约3×10⁷细胞/ml。

如图1所示，孵育过程中细胞悬液150的体积显著小于流体室的总体积。更具体地，细胞悬液的体积小于流体室体积的一半，甚至小于流体室体积的三分之一。因此当流体室如图1所示在大致垂直的方向时，流体悬液的上表面形成远低于流体室20的上端22的弯液面156。如图1中弯液面低于流体室20高度的中点。

参考图4，流体室20的体积可大于悬浮液经稀释后降低了浓度的细胞悬液的体积，特别是在加入缓冲液之后，细胞悬液的弯液面156应在流体室上端22之下。具体地说，在弯液面156和流体室22上端之间形成气穴或间隙。

虽然流体室的体积应大于细胞悬液的体积，但应尽量限制气穴的体积，使细胞悬液覆盖流体室的收集表面21的大部分区域。特别是在磁力分离步骤中使用流体室时，细胞悬液的体积足以覆盖超过50％的收集表面21。更具体地，在磁力分离步骤中使用流体室时，细胞悬液的体积足以覆盖超过60％的收集表面21。进一步，在磁力分离步骤期间使用流体室时，细胞悬浮液的体积可能足以覆盖70％以上收集表面21。再进一步，在磁分离步骤期间使用流体室时，细胞悬浮液的体积可能足以覆盖超过80％收集表面21。特别地，在磁力分离步骤期间使用流体室时，细胞悬浮液的体积可能足以覆盖超过90％收集表面21。

如图4所示，在将缓冲液添加到细胞悬液时，流体室20可以旋转成基本垂直的方向，然后使流体室与磁性元件进行操作接合。特别地，流体室朝向磁性元件120移动，使得磁性元件向流体室中的细胞悬液施加磁梯度。这也可通过将磁性组件120移向流体室20来实现。然而，在本例中则操作腔室控制系统50以使流体室20朝向磁性组件移动，特别是线性驱动器110驱动流体室20朝向磁性组件120移动。另外，操作腔室控制系统50可旋转流体室20，特别是旋转驱动器70可以通过驱动电动机80以旋转流体室20。具体地，旋转驱动器70可旋转流体室，直到流体室与磁性组件120对准。例如，旋转致动器70可旋转流体室直到收集表面21基本上与磁性系统平行。以这种方式，流体室的位置和方向由腔室控制系统50操纵，使流体室与磁性组件120形成操作性接合。特别是流体室20的定位使得其收集表面21与磁性组件接近或邻接(如图3和图5a-c)。

当流体室与磁性组件120进行操作接合时，磁性组件将磁场施加于细胞悬液150，将靶细胞吸附于流体室的收集表面21。具体地，覆盖细胞悬液的磁场吸引已标记的靶细胞。除了将靶细胞152吸引到收集表面21之外，磁性力还将靶细胞保留在收集表面上。在将磁场施加于细胞悬液之后，流体悬液150可以从流体室排出，此时流体室仍保持与磁性系统的操作性接合。以这种方式，无关细胞可从流体室排出，而靶细胞则保留在收集表面21上，并由来自磁性组件120的磁力保持在适当的位置。

在排出细胞悬液的步骤之后，收集表面21上可能滞留一些由靶细胞152夹带的无关细胞154，其可通过用缓冲液填充流体室20从收集表面21洗脱。当缓冲液被输入或泵入到流体室时，流体的弯液面搅动收集表面上的细胞。搅动或洗涤提供足够的力以使无关细胞离开收集表面而脱落。洗涤步骤可以根据需要通过重复多次排出和用缓冲液重新填充流体室来完成，使无关细胞与收集在收集表面上的靶细胞分离。本例中在洗涤步骤期间，流体室保持与磁性组件120的操作性接合，而且，在每个洗涤步骤期间，流体室20可以顺时针和/或逆时针旋转，使得腔室中的流体的弯液面被引导流过收集表面。每当弯液面流过收集表面21的谋个区域，弯液面可以搅动一些滞留的无关细胞154，从而将其与靶细胞分离。

在收集了靶细胞并将液体从流体室排出之后，将收集的靶细胞重新悬浮在液体中。比如，可以将缓冲液输送到流体室中，并将流体室与磁性系统120分离。具体地，操作线性驱动器90将流体室20平移离开磁性系统，使得后者不能赋予足够的磁力来吸引靶细胞。一旦流体室离开磁场，靶细胞则从收集表面释放，与缓冲液混合为悬浮液。然后可将此流体从流体室排出到收集容器中，从而将靶细胞回收在收集容器中。

如上所述，靶细胞保持在收集表面上的同时，洗涤靶细胞，然后排出。或者，在收集细胞并排出流体室的液体之后，如先前所述，可以用缓冲液重新填充流体室。然后可以移动流体室使其离开与磁性组件120的操作接合，导致收集的细胞与流体一起悬浮。然而，这时不排出细胞悬浮液，而是将流体室移回到与磁性组件的操作接合中，再次将靶细胞收集在收集表面上。由于前一步排出流体时已从流体室排出了大量的无关者细胞，所以在第二步向细胞悬液再次施加磁场时，细胞悬液中仅剩余少量的无关细胞。因为在第二次磁分离期间存在较低浓度的无关细胞，所以较少的无关细胞被夹带滞流在收集表面。在第二次施加磁场之后，细胞的处理可以如前所述。特别地，靶细胞因磁力作用收集并保持在收集表面21上，同时流体从流体室排出以清除无关细胞；通过弯液面来洗涤细胞以洗脱分离滞流在收集表面上的无关细胞。此外还应注意，在某些应用中，可能期望在排出靶细胞之前重复磁分离步骤超过两次。在每次磁分离的过程中，无关细胞的浓度降低，从而降低无关细胞被夹带而滞流在收集表面的可能性。

在磁细胞分离过程中要考虑两个涉及无关细胞的问题。一个问题是如果非靶细胞在收集期间被夹带在靶细胞层内。另一种是非靶细胞只是位于靶细胞的表面或者松散的和收集表面的靶细胞粘附。基于这两个问题，在分离程序中使用重力有其好处。例如，在含有少于1％蛋白质添加物的水性密度培养液里进行的简单细胞分离程序中，rbc以每分钟约20个细胞直径的速率沉降。在铁磁流体标记的细胞的磁分离中，分离过程通常需要10分钟，因此，rbc在该时间段内降低约200个直径；并且该计算也表明，在上表面收集(即，靶细胞被逆重力方向的磁力吸引)时，较少的rbc与靶细胞的夹带。相反地，在靶细胞被向下吸引的情况下，沉降在收集表面上的rbc可能导致产生更多的rbc夹带。重力的第二个益处涉及到收集容器的排空，因为当靶细胞在容器的底部表面上时，较难清空容器，必须特别留意在去除非磁性物体时不干扰收集的细胞。简单证明这一作用，将10％rbc比容的rbc悬液置于比色杯中，倾斜至45°角，并用巴斯德移液管除去内容物。一种情况，模拟细胞可能在比色杯的底部内表面上形成一层，在去除内容物和随后的添加洗涤液时需要注意避免接触该表面。在模拟细胞收集在比色杯内上表面的情况下，则不需要这些顾虑，并且比色杯可以更有效地排空，并在一定程度上可以更快地再被填充。当模拟细胞收集在比色杯的内上表面的情况时，在去除内容物后，用培养基再次补充比色杯两次，而不用混合，可有效的清除比色杯里的rbc。在模拟以内表面底面收集细胞的情况下，则需要至少两倍的液体交换(约4–5倍)以清洗到比色杯里没有rbc。

图1-4描绘了可用于处理含有约10¹⁰细胞的白细胞分离产物以获得富集的cd3⁺t细胞的装置。该方法使用直接免疫磁性标记步骤，用与抗cd3抗体结合的铁磁流体。首先，将80ml无血小板白细胞分离产物(1.2×10⁸个细胞/ml)通过入口加入容器中。容器处于大致垂直的位置，被填充到其容量的大约30％。在同样的位置，向容器中加入适量的铁磁流体(例如20ml)，然后，将流体室旋转到水平位置并且前后移动以混合内容物。

流体室的收集表面积可以与分离的细胞数量相匹配，使得在分离过程期间形成的收集细胞层小于5层，优选小于3层。通过提供足够的收集区域，控制收集细胞的数量，并施加磁场以向上牵拉细胞，无关细胞的滞流可被消除或减少到可接受的水平。在一个实例中，使用16.5×26cm的收集表面，显示6.5×10⁸个细胞可呈单层(根据我们的观察，1.5×10⁶个白细胞可以在1.0cm²形成单层)。计算表明，对于10¹⁰细胞的白细胞分离产物，其中30％为cd3⁺细胞，约4.5层的cd3⁺靶细胞将在收集表面积聚。

在通过同时添加单克隆抗体(mab)和通用标记铁磁流体进行的间接免疫磁性标记的过程中，将抗cd3mab和大鼠抗小鼠fc缀合的铁磁流体加入到含有细胞悬液的分离室中。此过程中腔室处于如图2所示的接近垂直位置，并且如上所述先加入白细胞分离产物，随后加入约5ml含有通用标记铁磁流体的悬浮液。这些组分的混合类似于直接标记过程，也就是说，腔室旋转到水平位置(图1)并且前后移动。请注意，此期间通用标记铁磁流体和靶细胞之间不会发生反应或特异结合。添加mab时，如图2所示，将腔室旋转到近垂直方向，快速加入约15ml含有mab的悬液，将腔室旋转至如图1所示的水平位置，并来回移动容器将各成分充分混合。或者，也可以修改加样的顺序，即先将通用标记铁磁流体加入到分离室中，然后加入mab，并且在适当混合之后，将白细胞分离产物加入到室中。

在此有两个选择可以进行：(1)将反应混合物孵育15-20分钟，此时分离室温和的线性运动有助于反应，或(2)通过使磁性颗粒在细胞悬液中平移而产生其相对于细胞的运动来增强靶细胞的磁性标记。后一选择可以通过向腔室施加磁梯度来实现，如图3所示。通过使腔室接近磁体10-40秒，然后与磁体分离，以引导混合物的重新分配，即试剂和细胞在混合液中运动，从而促进相互作用。因此，循环执行此步骤可增强目标生物的磁标记。在小规模实验中，有效的靶细胞标记可以在7-10分钟内实现。

一旦孵育完成，将新鲜的培养基加入室中以稀释内容物。在该实例中，加入200ml培养基以至约300ml的终体积(3×10⁷细胞/ml)对于分离30％的细胞群体是有效的。然后可以将容器旋转到水平位置并且前后来回移动以促进混合。注意，即使在加用缓冲液稀释内容物之后，室内仍有空气空间。类似于图3所示的结构，流体室21与磁阵列板接触，以大约45度的设置以有效分离靶细胞，之后通过排空容器以去除非靶细胞(见图5c)。

为了除去滞留的无关细胞，通过保持磁梯度将收集的靶细胞保留在收集表面，然后将培养基加入室中，调整输液速度以促使弯液面有效地洗涤收集表面的靶细胞。腔室可再次排空，并且根据需要重复该步骤以洗脱夹带的细胞。最后，为了收集靶细胞，将腔室与磁体分离，并将培养基加入到腔室，可以旋转或水平地前后移动腔室以促进靶细胞在培养基中的再悬浮(图1)。

在某些细胞分离过程中，如果弯液面的洗涤不足以去除无关细胞，则可用另一种操纵过程。在这种情况下，细胞如上所述在收集表面积聚，将容器排空，并加入足量的培养基，然后将分离室和磁体分离，使收集的细胞失去磁力作用。其结果使细胞从收集表面脱落，无关细胞则被释放。其后，再恢复磁梯度和排出腔室的内容物。可根据需要重复该过程，以进一步丰富靶细胞群体。

期望避免或至少最小化靶细胞在集合表面的堆积，这种情况发生是由于收集表面处于磁体产生的不均匀磁梯度所致。这种堆积效应使得在磁分离过程中去除滞留的无关细胞复杂化。当细胞均匀收集时，无关细胞可通过使洗涤液流经细胞收集表面而去除，此时靶细胞被磁力保持在原位(称为“现场洗涤”)。进行现场洗涤是非常需要的，因为其显著快于传统的细胞再悬浮和随后的磁分离以去除滞留的无关细胞的方法。此外，它也是一个更温和的过程，因此保持了细胞的完整性和活性。

以下实例以用于说明本发明的某些实际方案，它们并不是以任何方式限制本发明。

例1

在靶细胞磁分离过程中重力对红细胞(rbc)滞留的影响

在这些实验中，用生物素化的抗cd3小鼠mab(tonbobiotech，sandiego，ca)标记来自cem细胞系(t－淋巴母细胞，cd3⁺)的cd3⁺细胞，细胞浓度为10⁸个细胞/ml。通过洗涤和离心除去未结合的mab，并以常规方法用链霉亲和素铁磁流体磁性标记细胞。所有实验均在室温下进行。为了模拟用血沉棕黄层的分离，将标记的细胞与在缓冲液中的新鲜牛rbc混合，后者来自经edta处理的牛血离心后的细胞成分。以10％，20％和30％红细胞比容模拟rbc的污染水平，实验的终体积为2ml，在丙烯酸比色杯(1.0×1.0×4.0cm)中进行分离。根据实验中使用的靶细胞数量、分离的几何参数和收集表面积，计算出靶细胞(如果是均匀收集)可被收集为三层。该数值是基于当细胞为单层时的数据，即1.4×10⁶个细胞/cm²-理论计算和显微镜观察的数值。这些实验中收获的靶细胞的百分比均>94％。因此，在磁分离期间有机会夹带rbc。

图3描绘了在抵抗重力分离靶细胞时测定rbc滞留的实验设计。如上所述，当重力是细胞分离的因素时，放置磁体使磁场力处于约45°度角有益处。换句话说，当磁性标记的细胞被磁体向下牵拉时，矢量彼此成45°角并指向相同的方向。当靶标细胞被向上牵拉时，矢量之间也是45°角，但方向相反。在本实验的分离部分，将比色杯中的细胞混合物定在45°角，其中一种情况是磁力将细胞向上拉至收集表面(图5b)，而另一种则将细胞向下拉至收集表面(图5a)。在前一种情况(图5b)中，靶细胞被向上吸引，当分离的靶细胞向上至分离表面时，重力会导致非靶标细胞(这里指rbc)下落。后者如图5a所示的分离，rbc或者在分离开始时已在容器底部或在分离过程中因重力沉降于底面，有机会被夹带滞留。

对于该实例，一旦分离完成并且已知分离室(比色杯)可无限制的有效被洗涤以去除rbc，如果细胞收集在腔室的内下表面时(如图5a所示)，可转动整个系统采取与图5c相同的方向。此时两个分离系统持相同的方向，用巴斯德移液管除去比色杯的内容物，加入3.0ml洗涤缓冲液并静置2分钟。重复该wwor过程二次，最后将比色杯从磁性梯度中移开，将靶细胞重新悬浮于缓冲液中。

为了确定rbc的滞留，将回收的细胞悬浮在缓冲液中，离心沉淀细胞并重新悬浮在水中以裂解夹带的rbc。将悬液离心以沉淀靶向标记的cem细胞，无细胞上清液中血红蛋白的量用soretband测定(400nm)。结果如下表所示：

因为向上(反重力)分离的细胞或向下(随重力)分离的细胞均用已证明非常有效的表面洗涤技术以相同的方式洗脱未结合或无关的细胞，soret数据应反映在分离过程中滞留的rbc数量。对于通过牵拉细胞反重力进行的分离，当红细胞比容增加时，soret值分别为0.030，0.071和0.050，表明rbc的滞留可以忽略。而且，soret吸光度和红细胞比容之间非常明确的关系也证明了向下分离细胞(随重力方向)会导致rbc的滞留。在随重力分离时难以确定有多少rbc夹带，或者在10分钟分离过程中有多少rbc沉降，因为有些rbc在分离开始之前已经存在于分离表面。

该实例在wwor步骤期间，缓冲液与磁性定位的靶细胞接触2分钟。允许缓冲液与靶细胞接触一段时间的目的是使在添加洗涤液期间可能从收集表面移出的任何靶细胞有机会被吸回到收集表面。此外，它也可能会给任何被夹带的rbc更多的时间通过重力来脱落。为了确定洗液与收集细胞接触的时间(停留)是否是一个影响因素，又测试另外两个洗涤时间-30秒和10分钟停留。在所有情况下(30秒、2分钟和10分钟)，收获的靶细胞均没有rbc。

例2

从血沉棕黄层回收cd3⁺细胞时重力对rbc污染的影响

如前所述，当从血沉棕黄层分离靶细胞时，消除红细胞产物可能需要多个循环的再悬浮和磁分离。为了确定所公开的方法，特别是逆重力和wwor分离的方法是否有益于从血沉棕黄层中回收cd3⁺靶细胞，将例1所述的方法用于一位年轻健康男性的血液。

取小量血沉棕黄层样品，用蒸馏水将其中的红细胞裂解并用血细胞计数器来测定血沉棕黄层中白细胞含量。用生物素化的抗cd3小鼠mab标记血沉棕黄层中的cd3⁺细胞，通过离心除去未结合的mab，并以常规方法用链霉亲和素铁磁流体磁性标记细胞。将磁性标记的细胞样品分为两份，分别逆重力分离10分钟，如图5b所示。将液体从室中排出，并用四个周期的wwor。这里，洗涤缓冲液加入后使用两个不同的停留时间。一个样品，缓冲液与磁性固定的靶细胞接触30秒，另一个样品则为2分钟。两种情况均使用四个周期wwor，两个样品在回收的靶细胞中没有观察到rbc，表明30秒的停留时间在该wwor过程足够。

阳性细胞(磁性标记)部分的纯度和产率通过血细胞计数器和流式细胞仪分析评价，流式细胞分析时用抗cd3-pe标记细胞(tonbo，sandiego，ca)，流式细胞仪为amnisflowsight(millipore，billerica，ma)。回收细胞中cd34⁺细胞为31±2.5％，cd3⁺为85±3％。典型的血沉棕黄层cd3⁺细胞含量约为30％。考虑到分离系统中没有加入fcr封闭试剂到，也没有优化分离的其它参数，cd3⁺靶细胞纯度达到85％也是合理的。

从这里公开的rbc实验可以清楚地看到，当使用血沉棕黄层制剂时，逆重力分离细胞有其优势。在向下牵拉细胞的情况下，位于底表面(收集表面)的rbc和非靶细胞可能滞留。同样，横向分离靶细胞也会导致这些细胞在收集表面或附近某些程度的滞留。当向下拉靶细胞的时候，rbc夹带的wwor实例清楚地表明了这一点。相反，抵抗重力上牵拉细胞，并且方便地设定约45°角度的磁梯度，至少给收集表面附近的细胞提供沉降的机会。事实上，在使细胞处于磁梯度之前给细胞混合物一个短暂的沉降的机会是谨慎的，比如静置2分钟。在wwor之后，从血沉棕黄层中分离的cd3⁺细胞不含rbc也证明了本发明的优点。

鉴于这里描述的磁分离中重力的作用，应当清楚本发明不限于1g向下的力。很容易将此概念扩展到采用离心力的系统，就像在此如何利用重力一样。例如，在适当的离心场中进行目标磁分离的方法，其中磁梯度的方向指向旋转中心，从而在该方向上拉动磁性目标，离心力则迫使非目标物体径向移动，此方法可实现一步分离。换句话说，只有靶细胞将位于里边的磁梯度收集表面上，而非靶细胞则位于适当设计的腔室的底部。可以通过调节离心力来调节高度纯化的群体的收集，也可使弱磁性靶向成分(例如可能是非特异性结合磁性纳米颗粒的细胞)可以被离心分离。同样地，可以分离结合不同磁性质量的细胞或其它靶向成分。

例3

从血白细胞产物中分离cd3⁺细胞

从约1.0l、含10¹⁰细胞的血白细胞层开始，首先除去血小板，因为已知其会干扰免疫磁性分离。可以通过离心或使用公认的膜技术(例如，纺丝膜过滤，freseniuskabiagandfreseniuskabiusa)的方法来完成。然后用适当的缓冲液将细胞悬浮于约80ml的体积中，该缓冲液含有不与通用标记物反应的fcr封闭试剂、dnase、蛋白质(如人血清白蛋白)和其他适当的试剂以降底非特异性结合。然后将该混合物加入到垂直放置的分离室中。

随之从各自的管中将抗cd3共轭磁性颗粒(用于直接标记)或共同标记磁性颗粒(用于间接标记)加入到此80ml的细胞悬液中。优选采用间接方法，其中共同标记抗体的fab或fab'片段将通过其远端位点与磁性纳米颗粒连接。使用的fab或fab'片段理想地被引导到靶向mab的fc决定簇，并且片段可以来自各种动物，可以是单克隆抗体(例如，大鼠抗小鼠fcmab)。功能化抗fc的纳米粒子在设计时应避免其与fcr封闭试剂的相互作用，后者用于消除非特异的纳米粒子-细胞的结合。

使用间接方法，将5ml含有4mg大鼠抗小鼠铁磁流体的溶液加入到分离室中的80ml细胞悬液中，然后使用旋转驱动器将腔室调至到水平位置，并且通过线性驱动器产生来回混合的移动。在该混合之后立即将该腔室旋转到其垂直位置，并从单独的管道加入15ml含有30μg抗cd3mab的溶液(使细胞悬液终浓度为10⁸个细胞/ml)，然后恢复到水平方向，再次来回移动以促进腔室内容物的混合。

将血样、铁磁流体和mab加入20×22×0.75cm的分离室以进行标记步骤。该室具有约330ml的容量，所以100ml标记溶液将占其容量约30％。带有无菌过滤器的放气阀装于分离室中，以在填充期间保持室内的大气压。在直立位置填充腔室后，旋转驱动器旋转90°至水平位，并用线性驱动器进行搅拌。然后将腔室返回到直立或垂直位置，进一步旋转至45°，并横向移动靠近磁阵列以进行磁力混合。磁体的外部尺寸约为25×30cm，设置于45°角，由平行的nefebn-52级磁块固定于足够厚的以容纳此磁通量的铁背板。磁块尺寸为20×0.5×2cm，以3mm间隔分开，并呈交替的北极和南极产生强磁场梯度，将磁性标记的物体向上朝向磁体表面吸引。重复多次磁力混合和搅拌过程以重新分配混合细胞和标记成分。

孵育后，将细胞悬液在标记室中用培养基稀释，并用与磁混合相同的磁体系统进行磁分离。稀释的分离溶液终体积约300ml，占腔室容量约90％。为了进行磁分离，用旋转驱动器将腔室从直立位置旋转至45°，然后用线性驱动器横向移动到磁场中。如前所述，强磁场梯度向上吸引磁性物体，导致细胞收集在最靠近磁体的腔室表面。此时，根据需要排空并重新填充腔室以除去非靶细胞，从而提高在收集表面的靶细胞的纯度。最后，将腔室与磁体分开，旋转使收集表面位于底部，轻轻地搅动以使收集的细胞重新悬浮，再恢复于直立位置排出以将靶细胞回收到容器中。

为了使用上述间接方法从10¹⁰细胞中分离cd3⁺细胞(即，约3×10⁹个靶细胞)，需要30μg的抗cd3mab和4mg的大鼠抗小鼠fc铁磁流体。值得注意的是，如果使用的mab的量增加(例如55μgmab)，则使用更少的铁磁流体以实现相似的产量；然而，铁磁流体的成本远低于mab，因此一般操作优选较低量的mab。在30μgmab时，每个靶细胞的mab数目将约为37,500。假设该mab与其细胞决定簇的亲和常数为10⁸，并且基于简单的scatchard计算，预计约10％的mab处于结合状态。从我们的铁磁流体的元素分析和理论考虑，我们确定1μg铁磁流体包含2×10⁸个纳米颗粒。由此计算出4mg铁磁流体含有8×10¹¹个纳米颗粒，或者每个靶细胞约270个纳米颗粒。最后，我们的数据表明，结合有50个铁磁纳米粒子的细胞已足以用我们使用的磁场梯度来分离。如此，将存在足够的mab结合和足够的铁磁纳米粒子来完成分离。

可以采用另一种间接方法，其中将mab和大鼠抗小鼠铁磁流体在腔室中混合，然后立即加入适当混匀的细胞悬液。将25ml含有1mg大鼠抗小鼠铁磁流体的溶液加入腔室，随后再加入25ml含有100μg抗cd3mab的溶液。在如上所述的适当混合之后，立即将50ml含有2×10⁸个细胞/ml的细胞悬液加入到室中。

如上所述，磁性细胞分离可以在靶细胞浓度接近1-2×10⁷个细胞/ml时进行。此外，在收集表面积聚分离的细胞应不超过五层以避免非靶细胞的滞留。初步实验表明，当利用向上逆重力的磁分离时，可以洗涤四层细胞以清除非靶细胞而不需要再悬浮。当用缓冲液稀释细胞至300ml时，分离溶液中的总细胞浓度约为3.33×10⁷个细胞/ml，其中靶细胞浓度为1×10⁷个细胞/ml。我们已确定约1×10⁶个细胞在1cm²的表面上形成单层。因此，具有440cm²收集表面积的腔室可足以将收集细胞层的数量限制到5或更少，以避免滞留非靶细胞。考虑到此收集表面积和330ml所需的室容量，分离室的厚度应该约为7.5mm，我们已经确定此厚度允许在10分钟的收集时间内有效地收集磁性标记的细胞。基于这些计算，分离室的合适尺寸应该是约20×22×0.75cm。

尽管以上已经描述和具体示例了本发明的某些优选实例，但是本发明不限于这些实例。如所附权利要求中所阐述的，在不脱离本发明的范围和精髓的情况下，可以对其进行各种调整。

此外，在附带的权利要求中(以原始和修改的形式)使用“包括”、“基本上由...组成”和“由...组成”的过渡性术语定义了权利要求范围，未被列举的附加要求要素或步骤(如果有的话)被排除在权利要求的范围之外。术语“包括”旨是包含性的或开放性的，并且不排除任何额外未被列举的要素、方法、步骤或材料。术语“由......组成”则排除权利要求中规定以外的要素、步骤或材料，并且在权利要求的成分中，不排除通常与指定材料相随的杂质。术语“基本上由...组成”将权利要求的范围限制于指定的以及不会实质性地影响要求保护的发明的基本和新特征的要素、步骤或材料。负载的混合金属氧化物催化剂，其制备和使用的方法可以在替代实方案中由“包括”，“基本上由...组成”和“由......组成”中的任何过渡性术语更具体地定义。