本发明一般涉及疫苗，更具体而言涉及禽流感疫苗。
背景技术：
禽流感是一种家禽的主要疾病。该疾病是由禽流感病毒(avian influenza virus，AIV)所引起的。高致病性禽流感病毒如H5N1和H5N2病毒株造成数亿鸟类，包括家禽的死亡。目前针对高致病性禽流感病毒(highly pathogenic avian influenza virus，HPAIV)的市售疫苗是由灭活病毒所制成。这种疫苗可能对新突变的高致病性病毒株无效。此外，以灭活病毒疫苗接种的鸟类所产生的抗体无法与被感染的鸟类区分，这可能导致难以监测该疾病流行的情况。因此，需要开发针对禽流感病毒(AIV)的新颖且有效的疫苗，以控制高致病性禽流感病毒(HPAIV)的疫情扩散。针对这些问题，亚单位疫苗相对于全病毒疫苗而言是较佳的设计。表现全病毒的结构以及抗原组成的类病毒颗粒(Virus-like particle,VLP)是一种有效的疫苗抗原，而且没有病毒生长的风险。
技术实现要素：
一方面，本发明涉及一种疫苗组合物，包含：
(a)有效剂量的流感病毒类病毒颗粒(virus-like particle，VLP)，包含：
(i)流感病毒M1蛋白、流感病毒M2蛋白、流感病毒血凝素(hemagglutinin，HA)，以及流感病毒神经氨酸酶(neuraminidase，NA)蛋白；
(b)口蹄疫病毒(Foot-and-mouth disease virus，FMDV)的重组VP3壳蛋白(rVP3)；以及
(c)铝胶。
另一方面，本发明涉及一种疫苗组合物，其包含：
(a)有效剂量的流感类病毒颗粒(VLP)，包含：
(i)流感病毒M1蛋白、流感病毒M2蛋白、流感病毒血凝素(HA)，以及流感病毒神经氨酸酶(NA)蛋白；
(b)口蹄疫病毒(FMDV)VP3壳蛋白、口蹄疫病毒重组VP3壳蛋白(rVP3)、VP3壳蛋白肽或SUMO VP3壳蛋白；以及
(c)铝胶。
在本发明的一个具体实施例中，该流感病毒血凝素(HA)和该流感病毒神经氨酸酶(NA)蛋白为禽流感病毒血凝素(HA)和禽流感病毒神经氨酸酶(NA)蛋白。
在另一具体实施例中，该禽流感病毒血凝素(HA)和该禽流感病毒神经氨酸酶(NA)蛋白选自由H5N2、H5N1以及H5N8所组成的群组。
另一方面，本发明涉及配制本发明的疫苗组合物的方法，其中该方法包括将该有效剂量的流感病毒类病毒颗粒(VLP)加入该VP3壳蛋白、rVP3壳蛋白、VP3壳蛋白肽或SUMO VP3壳蛋白，以及铝胶中。
另外，再一方面，本发明还涉及本发明的疫苗组合物在制备用于在有此需要的受试者中诱导免疫原性反应的药物中的用途。
本发明还涉及一种疫苗组合物，用于在有此需要的受试者中诱导免疫原性反应。或者，本发明涉及在有此需要的受试者中诱导免疫原性反应的方法，包含对有此需要的受试者施用本发明的疫苗组合物以诱导免疫原性反应。
该受试者可以是哺乳类动物以及禽类动物的至少一种。
另外，又一方面，本发明涉及包含流感病毒M1蛋白、流感病毒M2蛋白、流感病毒血凝素(HA)，以及流感神经氨酸酶(NA)蛋白的流感病毒类病毒颗粒(VLP)。
或者，本发明涉及流感类病毒颗粒(VLP)，其包含：
(a)可以自我组装成VLP核心的流感病毒M1核心蛋白；以及
(b)在该VLP表面上表达的流感病毒血凝素(HA)和流感病毒神经氨酸酶(NA)蛋白；
其中该VLP为非复制性且非感染性的，而且不含有完整的病毒核酸。该流感VLP可以进一步包含在该流感VLP的表面上表达的流感病毒M2蛋白。
另外，另一方面，本发明涉及包含生产本发明的流感病毒VLP的宿主细胞。
在一个具体实施例中，该宿主细胞为Vero细胞或293T细胞。
依照以下说明结合附图将对具体实施例作更好的描述，在不脱离本发明的新颖概念的精神和范围的情况下，明显地可以在其中采取一些变化和修改。
附图说明了本发明的一个或多个具体实施例，并且与书面描述一起用于解释本发明的原理。尽可能地，在整个附图中使用相同的组件符号以指示具体实施例中的相同或相似的组件。
附图说明
图1所示为由Vero E6细胞产生的H5N2-VLP的特征分析。(A)血球凝集作用的效价。(B)以免疫印迹分析法定量分析H5N2-VLP所含的HA蛋白量。(C)以透射电子显微镜观察H5N2-VLP的形态。
图2所示为rVP3蛋白具有显著刺激鸡的B细胞(A，左图)以及CD8+T细胞(A，右图)增殖的功效，并诱导鸡的这些免疫细胞产生IFN-γ(B)。
图3(A)所示为在以rVP3与铝胶作为佐剂的VLP免疫的鸡经过攻毒后完全存活，这比以rVP3与铝胶作为佐剂的灭活病毒免疫的鸡在攻毒实验中所产生的结果还更好。(B)病毒脱落量测试显示经以rVP3与铝胶作为佐剂的VLP免疫的鸡病毒脱落量比用灭活病毒免疫的鸡病毒脱落量还少。(C)IFN-γ测试发现经以rVP3与铝胶作为佐剂的VLP免疫的鸡比用灭活病毒免疫的鸡产生更高量的IFN-γ。
具体实施方式
在以下实施例中更具体地描述本发明，这些实施例仅仅是说明性的，对于本领域技术人员而言，可以在其中采取多种修改和变化是清楚明白的。现在详细描述本发明的各种具体实施例。参考附图，如整个图中所示，相同的组件符号表示相同的组成部分。除非上下文另有明确说明，否则在本文的描述以及之后的权利要求中使用的“一”、“一个”以及“该”的含义包括复数形式。此外，如本文的描述以及之后的权利要求中所使用的，除非上下文另有明确指示，否则“在...之中”的含义包括“在...之中”以及“在...之上”。此外，为了读者的方便，可以在说明书中使用标题或副标题，其不会影响本发明的范围。另外，本说明书中使用的一些术语在下面有更具体地定义。
定义
在本说明书中使用的术语，在本发明的上下文中以及在使用每个术语的特定上下文中，通常具有它们在本领域中的普通含义。用于描述本发明的某些术语在下文或说明书中的其他地方讨论，以向实践者提供关于本发明的描述的附加指导。为了方便，可以突出显示某些术语，例如使用斜体和/或引号。使用突出显示对术语的范围和含义没有影响；在相同的上下文中，无论是否被突出显示，术语的范围和含义是相同的。应当理解的是，相同的事物可以以多于一种方式来阐述。因此，替代语言和同义词可用于本文所讨论的任何一个或多个术语，不会因本文是否详细描述或讨论术语而施加任何特别的重要性。某些术语的同义词也被提供于本发明中。一个或多个同义词的表述不会排除使用其他的同义词。在本说明书中的任何地方使用实施例，包括本文讨论的任何术语的示例仅是说明性的，并且绝不限制本发明或任何示例性术语的范围和含义。同样，本发明不限于本说明书中给出的各种具体实施例。
除非另有定义，否则本文使用的所有技术与科学术语具有与本发明所属领域的普通技术人员通常理解的相同的含义。在冲突的情况下，本文件，包括定义将控制该含义。
如本文所用，“约”、“大约”或“近似”通常表示在所给定的数值或范围的20％内，优选在10％内，更优选在5％内。本文给出的数量是近似的，意味着如果没有明确说明，术语“约”、“大约”或“近似”是可以推断。
VP3为口蹄疫病毒(FMDV)的壳蛋白之一。口蹄疫病毒(FMDV)的壳蛋白是由四种结构蛋白，即VP1、VP2、VP3和VP4，所组成。
rVP3为一种衍生自重组DNA的VP3类蛋白，其由大肠杆菌表达及纯化。T7标签以及His标签分别连接到VP3蛋白的N端及C端。
VP3肽为一种由口蹄疫病毒(FMDV)VP3蛋白第91～150个残基所组成的多肽。
SUMO VP3为一种VP3融合蛋白，其中VP3融合到六组氨酸标记的酵母SUMO(小泛素相关修饰物，small ubiquitin-related modifier)蛋白上。
开发新颖且有效的疫苗以保护人类及动物免受流感病毒的感染，并且控制流感病毒的传播，是全世界的重要任务。抗原制备物和佐剂都是疫苗的重要组成分。代表整个病毒的结构和抗原组成的类病毒颗粒(VLP)是有效的疫苗抗原，而且不具有病毒生长的风险。我们发现VLP与rVP3以及铝胶作为抗禽流感病毒疫苗的组合产生了最好的保护。以含有rVP3与铝胶作为佐剂的H5N2-VLP疫苗免疫的鸡，以H5N2病毒攻毒后保护率达100％，造成比以含有rVP3与铝胶作为佐剂的灭活病毒疫苗免疫的鸡具有更少的病毒释出。我们的数据显示含有rVP3及铝胶作为佐剂的VLP可作为对抗流感病毒的新型疫苗。
实施例
在不意图限制本发明的范围的情况下，以下提供根据本发明的具体实施例的示例性仪器、装置、方法及其相关结果。注意，为了读者的方便，可以在实施例中使用标题或副标题，其应当不以任何方式限制本发明的范围。此外，本文提出并揭露了某些理论；然而，不管它们是对还是错，都不应限制本发明的范围，只要根据本发明实施该发明而不考虑任何特定的理论或作用方案。
VP3与VLP是根据美国专利号8,980,281与8,795,678所制备，其全部内容通过引用方式并入本文。
FMDV VP3蛋白是从大肠杆菌中表达及纯化而来。简言之，将编码FMDV VP3的基因克隆到pET-24a表达载体(Novagen公司，麦迪逊，威斯康星州，美国)中，并转化到BL21-CodonPlus(DE3)-RIL菌株(Stratagene公司，加州，美国)中。在TEN缓冲液(20mM Tris-HCl，pH 8.0，1mM EDTA，100mM NaCl)中以微流化器(M-110Y细胞破碎)将表达重组VP3蛋白的大肠杆菌破碎。将细菌裂解物离心，将沉淀物以含有0.05％脱氧胆酸盐的TEN缓冲液、含有25％蔗糖的TEN缓冲液，以及TEN缓冲液依次清洗。沉淀物最后以结合缓冲液(20mM Tris-HCl，100mM NaCl，8M尿素)溶解，且以具有咪唑阶梯梯度(step gradient)的钴亲和柱纯化VP3。将含有VP3蛋白的分段汇集在一起，然后以10倍体积的重折叠缓冲液(20mM Tris，5μMβ-巯基乙醇)以滴加的方式稀释，并在4℃下作用1小时。将重折叠的VP3在4℃下以10倍体积的透析缓冲液(20mM Tris，100mM NaCl，2μMβ-巯基乙醇)透析过夜。
rVP3蛋白序列(SEQ ID NO:1)，具有241个氨基酸：MASMTGGQQMGRGSGIFPVACSDGYGGLVTTDPKTADPVYGKVFNPPRNLLPGRFTNLLDVAEACPTFLHFDGDVPYVTTKTDSDRVLAQFDLSLAAKHMSNTFLAGLAQYYTQYSGTINLHFMFTGPTDAKARYMVAYAPPGMEPPKTPEAAAHCIHAEWDTGLNSKFTFSIPYLSAADYAYTASDBAETTMBQGWBCLFQITHGKADGDALVVLASAGKDFDLRLPVDARTQLEHHHHH
VP3蛋白序列(SEQ ID NO:2)，具有220个氨基酸：GIFPVACSDGYGGLVTTDPKTADPVYGKVFNPPRNLLPGRFTNLLDVAEACPTFLHFDGDVPYVTTKTDSDRVLAQFDLSLAAKHMSNTFLAGLAQYYTQYSGTINLHFMFTGPTDAKARYMVAYAPPGMEPPKTPEAAAHCIHAEWDTGLNSKFTFSIPYLSAADYAYTASDBAETTMBQGWBCLFQITHGKADGDALVVLASAGKDFDLRLPVDARTQ
VP3肽序列(SEQ ID NO:3)，具有60个氨基酸：LAGLAQYYTQYSGTINLHFMFTGPTDAKARYMVAYAPPGMEPPKTPEAAAHCIHAEWDTG
SUMO VP3蛋白序列(SEQ ID NO:4)，具有330个氨基酸：HHHHHHMSDSEVNQEAKPEVKPEVKPETHINLKVSDGSSEIFFKIKKTTPLRRLMEAFA KRQGKEMDSLRFLYDGIRIQADQTPEDLDMEDNDIIEAHREQIGGATYGGMGIFPVACSDGYGGLVTTDPKTADPVYGKVFNPPRNLLPGRFTNLLDVAEACPTFLHFDGDVPYVTTKTDSDRVLAQFDLSLAAKHMSNTFLAGLAQYYTQYSGTINLHFMFTGPTDAKARYMVAYAPPGMEPPKTPEAAAHCIHAEWDTGLNSKFTFSIPYLSAADYAYTASDBAETTMBQGWBCLFQITHGKADGDALVVLASAGKDFDLRLPVDARTQ
M1序列(SEQ ID NO:5)，具有252个氨基酸MSLLTEVETYVLSIVPSGPLKAEIAQRLEDVFAGKNTDLEALMEWLKTRPILSPLTKGILGFVFTLTVPSERGLQRRRFVQNALNGNGDPNNMDKAVKLYRKLKREITFHGAKEIALSYSAGALASCMGLIYNRMGAVTTEVAFGLVCATCEQIADSQHRSHRQMVATTNPLIRHENRMVLASTTAKAMEQMAGSSEQAAEAMEIASQARQMVQAMRAIGTHPSSSTGLRDDLLENLQTYQKRMGVQMQRFK
M2序列(SEQ ID NO:6)，具有97个氨基酸MSLLTEVETPIRNEWGCRCNDSSDPLVVAANIIGILHLILWILDRLFFKCVYRLFKHGLKRGPSTEGVPESMREEYRKEQQNAVDADDSHFVSIELE
H5序列(SEQ ID NO:7)，具有564个氨基酸MERIVIAFAIVNIVTGDRICIGYHANNSTTQVDTIMEKNVTVTHAQDILEKEHNGRLCSLKGVKPLILKNCSVAGWLLGNPMCDEFLNAPEWSYIVEKDRPSNGLCYPGTFNYYEELKHLMSSTNQFEKIQIFPRSSWSNHDASSGVSSACPYNGRSSFFRNVVWLIKKNNVYRTITRTYNNTNIEDLLIIWGIHHPNNAAEQIKLYQNPSTYVSVGTSTLNQRSIPEIATRPKVNGQSGRMEFFWTILRPNDSITFESTGNFIAPEYAYKIVKKGDSAIMKSELSYSNCDTKCQTPVGAINSSMPFHNVHPFAIGECPKYVKLKKLVLATGLRNIPQRRKRGLFGAIAGFIEGGWQ GMVDGWYGYHHSNEQGSGYAADKESTQKAVDGITNKVNSIISKMNSQFEAVGKEFNNLERRIENLNKKMEDGFIDVWTYNAELLVLMENERTLDLHDSNVKNLYDKVRRQLRDNAKELGNGCFEFYHRCDNKCMESVRNGTYDYPQYSEESRLKREEIDGVKLESMGVYQIISIYSTVASSLALAIMVAGLSFWMCSNGSLQCRVCI
N2序列(SEQ ID NO:8)，具有449个氨基酸MNPNQKIITIGSVSLTIATVCFLMQIAILTMTVTLHFNQNECSIPANNQVVPCEPIIIEKSINYRDWSKPQCRITGFAPFSKDNSIRLSAGGNIWVTREPYVSCDTSKCYQFALGQGTTLDNKHSNGTIHDRTPHRTLLMSELGVPFHLGTKQVCIAWSSSSCHDGKAWLHVCVTGDDKNATASFIYDGMLVDSIGSWSQNILRTQESECVCINGTCTVVMTDGSASGKADTRILFIEEGQVIHISPLSGSAQHIEECSCYPRYPNVRCVCRDNWKGSNRPVVDINMADYSIDSSYVCSGLVGDTPRNDDSSSSSNCRDPNNEKGNPGVKGWAFDDGDDIWMGRTISKDSRSGYETFRVIDGWTIANSKSQINRQVIVDNNNWSGYSGIFSVENKSCINRCFYVELIRGRPKETRVWWTSNSIVAFCGTSGTYGTGSWPDGANINFMPI
实施例1
自Vero细胞进行流感病毒类病毒颗粒(VLPs)的表达及纯化。根据美国专利号8,980,281建立产生流感病毒VLP的Vero细胞系统。
基于美国专利号8,980,281中公开的已建立的平台，通过将pCI6/TO-M1-M2和pCI4/TO-HA-NA质粒分两步骤稳定转染到293T细胞中，我们成功地产生了生产H5N2-VLP的细胞克隆株。我们还使用Vero E6细胞在Vero细胞中生产流感病毒H5N2-VLP。简言之，我们构建了含有两个表达盒的质粒，用四环霉素诱导方式表达禽流感病毒的H5蛋白和N2蛋白。通过在起始细胞株中稳定转染表达质粒，随后分离克隆株，我们筛选并鉴定了产生H5N2-VLP的细胞株。在微载体悬浮培养系统以脱氧羟四环素诱导，以使VLP由生产细胞表达和分泌。将条件培养基用超高速离心纯化后，对分泌VLP的颗粒形态(图1C)、平均大小和血凝反应能力进行特征分析，并且通过总蛋白量和血凝素(HA)蛋白量来定量VLP成分。我们发现，以这种方式进行的Vero细胞比293T细胞成为更好的VLP生产者。它们含有更多的血凝素(HA)蛋白，且可多达9％的总VLP蛋白(图1A和B)。此外，Vero E6细胞产生的VLP的血球凝集作用效价比293T细胞产生的血球凝集作用效价高4倍。因此，将在Vero E6细胞中产生的H5N2-VLP作为禽流感病毒疫苗的抗原。
抗原制剂和佐剂都是疫苗的重要组分。为了寻找更好的佐剂，我们克隆了口蹄疫病毒壳蛋白的VP3基因。含有VP3基因的质粒在大肠杆菌中过度表达、纯化并重折叠以具有佐剂活性。然后我们研究了rVP3是否可以活化鸡免疫细胞中的免疫反应。我们发现rVP3刺激了鸡的B细胞和CD8+T细胞的增殖(图2A)。rVP3也诱导这些鸡免疫细胞产生IFN-γ(图2B)。这些结果显示，rVP3在体外诱导鸡免疫细胞的细胞免疫反应。
为了检查H5N2-VLP和rVP3的疫苗功效，我们首先以H5N2-VLP单独免疫鸡，发现它没有引起足够的抗体效价，表示H5N2-VLP需要佐剂的辅助以诱导完全免疫反应。与以含有rVP3和铝胶作为佐剂的相同剂量的H5N2-VLP疫苗免疫的鸡，或与以含有铝胶的相同剂量的灭活病毒疫苗免疫的鸡相比，以含有铝胶作为佐剂的低剂量的H5N2-VLP疫苗免疫的鸡在攻毒后10天病情较为严重。以含有rVP3和铝胶作为佐剂的较高剂量的H5N2-VLP疫苗初次免疫并加强免疫的鸡，会引起较高的血球凝集抑制作用(hemagglutination inhibition，HI)抗体以及血清中和(serum neutralization，SN)抗体效价，这与以含有rVP3和铝胶作为佐剂的灭活病毒疫苗免疫的作用及抗体效价类似。此外，以含有rVP3和铝胶作为佐剂的H5N2-VLP疫苗免疫的鸡，经过H5N2病毒攻毒后完全存活(图3A)，具有较少的病毒释出，甚至优于以含有rVP3和铝胶作为佐剂的灭活病毒疫苗免疫的结果(图3B)。与我们的鸡免疫细胞体外研究结果一致，以含有rVP3和铝胶作为佐剂的H5N2-VLP疫苗免疫的鸡，诱导产生的IFN-γ和IL18高于以含有rVP3和铝胶作为佐剂的灭活病毒疫苗所诱导产生的IFN-γ和IL18(图3C)。
实施例2
使用如上述类似方法，通过将pCI6/TO-M1-M2和pCI4/TO-HA-NA质粒分两步骤连续稳定地转染到293T细胞中，我们制造出产生H5N1-VLP的细胞克隆株。我们还使用Vero E6细胞在Vero细胞中产生流感病毒H5N1-VLP。简言之，我们构建了含有两个表达盒的质粒，以允许四环霉素诱导表达禽流感病毒的H5蛋白和N1蛋白。通过在生成细胞株中稳定转染表达质粒，随后分离克隆株，我们筛选并鉴定了产生H5N1-VLP的细胞株。在微载体悬浮培养系统中以脱氧羟四环素诱导，以使VLP由生产细胞表达和分泌。在条件培养基的离心纯化后，对分泌VLPs的颗粒形态、平均大小和血凝反应能力进行特征分析，并且通过总蛋白量定量VLP成分。以在Vero E6细胞中产生的H5N1-VLP作为禽流感病毒疫苗的抗原。
实施例3
使用如上述类似方法，通过将pCI6/TO-M1-M2和pCI4/TO-HA-NA质粒分两步骤连续稳定地转染到293T细胞中，我们制造出产生H5N8-VLP的细胞克隆株。我们还使用Vero E6细胞在Vero细胞中产生流感病毒H5N8-VLP。简言之，我们构建了含有两个表达盒的质粒，用四环霉素诱导方式表达禽流感病毒的H5蛋白和N8蛋白。通过在生成细胞株中稳定转染表达质粒，随后分离克隆株，我们筛选并鉴定了产生H5N8-VLP的细胞株。在微载体悬浮培养系统中以脱氧羟四环素诱导，以使VLP由生产细胞表达和分泌。将条件培养基利用超高速离心纯化后，对分泌VLPs的颗粒形态、平均大小和血凝反应能力进行特征分析，并且通过总蛋白量定量VLP成分。以在Vero E6细胞中产生的H5N8-VLP作为禽流感病毒疫苗的抗原。
总之，我们已经发现了针对高致病性禽流感病毒的新疫苗。这种新的禽流感病毒疫苗由禽流感病毒类病毒颗粒(VLP)作为抗原以及以rVP3和铝胶作为佐剂所组成。该疫苗可以在免疫的鸡中诱导高效价的中和抗体以及细胞调节的免疫反应。它保护鸡抵抗高致病性禽类病毒的攻毒以及具有较少的病毒释出。该疫苗可作为抗禽流感病毒的疫苗，以保护家禽产业、家禽蛋产业，以及人类免于禽流感病毒流行病疫情的爆发。
本发明的示例性实施例的上述描述仅出于说明及描述的目的而呈现，并且并非意图穷举或将本发明限于所公开的精确形式。鉴于上述启示，许多修改及变化是可能的。
选择和描述实施例和示例以便解释本发明的原理及其实际应用，以便使本领域的技术人员能够利用本发明和各种实施例，以及进行各种修改以适合于预期的特定用途。在不脱离本发明的精神和范围的情况下，替代实施例对于本发明所属领域的技术人员将变得清楚明了。因此，本发明的范围是由所附的权利要求书限定，而非由上述描述与其中所述的示例性实施例限定。
在本发明的描述中引用和讨论了一些参考文献，其可以包括专利、专利申请以及各种出版物。提供这种参考文献的引用和/或讨论仅仅是为了澄清本发明的描述，而非承认任何这样的参考文献为本发明的“现有技术”。在本说明书中引用和讨论的所有参考文献通过引用方式整体并入本文，并且与每个参考文献单独地通过引用而并入本文一样。
序列表
<110> 中央研究院
<120> 包括类病毒颗粒及新型佐剂的禽流感疫苗组合物
<130> 10011-054PCT
<150> 62216865
<151> 2015-09-10
<160> 8
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 241
<212> PRT
<213> 口蹄疫病毒
<400> 1
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<211> 220
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<213> 口蹄疫病毒
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