本申请根据 35 U.S.C. § 119(e)要求2015年4月6日提交的美国临时申请号62/143,744的优先权，其全文以引用的方式合并入本文中。
背景技术：
脑癌是危险的并且难以治疗。胶质母细胞瘤（Glioblastoma，GB）是最常见和最具侵袭性的原发性脑肿瘤。大脑的癌症还造成风险，它是来自其他来源的转移的结果；例如在患有转移性乳腺癌的患者中乳腺癌脑转移瘤（BCBM）是常见的。即使使用化疗、放射和手术切除，GB患者的中位总生存期仅为14.6个月（Morgan, R.A. et al. (2012) Hum Gene Ther. 23:1043-1053）。BCBM同样对可用的治疗具有较高的耐药性，并且对患者表现出不良的预后。常规的疗法通常缺少特异性，并且会对周围的脑实质和全身组织造成损害，这是限制其应用的因素（Imperato, J.P. et al. (1990) Ann Neurol. 28:818-822）。对于GB的基于免疫的疗法是常规治疗的有希望的替代品，其具有产生可持续的抗肿瘤反应的潜在的长期效益，其有潜力靶定局部的和浸润性肿瘤细胞（Mellman, I. et al. (2011) Nature 480:480-489）。表皮生长因子受体（EGFR）在包括GB的多种肿瘤中起到重要作用。EGFR是在GB中最常被扩增的基因，而其在正常脑组织中的表达是不可检测的或极低的（Parsons, D.W. et al. (2008) Science 321:1807-1812；Salomon, D.S. et al. (1995) Crit. Rev Oncol Hematol. 19:183-232）。配体至EGFR的结合导致受体同源和异源二聚体形成、几个关键酪氨酸残基的自磷酸化，其导致几个细胞内下游信号通路的激活，这些通路包括Ras/Raf/MEK/ERK通路、PLCγ-PKC 通路和PI3K/AKT通路，导致细胞增殖、运动和存活（Zandi, R. et al. (2007) Cell Signal 19:2013-2023）。EGFR扩增的肿瘤中的大约20-40%含有EGFR变异体III突变体（EGFRvIII），其包括在细胞外配体结合结构域中的外显子2-7的缺失（Aldape, K.D. et al. (2004) Journal of Neuropathology and Experimental Neurology 63:700-707；Biernat, W. et al. (2004) Brain Pathol. 14:131-136；Fan, Q.W. et al. (2013) Cancer Cell 24:438-449；Sugawa, N. et al. (1990) Proc Natl Acad Sci. USA 87:8602-8606）。该突变体形式在没有配体的情况下显示出组成性激活，从而激活肿瘤促进信号通路（Ohno, M. et al. (2010) Cancer Sci. 101:2518-2524）。
技术实现要素：
胶质母细胞瘤（GB）仍然是最具侵袭性的原发性脑部恶性肿瘤。嵌合抗原受体（CAR）修饰的免疫细胞的过继转移已经成为有希望的抗癌方法，但是CAR工程化的自然杀伤（NK）细胞用于治疗GB的潜在应用还没有被研究。来自大约50%的GB患者的肿瘤表达野生型EGFR（wtEGFR），并且在较少的情况中表达wtEGFR和突变形式EGFRvIII；但是，先前报道的CAR T细胞仅集中于靶定EGFRvIII。
本发明的方面涉及一种嵌合抗原受体（CAR），其包括：（a）抗原结合结构域；（b）铰链结构域；（c）跨膜结构域；和（d）细胞内结构域。本发明提供了一种新颖的CAR——一种表皮生长因子受体（“EGFR”）嵌合抗原受体（CAR），其包括、或替代地基本上由其组成、或进一步地由其组成：（a）识别野生型和/或突变的表皮生长因子受体（EGFR）（“wtEGFR和/或突变的EGFR”）两者的抗EGFR抗体的抗原结合结构域；（b）铰链结构域多肽；（c）共刺激多肽；和（d）CD3ζ信号传导结构域。在一个方面，所述共刺激分子包括细胞内结构域和跨膜结构域。非限制性的例子包括CD8、4-1BB共刺激信号传导区域、CD28共刺激分子、OX40、ICOS和CD27。在一个方面，所述抗EGFR抗体的抗原结合结构域包括抗EGFR重链（HC）可变区域和抗EGFR轻链（LC）可变区域。在进一步的方面，所述EGFR CAR进一步包括位于所述抗EGFR HC可变区域和所述抗EGFR LC可变区域之间的接头多肽、或替代地基本上由其组成、或进一步地由其组成。所述CAR可以进一步包括可检测标签或纯化标记物。
本文进一步公开了编码所述EGFR CAR及其补体的多核苷酸及其每个的等效物。本发明提供了含有所述多核苷酸和/或EGFR CAR的载体和宿主细胞。所述载体是质粒或载体。所述细胞可以是原核或真核细胞。在一个方面，所述细胞是T细胞或NK细胞。所述细胞可以被扩增，因此本发明进一步提供了所述细胞的被扩增的群体。在一个方面，所述细胞是细胞（例如T细胞）的被激活的群体。
本发明进一步提供了这些组合物的诊断和治疗用途。例如，本发明提供了抑制细胞和/或肿瘤中的一个或多个的生长的方法，所述细胞和/或肿瘤在表达EGFR的细胞或干细胞的表面上表达wt EGFR或突变的EGFR、或wt EGFR和突变的EGFR，其中将这些细胞与有效量的包括本发明所述的EGFR CAR的分离的细胞接触。所述细胞可以是肿瘤细胞，例如胶质母细胞瘤或癌症干细胞，例如胶质母细胞瘤干细胞。所述接触可以是体外的或体内的。当在体外进行时，所述方法可用来筛选新的疗法或合并疗法。在体内，所述方法可用于治疗患有表达EGFR的癌症的患者，所述癌症例如脑癌，例如胶质母细胞瘤或另一种癌症（例如乳腺癌）在大脑中的转移瘤。
在另一个方面，本发明提供了在有需要的对象中抑制以下中的一种或多种的生长的方法：在细胞的表面上表达wt EGFR或突变的EGFR、或wt EGFR和突变的EGFR的细胞。所述方法包括向所述对象施用有效量的包括本文所述的EGFR CAR的分离的细胞、或替代地基本上由其组成、或进一步地由其组成。所述表达EGFR的细胞可以是肿瘤细胞或癌症干细胞，例如胶质母细胞瘤或胶质母细胞瘤干细胞。所述表达EGFR CAR的分离的细胞对于接受该细胞的对象来说可以是自体同源的（e autologous）。本发明进一步提供了在有需要的对象中治疗癌症的方法，其中癌症细胞表达wt EGFR或突变的EGFR、或wt EGFR和突变的EGFR，其中向所述对象施用有效量的包括本文所述的EGFR CAR的分离的细胞。这些方法中的分离的细胞可以是NK细胞和/或T细胞，并且对于被治疗的对象来说可以是自体同源的。在进一步的方法，可以通过如由治疗医师所确定的任何合适的途径来施用所述细胞，包括但不限于颅内注射、静脉给药。
本发明进一步提供了一种分离的复合物，其包括本文所述的EGFR CAR以及EGFR蛋白或其片段和/或突变的EGFR蛋白或其片段。在另一个方面，本发明提供了一种分离的复合物，其包括本文所述的EGFR CAR以及表达wt EGFR或突变的EGFR、或wt EGFR和突变的EGFR的细胞。
本发明的进一步的方面涉及使用本文所述的表达EGFR CAR的细胞（例如T细胞或NK细胞）和溶瘤性单纯疱疹病毒的组合物和联合癌症疗法。一些实施方式涉及一种治疗肿瘤或癌症的方法，其中表达EGFR CAR的细胞和溶瘤性单纯疱疹被施用至有需要的患者。在一些实施方式中，表达EGFR CAR的细胞和溶瘤性单纯疱疹病毒被同时施用；在其他实施方式中，表达EGFR CAR的细胞在溶瘤性单纯疱疹病毒的施用之前或之后被施用。
本发明进一步提供了包括上述组合物中的一种或多种的试剂盒。本发明还进一步提供了诊断性地或治疗性地使用它们的说明。
附图说明
图1A-1B示出了EGFR在GB和GB干细胞上的表达。（图1A）通过流式细胞术监控了在神经胶质瘤细胞系（U251、LN229和Gli36dEGFR）和神经胶质瘤干细胞（GB30、GB83、GB326、GB1123、GB84V3SL、GB157V3SL和GB19）上的表面EGFR表达。NK细胞系NKL和NK-92作为阴性对照。（图1B）通过RT-PCR确定了在图1A中详述的神经胶质瘤细胞系和神经胶质瘤干细胞中的EGFR mRNA表达。流程图和数据代表三个独立实验。
图2A-2B示出了EGFR-特异性CAR的生成和其在CAR转导的NK细胞上的表达的检测。（图2A）EGFR-CAR 慢病毒构建体的示意图。（图2B）在转导有EGFR-CAR构建体（分别为NK-92-EGFR-CAR和NKL-EGFR-CAR）或空载体构建体（EV）的NK-92和NKL细胞的表面上的嵌合EGFR scFv的表达。通过GFP表达对细胞进行FACS分选，然后使用抗小鼠Fab抗体（实线）或IgG同种型对照（虚线）对细胞进行染色，然后通过流式细胞仪进行分析。SP：信号肽；VH：重链；VL：轻链；ScFv单链可变片段。流程图和数据代表三个独立实验。
图3A-3B示出了EGFR-CAR修饰的NK-92和NKL细胞识别并杀死EGFR+ GB细胞系细胞。（图3A）使用标准铬-51释放测定得出的空载体（EV）转导的或EGFR-CAR转导的NK-92和NKL细胞针对Gli36dEGFR、LN229或U251细胞的细胞毒性活性。（图3B）使用ELISA测试得出的在存在或不存在Gli36dEGFR、LN229或U251细胞的情况下的空载体EV转导的或EGFR-CAR转导的NK-92和NKL细胞的IFN-γ释放。示出了三个独立实验的代表性数据。*p < 0.05；**p < 0.01。
图4A-4B示出了EGFR-CAR修饰的NK-92和NKL细胞显示出增强的EGFR+ GB干细胞的裂解。（图4A）使用铬-51释放测定得出的NK-92-EV或NK-92-EGFR-CAR 细胞（上面板）和NKL-EV或NKL-EGFR-CAR细胞（下面板）针对GB1123、GB30、GB157V3SL和GB84V3SL GB 干细胞的细胞毒性活性。（图4B）在与GB 干细胞共培养时NK-92-EGFR-CAR或NK-92-EV细胞（上面板）和NKL-EV或NKL-EGFR-CAR细胞（下面板）的IFN-γ分泌的ELISA分析。示出了三个独立实验的代表性数据。*p < 0.05；**p < 0.01。
图5A-5C示出了NK-92-EGFR-CAR细胞的增强的靶标识别取决于EGFR在细胞表面上的表达。（图5A）使用抗EGFR抗体（实线）或IgG同种型对照（虚线）进行流式细胞术，以检测在转导有空载体或含有wtEGFR或EGFRvIII的载体的GB19细胞的表面上的EGFR表达。（图5B）NK-92-EV或NK-92-EGFR-CAR（上面板）和NKL-EV或NKL-EGFR-CAR（下面板）针对在图5A中示出的GB19、GB19-wtEGFR和GB19-EGFRvIII细胞的细胞毒性。以不同的效应器/靶标（E/T）比率使用NK-92或NKL细胞孵育GB19细胞4小时。使用铬-51释放测定确定肿瘤裂解。（图5C）NKL-EV或NKL-EGFR-CAR（左）和NK-92-EGFR-CAR或NK-92-EV细胞（右）与相等数量的GB19-载体或GB19-EGFR细胞共培养24小时。然后取得上清液，以使用ELISA测量IFN-γ分泌。流程图和数据代表三个独立实验。*p < 0.05，**p < 0.01。
图6A-6E示出了NK-92-EGFR-CAR细胞抑制原位人脑胶质瘤干细胞的体内生长，延长带有胶质瘤细胞的小鼠的存活，并且定位在大脑中而不迁移到其他器官和组织。（图6A）带有GB30肿瘤的小鼠的脑生物发光成像。通过立体定向注射使用表达荧光素酶的GB30细胞孵育NSG小鼠（第0天）。在孵育之后七天，使用空载体转导的NK-92细胞（NK-92-EV）、EGFR-CAR转导的NK-92细胞（NK-92-EGFR-CAR）或Hank’s缓冲盐溶液（HBSS；阴性对照），对小鼠进行一次颅内注射。（图6B）来自图6A的每只小鼠每秒钟的光子的单位的量化汇总。*表示p < 0.05。（图6C）通过Kaplan-Meier生存率曲线（每个群组n = 5）确定，与使用NK-92-EV细胞或HBSS处理的小鼠相比，使用NK-92-EGFR-CAR细胞处理的带有GB30的小鼠显示出显著提高的总体生存率（** p < 0.01）。（图6D）在将CAR NK细胞颅内注射进带有GB30的小鼠的大脑之后3天，在肝、肺、血、脾、骨髓（BM）和脑中通过流式细胞术确定的CD56+CD3-人类EGFR-CAR NK-92细胞的存在。（图6E）在将CAR NK细胞颅内注射进带有GB30的小鼠的大脑之后3天，在肝、肺、血、脾、骨髓（BM）和脑中通过RT-PCR确定的EGFR-CAR表达。NC =阴性对照（没有增加DNA模板）；PC =阳性对照， EGFR-CAR NK-92细胞。*p < 0.05，**p < 0.01。
图7A-7C示出了在原位异种移植物GB模型中，EGFR-CAR转导的NK-92细胞抑制表达wtEGFR的GB肿瘤生长，并且延长带有肿瘤的小鼠的生存期。（图7A）带有U251肿瘤的小鼠的脑生物发光成像。通过立体定向注射，使用105个表达荧光素酶的U251细胞颅内植入NSG小鼠（第0天）。在接种之后10、40、70天，使用NK-92-EV细胞、NK-92-EGFR-CAR细胞或HBSS（作为阴性对照）颅内输注小鼠。在第100天取得小鼠的脑生物发光成像。（图7B）来自图7A的每只小鼠每秒钟的光子的单位的量化汇总。**表示p < 0.01。（图7C）通过Kaplan-Meier生存率曲线（每个群组n = 5）确定，与使用NK-92-EV细胞（* p < 0.05）或HBSS（** p < 0.01）处理的小鼠相比，使用NK-92-EGFR-CAR细胞处理的带有U251的小鼠显示出显著提高的总体生存率。
图8A-8B示出了EGFR-CAR原代NK细胞显示出增强地根除了EGFR+ GB细胞和衍生自患者的GB 干细胞。（图8A）与模拟转导的原代NK细胞（原代NK-EV）相比，EGFR-CAR修饰的原代NK细胞（原代NK-CAR）显示出对EGFR+ Gli36dEGFR 和U251 GB细胞系的增加的细胞溶解活性。（图8B）与模拟转导的原代NK细胞（原代NK-EV）相比，EGFR-CAR修饰的原代NK细胞（原代NK-CAR）显示出对EGFR+-衍生自患者的GB30和GB157V3SL干细胞的细胞毒性。示出的数据代表了三个具有相似结果的实验，检查从不同的健康捐赠者分离的NK细胞。*p < 0.05；**p< 0.01。
图9A-9C示出了NK-92-EGFR-CAR细胞的增强的靶标识别取决于EGFR在细胞表面上的表达。（图9A）使用转导有空载体（EV；左）、wtEGFR（中间）或EGFRvIII（右）的293T细胞的抗EGFR抗体（实线）或IgG同种型对照（虚线）进行的流式细胞术分析。（图9B）NK-92-EV或NK-92-EGFR-CAR（上面板）和NKL-EV或NKL-EGFR-CAR（下面板）针对293T-EV（左）、293T-EGFR（中）和 293T-EGFRvIII（右）细胞的细胞毒性。以不同的效应器/靶标（E/T）比率使用NK细胞孵育293T细胞4小时。使用铬-51释放测定确定肿瘤裂解。（图9C）在靶细胞和效应细胞共孵育24小时之后，使用ELISA测量来自共培养物的上清液的IFN-γ分泌。示出的数据代表了三个具有相似结果的实验。*p < 0.05；**p < 0.01。
图10A-10B示出了NK-92-EGFR-CAR细胞的效果被阻隔EGFR的抗体（Ab）减弱。（图10A）NK-92-EV或NK-92-EGFR-CAR针对GB30细胞（左）或U251细胞（右）的细胞毒性，其被预先使用EGFR特异性单克隆抗体528或IgG匹配的同种型对照抗体进行处理。以不同的效应器/靶标（E/T）比率使用被预先处理的NK-92-EV或NK-92-EGFR-CAR细胞孵育靶细胞4小时。使用铬-51释放测定确定肿瘤裂解。（图10B）在靶细胞和效应细胞共孵育24小时之后，使用ELISA测量来自共培养物的上清液的IFN-γ分泌。示出的数据代表了三个具有相似结果的实验。*p < 0.05；**p < 0.01。Ab= EGFR特异性单克隆抗体528；iso= IgG匹配的同种型对照抗体。
图11示出了在瘤内注射之后NK-92-EGFR-CAR位于肿瘤区域。在GB30植入之后七天，将NK-92-EGFR-CAR细胞瘤内注射入小鼠大脑。在3天之后获得小鼠大脑，使用石蜡包埋，并进行苏木精和曙红（H＆E）染色。H＆E染色显示，NK-92-EGFR-CAR细胞仅存在于肿瘤区域里面。示出了20x、40x和100x的放大倍率（物镜：2x、4x或10x；目镜：10X）。
图12A-12B示出了EGFR在乳腺癌细胞系和组织中的表达。通过流式细胞术检测EGFR在乳腺癌细胞系（MDA-MB-231、MDA-MB-468和MCF-7）的细胞表面上的表达（图12A）。对来自患有原发性乳腺癌和脑转移瘤的患者的肿瘤组织，进行EGFR表达的苏木精和伊红（HE）染色和免疫组织化学术（IHC）（图12B）。
图13A-13E证明了EGFR-CAR NK-92细胞识别并裂解乳腺癌细胞系的EGFR阳性细胞。使用山羊抗小鼠F(ab＇)2多克隆抗体，通过流式细胞术确定EGFR scFv在EGFR-CAR转导的NK-92细胞上的表达（图13A）。使用标准ELISA测试，确定在存在或不存在MDA-MB-231、MDA-MB-468或MCF-7细胞的情况下，空载体（EV）转导的或EGFR-CAR转导的NK-92细胞的IFN-γ释放。**P < 0.01（图13B）。使用标准铬-51释放试验，检测空载体（EV）转导的或EGFR-CAR转导的NK-92细胞针对MDA-MB-231（图13C）、MDA-MB-468（图13D）或MCF-7（图13E）细胞的细胞毒性活性（E，效应细胞；T，靶细胞）。
图14A-14D示出了在使用EGFR+乳腺癌细胞时EGFR-CAR原代NK细胞的增强的细胞毒性和IFN-γ生产。使用标准ELISA测试，确定在存在或不存在MDA-MB-231、MDA-MB-468或MCF-7细胞的情况下，空载体（EV）转导的或EGFR-CAR转导的原代NK细胞的IFN-γ释放（图14A）。使用标准铬-51释放试验，检测空载体（EV）转导的或EGFR-CAR转导的原代NK细胞的针对MDA-MB-231（图14B）、MDA-MB-468（图14C）或MCF-7（图14D）细胞的细胞毒性活性（E，效应细胞；T，靶细胞）。
图15A-15C示出了oHSV-1单独地就能够裂解并根除乳腺癌细胞系肿瘤细胞。通过MTS检测了共培养48小时之后oHSV-1对乳腺癌细胞系（MDA-MB-231、MDA-MB-468或MCF-7）的剂量依赖性细胞毒性*P < 0.05; **P < 0.01（图15A）。图15B示出了在其共培养不同的时间段之后，oHSV-1细胞毒性针对乳腺癌细胞系MDA-MB-231、MDA-MB-468或MCF-7的MTS测试。图15C示出了在MDA-MB-231-CBRluc-EGFP细胞和oHSV-1的共培养的介质中荧光素酶水平的测定。
图16A-16B揭示了EGFR-CAR NK-92细胞和oHSV-1的联合治疗使得体外更有效地根除乳腺癌肿瘤细胞。使用单独的CAR细胞、单独的oHSV-1、EGFR-CAR NK-92细胞处理肿瘤细胞4小时，然后使用oHSV-1 (CAR + oHSV)或oHSV处理4小时，然后使用EGFR-CAR NK-92细胞(oHSV + CAR)处理。通过在不同的时间点释放至上清液的荧光素酶，测定表达CBRluc-EGFP的MDA-MB-231肿瘤细胞的根除（图16A）。通过在共培养之后的第4天保留在MDA-MB-231-CBRluc-EGFP细胞中的荧光素酶的相对光单位，确定了与单独的EGFR-CAR NK-92细胞（CAR）或单独的oHSV-1（oHSV）相比，无论顺序如何，EGFR-CAR NK-92细胞和oHSV-1联合 (CAR + oHSV或oHSV + CAR) 消除更多的MDA-MB-231肿瘤细胞。**P < 0.01（图16B）。数据代表了三个独立的实验。
图17A-17B证明了EGFR-CAR转导的NK-92细胞抑制MDA-MB-231肿瘤生长并且延长带有肿瘤的小鼠的生存期。带有BCBM肿瘤的小鼠的脑生物发光成像。通过立体定向注射，使用MDA-MB-231-CBRluc-EGFP细胞孵育NSG小鼠（第0天）。在孵育之后10天，使用EGFR-CAR NK-92、oHSV-1、NK-92-EV或HBSS，对小鼠进行一次颅内注射。在第15天使用oHSV-1注射联合治疗群组的小鼠。在使用MDA-MB-231-CBRluc-EGFP细胞孵育之后四周，小鼠腹膜内注射D荧光素，并使用体内成像系统进行成像（图17A）。使用EGFR-CAR NK-92细胞，瘤内处理带有MDA-MB-231-CBRluc-EGFP肿瘤的小鼠，然后注射oHSV-1（CAR + oHSV）、单独的EGFR-CAR NK-92细胞（CAR）、单独的oHSV-1、或HBSS对照。结果是，通过Kaplan-Meier生存率曲线（每个群组n = 5）确定，与其他处理相比，先后注射EGFR-CAR NK-92细胞和oHSV-1显示出显著提高的总体生存率（图17B）。
图18示出了慢病毒在人类原代NK细胞中的转导效率。在使用EGFR-CAR慢病毒感染人类原代NK细胞之后，通过流式细胞术确定GFP (+)细胞的百分比。
图19示出了激活标记物在EGFR-CAR NK-92细胞的表面上的表达响应于乳腺癌细胞的变化。在与乳腺癌细胞（MDA-MB-231、MDA-MB-468和MCF-7）过夜共培养之后，通过流式细胞术确定CD27和CD69在EGFR-CAR NK-92细胞中的表面表达。
图20A-20B证明了通过单独的oHSV造成的乳腺癌细胞的裂解。通过显微镜下的明亮图像，证明了在共培养4天之后oHSV造成的乳腺癌细胞系（MDA-MB-231）的裂解（图20A）。使用oHSV-1处理EGFR-CAR NK92细胞4天，显微镜检查显示，oHSV-1对EGFR-CAR NK-92细胞的增殖和活力没有明显影响（图20B）。
图21示出了通过HSV、EGFR-CAR NK-92细胞及其联合造成的乳腺癌细胞系（MDA-MB-231）的裂解。“MDA-MB-231+CAR+oHSV”表示EGFR-CAR NK-92细胞处理4小时，然后oHSV-1处理。“MDA-MB-231+oHSV+CAR”表示oHSV-1处理4小时，然后EGFR-CAR NK-92细胞处理。
图22示出了使用载体、NK-92细胞、oHSV、EGFR-CAR NK-92细胞以及oHSV和EGFR-CAR NK-92细胞的联合进行治疗的颅内异种移植物GB肿瘤的发射光子的量化。
详细描述
应该理解的是，本发明不被限制至所述特定的方面，因为这些方面当然可能发生改变。还应该理解的是，本文所用的术语仅仅是为了描述特定的方面，并且并非旨在限制，因为本发明的范围将仅仅被附加的权利要求限制。
除非另有定义，否则本文所用的所有技术的和科学的术语都具有如属于本发明的技术领域的普通技术人员通常理解一样的含义。尽管可以在本技术的实践或试验中使用与本文所述的类似或等同的任何方法和材料，但是现在描述的是优选的方法、装置和材料。本文提及的所有技术和专利公开其全文都以引用的方式合并入文中。本文的任何描述都不应该被解释为承认通过在先发明本发明无权先于这样的公开。
除非另有说明，否则本技术的实践将采用组织培养、免疫学、分子生物学、微生物学、细胞生物学和重组DNA的常规技术，这是在本领域的技术之内的。参见例如Sambrook and Russell eds. (2001) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd edition; the series Ausubel et al. eds. (2007) Current Protocols in Molecular Biology; the series Methods in Enzymology (Academic Press, Inc., N.Y.); MacPherson et al. (1991) PCR 1: A Practical Approach (IRL Press at Oxford University Press); MacPherson et al. (1995) PCR 2: A Practical Approach; Harlow and Lane eds. (1999) Antibodies, A Laboratory Manual; Freshney (2005) Culture of Animal Cells: A Manual of Basic Technique, 5th edition; Gait ed. (1984) Oligonucleotide Synthesis; U.S. Patent No. 4,683,195; Hames and Higgins eds. (1984) Nucleic Acid Hybridization; Anderson (1999) Nucleic Acid Hybridization; Hames and Higgins eds. (1984) Transcription and Translation; Immobilized Cells and Enzymes (IRL Press (1986)); Perbal (1984) A Practical Guide to Molecular Cloning; Miller and Calos eds. (1987) Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells (Cold Spring Harbor Laboratory); Makrides ed. (2003) Gene Transfer and Expression in Mammalian Cells; Mayer and Walker eds. (1987) Immunochemical Methods in Cell and Molecular Biology (Academic Press, London); 和Herzenberg et al. eds (1996) Weir’s Handbook of Experimental Immunology。
所有数字指定（包括范围），例如pH、温度、时间、浓度、以及分子质量，都是在适当时变化（+）或（-）0.1 或1.0、或替代地变化+/- 15 %、或替代地10%、或替代地5%、或替代地2%的增值的近似值。应该理解的是，尽管并非总是明确地声明，但是所有的数字指定都有术语“约”在前。还应该理解的是，尽管并非总是明确地声明，但是本文所述的试剂仅仅是示例性的，并且这些试剂的等效物在本领域是已知的。
在没有明确描述的情况下应该推断、并且除非另有说明，否则当本技术涉及多肽、蛋白、多核苷酸或抗体时，这样的等效物或生物等效物旨在落入本技术的范围之内。
定义
如在本文和在权利要求中使用的，单数形式“一个”、“一种”、以及“所述”包括复数指代，除非文中另外明确规定。例如，术语“一个细胞”包括多个细胞，包括其混合物。
如本文所用的，术语“动物”表示活的多细胞脊椎动物生物，是包括例如哺乳动物和鸟类的类别。术语“哺乳动物”包括人类哺乳动物和非人类哺乳动物。
术语“对象”、“宿主”、“个体”和“患者”在此被可交换地使用，表示人类和兽医对象，例如人类、动物、非人灵长类动物、狗、猫、羊、鼠、马和牛。在一些实施方式中，所述对象是人类。
如本文使用的，术语“抗体”统一指免疫球蛋白或免疫球蛋白样分子，包括例如且不限于IgA、IgD、IgE、IgG和IgM及其组合，以及在任何脊椎动物中在免疫反应期间产生的类似分子，所述脊椎动物例如是哺乳动物（例如人类、山羊、兔和鼠）以及非哺乳动物物种（例如鲨鱼免疫球蛋白）。除非另有具体说明，否则术语“抗体”包括特异性地结合至感兴趣的分子（或感兴趣的高度相似的分子的群组）至实质性排除结合至其他分子的完整的免疫球蛋白和“抗体片段”或“抗原结合片段”（例如，在生物样品中与对其他分子的结合常数相比，对感兴趣的分子的结合常数大至少103 M-1、至少104 M-1或至少105 M-1的抗体和抗体片段）。术语“抗体”还包括遗传工程形式，例如嵌合抗体（例如人源化鼠抗体）、异源偶联抗体（例如双特异性抗体）。还请参见Pierce Catalog and Handbook, 1994-1995 (Pierce Chemical Co., Rockford, Ill.); Kuby, J., Immunology, 3rd Ed., W.H. Freeman & Co., New York, 1997。
就抗体结构而言，免疫球蛋白具有通过二硫键互相连接的重（H）链和轻（L）链。存在两种类型的轻链：λ和κ。存在决定抗体分子的功能活性的五种主要的重链类型（或同种型）：IgM、IgD、IgG、IgA和IgE。每个重链和轻链都包括恒定区域和可变区域（所述区域也被称为“结构域”）。结合起来，重链和轻链可变区域特异性地结合抗原。重链和轻链可变区域包括被三个高度可变区域打断的“框架”区域，所述高度可变区域也被称为“互补决定区域”或“CDR”。框架区域和CDR的范围已经被确定（参见Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, U.S. Department of Health and Human Services, 1991，其以引用的方式合并入本文中）。Kabat数据库现在在线维护。不同的轻链或重链的框架区域的序列在物种之内是相对保守的。抗体的框架区域，即组成的轻链和重链的结合的框架区域，主要采用β折叠构象，而CDR形成环，该环连接所述β折叠结构或者在一些情况中形成所述β折叠的一部分。因此，框架区域作用来形成支架，其用来通过互链、非共价相互作用将CDR定位在正确的朝向中。
CDR主要负责结合至抗原的表位。每个链的CDR通常被称为CDR1、CDR2和CDR3，这是从N末端开始依次进行编号，并且也通常由该特定的CDR所位于的链而确定。因此，VH CDR3位于发现其的抗体的重链的可变结构域，而VL CDR1是来自发现其的抗体的轻链的可变结构域的CDR1。结合EGFR的抗体将具有特异性的VH区域和VL区域序列，并因此具有特异性的CDR序列。具有不同的特异性（即对不同抗原的不同结合位点）的抗体具有不同的CDR。虽然抗体与抗体之间不同的是CDR，但是在CDR之内只有数量有限的氨基酸位置直接涉及抗原结合。在CDR之内的这些位置被称为特异性决定残基（SDR）。
如本文使用的，术语“抗原”是指可以被特异性的体液或细胞免疫的产品（例如抗体分子或T细胞受体）特异性地结合的化合物、组合物或物质。抗原可以是任何类型的分子，包括例如半抗原、简单中间代谢物、糖（例如寡糖）、脂质和激素以及大分子（例如复合碳水化合物（例如多糖））、磷脂和蛋白质。常见的抗原的类别包括但不限于病毒抗原、细菌抗原、真菌抗原、原生动物和其他寄生虫抗原、肿瘤抗原、涉及自身免疫性疾病的抗原、过敏和移植物排斥、毒素和其他杂项抗原。
如本文使用的，术语“抗原结合结构域”是指能够特异性地结合至抗原靶标的任何蛋白或多肽结构域。
如本文使用的，术语“嵌合抗原受体”（CAR）是指这样的融合蛋白，其包括能够结合至抗原的细胞外结构域、衍生自与该细胞外结构域衍生自的多肽不同的多肽的跨膜结构域、以及至少一个细胞内结构域。“嵌合抗原受体（CAR）”有时被称为“嵌合受体”、“T-体（T-body）”或“嵌合免疫受体（CIR）”。“能够结合至抗原的细胞外结构域”是指能够结合至某个抗原的任何寡肽或多肽。“细胞内结构域”是指已知用作发送信号来引起细胞内的生物过程的激活或抑制的结构域的任何寡肽或多肽。“跨膜结构域”是指已知跨越细胞膜并且能够作用来连接细胞外结构域和信号传导结构域的任何寡肽或多肽。嵌合抗原受体可以任选地包括“铰链（hinge）结构域”，其用作细胞外结构域和跨膜结构域之间的接头。在本文中公开了编码每个结构域的组分的非限制性的示例性多核苷酸序列，例如：
铰链结构域：IgG1重链铰链序列：CTCGAGCCCAAATCTTGTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCG
跨膜结构域：CD28跨膜区域： TTTTGGGTGCTGGTGGTGGTTGGTGGAGTCCTGGCTTGCTATAGCTTGCTAGTAACAGTGGCCTTTATTATTTTCTGGGTG
细胞内结构域：4-1BB共刺激信号传导区域： AAACGGGGCAGAAAGAAACTCCTGTATATATTCAAACAACCATTTATGAGACCAGTACAAACTACTCAAGAGGAAGATGGCTGTAGCTGCCGATTTCCAGAAGAAGAAGAAGGAGGATGTGAACTG
细胞内结构域：CD28共刺激信号传导区域： AGGAGTAAGAGGAGCAGGCTCCTGCACAGTGACTACATGAACATGACTCCCCGCCGCCCCGGGCCCACCCGCAAGCATTACCAGCCCTATGCCCCACCACGCGACTTCGCAGCCTATCGCTCC
细胞内结构域：CD3ζ信号传导区域： AGAGTGAAGTTCAGCAGGAGCGCAGACGCCCCCGCGTACCAGCAGGGCCAGAACCAGCTCTATAACGAGCTCAATCTAGGACGAAGAGAGGAGTACGATGTTTTGGACAAGAGACGTGGCCGGGACCCTGAGATGGGGGGAAAGCCGAGAAGGAAGAACCCTCAGGAAGGCCTGTACAATGAACTGCAGAAAGATAAGATGGCGGAGGCCTACAGTGAGATTGGGATGAAAGGCGAGCGCCGGAGGGGCAAGGGGCACGATGGCCTTTACCAGGGTCTCAGTACAGCCACCAAGGACACCTACGACGCCCTTCACATGCAGGCCCTGCCCCCTCGCTAA。
每个示例性结构域组分的进一步的实施方式包括与由上述核酸序列编码的蛋白具有至少70%、或替代地至少80%氨基酸序列同一性、优选90%序列同一性、更优选至少95%序列同一性的具有类似的生物功能的其他蛋白。进一步地，在本文中提供了这样的结构域的非限制性例子。
缩写“EGFR”代表表皮生长因子受体。EGFR也被称为ErbB-1和HER1。它是细胞包面受体的表皮生长因子家族的细胞表面受体。术语“EGFR”也表示与该名称相关的特定的蛋白片段，以及与本文公开的EGFR的任何同种型具有至少70%、或替代地至少80%氨基酸序列同一性、优选90%序列同一性、更优选至少95%序列同一性的具有类似的生物功能的任何其他分子。同种型1是规范序列；因此，以下所有位置信息表示以下氨基酸序列。
EGFR同种型1，Uniprot P00533-1：MRPSGTAGAALLALLAALCPASRALEEKKVCQGTSNKLTQLGTFEDHFLSLQRMFNNCEVVLGNLEITYVQRNYDLSFLKTIQEVAGYVLIALNTVERIPLENLQIIRGNMYYENSYALAVLSNYDANKTGLKELPMRNLQEILHGAVRFSNNPALCNVESIQWRDIVSSDFLSNMSMDFQNHLGSCQKCDPSCPNGSCWGAGEENCQKLTKIICAQQCSGRCRGKSPSDCCHNQCAAGCTGPRESDCLVCRKFRDEATCKDTCPPLMLYNPTTYQMDVNPEGKYSFGATCVKKCPRNYVVTDHGSCVRACGADSYEMEEDGVRKCKKCEGPCRKVCNGIGIGEFKDSLSINATNIKHFKNCTSISGDLHILPVAFRGDSFTHTPPLDPQELDILKTVKEITGFLLIQAWPENRTDLHAFENLEIIRGRTKQHGQFSLAVVSLNITSLGLRSLKEISDGDVIISGNKNLCYANTINWKKLFGTSGQKTKIISNRGENSCKATGQVCHALCSPEGCWGPEPRDCVSCRNVSRGRECVDKCNLLEGEPREFVENSECIQCHPECLPQAMNITCTGRGPDNCIQCAHYIDGPHCVKTCPAGVMGENNTLVWKYADAGHVCHLCHPNCTYGCTGPGLEGCPTNGPKIPSIATGMVGALLLLLVVALGIGLFMRRRHIVRKRTLRRLLQERELVEPLTPSGEAPNQALLRILKETEFKKIKVLGSGAFGTVYKGLWIPEGEKVKIPVAIKELREATSPKANKEILDEAYVMASVDNPHVCRLLGICLTSTVQLITQLMPFGCLLDYVREHKDNIGSQYLLNWCVQIAKGMNYLEDRRLVHRDLAARNVLVKTPQHVKITDFGLAKLLGAEEKEYHAEGGKVPIKWMALESILHRIYTHQSDVWSYGVTVWELMTFGSKPYDGIPASEISSILEKGERLPQPPICTIDVYMIMVKCWMIDADSRPKFRELIIEFSKMARDPQRYLVIQGDERMHLPSPTDSNFYRALMDEEDMDDVVDADEYLIPQQGFFSSPSTSRTPLLSSLSATSNNSTVACIDRNGLQSCPIKEDSFLQRYSSDPTGALTEDSIDDTFLPVPEYINQSVPKRPAGSVQNPVYHNQPLNPAPSRDPHYQDPHSTAVGNPEYLNTVQPTCVNSTFDSPAHWAQKGSHQISLDNPDYQQDFFPKEAKPNGIFKGSTAENAEYLRVAPQSSEFIGA。
结合位点包括但不限于745和855位；活性位点包括但不限于837位；并且感兴趣的其他位点包括但不限于1016位。根据以下序列，EGFR同种型2 (Uniprot P00533-2)在404至405位具有FL至LS的取代，并且缺少406位至1210位的区域。EGFR同种型4 (Uniprot P00533-4)在628位具有C至S的取代，并且缺少629位至1210位的区域。EGFR同种型3 (Uniprot P00533-3)从628至705位不同，并且缺少706位至1210位的区域。
EGFR种型3，Uniprot P00533-3： MRPSGTAGAALLALLAALCPASRALEEKKVCQGTSNKLTQLGTFEDHFLSLQRMFNNCEVVLGNLEITYVQRNYDLSFLKTIQEVAGYVLIALNTVERIPLENLQIIRGNMYYENSYALAVLSNYDANKTGLKELPMRNLQEILHGAVRFSNNPALCNVESIQWRDIVSSDFLSNMSMDFQNHLGSCQKCDPSCPNGSCWGAGEENCQKLTKIICAQQCSGRCRGKSPSDCCHNQCAAGCTGPRESDCLVCRKFRDEATCKDTCPPLMLYNPTTYQMDVNPEGKYSFGATCVKKCPRNYVVTDHGSCVRACGADSYEMEEDGVRKCKKCEGPCRKVCNGIGIGEFKDSLSINATNIKHFKNCTSISGDLHILPVAFRGDSFTHTPPLDPQELDILKTVKEITGFLLIQAWPENRTDLHAFENLEIIRGRTKQHGQFSLAVVSLNITSLGLRSLKEISDGDVIISGNKNLCYANTINWKKLFGTSGQKTKIISNRGENSCKATGQVCHALCSPEGCWGPEPRDCVSCRNVSRGRECVDKCNLLEGEPREFVENSECIQCHPECLPQAMNITCTGRGPDNCIQCAHYIDGPHCVKTCPAGVMGENNTLVWKYADAGHVCHLCHPNCTYGPGNESLKAMLFCLFKLSSCNQSNDGSVSHQSGSPAAQESCLGWIPSLLPSEFQLGWGGCSHLHAWPSASVIITASSCH。
EGFRvIII是来自EGFR的突变体，其被报导在相当的比例的患有多形性胶质母细胞瘤（GB）的患者中表达。Gan et al. 205350-5370报导了该突变形式也在其他种类中表达。术语“突变的EGFR”可以表示EGFRvIII，或者与该名称相关的特定的蛋白片段，以及与本文所示的EGFRvIII或本文进一步定义的其等效物具有至少70%、或替代地至少80%氨基酸序列同一性、优选90%序列同一性、更优选至少95%序列同一性的具有类似的生物功能的任何其他分子。
EGFRvIII，Uniprot P00533[30-297]： MRPSGTAGAA LLALLAALCP ASRALEEKKV CQGTSNKLTQ LGTFEDHFLS LQRMFNNCEV VLGNLEITYV QRNYDLSFLK TIQEVAGYVL IALNTVERIPLENLQIIRGN MYYENSYALA VLSNYDANKT GLKELPMRNL QEILHGAVRF SNNPALCNVE SIQWRDIVSS DFLSNMSMDF QNHLGSCQKC DPSCPNGSCWGAGEENCQKL TKIICAQQCS GRCRGKSPSD CCHNQCAAGC TGPRESDCLV CRKFRDEATC KDTCPPLMLY NPTTYQMDVN PEGKYSFGAT CVKKCPRNYV VTDHGSCVRA CGADSYEMEE DGVRKCKKCE GPCRKVCNGI GIGEFKDSLS INATNIKHFK NCTSISGDLH ILPVAFRGDS FTHTPPLDPQ ELDILKTVKE ITGFLLIQAW PENRTDLHAF ENLEIIRGRT KQHGQFSLAV VSLNITSLGL RSLKEISDGD VIISGNKNLC YANTINWKKL FGTSGQKTKI ISNRGENSCK ATGQVCHALC SPEGCWGPEP RDCVSCRNVS RGRECVDKCN LLEGEPREFV ENSECIQCHP ECLPQAMNIT CTGRGPDNCI QCAHYIDGPH CVKTCPAGVM GENNTLVWKY ADAGHVCHLC HPNCTYGCTG PGLEGCPTNG PKIPSIATGM VGALLLLLVV ALGIGLFMRR RHIVRKRTLR RLLQERELVE PLTPSGEAPN QALLRILKET EFKKIKVLGS GAFGTVYKGL WIPEGEKVKI PVAIKELREATSPKANKEIL DEAYVMASVD NPHVCRLLGI CLTSTVQLIT QLMPFGCLLDYVREHKDNIG SQYLLNWCVQ IAKGMNYLED RRLVHRDLAA RNVLVKTPQHVKITDFGLAK LLGAEEKEYH AEGGKVPIKW MALESILHRI YTHQSDVWSYGVTVWELMTF GSKPYDGIPA SEISSILEKG ERLPQPPICT IDVYMIMVKC WMIDADSRPK FRELIIEFSK MARDPQRYLV IQGDERMHLPLMDEEDMDDV VDADEYLIPQ QGFFSSPSTS RTPLLSSLSA TSNNSTVACIDRNGLQSCPI KEDSFLQRYS SDPTGALTED SIDDTFLPVP EYINQSVPKRPAGSVQNPVY HNQPLNPAPS RDPHYQDPHS TAVGNPEYLN TVQPTCVNSTFDSPAHWAQK GSHQISLDNP DYQQDFFPKE AKPNGIFKGS TAENAEYLRVAPQSSEFIGA。
术语“突变的EGFR”也可以指EGFR的任何同种型的自然变体，包括但不限于具有以下突变中的一个或多个的变体：在98位R至Q、在266位P至R、在428位G 至D、在521位R至K、在674位V至I、在709位E至A、在709位E至G、在709位E至K、在719位G至A、在719位G至C、在719位G至D、在719位G至S、在724位G至S、在734位E至K、在746至752位ELREATS至D、在746至751位ELREAT至A、在746至750位的缺失、在746位的缺失、在747至751位的缺失、在747至749位的缺失、在747位L至F、在748位R至P、在752至759位的缺失、在768位S至I、在769位V至M、在787位Q至R、在790位T至M、在833位L至V、在834位V至L、在835位H至L、在838位L至V、在858位L至M、在858位L至R、在861位L至Q、在873位G至E、在962位R至G、在988位H至P、在1034位L至R、在1210位A至V、和/或在所述具体位置中的任何一个的不同的氨基酸取代或缺失。
“组合物”通常是指活性剂（例如化合物或组合物）和天然存在或非天然存在的载体的组合，所述载体是惰性的，例如可检测试剂或标签，或者是活性的，例如佐剂、稀释剂、粘合剂、稳定剂、缓冲剂、盐、亲脂性溶剂、防腐剂、佐剂等，并且包括药学上可接受的载体。载体还包括药物赋形剂和添加剂蛋白质、肽、氨基酸、脂质和碳水化合物（例如糖，包括单糖、二寡糖、三寡糖、四寡糖和寡糖；衍生的糖，例如糖醇、醛糖酸、酯化糖等；以及多糖或糖聚合物），其可以单独地或组合地存在，以重量或体积计单独地或组合地包括1-99.99%。示例性的蛋白赋形剂包括血清白蛋白（例如人血清白蛋白（HSA）、重组人白蛋白（rHA））、明胶、酪蛋白等。还具有缓冲能力的代表性的氨基酸/抗体组分包括丙氨酸、精氨酸、甘氨酸、精氨酸、甜菜碱、组氨酸、谷氨酸、天冬氨酸、半胱氨酸、赖氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、阿斯巴甜等。碳水化合物赋形剂也旨在位于本技术的范围之内，其例子包括但不限于：单糖，例如果糖、麦芽糖、半乳糖、葡萄糖、D-甘露糖、山梨糖等；二糖，例如乳糖、蔗糖、海藻糖、纤维二糖等；多糖，例如棉子糖、松三糖、麦芽糖糊精、葡聚糖、淀粉等；以及糖醇，例如甘露糖醇、木糖醇、麦芽糖醇、乳糖醇、木糖醇山梨醇（葡萄糖醇）和肌醇。
如本文使用的，术语“共有序列（consensus sequence）”是指这样的氨基酸或核苷酸序列，其通过对齐一系列的多个序列而确定，并且定义了代表在所述多个序列的每个对应位置处的氨基酸或碱基的主要选择的理想化序列。根据该系列的多个序列的序列，该系列的共有序列可以与这些序列的每一个有零个、一个、几个、或更多个取代基的不同。并且，根据该系列的多个序列的序列，可以对该系列确定一个以上的共有序列。已经对共有序列的生成进行过深入的数学分析。可以使用各种软件程序来确定共有序列。
如本文使用的，术语“CD8 α铰链结构域”是指与该名称相关的特定的蛋白片段，以及与本文所示的CD8 α铰链结构域序列具有至少70%、或替代地至少80%氨基酸序列同一性、优选90%序列同一性、更优选至少95%序列同一性的具有类似的生物功能的任何其他分子。在Pinto, R.D. et al. (2006) Vet. Immunol. Immunopathol. 110:169-177中提供了人类、小鼠和其他物种的CD8 α铰链结构域的示例性序列。在Pinto, R.D. et al. (2006) Vet. Immunol. Immunopathol. 110:169-177中提供了与CD8 α铰链结构域相关的序列。其非限制性的例子包括：
人类CD8 α铰链结构域， PAKPTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIY 小鼠CD8 α铰链结构域，KVNSTTTKPVLRTPSPVHPTGTSQPQRPEDCRPRGSVKGTGLDFACDIY 猫CD8 α铰链结构域，PVKPTTTPAPRPPTQAPITTSQRVSLRPGTCQPSAGSTVEASGLDLSCDIY。
如本文使用的，术语“CD8 α跨膜结构域”是指与该名称相关的特定的蛋白片段，以及与本文所示的CD8 α跨膜结构域序列具有至少70%、或替代地至少80%氨基酸序列同一性、优选90%序列同一性、更优选至少95%序列同一性的具有类似的生物功能的任何其他分子。与人类T细胞表面糖蛋白CD8α链的183至203位氨基酸（NCBI参考序列：NP_001759.3）、或者小鼠T细胞表面糖蛋白CD8α链的197至217位氨基酸（NCBI参考序列：NP_001074579.1）、以及大鼠T细胞表面糖蛋白CD8α链的190至210位氨基酸（NCBI参考序列：NP_ 113726.1）相关的片段序列，提供了CD8 α跨膜结构域的其他的示例性序列。与列出的NCBI的每一个相关的序列提供如下：
人类CD8 α跨膜结构域：IYIWAPLAGTCGVLLLSLVIT 小鼠CD8 α跨膜结构域：IWAPLAGICVALLLSLIITLI 大鼠CD8 α跨膜结构域：IWAPLAGICAVLLLSLVITLI。
如本文使用的，术语“4-1BB共刺激信号传导区域”是指与该名称相关的特定的蛋白片段，以及与本文所示的4-1BB共刺激信号传导区域序列具有至少70%、或替代地至少80%氨基酸序列同一性、优选90%序列同一性、更优选至少95%序列同一性的具有类似的生物功能的任何其他分子。在美国公开号20130266551A1（作为美国申请号US 13/826,258提交）中提供了4-1BB共刺激信号传导区域的示例性序列。与美国申请号US 13/826,258中公开的相关的4-1BB共刺激信号传导区域的序列提供如下：
4-1BB共刺激信号传导区域： KRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCEL。
如本文使用的，术语“CD28跨膜结构域”是指与该名称相关的特定的蛋白片段，以及与本文所示的CD28跨膜结构域序列具有至少70%、或替代地至少80%氨基酸序列同一性、优选90%序列同一性、更优选至少95%序列同一性的具有类似的生物功能的任何其他分子。与GenBank登录号XM_006712862.2和XM_009444056.1相关的片段序列，提供了CD28跨膜结构域的其他的非限制性的示例性序列。与列出的登录号的每一个相关的序列提供如下本文上述的序列。
如本文使用的，术语“CD28共刺激信号传导区域”是指与该名称相关的特定的蛋白片段，以及与本文所示的CD28共刺激信号传导区域序列具有至少70%、或替代地至少80%氨基酸序列同一性、优选90%序列同一性、更优选至少95%序列同一性的具有类似的生物功能的任何其他分子。CD28共刺激区域包括跨膜结构域和细胞内结构域。在美国专利号5,686,281；Geiger, T. L. et al., Blood 98: 2364-2371 (2001)；Hombach, A. et al., J Immunol 167: 6123-6131 (2001)；Maher, J. et al. Nat Biotechnol 20: 70-75 (2002)；Haynes, N. M. et al., J Immunol 169: 5780-5786 (2002)；Haynes, N. M. et al., Blood 100: 3155-3163 (2002)中提供了示例性的CD28共刺激信号传导区域。非限制性的例子包括以下CD28序列的114-220残基：MLRLLLALNL FPSIQVTGNK ILVKQSPMLV AYDNAVNLSC KYSYNLFSRE FRASLHKGLDSAVEVCVVYG NYSQQLQVYS KTGFNCDGKL GNESVTFYLQ NLYVNQTDIY FCKIEVMYPPPYLDNEKSNG TIIHVKGKHL CPSPLFPGPS KPFWVLVVVG GVLACYSLLVTVAFIIFWVR SKRSRLLHSD YMNMTPRRPG PTRKHYQPYA PPRDFAAYRS；及其等效物。
如本文使用的，术语“ICOS共刺激信号传导区域”是指与该名称相关的特定的蛋白片段，以及与本文所示的ICOS共刺激信号传导区域序列具有至少70%、或替代地至少80%氨基酸序列同一性、优选90%序列同一性、更优选至少95%序列同一性的具有类似的生物功能的任何其他分子。在美国公开号2015/0017141A1中提供了ICOS共刺激信号传导区域的非限制性的示例性序列。示例性的多核苷酸序列提供如下：
ICOS共刺激信号传导区域： acaaaaaaga agtattcatc cagtgtgcac gaccctaacg gtgaatacat gttcatgaga gcagtgaaca cagccaaaaa atccagactc acagatgtga cccta。
如本文使用的，术语“OX40共刺激信号传导区域”是指与该名称相关的特定的蛋白片段，以及与本文所示的OX40共刺激信号传导区域序列具有至少70%、或替代地至少80%氨基酸序列同一性、优选90%序列同一性、更优选至少95%序列同一性的具有类似的生物功能的任何其他分子。在美国公开号2012/20148552A1中公开了OX40共刺激信号传导区域的非限制性的示例性序列，其包括以下提供的示例性序列。
OX40共刺激信号传导区域，SEQ ID NO:72： AGGGACCAG AGGCTGCCCC CCGATGCCCA CAAGCCCCCT GGGGGAGGCA GTTTCCGGAC CCCCATCCAA GAGGAGCAGG CCGACGCCCA CTCCACCCTG GCCAAGATC。
如本文使用的，术语“CD3ζ信号传导结构域”是指与该名称相关的特定的蛋白片段，以及与本文所示的CD3ζ信号传导结构域序列具有至少70%、或替代地至少80%氨基酸序列同一性、优选90%序列同一性、更优选至少95%序列同一性的具有类似的生物功能的任何其他分子。在美国申请号US 13/826,258中提供了CD3ζ信号传导结构域的示例性序列。与CD3ζ信号传导结构域相关的序列列出如下：
RVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR。
如本文使用的，术语“B细胞”是指在适应性免疫系统的体液免疫中的一类淋巴细胞。B细胞主要作用来制造抗体、用作抗原呈递细胞、释放细胞因子、以及在抗原相互作用引起的刺激之后开发记忆B细胞。B细胞与其他淋巴细胞（例如T细胞）的不同点在于细胞表面上存在B细胞受体。B细胞可以是被分离的，也可以从商业上可获得的来源得到。商业上可获得的B细胞系的非限制性例子包括AHH-1 (ATCC® CRL-8146™)、BC-1 (ATCC® CRL-2230™)、BC-2 (ATCC® CRL-2231™)、BC-3 (ATCC® CRL-2277™)、CA46 (ATCC® CRL-1648™)、DG-75 [D.G.-75] (ATCC® CRL-2625™)、DS-1 (ATCC® CRL-11102™)、EB-3 [EB3] (ATCC® CCL-85™)、Z-138 (ATCC #CRL-3001) 、DB (ATCC CRL-2289) 、Toledo (ATCC CRL-2631) 、Pfiffer (ATCC CRL-2632) 、SR (ATCC CRL-2262) 、JM-1 (ATCC CRL-10421) 、NFS-5 C-1 (ATCC CRL-1693)；NFS-70 C10 (ATCC CRL-1694) 、NFS-25 C-3 (ATCC CRL-1695) 、和SUP-B15 (ATCC CRL-1929)细胞系。进一步的例子包括但不限于衍生自间变性和大细胞淋巴瘤的细胞系，例如DEL、DL-40、FE-PD、JB6, Karpas 299、Ki-JK、Mac-2A Ply1、SR-786、SU-DHL-1、-2、-4、-5、-6、-7、-8、-9、-10和-16、DOHH-2、NU-DHL-1、U-937、Granda 519、USC-DHL-1、RL；霍奇金淋巴瘤，例如DEV、HD-70、HDLM-2、HD-MyZ、HKB-1、KM-H2、L 428、L 540、L1236、SBH-1、SUP-HD1、SU/RH-HD-l。这样的商业上可获得的细胞系的非限制性示例性来源包括 American Type Culture Collection或ATCC(www.atcc.org/) 以及German Collection of Microorganisms and Cell Cultures (https://www.dsmz.de/)。
如本文使用的，术语“T细胞”是指在胸腺中成熟的一类淋巴细胞。T细胞在细胞介导的免疫中起重要作用，并且与与其他淋巴细胞（例如B细胞）的不同点在于细胞表面上存在T细胞受体。T细胞可以是被分离的，也可以从商业上可获得的来源得到。“T细胞”包括表达CD3的所有类型的免疫细胞，包括T辅助细胞（CD4+细胞）、细胞毒性T细胞（CD8+细胞）、自然杀伤T细胞、T调节细胞（Treg）和γ-δT细胞。“细胞毒性细胞”包括CD8+ T细胞、自然杀伤（NK）细胞和嗜中性粒细胞，这些细胞能够介导细胞毒性反应。商业上可获得的T细胞系的非限制性例子包括BCL2 (AAA) Jurkat (ATCC® CRL-2902™)、BCL2 (S70A) Jurkat (ATCC® CRL-2900™)、BCL2 (S87A) Jurkat (ATCC® CRL-2901™)、BCL2 Jurkat (ATCC® CRL-2899™)、Neo Jurkat (ATCC® CRL-2898™)、TALL-104细胞毒性人类T细胞系(ATCC # CRL-11386) 细胞系。进一步的例子包括但不限于成熟的T细胞系，例如Deglis、EBT-8、HPB-MLp-W、HUT 78、HUT 102、Karpas 384、Ki 225、My-La、Se-Ax、SKW-3、SMZ-1和T34；以及未成熟的T细胞系，例如ALL-SIL、Be13、CCRF-CEM、CML-T1、DND-41、DU.528、EU-9、HD-Mar、HPB-ALL、H-SB2、HT-1、JK-T1、Jurkat、Karpas 45、KE-37、KOPT-K1、K-T1、L-KAW、Loucy、MAT、MOLT-1、MOLT 3、MOLT-4、MOLT 13、MOLT-16、MT-1、MT-ALL、P12/Ichikawa、Peer、PER0117、PER-255、PF-382、PFI-285、RPMI-8402、ST-4、SUP-T1至T14、TALL-1、TALL-101、TALL-103/2、TALL-104、TALL-105、TALL-106、TALL-107、TALL-197、TK-6、TLBR-1、-2、-3和-4、CCRF-HSB-2 (CCL-120.1)、J.RT3-T3.5 (ATCC TIB-153)、J45.01 (ATCC CRL-1990)、J.CaM1.6 (ATCC CRL-2063)、RS4;11 (ATCC CRL-1873)、CCRF-CEM (ATCC CRM-CCL-119)；以及皮肤T细胞淋巴瘤细胞系，例如HuT78 (ATCC CRM-TIB-161)、MJ[G11] (ATCC CRL-8294)、HuT102 (ATCC TIB-162)。无白血病（Null leukemia）细胞系，包括但不限于REH、NALL-1、KM-3、L92-221，是免疫细胞的另一种商业上可获得的来源，同样的是衍生自其他白血病和淋巴瘤的细胞系，例如K562红白血病、THP-1单核细胞白血病、U937淋巴瘤、HEL红白血病、HL60白血病、HMC-1白血病、KG-1白血病、U266骨髓瘤。这样的商业上可获得的细胞系的非限制性示例性来源包括 American Type Culture Collection或ATCC(www.atcc.org/) 以及German Collection of Microorganisms and Cell Cultures (https://www.dsmz.de/)。
如本文使用的，术语“NK细胞”（也被称为自然杀伤细胞）是指起源于骨髓并且在先天免疫系统中起重要作用的一类淋巴细胞。NK细胞提供针对病毒感染的细胞、肿瘤细胞或其他应激细胞的快速免疫反应，即使是细胞表面上不存在抗体和主要组织相容性复合体。NK-92 (ATCC, CRL-2407)和NKL（被描述于Robertson et al. (1996) 24(3):406-414）是NK细胞的具体例子。NK细胞可以是被分离的，也可以从商业上可获得的来源得到。商业性的NK细胞系的非限制性例子包括NK-92 (ATCC® CRL-2407™)、NK-92MI (ATCC® CRL-2408™)细胞系。进一步的例子包括但不限于HANK1、KHYG-1、NKL、NK-YS、NOI-90和YT NK细胞系。这样的商业上可获得的细胞系的非限制性示例性来源包括 American Type Culture Collection或ATCC(www.atcc.org/) 以及German Collection of Microorganisms and Cell Cultures (https://www.dsmz.de/)。
如本文使用的，术语“核酸序列”和“多核苷酸”被可互换地使用来指任何长度的核苷酸的聚合形式，核糖核苷酸或脱氧核糖核苷酸。因此，该术语包括但不限于单链、双链或多链DNA或RNA、DNA基因组、cDNA、DNA-RNA杂交体、或包含嘌呤和嘧啶碱基或其他天然的、化学的或生物化学修饰的、非天然的或衍生的核苷酸碱基的聚合物。
术语“编码”在被应用至核酸序列时是指，被陈述来“编码”多肽的多核苷酸，以其天然状态或者在通过本领域技术人员熟知的方法操纵时，可以被转录和/或翻译来产生用于该多肽和/或其片段的mRNA。反义链是这样的核酸的补体，并且编码序列可以由此导出。
如本文使用的，术语“信号肽”或“信号多肽”是指通常出现在新合成的分泌或膜多肽或蛋白的N末端的氨基酸序列。它作用来引导多肽跨过或者进入细胞膜，然后随后被移除。其例子在本领域中是已知的。非限制性的例子是在美国专利号. 8,853,381和5,958,736中描述的。
如本文使用的，术语“载体”是指被设计来用于在不同的宿主之间传送的核酸构建体，其包括但不限于质粒、病毒、粘粒、噬菌体、BAC、YAC等。在一些实施方式中，可以从商业上可获得的载体制备质粒载体。在其他实施方式中，可以根据本领域已知的技术从杆状病毒、逆转录病毒、腺病毒、AAV等制造病毒载体。在一个实施方式中，所述病毒载体是慢病毒载体。
如本文使用的，术语“启动子”是指调节编码序列（例如基因）的表达的任何序列。启动子可以例如是组成型的、可诱导的、可抑制的或组织特异性的。“启动子”是这样的控制序列，它是多核苷酸序列的一个区域，在此控制转录的起始和速率。它可以包括遗传性元件，在此调节蛋白和分子可以结合例如RNA聚合酶和其他转录因子。
如本文使用的，术语“分离的细胞”通常是指细胞基本上和组织的其他细胞分离。“免疫细胞”包括例如衍生自在骨髓中产生的造血干细胞（HSC）的白血细胞（白细胞）、淋巴细胞（T细胞、B细胞、自然杀伤（NK）细胞）和骨髓来源的细胞（嗜中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞、单核细胞、巨噬细胞、树突状细胞）。“T细胞”包括表达CD3的所有类型的免疫细胞，包括T辅助细胞（CD4+细胞）、细胞毒性T细胞（CD8+细胞）、自然杀伤T细胞、T调节细胞（Treg）和γ-δT细胞。“细胞毒性细胞”包括CD8+ T细胞、自然杀伤（NK）细胞和嗜中性粒细胞，这些细胞能够介导细胞毒性反应。
如本文使用的，术语“分离的细胞”通常是指细胞基本上和组织的其他细胞分离。该术语包括原核和真核细胞。
“免疫细胞”包括例如衍生自在骨髓中产生的造血干细胞（HSC）的白血细胞（白细胞）、淋巴细胞（T细胞、B细胞、自然杀伤（NK）细胞）和骨髓来源的细胞（嗜中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞、单核细胞、巨噬细胞、树突状细胞）。“T细胞”包括表达CD3的所有类型的免疫细胞，包括T辅助细胞（CD4+细胞）、细胞毒性T细胞（CD8+细胞）、自然杀伤T细胞、T调节细胞（Treg）和γ-δT细胞。“细胞毒性细胞”包括CD8+ T细胞、自然杀伤（NK）细胞和嗜中性粒细胞，这些细胞能够介导细胞毒性反应。
术语“转导”在其被应用至生产嵌合抗原受体细胞时是指，外来核酸序列被引入细胞中的过程。在一些实施方式中，该转导是通过载体完成的。
如本文使用的，术语“自体同源的（autologous）”在涉及细胞时是指，被分离并且被灌注回相同的对象（受体或宿主）的细胞。“同种异体的”是指非自体同源的细胞。
“有效量”是指该量的试剂或合并的量的两种或多种试剂在被施用来治疗哺乳动物或其他个体时，足以影响对疾病的这种治疗。“有效量”将会根据试剂、疾病及其严重程度和要被治疗的对象的年龄、体重等而发生变化。
如本文使用的，术语“癌症”是指涉及异常细胞生长并且有可能侵入或传播到身体的其他部分的一组疾病中的任何一种。癌症可以影响对象的身体的不同部分。癌症的非限制性的例子包括乳腺癌、卵巢癌、白血病、淋巴瘤、胶质母细胞瘤和星形细胞瘤。在一些实施方式中，起源于大脑的癌症和/或在大脑中发生的来自身体的其他部分的癌症的转移，是与本发明相关的。例如，“胶质母细胞瘤”（GB）是由高度恶性的星形胶质细胞引起的肿瘤；人们怀疑，这是因为细胞的快速繁殖和血管生成。“实体肿瘤”是通常不包括囊肿或液体区域的异常的组织块。实体肿瘤可以是良性的或恶性的。不同类型的实体肿瘤以形成它们的细胞的类型命名。实体肿瘤的例子包括肉瘤、癌和淋巴瘤。
如本文使用的，术语“包括”旨在表示组合物和方法包括所述的元素但不排除其他元素。“基本上由……组成”当被用来定义组合物和方法时，应该表示排除对于预期用途的组合来说具有任何实质性作用的其他元素。例如，如本文定义的基本上由该元素组成的组合物，将不会从分离和纯化方法和药学上可接受的载体（例如磷酸盐缓冲盐水、防腐剂等）中排除微量污染物。“由……组成”应该表示排除多于微量元素的其他成分和用于施用本文公开的组合物的实质性方法步骤。通过这些过渡性术语的每一个进行定义的方面都在本发明的范围之内。
如本文使用的，术语“可检测的标记物”是指能够直接或间接制造可检测的信号的至少一个标记物。该标记物的非穷举性的列表包括酶，其例如通过比色、荧光、发光制造可检测的信号，例如辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶、发色团（例如荧光剂、发光染料）、带有通过电子显微镜或通过其电性质（例如电导率、电流分析、伏安法、阻抗）检测的电子密度的基团、可检测的基团，例如其分子具有足够的大小来诱导其物理和/或化学性质上的可检测的修饰，这样的检测可以通过任选的方法完成，例如衍射、表面等离子体共振、表面变化、接触角变化或物理方法（例如原子力谱、隧道效应）、或放射性分子（例如 32 P、35 S或125 I）。
如本发明使用的，术语“纯化标记物”是指可用于纯化或鉴定的至少一个标记物。该标记物的非穷举性的列表包括His、lacZ、GST、麦芽糖结合蛋白、NusA、BCCP、c-myc、CaM、FLAG、GFP、YFP、樱桃、硫氧还蛋白、聚（NANP）、V5，Snap、HA、几丁质结合蛋白、 Softag 1、Softag 3、Strep或S蛋白。合适的直接或间接荧光标记物包括FLAG、GFP、YFP、RFP、dTomato、樱桃、Cy3、Cy 5、Cy 5.5、Cy 7、DNP、AMCA、生物素、地高辛、Tamra、得克萨斯红、罗丹明、Alexa荧光、FITC、TRITC或任何其他荧光染料或半抗原。
如本文使用的，术语“表达”是指多核苷酸被转录成mRNA的过程和/或被转录的mRNA随后被翻译成肽、多肽或蛋白的过程。如果多核苷酸衍生自基因组DNA，则表达可以包括mRNA在真核细胞中的剪接。可以通过测量细胞或组织样品中mRNA或蛋白的量确定基因的表达水平。在一个方面，来自一个样品的基因的表达水平可以直接与来自对照或参照样品的基因的表达水平进行比较。在另一个方面，来自一个样品的基因的表达水平可以在施用化合物之后直接与来自相同样品的该基因的表达水平进行比较。
如本文使用的，当被用在两个或更多个核酸或多肽序列的内容中时，“同源性”或“相同的”、“同一性”或“相似性”百分比是指，两个或更多个序列或子序列是相同的，或者在特定的区域（例如编码本文所述的抗体的核苷酸序列或本文所述的抗体的氨基酸序列）上特定百分比的核苷酸或氨基酸残基是相同的，例如至少60%同一性、优选地至少65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更高的同一性。可以通过比较为了进行比较而被对齐的每个序列中的位置，确定同源性。当被比较的序列中的位置被相同的碱基或氨基酸占据时，则这些分子在该位置是同源的。序列之间的同源性的程度是这些序列享有的匹配的或同源的位置的数目的函数。可以使用本领域已知的软件程序来确定对齐和同源性或序列同一性百分比，例如在Current Protocols in Molecular Biology (Ausubel et al., eds. 1987) Supplement 30, section 7.7.18, Table 7.7.1中描述的软件程序。优选地，使用默认参数进行对齐。优选的对齐程序是BLAST，使用默认参数。特别地，优选的程序是BLASTN和BLASTP，使用以下默认参数：遗传密码=标准；筛选=无；链=两个；截点=60；预期=10；矩阵=BLOSUM62；描述=50个序列；排序= HIGH SCORE；数据库=不重复的，GenBank + EMBL + DDBJ + PDB + GenBank CDS translations + SwissProtein + SPupdate + PIR。这些程序的详情可以在以下网址找到：ncbi.nlm.nih.gov/cgi-bin/BLAST。术语“同源性”或“相同的”、“同一性”或“相似性”百分比还表示、或者可以被应用至测试序列的补体。所述术语还包括具有缺失和/或添加、以及具有取代基的序列。如本文描述的，优选的算法可以解释间隙等。优选地，在长度至少为约25个氨基酸或核苷酸的区域上、或者更优选地在长度至少为50-100个氨基酸或核苷酸的区域上存在同一性。“不相关的”或“非同源的”序列与本文公开的序列中的一个享有少于40%的同一性、或者替代地少于25%的同一性。
短语“一线”或“二线”或“三线”是指患者接受的治疗的顺序。一线治疗方案是首先给出的治疗，而二线或三线疗法是分别在一线疗法之后或在二线疗法之后给出的。美国国家癌症研究所将一线疗法定义为“用于疾病或病症的第一治疗”。在患有癌症的患者中，主要的治疗可以是手术、化疗、放射治疗或这些疗法的组合。一线疗法还被本领域技术人员称为“主要疗法和主要治疗”。参见美国国家癌症研究所的网站www.cancer.gov，最后一次访问是在2008年5月1日。通常，患者被给予后续的化疗方案，因为患者对一线疗法没有显示出阳性的临床或亚临床反应，或者一线疗法已经停止。
在一个方面，术语抗体的“等效物”或“生物等效物”表示抗体如通过ELISA或其他合适的方法测定地选择性地结合其表位蛋白或其片段的能力。生物等效的抗体包括但不限于与参照抗体结合至相同的表位的抗体、肽、抗体片段、抗体变体、抗体衍生物和抗体模拟物。
在没有明确描述的情况下应该推断、并且除非另有说明，否则当本技术涉及多肽、蛋白、多核苷酸或抗体时，这样的等效物或生物等效物旨在落入本技术的范围之内。如本文使用的，在指示蛋白、抗体、多肽或核苷酸时，术语“其生物等效物”旨在与“其等效物”是同义的，是指具有最小的同源性，同时仍然保持期望的结构或功能。除非本文具体说明，否则可以预期的是，本文提及的任何多核苷酸、多肽或蛋白还包括其等效物。例如，等效物是指与参照蛋白、多肽或核苷酸具有至少约70%同源性或同一性、或至少80%同源性或同一性和替代地、或至少约85%、或替代地至少约90%、或替代地至少约95%、或替代地98%百分比同源性或同一性并且表现出基本上等效的生物活性。替代地，当指示多核苷酸时，其等效物是在严格条件下与参照多核苷酸或其补体（complement）杂交的多核苷酸。
多核苷酸或多核苷酸区域（或多肽或多肽区域）与另一个序列具有一定百分比（例如80%、85%、90%或95%）的“序列同一性”是指，当被对齐时，该百分比的碱基（或氨基酸）在两个序列的比较中是相同的。可以使用本领域已知的软件程序来确定对齐和同源性或序列同一性百分比，例如在Current Protocols in Molecular Biology (Ausubel et al., eds. 1987) Supplement 30, section 7.7.18, Table 7.7.1中描述的软件程序。优选地，使用默认参数进行对齐。优选的对齐程序是BLAST，使用默认参数。特别地，优选的程序是BLASTN和BLASTP，使用以下默认参数：遗传密码=标准；筛选=无；链=两个；截点=60；预期=10；矩阵=BLOSUM62；描述=50个序列；排序= HIGH SCORE；数据库=不重复的，GenBank + EMBL + DDBJ + PDB + GenBank CDS translations + SwissProtein + SPupdate + PIR。这些程序的详情可以在以下网址找到：ncbi.nlm.nih.gov/cgi-bin/BLAST。
“杂交”是指其中一个或多个多核苷酸反应来形成复合物，并且该复合物通过核苷酸残基的碱基之间的氢键结合而被稳定的反应。可以通过Watson-Crick碱基配对、Hoogstein结合或通过任何其他序列特异性的方式来发生氢键结合。所述复合物可以包括形成双螺旋结构的两条链、形成多链复合物的三条或更多条链、单一的自我杂交的链、或这些的任何组合。杂交反应可以由在更广泛的过程中的步骤组成，例如PCR过程的起始步骤、或者通过核酶进行的多核苷酸的酶裂解步骤。
严格杂交条件的例子包括：约25°C至约37°C的孵育温度；约6x SSC至约10x SSC的杂交缓冲液浓度；约0%至约25%的甲酰胺浓度；以及约4x SSC至约8x SSC的洗涤溶液。中度杂交条件的例子包括：约40°C至约50°C的孵育温度；约9x SSC至约2x SSC的缓冲液浓度；约30%至约50%的甲酰胺浓度；以及约5x SSC至约2x SSC的洗涤溶液。高严格杂交条件的例子包括：约55°C至约68°C的孵育温度；约1x SSC至约0.1x SSC的缓冲液浓度；约55%至约75%的甲酰胺浓度；以及约1x SSC至约0.1x SSC的洗涤溶液、或去离子水。一般来说，杂交孵育时间为5分钟至24小时，具有1、2、或更多个洗涤步骤，并且洗涤孵育时间为约1、2或15分钟。SSC是0.15 M NaCl和15 mM柠檬酸缓冲液。应该理解的是，可以采用使用其他缓冲系统的SSC的等效物。
“与肿瘤组织类型对应的正常细胞”是指来自与肿瘤组织相同的组织类型的正常细胞。非限制性例子是来自患有肺肿瘤的患者的正常肺细胞、或者来自患有结肠肿瘤的患者的正常结肠细胞。
如本文使用的，术语“分离的”是指，分子或生物体或细胞材料基本上不含其他材料。在一个方面，术语“分离的”是指，核酸（例如DNA或RNA）或蛋白或多肽（例如抗体或其衍生物）或细胞或细胞器、或组织或器官与存在于自然来源中的其他DNA或RNA、或蛋白或多肽、或细胞或细胞器、或组织或器官分离。术语“分离的”还指，核酸或肽基本上不含细胞材料、病毒材料、或培养基（当通过重组DNA技术生产时）、或化学前体或其他化学品（当化学合成时）。再者，“分离的核酸”旨在包括天然地不形成为片段并且不会在天然状态下发现的核酸片段。术语“分离的”在本文中还被用来指从其他细胞蛋白分离的多肽，并且旨在包括纯化的和重组的多肽。术语“分离的”在本文中还被用来指从其他细胞分离的细胞或组织，并且旨在包括培养的和工程化的细胞或组织。
如本文使用的，术语“单克隆抗体”是指，通过B淋巴细胞的单一克隆制造的抗体，或者通过其中已经转染了单一抗体的轻链和重链基因的细胞制造的抗体。单克隆抗体是通过本领域技术人员已知的方法制造的，例如通过由骨髓瘤细胞与免疫脾细胞的融合而制造杂交抗体形成细胞。单克隆抗体包括人源化单克隆抗体。
术语“蛋白”、“肽”和“多肽”被可互换地使用，并且以其最广泛的意义来指两个或更多个氨基酸、氨基酸类似物或肽模拟物子单元的化合物。所述子单元可以通过肽键而被连接。在另一个方面，所述子单元可以通过其他键（例如酯键、醚键等）而被连接。蛋白或肽必须包括至少两个氨基酸，并且对于可以组成蛋白或肽的序列的氨基酸的最大数目没有限制。如本文使用的，术语“氨基酸”是指天然的和/或非天然的或合成的氨基酸，包括甘氨酸以及D和L光学异构体、氨基酸类似物和肽模拟物。
术语“多核苷酸”和“寡核苷酸”被可互换地使用，并且是指任何长度的核苷酸的聚合形式，是脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸及其类似物。多核苷酸可以具有任意的三维结构并且可以进行已知或未知的任何作用。以下是多核苷酸的非限制性例子：基因或基因片段（例如探针、引物、EST或SAGE标签）、外显子、内含子、信使RNA（mRNA）、转移RNA、核糖体RNA、RNAi、核酶、cDNA、重组多核苷酸、支链多核苷酸、质粒、载体、分离的任何序列的DNA、分离的任何序列的RNA、核酸探针和引物。多核苷酸可以包括经修饰的核苷酸，例如甲基化核苷酸和核苷酸类似物。如果存在，则对核苷酸结构的修饰可以被施加在多核苷酸的组装之前或之前。核苷酸的序列可以被非核苷酸组分打断。多核苷酸可以在聚合之后被进一步修饰，例如与标签组分偶联。该术语还指双链分子和单链分子。除非另有说明或者需要，否则本技术的涉及多核苷酸任何方面都包括双链形式以及已知或预测形成双链形式的两个互补的单链形式中的每一个。
如本文使用的，术语“纯化的”不要求绝对的纯度；相反，它旨在作为相对性的的术语。因此，例如，纯化的核酸、肽、蛋白、生物复合物或其他活性化合物是整体地或部分地与蛋白或其他污染物分离的。通常，用于在本发明中使用的基本上纯化的肽、蛋白、生物复合物或其他活性化合物，在该肽、蛋白、生物复合物或其他活性化合物与药物载体、赋形剂、缓冲剂、吸收促进剂、稳定剂、防腐剂、佐剂或其它辅助成分在用于治疗性给药的完整的药物制剂中混合或制备之前，包括多于80%的存在于制剂中的所有大分子物种。更一般地，在与其他制剂成分混合之前，所述肽、蛋白、生物复合物或其他活性化合物被纯化，以代表大于90%、通常大于95%的存在于纯化制剂中的所有大分子物种。在其他情况中，纯化制剂可以是基本上均质的，其中其他大分子物种不能通过常规技术而被检测到。
如本文使用的，术语“特异性结合”是指抗体和抗原之间的接触具有的结合亲和力为至少10−6 M。在一些方面，抗体结合具有的亲和力为至少约10−7 M，并且优选10−8 M、10−9 M、10−10 M、10−11 M或10−12 M。
如本文使用的，术语“重组蛋白”是指通过重组DNA技术制造的多肽，其中通常编码该多肽的DNA被插入进合适的表达载体，该表达载体被用来转化宿主细胞以产生异源蛋白。
如本文使用的，“治疗”在对象中的疾病是指（1）防止症状或疾病在预先有倾向的或尚未显示疾病症状的对象中发生；（2）抑制疾病或阻止其发展；或者（3）改善或消退疾病或疾病的症状。如本领域中理解的，“治疗”是用于获得有益的或期望的结果（包括临床结果）的方法。对于本技术的目的，有益的或期望的结果可以包括但不限于以下中的一种或多种：一个或多个症状的缓解或改善，病症（包括疾病）的程度的降低，病症（包括疾病）的稳定化（即不恶化）状态，病症（包括疾病）的延迟或减缓，病症（包括疾病）、状态和缓解（无论是部分还是全部）的进展、改善或缓解，无论是可检测的还是不可检测的。
如本文使用的，术语“过度表达”是指细胞、组织、或器官表达蛋白的量大于在对照细胞、对照组织、或器官中生产的量。过度表达的蛋白可以对于宿主细胞来说是内源性的或者对于宿主细胞来说是外源性的。
如本文使用的，术语“接头序列”是指任何这样的氨基酸序列，其包括可以被重复1至10、或替代地至约8、或替代地至约6、或替代地约5、或4或替代地3、或替代地2次的1至10个、或替代地8个氨基酸、或替代地6个氨基酸、或替代地5个氨基酸。接头序列的非限制性的例子在本领域中是已知的，例如GGGGSGGGGSGGGG；EFM三肽；或Glu-Phe-Gly-Ala-Gly-Leu-Val-Leu-Gly-Gly-Gln-Phe-Met。
如本文使用的，术语“增强子”是指不管其相对于要被表达的氨基酸序列的位置和朝向，都增强、改善或改良氨基酸序列的转录的序列元件。增强子可以增强来自单个启动子的转录，或者同时增强来自一个以上的启动子的转录。只要保留或基本上保留该改善转录的功能（例如至少70%、至少80%、至少90%或至少95%的野生型活性，即全长序列的活性），则野生型增强子序列的任何截断的、突变的或修饰的变体都同样在上述定义之内。
如本文使用的，术语“WPRE”或“土拨鼠肝炎病毒（WHP）转录后调控元件”是指与该名称相关的特定的核苷酸片段，以及与本文所示的WPRE序列具有至少70%、或替代地至少80%氨基酸序列同一性、优选90%序列同一性、更优选至少95%序列同一性的具有类似的生物功能的任何其他分子。例如，WPRE是指在土拨鼠肝炎病毒基因组序列（GenBank登录号J04514）中出现的类似于人类乙型肝炎病毒转录后调控元件（HBVPRE）的区域，并且该基因组序列的1093位至1684位的592个核苷酸对应于转录后调控区域（Journal of Virology, Vol. 72, p.5085-5092, 1998）。使用逆转录病毒载体的分析显示，被插入至感兴趣的基因的3'末端未翻译区域的WPRE提高了产生的蛋白的量5至8倍。还被报道的是，WPRE的引入抑制了mRNA降解（Journal of Virology, Vol. 73, p.2886-2892, 1999）。在广义上，例如WPRE的通过使mRNA稳定而提高氨基酸翻译的效率的元件也被认为是增强子。
被用来指示病毒的术语“溶瘤性”是指病毒优先感染和杀死癌细胞。“疱疹病毒”是指herpesviridae家族中的任何成员，包括但不限于单纯疱疹病毒（例如HSV-1 和HSV-2）。在本文中描述了非限制性的示例性溶瘤性疱疹病毒及其用途。例如，在临床试验中已经测试了G207、HSV1716、NV1020、Talimogene laherparvec（“T-VEC” 或“Oncovex-GMCSF”）。参见Varghese et al. (2002) Cancer Gene Therapy. 9(12):967-978。
缩写列表
CAR：嵌合抗原受体
IRES：内部核糖体进入位点
MFI：平均荧光强度
MOI：感染复数
PBMC：外周血单核细胞
PBS：磷酸盐缓冲溶液
scFv：单链可变片段
GB：胶质母细胞瘤
BCBM：乳腺癌脑转移瘤
oHSV：溶瘤性单纯疱疹病毒。
实施本发明的模型
嵌合抗原受体及其用途
组合物
本发明提供了结合至野生型和/或突变的EGFR的嵌合抗原受体（CAR），其包括细胞外和细胞内结构域、或基本上由其组成。所述细胞外结构域包括靶标特异性结合元件，或者被称为抗原结合结构域。所述细胞内结构域或细胞质结构域包括共刺激信号传导区域和ζ链部分。所述CAR任选地进一步包括多达300个氨基酸、优选地10至100个氨基酸、更优选地25至50个氨基酸的隔离结构域。在一个方面，本发明提供了一种嵌合抗原受体（CAR），其包括、或替代地基本上由其组成、或进一步地由其组成：（a）识别野生型和/或突变的表皮生长因子受体（EGFR）（“wtEGFR和/或突变的EGFR”）之一或两者的抗EGFR抗体的抗原结合结构域；（b）铰链结构域多肽；（c）共刺激分子或多肽；和（d）CD3ζ信号传导结构域。
抗原结合结构域。在一些方面，本发明提供了一种CAR，其包括对野生型和/或突变的EGFR特异的抗原结合结构域、或替代地基本上由其组成、或进一步地由其组成。在一个方面，所述突变的EGFR是EGFRvIII。在一些实施方式中，所述抗原结合结构域包括野生型和/或突变的EGFR抗体的抗原结合结构域、或替代地基本上由其组成、或进一步地由其组成。在进一步的实施方式中，所述抗原结合结构域包括抗EGFR抗体的重链可变区域或轻链可变区域、或替代地基本上由其组成、或进一步地由其组成，所述抗EGFR抗体反过来包括所述抗原结合结构域、或替代地基本上由其组成、或进一步地由其组成。抗EGFR抗体的重链和轻链可变区域在本领域中是已知的并且如上所述。
在一些实施方式中，所述抗体的重链可变区域包括、或替代地基本上由其组成、或进一步地由其组成：
Q V Q L Q Q S G S E M A R P G A S V K L P C K A S G D T F T S Y W M H W V K Q R H G H G P E W I G N I Y P G S G G T N Y A E K F K N K V T L T V D R S S R T V Y M H L S R L T S E D S A V Y Y C T R S G G P Y F F D Y W G Q G T T L T V S S、或其等效物、或者由以下多肽编码的多核苷酸： gacattctaatgacccaatctccactctccctgcctgtcagtcttggagatcaagcctcctacctgcaaaggccaggccagtctccaaagctcctgatctacaaagtttccgaccgattttacctgcaaaggccaggccagtctccaaagctcctgatctacaaagtttccgaccgattttctggggtcccagacaggttcagtggcagtggatcagggacagatttcacactcaagatcagcagagtagaggctgaggatctgggaatttattactgctttcaaggttcacatattcctcccacgttcggaggggggaccaagctggaaatcaaacgtgcggcc、或其等效物。
所述多肽或其等效物可以被跟随有在羧基末端的另外50个氨基酸、或替代地约40个氨基酸、或替代地约30个氨基酸、或替代地约20个氨基酸、或替代地约10个氨基酸、或替代地约5个氨基酸、或替代地约4、或3、或2或1个氨基酸。
在其他方面，所述LC可变区域包括、或替代地基本上由其组成、或进一步地由其组成：
D I L M T Q S P L S L P V S L G D Q A S I S C R S S Q N I V H N N G I T Y L E W Y L Q R P G Q S P K L L I Y K V S D R F S G V P D R F S G S G S G T D F T L K I S R V E A E D L G I Y Y C F Q G S H I P P T F G G G T K L E I K R A A、或其等效物、或者由以下多核苷酸编码的多肽： caggtccagctgcagcagtctgggtctgagatggcgaggcctggagcttcagtgaagctgccctgcaaggcttctggcgacacattcaccagttactggatgcactgggtgaagcagaggcatggacatggccctgagtggatcggaaatatttatccaggtagtggtggtactaactacgctgagaagttcaagaacaaggtcactctgactgtagacaggtcctcccgcacagtctacatgcacctcagcaggctgacatctgaggactctgcggtctattattgtacaagatcggggggtccctacttctttgactactggggccaaggcaccactctcacagtctcctcc、或其等效物。
所述多肽或其等效物可以被跟随有在羧基末端的另外50个氨基酸、或替代地约40个氨基酸、或替代地约30个氨基酸、或替代地约20个氨基酸、或替代地约10个氨基酸、或替代地约5个氨基酸、或替代地约4、或3、或2或1个氨基酸。
其等效物包括与由在高度严格条件下与编码所述CAR的多核苷酸的补体杂交的多核苷酸编码的CAR或多肽具有至少80%的氨基酸同一性的多肽，其中所述高度严格条件包括：约55°C至约68°C的培养温度；约1x SSC至约0.1x SSC的缓冲液浓度；约55%至约75%的甲酰胺浓度；以及约1x SSC、0.1x SSC、或去离子水的洗涤溶液。
替代的实施方式包括来自LC可变区域的CDR（例如CDR1、CDR2、CDR3）中的一个或多个以及来自其他EGFR抗体CDR的合适的CDR，以及其每个的等效物。因此，作为例子，来自LC可变区域的CDR1和CDR2可以与另一个抗EGFR抗体的LC可变区域的CDR3联合，并且在一些方面，可以包括在羧基末端的另外50个氨基酸、或替代地约40个氨基酸、或替代地约30个氨基酸、或替代地约20个氨基酸、或替代地约10个氨基酸、或替代地约5个氨基酸、或替代地约4、或3、或2或1个氨基酸。
跨膜结构域。跨膜结构域可以衍生自天然的或合成的来源。在所述来源是天然的情况中，所述结构域可以衍生自任何膜结合或者跨膜蛋白。具有在本发明中的特定用途的跨膜区域可以衍生自CD8、CD28、CD3、CD45、CD4、CD5、CDS、CD9、CD 16、CD22、CD33、CD37、CD64、CD80、CD86、CD 134、CD137、CD 154、TCR。替代地所述跨膜结构域可以是合成的，在该情况中它将主要包括疏水残基，例如亮氨酸和缬氨酸。优选地，在合成的跨膜结构域的每个末端将会发现苯丙氨酸、色氨酸和缬氨酸的三联体。任选地，短的寡肽或多肽接头（优选长度为2至10个氨基酸）可以形成CAR的跨膜结构域和细胞质信号传导结构域之间的连接。甘氨酸-丝氨酸二联体提供了特别合适的接头。在一个方面，所述跨膜结构域是CD28跨膜结构域，上文描述了其非限制性例子。在另一个方面，所述跨膜结构域是被连接至CD8α铰链结构域的CD28跨膜结构域。
细胞质结构域。CAR的细胞质结构域（胞质域）或细胞内信号传导结构域负责在其中置有CAR的免疫细胞的传统效应器功能中的至少一个的激活。细胞内信号传导结构域是指蛋白的转导效应器功能信号并引导免疫细胞来进行其特异性功能的一部分。可以使用整个信号传导结构域或其截断的部分，只要该截断的部分足够来转导效应器功能信号。TCR和共受体的细胞质序列以及其衍生物或变体能够作用为细胞内信号传导结构域以在CAR中使用。具有在本发明中的特定用途的细胞内信号传导结构域可以衍生自CD8α、CD28、FcR、TCR、CD3、CDS、CD22、CD79a、CD79b、CD66d。因为通过TCR产生的信号单独不足以进行T细胞的完全激活，所以还可能需要二级或共刺激信号。因此，共刺激信号传导分子的细胞内区域包括但不限于CD8α、CD27、CD28、4- IBB (CD 137)、OX40、CD30、CD40、PD- 1、ICOS、淋巴细胞功能相关的抗原- 1 (LFA-1 )、CD2、CD7、LIGHT、NKG2C、B7-H3、或特异性地与CD83结合的配体也可以被包括在CAR的细胞质结构域中。在一个方面，所述细胞内结构域是CD28细胞内结构域。在另一个方面，它是CD8α细胞内结构域。
在一些实施方式中，嵌合抗原受体的细胞激活部分是T细胞信号传导结构域，其包括以下中的一个或多个蛋白或其片段、或替代地基本上由其组成、或进一步地由其组成：CD8蛋白、CD28蛋白、4-1BB蛋白、和CD3-ζ蛋白。
在具体的实施方式中，所述CAR包括、或替代地基本上由其组成、或进一步地由其组成：结合EGFR和突变的EGFR的抗体的抗原结合结构域、铰链结构域、共刺激信号传导区域、以及CD3ζ信号传导结构域。在进一步的实施方式中，所述共刺激信号传导区域包括CD28共刺激信号传导区域和/或4-1BB共刺激信号传导区域中的一个或两个。所述CAR可以进一步包括信号多肽。
在一些实施方式中，所述CAR可以进一步包括可检测的标记物或纯化标记物。
本发明还提供了一种分离的复合物，其包括所述EGFR CAR和EGFR蛋白或其片段和/或突变的EGFR蛋白或其片段。本发明进一步提供了一种分离的复合物，其包括本文所述的CAR和表达wt EGFR和/或突变的EGFR的细胞。
多核苷酸和宿主细胞
本发明还提供了编码上述EGFR CAR的分离的核酸和这些序列的补体。所述核算可以是DNA、RNA或被修饰的核酸。所述核酸可以被结合进载体，例如质粒或病毒载体，例如慢病毒载体、腺病毒载体、或腺相关病毒载体。在一个方面，所述载体是pCDH载体。
本发明还提供了分离的宿主细胞（原核或真核细胞），其包括本文所述的EGFR CAR或编码所述CAR的多核苷酸或其补体或包括所述多核苷酸或其补体的载体。原核细胞的非限制性的例子包括细菌，例如大肠杆菌。真核细胞的非限制性的例子包括T细胞、NK细胞、干细胞、293 T细胞、NK-92细胞和NKL细胞。所述细胞可以来自任何物种，例如动物、哺乳动物、人、鼠、马、牛、猫或犬。所述细胞可以被分离自要被治疗的患者。它们因此可以是自体同源的或同种异体的。可以诊断地或治疗地使用被转化的分离的细胞。
所述分离的核酸可以进一步包括可检测的标记物或纯化标记物。所述核酸可以与载体组合在一起，所述载体例如是固体支撑物或药学上可接受的载体。它们可用来制备本文所述的CAR。
用于制备CAR的方法
本发明的方面涉及包括EGFR CAR的分离的细胞以及制备这样的细胞的方法。所述细胞是原核或真核细胞。在一个方面，所述细胞是T细胞或NK细胞。所述真核细胞可以来源于任何优选的物种，例如动物细胞、哺乳动物细胞，例如人类、猫或犬科动物细胞。
在具体的实施方式中，所述分离的细胞包括外源性CAR、或替代地基本上由其组成、或进一步地由其组成，所述CAR包括、或替代地基本上由其组成、或进一步地由其组成：特异性地识别野生型EGFR和/或突变的EGFR的抗体的抗原结合结构域、铰链结构域、共刺激分子（例如CD28共刺激信号传导区域和/或4-1BB共刺激信号传导区域）、以及CD3ζ信号传导结构域。在一些实施方式中，所述分离的细胞是T细胞，例如动物T细胞、哺乳动物T细胞、猫T细胞、犬T细胞或人T细胞。在一些实施方式中，所述分离的细胞是NK细胞，例如动物NK细胞、哺乳动物NK细胞、猫NK细胞、犬NK细胞或人NK细胞。
在一些实施方式中，公开了生产表达EGFR CAR的细胞的方法，所述方法包括、或替代地基本上由其组成：（i）使用编码所述抗EGFR CAR的核酸序列转导细胞或分离的细胞的群体。可以使用本文描述的病毒载体，或者使用在Riet, et al. (2103) Meth. Mol. Biol. 969:187-201的标题为《非病毒RNA转染以使用嵌合抗原受体瞬时修饰T细胞以用于过继疗法》中描述的技术，转染所述细胞。在进一步的方面，所述方法进一步包括：通过选择表达EGFR结合结构域的细胞，选择表达CAR的细胞。可以通过使用抗EGFR抗体来选择性地识别和结合在细胞的表面上表达的EGFR结合结构域，从而完成选择。在一些实施方式中，所述分离的细胞是T细胞，例如动物T细胞、哺乳动物T细胞、猫T细胞、犬T细胞或人T细胞，从而生产EGFR CAR T细胞。在一些实施方式中，所述分离的细胞是NK细胞，例如动物NK细胞、哺乳动物NK细胞、猫NK细胞、犬NK细胞或人NK细胞，从而生产EGFR CAR NK细胞。
T细胞或NK细胞的来源。在本发明的T细胞的扩增和遗传修饰之前，可以从对象或培养物获得T细胞的来源。T细胞可以获得自对象中的许多来源，包括外周血单核细胞、骨髓、淋巴结组织、脐带血、胸腺组织、来自感染位点的组织、腹水、胸腔积液、脾组织和肿瘤。
分离相关细胞的方法在本领域中是熟知的并且可以容易地适用至本申请；在以下例子中描述了示例性的方法。用于与本发明相关的用途的分离方法包括但不限于Life Technologies Dynabeads®系统；STEMcell Technologies EasySep™、RoboSep™、RosetteSep™、SepMate™；Miltenyi Biotec MACS™细胞分离试剂盒、以及其他商业上可获得的细胞分离和分隔试剂盒。可以通过使用在对独特的细胞表面标记物特异的这样的试剂盒中可用的珠粒或其他结合试剂，分离免疫细胞的特定的亚群体。例如，MACS™ CD4+和CD8+ MicroBeads可以被用来分离CD4+和CD8+ T细胞。
替代地，细胞可以通过商业上可用的细胞培养物而获得，其包括但不限于：对T细胞，BCL2 (AAA) Jurkat (ATCC® CRL-2902™)、BCL2 (S70A) Jurkat (ATCC® CRL-2900™)、BCL2 (S87A) Jurkat (ATCC® CRL-2901™)、BCL2 Jurkat (ATCC® CRL-2899™)、Neo Jurkat (ATCC® CRL-2898™)细胞系；以及对于NK细胞，NK-92 (ATCC® CRL-2407™)、NK-92MI (ATCC® CRL-2408™)细胞系。
载体。可以使用载体制备CAR。在以下例子中详细地讨论了使用所述载体来制备示例性的载体和生产表达CAR的细胞。总的来说，通常通过将编码CAR多肽或其部分的核酸可操作地连接至启动子，并且将构建体结合进表达载体，实现编码CAR的天然的或合成的核酸的表达。所述载体可以适于复制和整合真核生物。
用于生产包括载体和/或外源性核酸的细胞的方法在本领域中是熟知的。参见例如Sambrook et al. (2001 , Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, New York)。不管被用来将外源性核酸引入宿主细胞或将细胞暴露至本发明的抑制剂的方法如何，为了确认重组DNA序列在宿主细胞中的存在，可以进行多种测试。这样的测试包括：例如本领域技术人员熟知的“分子生物学”测定，例如Southern和Northern印迹、RT-PCR和PCR；“生物化学”测定，例如检测特定的肽是否存在，例如通过免疫学手段（ELlSA和蛋白质印迹）或者通过本文描述的测试来识别落入本发明的范围之内的试剂。
在一些实施方式中，所述分离的核酸序列编码CAR，其包括、或替代地基本上由其组成、或进一步地由其组成：识别野生型和突变的EGFR之一或两者的抗EGFR抗体的抗原结合结构域、CD28共刺激信号传导区域和/或4-1BB共刺激信号传导区域、以及CD3ζ信号传导结构域。在具体的实施方式中，所述分离的核酸序列包括编码以下的序列、或替代地基本上由其组成、或进一步地由其组成：抗EGFR抗体的抗原结合结构域、随后的铰链结构域、CD28共刺激信号传导区域和/或4-1BB共刺激信号传导区域、随后的CD3ζ信号传导结构域。在进一步的方面，所述抗原结合结构域包括HC可变区域和LC可变区域，它们任选地通过接头多肽而被连接。
在一些实施方式中，所述分离的核酸包括赋予抗生素耐药性的多核苷酸。
在一些实施方式中，所述分离的核酸序列被包括在载体中。在一些实施方式中，所述载体是质粒。在其他实施方式中，所述载体是病毒载体。在具体的实施方式中，所述载体是慢病毒载体。
在以下例子中详细地讨论了使用所述载体来制备示例性的载体和生产表达CAR的细胞。总的来说，通常通过将编码CAR多肽或其部分的核酸可操作地连接至启动子，并且将构建体结合进表达载体，实现编码CAR的天然的或合成的核酸的表达。所述载体可以适于复制和整合真核生物。用于生产包括载体和/或外源性核酸的细胞的方法在本领域中是熟知的。参见例如Sambrook et al. (2001, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, New York)。
在一个方面，术语“载体”是指这样的重组载体，其保留了感染和转导不分裂和/或缓慢分裂的细胞并整合到靶细胞的基因组中的能力。在一些方面，所述载体衍生自或者基于野生型病毒。在进一步的方面。所述载体衍生自或者基于野生型慢病毒。这样的例子包括但不限于人类免疫缺陷病毒（HIV）、马传染性贫血病毒（EIAV）、猿猴免疫缺陷病毒（SIV）和猫免疫缺陷病毒（FIV）。替代地，应该理解的是，其他逆转录病毒可以被用作载体骨架的基础，例如鼠白血病病毒（MLV）。很明显，根据本发明的病毒载体不必被局限于特定病毒的组件。所述病毒载体可以包括衍生自两种或更多种不同病毒的组件，并且还可以包括合成的组件。载体组件可以被操纵来获得所需的特性，例如靶细胞特异性。
本发明的重组载体衍生自灵长类和非灵长类。灵长类慢病毒的例子包括人类免疫缺陷病毒（HIV）、人类获得性免疫缺陷综合征（AIDS）的致病因子、以及猿猴免疫缺陷病毒（SIV）。非灵长类慢病毒群组包括 “慢病毒”原型visna/maedi病毒（VMV）、以及相关的山羊关节炎脑炎病毒（CAEV）、马传染性贫血病毒（EIAV）和更近期地被描述的猫免疫缺陷病毒（FIV）和牛免疫缺陷病毒（BIV）。现有技术的重组慢病毒载体在本领域中是已知的，例如参见美国专利号6,924,123；7,056,699；7,07,993；7,419,829和7,442,551，其以引用的方式合并入本文中。
美国专利号6,924,123公开了某些逆转录病毒序列促进整合进靶细胞基因组。该专利教导了每个逆转录病毒包括被称为gag、pol和env的基因，其编码病毒粒子蛋白和酶。这些基因通过被称为长末端重复（LTR）的区域而被处于两个末端的侧翼。所述LTR负责前病毒整合和转录。它们也用作增强子-启动子序列。换句话说，LTR能够控制病毒基因的表达。逆转录病毒RNA的封装通过位于病毒基因组的5'末端的psi序列而发生。LTR自身是可以被分为三种元件的相同的序列，其被称为U3、R和U5。U3衍生自对RNA的3'末端独特的序列。R衍生自在RNA的两个末端重复的序列，而U5衍生自RNA的5'末端独特的序列。在不同的逆转录病毒之间这三种元件的尺寸可以发生较大的变化。对于病毒基因组，聚合（A）加成（终止）的位点是在LRT右手边的R和U5之间的边界处。U3含有前病毒的大多数转录控制元件，其包括启动子和多重增强子序列，它们响应细胞（在某些情况下为病毒）转录激活蛋白。
关于结构基因gag、pol和env自身，gag编码病毒的内部结构蛋白。gag蛋白被蛋白水解地处理成成熟蛋白MA（基质）、CA（衣壳）和NC（核衣壳）。pol基因编码逆转录酶（RT），其包括DNA聚合酶、相关的RNA酶H和整合酶（IN），它们介导基因组的复制。
对于病毒载体颗粒的生产，载体RNA基因组被表达自在宿主细胞中的编码它的DNA构建体。通过在宿主细胞中表达的其他核酸序列（“包装系统”，其通常包括gag/pol和env中的一个或两个），以反式的形式提供不被所述载体基因组编码的颗粒的部件。可以通过瞬时转染将生产病毒载体颗粒所需的一组序列引入宿主细胞，或者它们可以被整合进宿主细胞基因组、或者它们可以以混合物的方式而被提供。涉及的技术对于本领域技术人员来说是已知的。
用于在本发明中使用的逆转录病毒载体包括但不限于：Invitrogen的pLenti系列版本4、6和6.2 “ViraPower”系统，由Lentigen Corp.制造；pHIV-7-GFP，由City of Hope Research Institute实验室生成和使用；“Lenti-X” 慢病毒载体，pLVX，由Clontech制造；pLKO.1-puro，由Sigma-Aldrich制造；pLemiR，由Open Biosystems制造；以及pLV，由Virology (CBF), Berlin, Germany 的Charité Medical School, Institute实验室生成和使用。
不管被用来将外源性核酸引入宿主细胞或将细胞暴露至本发明的抑制剂的方法如何，为了确认重组DNA序列在宿主细胞中的存在，可以进行多种测试。这样的测试包括：例如本领域技术人员熟知的“分子生物学”测定，例如Southern和Northern印迹、RT-PCR和PCR；“生物化学”测定，例如检测特定的肽是否存在，例如通过免疫学手段（ELlSA和蛋白质印迹）或者通过本文描述的测试来识别落入本发明的范围之内的试剂。
包装载体和细胞系。可以通过使用包装载体和细胞系，将CAR包装进逆转录病毒包装系统。包装质粒包括但不限于逆转录病毒载体、慢病毒载体、腺病毒载体和腺相关病毒载体。包装载体包括促进遗传物质递送进细胞的元件和序列。例如，逆转录病毒构建体是这样的包装质粒，其包括至少一种逆转录病毒辅助DNA序列，其衍生自复制缺陷型逆转录病毒基因组，其以反式的方式编码包装复制缺陷型逆转录病毒载体所需的所有病毒粒子蛋白，并且用于生产能够以高滴度包装复制缺陷型逆转录病毒载体而不会产生复制完整型辅助病毒的病毒粒子蛋白。逆转录病毒DNA序列缺少编码病毒的病毒性5′ LTR的天然增强子和/或启动子的区域，并且缺少负责包装辅助基因组的psi功能序列和3′ LTR，但是编码外来的聚腺苷酸化位点（例如SV40聚腺苷酸化位点）、以及引导其中需要病毒生产的细胞类型中的有效转录的外来增强子和/或启动子。所述逆转录病毒是白血病病毒，例如莫洛尼鼠白血病病毒（MMLV）、人类免疫缺陷病毒（HIV）、或长臂猿白血病病毒（GALV）。所述外来增强子和/或启动子可以是人类巨细胞病毒（HCMV）即刻早期（IE）增强子和启动子、莫洛尼鼠肉瘤病毒（MMSV）的增强子和启动子（U3区域）、Rous肉瘤病毒（RSV）的U3区域、脾病灶形成病毒（SFFV）的U3区域、或连接到天然莫洛尼鼠白血病病毒（MMLV）启动子的HCMV IE增强子。逆转录病毒包装质粒可以由两个逆转录病毒辅助DNA序列组成，它们由基于质粒的表达载体编码，例如其中第一辅助序列包括编码嗜亲性MMLV 或GALV 的gag和pol蛋白的cDNA，并且第二辅助序列包括编码env蛋白的cDNA。Env基因，其确定宿主范围，可以衍生自编码以下的基因：嗜异性的、双嗜性的、嗜亲性、多嗜性的（貂病灶形成）或10A1鼠白血病病毒env蛋白、或长臂猿白血病病毒（GALV）env蛋白、人类免疫缺陷病毒env（gp160）蛋白、水泡性口炎病毒（VSV）G蛋白、人类T细胞白血病（HTLV）I型和II型env基因产物，或嵌合包膜基因，其衍生自前述env基因或编码前述env基因产物的细胞质和跨膜结构域的嵌合包膜基因中的一个或多个以及针对在所需的靶细胞上的特异性表面分子的单克隆抗体的组合。
在包装过程中，包装质粒和表达LHR的逆转录病毒载体被瞬时地共转染进能够产生病毒的哺乳动物细胞的第一群体中，该细胞例如是人类胚胎肾细胞，例如293细胞（ATCC No. CRL1573, ATCC, Rockville, Md.），从而生产高滴度的含有重组逆转录病毒的上清液。在本发明的另一种方法中，该细胞的瞬时转染的第一群体然后与哺乳动物靶细胞（例如人类淋巴细胞）共培养，从而以高效率转导具有外来基因的靶细胞。在本发明的另一种方法中，来自上述细胞的瞬时转染的第一群体的上清液与哺乳动物靶细胞（例如人类淋巴细胞或造血干细胞）一起孵育，从而以高效率转导具有外来基因的靶细胞。
在另一个方面，在能够产生病毒的哺乳动物细胞（例如人类胚胎肾细胞，例如293细胞）的第一群体中稳定地表达包装质粒。通过使用可选择的标记物进行共转染或者使用假型病毒进行感染，将逆转录病毒或慢病毒载体引入细胞中。在两种情况中，载体都发生整合。替代地，载体可以被引入游离基因地（episomally）维持的质粒中。生产了高滴度的含有重组逆转录病毒的上清液。
T细胞的激活和扩增。无论是在表达所需的CAR的T细胞或NK细胞的遗传修饰之前还是之后，都可以使用通常已知的方法来通常地激活和扩增T细胞或NK细胞，这些方法例如是在美国专利号6,352,694；6,534,055；6,905,680；6,692,964；5,858,358；6,887,466；6,905,681；7, 144,575；7,067,318；7, 172,869；7,232,566；7, 175,843；5,883,223；6,905,874；6,797,514；6,867,041中描述的方法。激活相关细胞的方法在本领域中是熟知的并且可以容易地适用至本申请；在以下例子中描述了示例性的方法。使用EGFR抗原离体刺激能够激活并扩增表达T细胞亚群体的所选的CAR。替代地，可以通过与EGFR抗原相互作用，体内激活T细胞。因此，在进一步的方面，本发明提供了表达EGFR CAR的细胞的分离的扩增的群体。
用于与本发明相关的用途的分离方法包括但不限于Life Technologies Dynabeads®系统激活和扩增试剂盒；BD Biosciences Phosflow™激活试剂盒、Miltenyi Biotec MACS™激活/扩增试剂盒、以及对相关细胞的激活部分特异性的其他商业上可获得的细胞试剂盒。可以通过使用在这样的试剂盒中可用的珠粒或其他试剂，激活或扩增免疫细胞的特定的亚群体。例如，α-CD3/α-CD28 Dynabeads®可以被用来激活和扩增分离的T细胞的群体。
如上所述，嵌合抗原受体包括抗原识别部分和细胞激活部分。本发明的方面涉及一种嵌合抗原受体（CAR），其包括对野生型和突变的EGFR特异的抗原结合结构域。
使用方法
治疗应用。本发明的CAR T细胞和NK可以被用来治疗表达EGFR的肿瘤和癌症，例如胶质母细胞瘤。本发明的EGFR CAR细胞可以被单独地施用，或者与稀释剂、已知的抗癌疗法（化学治疗、手术和/或辐射）、和/或与其他组分（例如细胞因子或免疫刺激性的其他细胞群体）一起施用。本发明的所述方法可以是一线疗法、二线疗法、三线疗法或四线疗法。
本发明的方法方面涉及用于在有需要的对象中抑制肿瘤的生长的方法、和/或用于治疗有需要的癌症患者的方法。在一些实施方式中，所述肿瘤是实体肿瘤。在一些实施方式中，所述肿瘤/癌症是胶质母细胞瘤或胶质母细胞瘤干细胞。在一些实施方式中，这些方法包括向所述对象或患者施用有效量的所述分离的细胞（例如包括EGFR CAR的分离的细胞）、或替代地基本上由其组成、或进一步地由其组成。在更进一步的实施方式中，所述分离的细胞是T细胞或NK细胞。在一些实施方式中，所述分离的细胞对于被治疗的所述对象或患者来说是自体同源的。在进一步的方面，所述肿瘤表达EGFR抗原，并且所述对象已经通过诊断（例如本文所述的一种）而被选择进行治疗。在进一步的方面，所述分离的细胞被直接注射或灌注进所述对象的大脑，以抑制胶质母细胞瘤或胶质母细胞瘤干细胞的生长。
可以以适于要被治疗或预防的疾病的方式，施用包括本发明的EGFR CAR的药物组合物。可以使用任何合适的施用方法，例如直接注射和/或全身施用，例如通过静脉注射。虽然可以通过临床试验确定合适的剂量，但是施用的量和频率将由例如患者的情况、以及患者的疾病的种类和严重性等因素确定。抑制肿瘤的生长的方法可以被使用至的对象包括但不限于人、狗、猫、马和其他物种。抑制肿瘤的生长的方法可以被使用至的对象包括但不限于人、狗、猫、马和其他物种。
在一个实施方式中，本发明提供了一种用于确定患者是可能响应还是不可能响应EGFR CAR疗法的方法，所述方法包括、或替代地基本上由其组成、或进一步地由其组成：将从所述患者分离的肿瘤样品与有效量的EGFR抗体接触，以及检测结合至所述肿瘤样品的任何抗体的存在，其中结合至所述肿瘤样品的抗体的存在表明所述患者可能响应EGFR CAR疗法，而结合至所述肿瘤样品的抗体的不存在表明所述患者不可能响应EGFR CAR疗法。在另一个实施方式中，所述方法进一步包括向被确定可能响应EGFR CAR疗法的所述患者施用有效量的EGFR CAR疗法。在该方法中，所述患者可以患有脑癌。在一些实施方式中，所述脑癌是胶质母细胞瘤或另一种癌症（例如乳腺癌）的转移瘤。在一个方面，所述样品从被诊断患有、被怀疑患有、或有风险患有癌症的对象获得。
在一个方面，所述检测包括免疫组织化学（IHC）、蛋白质印迹、流式细胞术或ELISA中的一种或多种、或替代地基本上由其组成、或进一步地由其组成。
在一个方面，所述方法包括从所述对象分离所述生物样品、或替代地基本上由其组成、或进一步地由其组成。在进一步的方面，从所述对象分离T细胞或NK细胞，使用编码EGFR CAR的分离的核酸进行转导，并且制备被转导的细胞的被扩增的群体，用于使用本文所述的方法向所述对象施用。
在一个方面，所述对象是哺乳动物，例如人类患者。
组合物和载体
本发明的其他方面涉及组合物，其包括载体和以下产品中的一种或多种，例如EGFR CAR、包括EGFR CAR的分离的细胞、编码EGFR CAR的分离的核酸或其补体和/或、包括所述分离的核酸的载体。所述载体可以是固体载体或液体载体，例如药学上可接受的载体。
简单来说，包括但不限于在一个方面的本发明的组合物中的任何一种的本发明的药物组合物，包括本文所述的细胞群体、以及一种或多种药学上或生理上可接受的载体、稀释剂或赋形剂或固体支撑物。这样的组合物可以包括：缓冲液，例如中性缓冲盐水、磷酸盐缓冲盐水等；碳水化合物，例如葡萄糖、甘露糖、蔗糖或葡聚糖、甘露醇；蛋白质；多肽或氨基酸，例如甘氨酸；抗氧化剂；螯合剂，例如EDTA或谷胱甘肽；佐剂（例如氢氧化铝）；以及防腐剂。本发明的组合物可以被配制用于口服、静脉内、局部、肠内和/或肠胃外给药。在一些实施方式中，本发明的组合物被配制用于静脉给药。
简单来说，包括但不限于本文所述的本发明的组合物中的任何一种的本发明的药物组合物，联合一种或多种药学上或生理上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。这样的组合物可以包括：缓冲液，例如中性缓冲盐水、磷酸盐缓冲盐水等；碳水化合物，例如葡萄糖、甘露糖、蔗糖或葡聚糖、甘露醇；蛋白质；多肽或氨基酸，例如甘氨酸；抗氧化剂；螯合剂，例如EDTA或谷胱甘肽；佐剂（例如氢氧化铝）；以及防腐剂。本发明的组合物优选被配制用于静脉给药。
可以以适于要被治疗或预防的疾病的方式，施用包括本发明的药物组合物。虽然可以通过临床试验确定合适的剂量，但是施用的量和频率将由例如患者的情况、以及患者的疾病的种类和严重性等因素确定。
组合疗法
本发明的方面涉及组合疗法，其涉及本文公开的表达EGFR CAR的细胞以及溶瘤性单纯疱疹病毒。临床研究已经证明，溶瘤性疱疹病毒在单独施用的时候效果有限。本文提供的实验和公开证明了表达EGFR CAR的细胞的有希望的结果。申请人已经发现，表达EGFR CAR的细胞和溶瘤性单纯疱疹两者的施用具有协同效应。不被理论束缚地，人们怀疑，表达EGFR CAR的细胞可以促进肿瘤组织结构的破坏，使得癌症细胞更容易被溶瘤性疱疹病毒感染和破坏。
在一些实施方式中，预期在组合疗法中使用的表达EGFR CAR的细胞是分离的免疫细胞，任选地选自T细胞或NK细胞。在一些实施方式中，这些表达EGFR CAR的细胞是被辐射的。在一些实施方式中，表达EGFR CAR的细胞以1至10000 cGy的剂量被辐射，所述剂量例如但不限于大于、小于、或约1 cGy、5 cGy、10 cGy、50 cGy、100 cGy、500 cGy、1000 cGy、5000 cGy或10000 cGy。在一些实施方式中，辐射剂量优化了表达EGFR CAR的细胞的增殖，同时维持它们的完全活性至大于或约12, 24、36、48、60、72、84、96或更多个小时。在一些实施方式中，表达EGFR CAR的细胞被修饰（通过辐射或其他方式），从而不消灭或消除oHSV。
在一些实施方式中，所述溶瘤性单纯疱疹病毒是已经进行了临床试验并且如上公开的溶瘤性疱疹病毒中的一种或多种。在一些实施方式中，所述溶瘤性单纯疱疹病毒衍生自HSV-1或HSV-2。
在一些实施方式中，表达EGFR CAR的细胞与溶瘤性单纯疱疹病毒在相同的时间施用、或在其之前或之后施用。在一些实施方式中，表达EGFR CAR的细胞被首先施用。在其他实施方式中，溶瘤性单纯疱疹病毒被首先施用。在一些实施方式中，表达EGFR CAR的细胞在单个或多个剂量中施用。在一些实施方式中，溶瘤性单纯疱疹病毒在单个或多个剂量中施用。在一个实施方式中，首先施用表达EGFR CAR的细胞，然后施用溶瘤性单纯疱疹病毒一天或多天。
试剂盒
本发明进一步提供了试剂盒，其包括以下中的一种或多种：本文所述的EGFR CAR、编码所述EGFR CAR的分离的核酸或其补体、包括所述核酸的载体、本文所述的分离的细胞、或本文所述的分离的复合物。
以下实施例被提供来进行说明，而不限制本发明。
实施例1-表达EGFR CAR的细胞的生成和表征
细胞培养
在本研究中使用了人类GB细胞系[Gli36DeltaEGFR (Gli36dEGFR)、U251和LN229]和人类衍生自患者的GB干细胞（GB1123、GB30、GB83和GB326）（Mao, P. et al. (2013) Proc Natl Acad Sci. USA 110:8644-8649）。还使用相同的程序从GB患者中建立了GB84V3SL、GB157V3SL和GB19（Mao, P. et al. (2013) Proc Natl Acad Sci. USA 110:8644-8649）。在补充有10% FBS、青霉素（100 U/ml）和链霉素（100 μg/ml）的DMEM（Invitrogen, Grand Island, NY）中培养所有GB细胞系、293T细胞和Phoenix细胞。在补充有bFGF（20 ng/ml）、EGF（20 ng/ml）、Glutamax（1:100）、B27（1:100）、肝素（5 µg/ml）、青霉素（100 U/ml）和链霉素（100 μg/ml）的DMEM-F-12培养基中培养GB 干细胞。所有上述抗生素和细胞因子都购自Invitrogen。人类NK细胞系NK-92和NKL被维持存在补充有20% FBS、青霉素（100 U/ml）、链霉素（100 μg/ml）和150 IU/mL重组人类（rh）IL-2（Hoffman-La Roche Inc., Nutley, NJ）的RPMI-1640（Invitrogen）中。
小鼠
从Jackson Laboratories (Bar Harbor, ME)获得六至八周龄的NOD.Cg-PrkdcscidIl2rgtm1Wjl/SzJ小鼠（NSG）小鼠。所有动物工作都被俄亥俄州立大学动物护理和使用委员会批准，并且根据被批准的指南来进行方法。一定频率地监控小鼠的GB疾病进展，并且在它们变得垂死（具有神经损伤和明显的体重减轻）时进行处死。
抗EGFR CAR慢病毒构建体的生成
抗EGFR单链可变片段（scFv）衍生自产生小鼠单克隆抗体528的杂交瘤细胞系，该抗体识别wtEGFR和EGFRvIII（Hayashi, H. et al. (2004) Cancer Immunology, Immunotherapy:CII 53:497-509；Humphrey, P.A. et al. (1990) Proc Natl Acad Sci. USA 87:4207-4211）。单独地扩增重（VH）链和轻（VL）链的可变区域的编码结构域序列，并通过重叠PCR反应使用接头进行组装。使用切离自逆转录病毒载体的CD28-CD3ζ部分（Pule, M.A. et al. (2005) Mol Ther. 12:933-941）将VH-接头-VL片段整合在框架中。然后将整个抗EGFR-scFv-CD28-CD3ζ片段连接进标记为pCDH-CMV-MCS-EF1-copGFP的慢病毒载体（pCDH, System Biosciences, Mountain View, CA），以生成pCDH-EGFR-scFv-CD28-CD3ζ (pCDH-EGFR-CAR)构建体。
慢病毒生产和NK细胞的转导
为了生产慢病毒以用于感染NK细胞（NK-92和NKL），使用磷酸钙转染试剂（Promega, Madison, WI），通过前述的pCDH-EGFR-scFv-CD28-CD3ζ质粒或模拟pCDH载体以及包装构建体pCMV-VSVG和pCMV-DR9共转染293T细胞。转染和感染程序修改自先前公开的方案（Chu, J. et al. (2014) Leukemia 28:917-927）。
稳定地表达wtEGFR或EGFRvIII的GB19 干细胞的产生
使用磷酸钙转染试剂（Promega, Madison, WI），通过pBABE-wtEGFR（wtEGFR表达构建体）或pBABE-EGFRvIII（EGFRvIII表达构建体）或pBABE空载体以及Sara3包装质粒共转染Phoenix细胞。转染之后两天，收获感染的上清液，以在存在凝聚胺（8 μg/mL）的情况下感染GB19 干细胞。在无血清的DMEM-F12培养基中制造逆转录病毒，以用于GB19 干细胞，然后使用FACS Aria II细胞分选器（BD Biosciences, San Jose, CA）分选GFP阳性的GB19-wtEGFR或GB19-EGFRvIII细胞。
流式细胞术
为了评估EGFR-CAR的NK细胞表面表达，使用含有4% BSA的PBS洗涤被转导的NK细胞，并使用生物素标记的山羊抗小鼠F(ab＇)2多克隆抗体或正常的多克隆山羊IgG抗体（Jackson ImmunoResearch, West Grove, PA）（作为前述的同种型对照）进行孵育（Chu, J. et al. (2014) Leukemia 28:917-927）。然后再次洗涤细胞，使用别藻蓝蛋白（APC）共轭的链霉亲和素（Jackson ImmunoResearch, West Grove, PA）进行染色。为了确定GB细胞的表面上的wtEGFR和/或EGFRvIII表达，使用同时识别野生型EGFR及其突变形式（EGFRvIII）的小鼠单克隆抗人类EGFR（克隆H11, DAKO, Carpinteria, CA）孵育细胞，然后使用APC共轭的山羊抗小鼠IgG二抗进行染色。
逆转录PCR
为了检测在胶质瘤细胞中的EGFR mRNA表达，使用RNeasy Mini试剂盒（Qiagen, Hilden, Germany）从细胞系提取RNA，并使用NanoDrop（Thermo Fisher, Wilmington, DE）进行量化。使用M-MLV逆转录酶（Invitrogen, Grand Island, NY）制造逆转录，并使用GoTaq® Flexi DNA聚合酶（Promega, Madison, WI）进行PCR。正向引物是TGACTCCGTCCAGTATTGATCG，反向引物是GCCCTTCGCACTTCTTACACTT。PCR反应参数是95 °C 5分钟，在95°C 40s、55 °C 40s、72 °C 1 min循环35次，并在72 °C最终延长10分钟。
细胞毒性测试
如前所述地（Yu, J. et al. (2010) Blood 115:274-281）进行标准的4-h 51Cr释放测试。简单来说，使用51Cr标记靶细胞，并在37 。C下在96孔V 形底的培养板的孔中以各种效应器/靶标的比率（E/T）使用经修饰的NK细胞进行共培养4小时。收获上清液，并转移进含有液体闪烁鸡尾酒（Fisher Scientific, Waltham, MA）的闪烁瓶中，在Beckman Liquid Scintillation Counter LS-6500上测量51Cr的释放。使用在完全培养基或1% SDS中孵育的靶细胞，分别确定自发的或最大的51Cr释放。使用以下标准公式来计算特异性细胞裂解的百分比：100 x (cpm实验释放– cpm自发释放) / (cpm 最大释放 – cpm 自发释放)。
γ释放试验
在96孔V 形底的培养板中使用等量的NK效应细胞孵育1 × 106个靶细胞24小时。根据厂家的程序，使用来自R&D Systems的试剂盒（Minneapolis, MN），通过酶联免疫吸附测定（ELISA）测试无细胞上清液的IFN-γ分泌。在图中示出的数据代表具有相似结果的三个代表性实验之一的三个重复的孔的平均值。
在NSG小鼠中的原位人类GB30异种移植物的处理
如前所述地（He, S. et al. (2013) Blood 121:4663-4671），使用表达Pinco-pGL3-luc/GFP病毒的萤火虫荧光素酶（FFL），逆转录病毒转导GB30 GB 干细胞。使用FACS Aria II细胞分选器（BD Biosciences, San Jose, CA）分选GFP阳性细胞，并标记为“GB30-FFL”细胞。将NSG小鼠麻醉，并固定在立体定向装置中，在前囱横向2 mm且前方1 mm处钻深度为3.25 mm的孔，并植入在2 μl汉克缓冲盐溶液（HBSS）中的5 × 104个GB30-FFL细胞。在第7天，使用在5 μl HBSS中的2 × 106个效应细胞（未辐射的），即EGFR-CAR转导的NK-92细胞（NK-92-EGFR-CAR）或模拟转导的NK-92细胞（NK-92-EV），对小鼠进行颅内注射。仅使用5 μl HBSS处理的小鼠被用作对照。每日监控小鼠，并在显示出发病迹象时进行安乐死。在GB30-FFL细胞接种之后两周，使用D-荧光素（150 mg/kg体重；Gold Biotechnology, St. Louis, MO）对小鼠进行腹膜内（i.p.）输注，使用异氟烷进行麻醉，并通过活动成像软件（PerkinElmer）使用体内成像系统（IVIS-100, PerkinElmer, Waltham, MA）进行成像。
在NSG小鼠中的原位人类U251异种移植物的处理
如前所述地（He, S. et al. (2013) Blood 121:4663-4671），使用表达Pinco-pGL3-luc/GFP病毒的萤火虫荧光素酶（FFL），逆转录病毒转导U251 GB细胞。使用FACS Aria II细胞分选器（BD Biosciences, San Jose, CA）分选GFP阳性细胞，并标记为“U251-FFL”细胞。将NSG小鼠麻醉，并固定在立体定向装置中，在前囱横向2 mm且前方1 mm处钻深度为3.25 mm的孔，通过该孔在第0天接种在2 μl汉克缓冲盐溶液（HBSS）中的105个U251-FFL细胞。在第10、40、70天，使用在5 μl HBSS中的2 × 106个效应细胞，即EGFR-CAR转导的NK-92细胞（NK-92-EGFR-CAR）或模拟转导的NK-92细胞（NK-92-EV），对小鼠进行颅内注射。仅使用5 μl HBSS处理的小鼠被用作对照。每日监控小鼠，并在显示出发病迹象时进行安乐死。在U251-FFL细胞接种之后第100天，使用D-荧光素（150 mg/kg体重；Gold Biotechnology, St. Louis, MO）对小鼠进行腹膜内（i.p.）输注，使用异氟烷进行麻醉，并通过活动成像软件（PerkinElmer）使用体内成像系统（IVIS-100, PerkinElmer, Waltham, MA）进行成像。
细胞的器官和组织分布测定
在肿瘤植入之后7天，将2 × 106个NK-92 EGFR-CAR细胞颅内注射进三只携带GB30的小鼠。三天之后，处死所有小鼠，并获得肝、肺、脾、骨髓、血液和脑。一半的器官或组织用于使用DNA分离试剂盒（Invitrogen, Carlsbad, CA）进行基因组DNA分离，并使用引物来进行PCR，以扩增EGFR-CAR scFv区域。PCR正向引物是AGGTCACTCTGACTGTAGACA，反向引物是GTTCATGTAGTCACTGTGCAG。PCR反应参数是95 °C 5分钟，在95°C 40s、55 °C 40s、72 °C 1 min循环35次，并在72 °C最终延长10分钟。
另一半的器官或组织用来使用在Percoll (GE Healthcare, Pittsburgh, PA)中的密度梯度离心分离单核免疫细胞。使用V450小鼠抗人CD3e和APC小鼠抗人CD56抗体（eBioscience, San Diego, CA），对收集的免疫细胞进行表面染色，以确定在特定的器官或组织中NK-92- EGFR-CAR细胞的存在。
统计分析
使用未配对的学生的t检验（Student’s t test），比较两个独立的群组的正常分布时的连续端点。在比较三个或更多个独立的群组时，使用单向ANOVA。对于非正常分布的端点，例如体内生物发光强度，使用Kruskal-Wallis测试来比较NK-92-EGFR-CAR群组与NK-92-EV和HBSS处理的群组的中位数。对于生存数据，绘制Kaplan-Meier曲线，并使用对数秩检验进行比较。所有测试都是双面的。使用Bonferroni方法调整多个比较的P值，小于0.05的P值被认为是显著的。
稳定地表达wtEGFR或EGFRvIII的293T细胞系的产生
使用磷酸钙转染试剂（Promega, Madison, WI），通过pBABE-wtEGFR（wtEGFR表达构建体）、pBABE-EGFRvIII（EGFRvIII表达构建体）、或pBABE空载体以及Sara3包装质粒共转染Phoenix细胞。转染之后两天，收获感染的上清液，以在存在凝聚胺（8 μg/mL）的情况下感染293T细胞。使用FACS Aria II细胞分选器（BD Biosciences, San Jose, CA）分选GFP阳性的细胞。
慢病毒产生和原代NK细胞的转染
如前所述地（Chu, J. et al. (2014) Leukemia 28:917-927），生产慢病毒，并通过在4。C在20,000g的超速离心浓缩90分钟，并使用1x PBS重悬。如前所述地（He, S. et al. (2013) Blood 121:4663-4671），从健康捐献者（American Red Cross, Columbus, Ohio）的外周血白细胞中分离人类原代NK细胞，并通过在2000 rpm 和32。C的连续三轮离心2小时（在两轮之间温和地重悬），使用慢病毒（MOI = 2.5）进行感染，并使用FACS Aria II细胞分选器（BD Biosciences, San Jose, CA）分选GFP阳性的细胞。进行标准的4-h 51Cr释放测试，以评估转导有EGFR-CAR质粒或对照载体的原代NK细胞针对U251和Gli36dEGFR GB细胞系和GB30和GB157V3SL衍生自患者的GB干细胞的细胞毒性。
抗体阻断测试
在37。C使用10 μg/ml EGFR中和抗体（克隆528, EMD Millipore, Billerica, MA）或同种型匹配的抗体预处理GB30 干细胞和U251细胞系30分钟。然后进行标准的4-h 51Cr释放测试，以评估NK-92-EGFR-CAR细胞和对照细胞针对528抗体或IgG预处理的靶细胞的细胞毒性。在96孔V底的培养板中，通过等量的NK-92-EGFR-CAR细胞或对照细胞，对使用528抗体或IgG预处理的1 × 106个靶细胞进行孵育24小时，然后在无细胞的上清液上通过ELISA对IFN-γ分泌进行量化。
携带GB30的小鼠的脑切片的苏木精和曙红（H＆E）染色
在第0天使用5 × 104个GB30细胞对NSG小鼠进行颅内注射。在第7天，使用在5 μl HBSS中的2 × 106个NK-92-EGFR-CAR细胞对小鼠进行颅内注射。在第10天，处死小鼠，并取得脑组织，并浸渍在10%福尔马林中24小时，然后将脑部包埋在石蜡中并处理以用于H&E染色。
结果
EGFR或EGFRvIII在GB细胞系或衍生自患者的GB干细胞上的表达
为了评估wtEGFR或EGFRvIII在GB细胞系或衍生自患者的GB干细胞的面板上的表面表达，使用同时识别wtEGFR和EGFRvIII的EGFR特异性抗体对完整的细胞进行染色，然后进行流式细胞术分析。如在图1A中所示，EGFR被表达在GB细胞系（Gli36dEGFR、U251和LN229）、衍生自患者的GB间充质（MES）干细胞（GB30、GB83、GB1123和GB326）和GB前神经（proneural，PN）干细胞（GB84V3S和GB157V3SL）上。为了进一步确定wtEGFR或EGFRvIII转录是否在这些细胞中表达，申请人使用特异性引物进行RT-PCR，并观察到wtEGFR mRNA在两个GB细胞系（U251和LN229）中表达。在GB细胞系Gli36dEGFR中，以及在申请人从GB患者（Mao, P. et al. (2013) Proc Natl Acad Sci. USA 110:8644-8649）获得的六种GB干细胞（GB30、GB83、GB1123、GB326、GB84V3SL和GB157V3SL）中，能够检测到EGFRvIII mRNA（图1B）。相反，通过流式细胞术分析或RT-PCR，一种GB干细胞（GB19，前神经）和两种NK细胞系（NK-92和NKL）没有可检测的EGFR表达。
表达EGFR-CAR的NK-92和NKL NK细胞的生成
在pCDH慢病毒载体骨架中生成第二代EGFR特异性CAR构建体。该构建体依次包括信号肽（SP）、重链可变区域（VH）、接头、轻链可变区域（VL）、铰链、CD28跨膜和细胞内结构域、以及CD3ζ信号传导部分（图2A）。使用该EGFR-CAR构建体来转导NK-92和NKL细胞系，以分别生成NK-92 EGFR-CAR和NKL EGFR-CAR细胞。分选经转导的细胞的由载体表达的GFP表达。为了验证EGFR-CAR在经转导的NK-92和NKL细胞上的细胞表面表达，使用识别抗EGFR的scFv部分的山羊抗小鼠F(ab＇)2抗体进行流式细胞术分析。图2B的数据显示，与使用空载体转导的相比，在EGFR-CAR转导的NK-92和NKL细胞中的细胞表面EGFR-CAR表达明显增加，前者具有不可检测的EGFR-CAR表达。
针对EGFR+ GB 细胞系的EGFR-CAR修饰的NK细胞毒性和IFN-γ生产的效力
在不同的效应细胞与靶细胞的比率下，使用标准的铬释放试验，评估EGFR-CAR转导的和模拟转导的NK细胞针对GB细胞的细胞毒性。图3A-3B显示，与对照NK-92-EV细胞相比，NK-92 EGFR-CAR细胞针对EGFR+ Gli36dEGFR、U251和LN229细胞的细胞毒性显著增强（图3A，上面板）。在使用转导有EGFR-CAR的NKL细胞系的实验中观察到相似的数据（图3A，下面板）。与对照细胞相比，转导有EGFR-CAR的人类原代NK细胞也显示出针对EGFR+ Gli36dEGFR和U251 GB细胞系的显著更有效的细胞毒性（图8A）。为了确定观察到的增强的细胞溶解活性是否伴随着相似的显著提高的IFN-γ分泌，申请人使用EGFR+胶质瘤细胞（Gli36dEGFR、U251和LN229）共培养EGFR-CAR NK-92细胞24小时，并通过ELISA测量IFN-γ生成。如在图3B中所示，在独自孵育时，EGFR-CAR修饰的和模拟转导的NK-92或NKL细胞都自发产生低或微不足道的水平IFN-γ。使用EGFR+胶质瘤细胞（Gli36dEGFR、U251和LN229）培养这些细胞，会在EGFR-CAR转导和模拟转导的NK-92或NKL细胞系中诱导IFN-γ，其中与模拟转导的NK-92或NKL细胞相比，由EGFR-CAR修饰的NK-92或NKL细胞产生的IFN-γ的水平显著更高（图3B）。这些结果与前述细胞毒性数据相一致，共同表明EGFR-CAR修饰能够显著增强NK细胞响应EGFR+胶质瘤细胞的效应功能。
针对衍生自GB患者的EGFR+ GB 干细胞的EGFR-CAR修饰的NK细胞毒性和IFN-γ生产的效力
申请人接着评估了EGFR-CAR修饰的NK-92和NKL细胞裂解具有内源性EGFR蛋白的表面表达的衍生自患者的GB 干细胞的能力。EGFR-CAR转导的NK-92细胞证明了与模拟转导的NK细胞相比，杀死EGFR+ GB间充质干细胞（GB1123和GB30）和GB前神经干细胞（GB157V3SL和GB84V3SL）的能力显著增强（图4A，上面板）。在使用转导有EGFR-CAR的NKL细胞进行重复的实验中，观察到相似的数据（图4A，下面板）。与对照细胞相比，转导有EGFR-CAR的原代NK细胞也显示出针对衍生自患者的表达EGFRvIII的干细胞 GB30和GB157V3SL的显著更有效的细胞毒性（图8B）。同样地，与模拟转导的NK-92（图4B，上面板）和NKL细胞（图4B，下面板）相比，在使用EGFR+ GB 干细胞共培养时，EGFR-CAR转导的NK-92和NKL细胞产生显著更多的IFN-γ。这些数据表明，与未经修饰的NK细胞对照相比，NK细胞的EGFR-CAR修饰能够显著增强针对EGFR+ GB 干细胞的NK细胞毒性和IFN-γ生成。
细胞的增强的细胞毒性和IFN-γ生成取决于靶细胞上的EGFR表面表达
申请人接着研究了由GB细胞触发的在EGFR-CAR转导的NK-92或NKL细胞中的增强的细胞毒活性和IFN-γ生成是否依赖于细胞表面EGFR抗原表达。在测试的GB细胞中，只有GMB19干细胞没有在其表面表达EGFR或EGFRvIII。因此，申请人采用该细胞系来研究在GB19细胞中的强制的wtEGFR或EGFRvIII过度表达是否足够来改变它们对EGFR-CAR转导的NK-92或NKL细胞的灵敏度。为了该目的，申请人通过逆转录病毒感染，在GB19细胞上过度表达了wtEGFR或EGFRvIII，由流式细胞仪确认（图5A）。与缺少EGFR表达的靶标GB19细胞或模拟转导的NK-92和NKL效应细胞相比，针对外源地过度表达EGFR或EGFRvIII的GB19细胞，EGFR-CAR-修饰的NK-92和NKL细胞的细胞毒活性显著提高（图5B）。同样地，与缺少EGFR的过度表达的靶标GB19细胞或模拟转导的NK-92和NKL效应细胞相比，在使用过度表达EGFR或EGFRvIII的GB19细胞进行共培养时，EGFR-CAR转导的NK-92和NKL细胞分泌的IFN-γ的水平显著提高（图5C）。这些数据表明，由NK-92-EGFR-CAR细胞造成的表达wtEGFR或EGFRvIII的GB细胞的识别和消除的提高，是以EGFR依赖性的方式发生的。并且，这些结果与确定性实验一致，该实验显示，与转导有空载体的NK-92细胞相比，在293T细胞中的强迫的EGFR表达导致NK-92-EGFR-CAR细胞的细胞毒性和IFN-γ生产提高（图9A-9C）。再者，申请人使用EGFR中和抗体（与scFv起源相同的克隆）预处理GB30和U251细胞，然后使用模拟细胞或NK-92-EGFR-CAR细胞进行经预处理的肿瘤细胞的共培养。铬-51释放测定显示，与同种型匹配的对照抗体相比，EGFR阻断的抗体减弱了在NK-92-EGFR-CAR中细胞毒性和IFN-γ生产的增强（图10），进一步证实了申请人确定的NK-92-EGFR-CAR细胞的效果是EGFR依赖性的。
细胞在两个原位异种移植物GB模型中抑制携带肿瘤的小鼠的GB肿瘤生长并延长生存期
为了进一步解决NK-92-EGFR-CAR细胞的潜在的治疗应用，申请人验证了它们的体内抗肿瘤活性。申请人通过将已经被工程地操作来表达萤火虫萤光素酶的表达EGFRvIII的GB30胶质瘤干细胞（GB30-FFL），颅内植入NSG小鼠的脑部，从而建立原位胶质瘤。萤火虫萤光素酶的表达使得我们能够通过体内生物发光成像来监控肿瘤生长。为了使潜在的全身毒性最小化，申请人在肿瘤细胞植入后7天，颅内注射NK-92-EGFR-CAR。如在图6A-6B所示，通过生物发光成像确定，与注射有HBSS的相比，接受了EGFR-CAR转导的或模拟转导的NK-92细胞的小鼠具有显著降低的肿瘤生长。但是，重要的是，与通过模拟转导的NK-92细胞处理的相比，在通过NK-92-EGFR-CAR细胞处理的小鼠中的肿瘤生长上的下降显著更大。与这些数据一致，与使用模拟转导的NK-92细胞或HBSS处理的小鼠相比，使用NK-92-EGFR-CAR细胞处理的小鼠存活显著更长的时间（在NK-92-EGFR-CAR和NK-92-EV处理的小鼠之间的中位生存期是38天 vs 23天，p ＜0.01；在NK-92-EGFR-CAR和HBSS处理的小鼠之间的中位生存期是38天 vs 17天，p ＜ 0.01）（图6C）。为了进一步解决NK-92-EGFR-CAR细胞针对表达wtEGFR的GB肿瘤的治疗效果，申请人通过将表达wtEGFR的U251-FFL细胞颅内植入NSG小鼠，建立了原位GB模型。申请人在肿瘤细胞植入之后10天、40天和70天，颅内注射了NK-92-EGFR-CAR细胞、NK-92-EV 细胞或HBSS（作为载体对照）。如在图7A-7B中所示，与灌注有HBSS或NK-92-EV细胞的相比，颅内注射有EGFR-CAR细胞的小鼠具有显著降低的肿瘤负荷。再者，与接受NK-92-EV细胞或HBSS的相比，使用NK-92-EGFR-CAR细胞处理的小鼠存活显著更长的时间（在NK-92-EGFR-CAR和NK-92-EV细胞处理的小鼠之间的中位生存期是187天 vs 150天，p ＜0.05；在NK-92-EGFR-CAR和HBSS处理的小鼠之间的中位生存期是187天 vs 138天，p＜0.01）（图7C）。结合起来说明，NK-92-EGFR-CAR细胞能够有效地体内靶定并消除表达wtEGFR或EGFRvIII的GB。
在颅内注射之后NK-92-EGFR-CAR细胞转移的评估
为了评估NK-92-EGFR-CAR细胞的颅内注射的安全性，申请人首先分析了颅内注射之后的全身细胞分布。申请人采取了流式细胞术分析和更敏感的PCR方法，来评估NK-92-EGFR-CAR在颅内注射进携带GB30的小鼠之后三天取得的各种器官和组织中的分布。如在图6D中所示，只在大脑中可以识别到CD56+细胞，并且其仅构成脑中总免疫渗透细胞的10.2％。相似地，PCR分析不能够在除了大脑之外的经测试的任何器官位点中检测到EGFR-CAR表达（图6E）。这些数据一起表明，在人类GB的原位小鼠模型中NK-92-EGFR-CAR细胞的颅内施用可以在不发生效应细胞的颅外迁移的情况下进行。申请人接着进行了颅内灌注有NK-92-EGFR-CAR细胞的携带GB30的小鼠的脑切片的苏木精和曙红（H＆E）染色。数据显示，NK-92-EGFR-CAR细胞仅分布在肿瘤里面（图11）。
讨论
在该研究中，申请人开发了新颖的和有希望的抗GB策略，采用EGFR-CAR修饰的人类NK-92来颅内靶定人类GB。来自GB患者的肿瘤表达wtEGFR或同时表达wtEGFR和EGFRvIII（Fan, Q.W. et al. (2013) Cancer Cell 24:438-449），这表明同时靶定该表面蛋白的两种形式将具有更广的用途或者比仅靶定一种更有效。申请人还证明了在申请人的原位临床前模型中EGFR-CAR修饰的NK-92细胞的颅内注射的体内有效性和安全性。
CAR T细胞已经被有效地用于治疗难治性慢性淋巴细胞白血病和急性淋巴细胞白血病，并且代表了对这些高度耐药性肿瘤的强大的新型治疗方式（Porter, D.L. et al. (2011) N Engl J Med. 365:725-733；Grupp, S.A. et al. (2013) N Engl J Med. 368:1509-1518；Brentjens, R.J. et al. (2013) Sci Transl Med. 5:177ra138；Papapetrou, E.P. et al. (2011) Nature Biotechnology 29:73-78）。并且，数个研究已经证明了CAR T细胞治疗GB的用途（Morgan, R.A. et al. (2012) Hum Gene Ther. 23:1043-1053；Ohno, M. et al. (2010) Cancer Sci. 101:2518-2524；Ahmed, N. et al. (2010) Clin Cancer Res. 16:474-485）。但是这些研究仅仅集中在靶定EGFRvIII。再者，CAR T能够引起细胞因子相关的不良事件和肿瘤溶解综合征（Grupp, S.A. et al. (2013) N Engl J Med. 368:1509-1518；Morgan, R.A. et al. (2010) Mol Ther. 18:843-851），这会导致病人的大量毒性或死亡。此外，自体CAR T细胞的生产是昂贵且耗时的方法。因此，使用CAR NK细胞来同时靶定wtEGFR和EGFRvIII以用于GB治疗是很好的替代性方法。
CAR工程化的NK细胞系（例如在本研究中使用的NK-92），能够潜在地提供现成的可再生的产品，以广泛地治疗不同的GB患者。申请人的本发明第一个研究了CAR修饰的NK-92细胞针对GB的应用。CAR修饰的NK-92细胞已经显示出有效地靶定其他癌症。例如，Esser等人工程化了NK-92细胞来稳定地针对双唾液酸神经节苷脂GD2表达CAR，其在神经母细胞瘤（NB）细胞上以高水平表达（Esser, R. et al. (2012) J Cell Mol Med. 16:569-581）。GD2-CAR在NK-92细胞上的表达增强了表达GD2的NB细胞的特异性消除，这些细胞对于通过亲代NK-92细胞进行杀死是有耐性的，这证明了GD2-CAR NK细胞针对NB细胞的潜在的临床应用。申请人最近已经研发了表达CS1-CAR的NK-92细胞来靶定多种骨髓瘤（MM）细胞，并且证明了这些工程化的NK-92细胞在体外通过MM细胞共培养时能够显示出增强的细胞毒性和IFN-γ生成（Chu, J. et al. (2014) Leukemia 28:917-927）。重要的是，在侵袭性原位MM异种移植小鼠模型中，CS1-CAR修饰的NK-92细胞的过继转移有效地阻止了体内人类IM9 MM细胞的传播，并且还显著地延长了携带IM9的小鼠的总体生存期（Chu, J. et al. (2014) Leukemia 28:917-927）。
据申请人所知，这是研究CAR免疫细胞同时靶定wtEGFR和EGFRvIII以用于GB治疗的可能性的首次研究。申请人制造了EGFR-CAR工程化的NK-92和NKL细胞以及原代NK细胞，其体外有效地裂解表达wtEGFR或EGFRvIII的GB细胞。两种分子在胶质瘤发生中都起到贡献的作用。表达EGFRvIII的细胞通常与表达wtEGFR的细胞在相同的患者中共同存在。Biernat报导了EGFR+ GB活检中的40%（20个中的8个）还显示出对EGFRvIII的阳性，但是仅仅15%（20个中的3个）具有主要的EGFRvIII扩增，这表明了基于选择性靶定EGFRvIII仅能为治疗方法获得有限的效果（Biernat, W. et al. (2004) Brain Pathol. 14:131-136）。在另一个研究中，在58个GB肿瘤之中，有83% (48/58)通过IHC对wtEGFR染色。进一步地，这些样品中的19% (11/58)对wtEGFR和EGFRvIII呈双阳性（Fan, Q.W. et al. (2013) Cancer Cell 24:438-449）。这两个研究证明，GB患者中相当大的部分具有表达 wtEGFR和表达EGFRvIII的细胞。所以，与选择性地靶定wtEGFR或EGFRvIII以治疗GB的治疗方法相比，本文描述的EGFR-CAR NK疗法同时靶定wtEGFR和EGFRvIII。如上所述，EGFRvIII特异性的CAR T细胞体外和体内都显示了针对表达EGFRvIII的GB的良好的抗肿瘤活性（Morgan, R.A. et al. (2012) Hum Gene Ther. 23:1043-1053；Ohno, M. et al. (2010) Cancer Sci. 101:2518-2524；Sampson, J.H. et al. (2014) Clin Cancer Res. 20:972-984）。申请人相信，同时靶定wtEGFR和EGFRvIII的方法应该不仅有效地治疗只具有表达wtEGFR的肿瘤细胞的GB患者，还有效地治疗同时具有表达wtEGFR的肿瘤细胞和表达EGFRvIII的肿瘤细胞的GB患者。为了该目的，申请人工程化了NK-92细胞来表达同时靶定tEGFR和EGFRvIII的EGFR-CAR，并且证明了表达wtEGFR或EGFRvIII的GB细胞可以在体外和/或体内被有效地消除。
靶定在胶质瘤细胞上的wtEGFR和EGFRvIII的潜在的挑战是在正常组织上wtEGFR的存在。EGFRvIII特异性的CAR T细胞的全身灌注被认为是相对安全的，因为EGFRvIII在能够表达高水平的wtEGFR的正常上皮细胞上不表达。但是，NK-92-EGFR-CAR或原代NK细胞的全身施用可能导致严重的全身毒性，这是因为其对正常的表达wtEGFR的细胞的影响。为了使该风险最小化，申请人颅内注射NK-92-EGFR-CAR以限制其移动性，并且证明了这些CAR在除了大脑之外的其他组织中保持是不可检测的。在本研究的进一步支持中，近期的研究显示，来自同时靶定wtEGFR和EGFRvIII的EGFR抗体的毒素结合的scFv的颅内递送，导致了针对表达wtEGFR或共同表达wtEGFR和EGFRvIII的颅内胶质母细胞瘤异种移植的强抗肿瘤作用。该局部施用没有引起明显的全身毒性（Chandramohan, V. et al. (2013) Clin Cancer Res. 19:4717-4727）。此外，申请人的H&E染色还显示，被注射进大脑内的植入肿瘤中的NK-92-EGFR-CAR细胞驻留在肿瘤区域。但是，因为NK-92是淋巴瘤细胞系，对于未来的临床应用，装配有CAR的NK-92细胞应该在灌注进患者之前被辐射。数个临床前研究证明，与未经照射的细胞相比，接受了10 Gy辐射的NK-92-CAR细胞在体外和体内显示出相似的效果（Uherek, C. et al. (2002) Blood 100:1265-1273；Schonfeld, K. et al. (2015) Mol Ther. 23:330-338）。替代地，应该考虑EGFR-CAR原代NK细胞，因为申请人显示了它们也有效地根除GB细胞。重要的是，表达膜结合IL-15（mbIL15）或膜结合的IL-21（mbIL21）的遗传工程化的人造抗原呈递细胞（aAPC）最近已经被用来成功地扩增原代NK细胞（Jordan, C.T. (2009) Cell Stem Cell 4:203-205；Brennan, C. et al. (2009) PLoS One 4:e7752）。
重要的是，在申请人的研究中，申请人观察到内源性EGFRvIII在所测试的衍生自患者的GB干细胞中的大多数上的高表达，使得与被转导有对照载体的NK-92细胞裂解相比，它们更容易被NK-92-EGFR-CAR细胞裂解。GB干细胞是反应原代GB的生物和病理特征的肿瘤细胞的亚群，并且保留了进行自我更新、多系统分化和整个肿瘤群体的再生的能力（Jordan, C.T. (2009) Cell Stem Cell 4:203-205）。GB 干细胞被认为负责肿瘤起始、繁殖、复发和化学和放射抗性。人们相信，靶定GB 干细胞是预防GB复发的关键方面。实际上，申请人的体内数据显示，NK-92-EGFR-CAR的一次施用显著地延长了植入有衍生自患者的表达EGFRvIII的GB 干细胞的小鼠的存活期。因此，申请人相信，申请人的研究证明，NK-92-EGFR-CAR在体外和在两个异种移植小鼠模型中靶定GB细胞和GB干细胞的应用，是与临床上复发的人类GB的潜在治疗是高度相关的。
GB由不同的分子亚型组成。间充质（MES）和前神经（PN）GB已经被鉴定为最重要的GB亚型（Mao, P. et al. (2013) Proc Natl Acad Sci. USA 110:8644-8649；Brennan, C. et al. (2009) PLoS One 4:e7752；Phillips, H.S. et al. (2006) Cancer Cell 9:157-173；Verhaak, R.G. et al. (2010) Cancer Cell 17:98-110）。在申请人的实验中，通过流式细胞术证实，申请人测试的所有MES和三种PN中的两种GB干细胞（GSC）都对EGFR表达呈阳性。PCR分析进一步证明，这些GB干细胞中的所有都表达EGFRvIII，而GB非干细胞系通常仅表达wtEGFR（除了在Gli36dEGFR中EGFRvIII的异位过度表达之外）。与这些发现一致，申请人的体外数据证明，当通过PN或MES EGFR+ GSC体外进行共培养时，EGFR-CAR NK细胞显示出增强的IFN-γ分泌和细胞毒性。MES GSC在体外更具侵袭性，并且能够快速地在体内产生颅内异种移植物（Mao, P. et al. (2013) Proc Natl Acad Sci. USA 110:8644-8649）。与PN GSC相比，MES GSC还表现出对辐射的显著抗性（Mao, P. et al. (2013) Proc Natl Acad Sci. USA 110:8644-8649）。申请人的体内数据证明，NK-92-EGFR-CAR细胞在侵袭性的GB30 MES GSC异种移植模型中显示出效果。
总的来说，申请人已经成功地制造了同时靶定GB中的wtEGFR和EGFRvIII的CAR NK细胞。装配有该EGFR-CAR的NK细胞有效地并且特异性地在体外和/或体内识别和消除GB细胞和/或其干细胞。申请人的研究支持了EGFR-CAR修饰的NK-92细胞用于治疗复发性GB的临床应用，其可以被局部地单独施用或者与其他方法联合施用。
实施例2-表达EGFR CAR的细胞和oHSV的组合
细胞培养
在DMEM（Invitrogen, Grand Island, NY）中培养人类乳腺癌细胞系 MDA-MB-231、MDA-MB-468和MCF-7以及293T和Phoenix细胞，并且补充有10% FBS、青霉素 (100 U/ml)和链霉素 (100 μg/ml)（全部来自Invitrogen）。人类NK细胞系NK-92和原代NK细胞（从哥伦布的American Red Cross获得）被维持在RPMI-1640（Invitrogen）中，其补充有20% FBS、青霉素 (100 U/ml)、链霉素 (100 μg/ml)和200 IU/mL重组人类(rh) IL-2 (Gold Biotechnology, MO)。
小鼠
从Jackson Laboratories (Bar Harbor, ME)获得六至八周龄的NOD.Cg-PrkdcscidIl2rgtm1Wjl/SzJ小鼠（NSG）小鼠。所有动物工作都被俄亥俄州立大学动物护理和使用委员会批准。每天地监控小鼠的疾病进展，并且在它们变得垂死（具有神经损伤和明显的体重减轻）时进行处死。
慢病毒构建体的生成
抗EGFR单链可变片段（scFv）衍生自编码同时针对wtEGFR和EGFRvIII的特异性单克隆抗体的DNA序列。参见Soffietti et al. (2002) J. Neurol. 249(10):1357-1369。使用切离自逆转录病毒载体的CD28-CD3ζ部分将VH-接头-VL片段整合在框架中。然后将整个抗EGFR-scFv-CD28-CD3ζ片段连接进标记为pCDH-CMV-MCS-EF1-copGFP的慢病毒载体（System Biosciences, Mountain View, CA），以生成pCDH-EGFR-scFv-CD28-CD3ζ (pCDH-EGFR-CAR)构建体。
慢病毒生产和NK-92细胞的转导
为了生产慢病毒以用于感染NK-92细胞，使用磷酸钙转染试剂（Promega, Madison, WI），通过前述的pCDH-EGFR-scFv-CD28-CD3ζ质粒或模拟pCDH载体以及包装构建体pCMV-VSVG和pCMV-DR9共转染293T细胞。转染和感染程序修改自Chu et al. (2014) Official Journal of the AACR, 20(15):3989-4000的方案。
稳定地表达CBRluc-EGFP的MDA-MB-231细胞的产生
根据Chu etl al. (2014)方案，使用ΔU3CBRluc-EGFP载体（来自JF DiPersio博士的慷慨礼物），通过逆转录病毒转染，生成稳定地表达CBRluc-EGFP的MDA-MB-231细胞。然后使用FACS Aria II细胞分选器（BD Biosciences, San Jose, CA）分选EGFP阳性的乳腺癌细胞并扩增，得到MDA-MB-231-CBRluc-EGFP细胞。
流式细胞术分析
为了确定在乳腺癌细胞系的表面上的EGFR表达，通过小鼠单克隆抗人EGFR（克隆H11, DAKO）对细胞进行孵育，然后通过APC缀合的山羊抗小鼠IgG二抗进行染色。如在Chu et al. (2014)中描述地通过流式细胞术评估EGFR-CAR的表面表达。
苏木精和伊红（HE）染色和免疫组织化学（IHC）测试
通过HE或通过抗野生型EGFR抗体，对来自同时患有原发性乳腺癌和脑转移瘤的患者的石蜡包埋的肿瘤组织切片进行染色（1:2000, DAK-H1-WT; Agilent Technologies, Santa Clara, CA），有用于IHC。根据厂家的说明，使用自动免疫染色仪（BenchMark XT, Ventana Medical Systems, Tucson, AZ）。通过Leica激光共焦显微镜（SP5Wetzlar, Germany）使切片可视化并拍照。
细胞毒性测试
如前所述地（Yu, J. et al. (2010) Blood 115:274-281），进行标准的4-h 51Cr释放测试。使用以下标准公式来计算特异性细胞裂解的百分比：100 x (cpm实验释放– cpm自发释放) / (cpm 最大释放 – cpm 自发释放)。
γ释放试验
在96孔V 形底的培养板的孔中使用等量的效应细胞孵育1 × 106个靶细胞24小时。根据厂家的程序，使用来自R&D Systems的试剂盒（Minneapolis, MN），通过酶联免疫吸附测定（ELISA）测试无细胞上清液的IFN-γ分泌。在图中示出的数据代表具有相似结果的三个代表性实验之一的三个重复的孔的平均值。
测试
在96孔平底培养板上接种乳腺癌细胞系细胞(5 x 103)，并在37˚C在含有10% FBS的DMEM介质中孵育。在处理的最后，根据厂家的说明，使用快速的基于四唑的MTS（3-（4,5-二甲基噻唑-2-基）-5-（3-羧基甲氧基苯基）-2-（4-磺基苯基）-2H-四唑，内盐）比色测定（CellTiter 96细胞增殖测定试剂盒; Promega, Madison, WI），确定细胞活力。参见Hayon et al. (2003) Leuk. Lymphoma 44(11):1957-1962。所有实验都在三个单独的场合进行至少三个重复。
荧光素酶测定
在96孔平底培养板中接种MDA-MB-231-CBRluc-EGFP细胞(5 x 103)，并在37˚C在含有10% FBS的DMEM介质中通过不同的处理进行孵育。在不同的时间点，直接收集20 μL的培养基，用于如在Fu et al. (2010) PLoS One. 5(7):e11867中描述的，使用双Glo荧光素酶测定系统（Promega）进行荧光素酶测定。在第4天，使用PBS漂洗两次细胞丸粒，然后使用30 μL的1×被动裂解缓冲液（Promega）进行裂解。通过离心（13,000 rpm，1分钟）使裂解物丸粒化，并收集上清液来测量萤光素酶活性。
在NSG小鼠中的乳腺癌脑入侵的处理
将NSG小鼠麻醉，并固定在立体定向装置中，在第0天将在2 μl汉克缓冲盐溶液（HBSS）中的1 × 105个MDA-MB-231-CBRluc-EGFP细胞注射入小鼠大脑，其中在右前囱横向2 mm且前方1 mm处钻深度为3.25 mm的孔。在第10天，使用在5 μl HBSS中的2 × 106个效应细胞，即EGFR-CAR转导的NK-92细胞（NK-92-EGFR-CAR）或空载体转导的NK-92细胞（NK-92-EV），对小鼠进行颅内注射。使用在5 μl HBSS中的2 × 105个斑块形成单位（pfu）oHSV-1（rQNestin34.5）（参见Kambara et al. (2005) Cancer Res. 65(7):2832-2839），对只有oHSV-1的群组进行颅内注射。使用5 μl HBSS处理的小鼠被用作对照。在第15日，使用2 × 105个pfu oHSV-1，对CAR加上oHSV-1处理群组中的小鼠进行颅内注射。每日监控小鼠，并在显示出发病迹象时进行安乐死。在MDA-MB-231-CBRluc-EGFP细胞接种之后四周，使用D-荧光素（150 mg/kg体重；Gold Biotechnology, St. Louis, MO, USA）对小鼠进行腹膜内（i.p.）输注，使用异氟烷进行麻醉，并通过活动成像软件（PerkinElmer）使用体内成像系统（IVIS-100, PerkinElmer, Waltham Massachusetts, USA）进行成像。
统计
使用未配对的学生的t检验，比较在进行或未进行数据转换的情况下两个独立的群组的正常分布时的连续端点。在比较三个或更多个群组时，使用单向ANOVA。对于生存数据，使用Kaplan-Meier分析来评估生存函数，并使用对数秩检验来比较两个群组之间的生存率。所有测试都是双面的。使用Holm的方法调整多个比较的P值。小于0.05的P值被认为是统计上显著的。
结果
EGFR在乳腺癌细胞系和原发性和转移性组织中的表达
为了评估EGFR在乳腺癌细胞系中的表达，使用EGFR特异性的抗体对细胞进行染色，然后进行流式细胞术分析。如在图12A中所示，EGFR被表达在MDA-MB-231、MDA-MB-468和MCF-7细胞系的表面上，虽然在MCF-7细胞上的水平明显较低。在通过苏木精和伊红（HE）染色确认了肿瘤细胞的存在之后，在来自被诊断患有转移性乳腺癌的两例患者的原发性肿瘤组织和对应的脑转移灶中，通过免疫组织化学（IHC），评估EFFR表达（图12B，上两行）。不仅在来自原发病灶的肿瘤细胞上观察到表面EFFR表达，还在来自脑转移瘤的细胞上面观察到（图12B，下两行）。
和原代NK细胞的增强的细胞毒性和IFN-γ生成
申请人在pCDH慢病毒载体骨架中生成了第二代EGFR-CAR构建体。该构建体依次包括信号肽、EGFR scFv、铰链区域、CD28和CD3ζ。使用表达CAR的慢病毒转导来自健康捐献者的NK-92和原代NK细胞，并根据由载体产生的GFP的表达进行分选。申请人使用识别抗EGFR的scFv部分的山羊抗小鼠F(ab＇)2抗体进行流式细胞术分析。图13A显示了EGFR-CAR在EGFR-CAR转导的NK-92细胞的表面上的表达，其在NK-92-EV细胞（转导有空载体pCDH的NK-92细胞）上是不可检测的。接着，申请人研究了EGFR-CAR表达是否能够赋予NK-92和原代NK细胞增强的IFN-γ生成和细胞溶解活性。申请人观察到，与转导有空载体的对应的效应细胞相比（图13B、14A），当通过MDA-MB-231细胞或MDA-MB-468细胞进行共培养时，EGFR-CAR转导的NK-92和原代NK细胞（图18）分泌显著更高水平的IFN-γ。有趣的是，在将具有较低水平的EGFR表达的MCF-7细胞用作靶标时，在IFN-分泌上的该变化较不明显。再者，在使用这三种细胞系进行共培养时，申请人观察到，分别与模拟转导的NK-92效应细胞（图13C-13E）或原代NK细胞（图14B-14D）相比，EGFR-CAR转导的NK-92和原代衍生自捐献者的NK细胞的细胞毒活性显著提高。使用CD69表面表达来测量效应细胞激活，申请人还观察到，具有EGFR表达的肿瘤细胞能够激活EGFR-CAR转导的NK-92细胞，与使用MCF-7细胞相比，在使用MDA-MB-231和MDA-MB-468细胞时，具有更高的激活。申请人还检测了另一种NK细胞激活标记物CD27的表达，并且观察到在EGFR-CAR NK-92细胞的表面上没有表达CD27（图19）。
通过oHSV-1造成的乳腺癌细胞系的裂解
申请人研究了oHSV-1单独地是否能够裂解并破坏乳腺癌细胞，其具有移动进脑中以形成转移性脑肿瘤的能力。如在图15A中所示，在共培养48小时之后，oHSV-1以剂量依赖的方式降低MDA-MB-231、MDA-MB-468和MCF-7细胞的活力，并且该效果在不同的时间点都观察得到（图15B）。显微镜分析显示，在共培养4天之后，oHSV-1单独地能够裂解这些乳腺癌细胞系细胞（图20A）。使用表达荧光素酶的MDA-MB-231细胞（MDA-MB-231-CBRluc-EGFP）确认了这一点，在其中与模拟感染的群组（在第4天P <0.01）相比，在来自具有oHSV-1感染的上清液中检测到的荧光素酶水平更高（图15C）。同时，通过显微镜检查确定，oHSV-1不裂解EGFR-CAR NK-92效应细胞或诱导其细胞凋亡（图20B）。
细胞联合oHSV-1形成体外癌细胞的更有效消除
当仅仅使用EGFR-CAR NK-92细胞或将其与oHSV-1联合（使用EGFR-CAR NK-92细胞处理4小时，然后进行oHSV-1处理，或反过来）来处理MDA-MB-231细胞时，MTS测试显示，在所有情况下，MDA-MB-231细胞系都被有效地杀死；但是，EGFR-CAR NK-92细胞和oHSV-1的组合形成更有效的杀死（数据未示出）。申请人然后通过测量在不同处理之后在MDA-MB-231-CBRluc-EGFP细胞的上清液中的萤光素酶活性，评估杀死效果。萤光素酶被发现会快速降解（未示出），因此，萤光素酶测试使得我们能够确定动态、实时的杀死效果，而非累积的杀死效果。基于此，申请人观察到，与单独的oHSV-1相比，单独的EGFR-CAR NK-92细胞和EGFR-CAR NK-92细胞与oHSV-1联合引起更快速的裂解（图5A）。在测量在共培养4天之后在剩余的MDA-MB-231-CBRluc-EGFP细胞（细胞丸粒）中的萤光素酶活性时，申请人发现，单独的EGFR-CAR NK-92细胞、单独的oHSV-1、或EGFR-CAR NK-92细胞与oHSV-1联合，全部都大量杀死MDA-MB-231-CBRluc-EGFP细胞，并且与单一疗法相比，不管顺序如何，EGFR-CAR NK-92细胞与oHSV-1联合更有效（图16B）。通过显微镜检查观察到相似的结果（图21）。EGFR-CAR NK-92细胞快速地破坏一些MDA-MB-231细胞，但是即使是5天之后，这些细胞的子集仍然保持原有的细胞形状和完整性。oHSV-1首先引起靶细胞聚集，然后细胞被逐渐裂解（图21）。但是，EGFR-CAR NK-92细胞与oHSV-1的组合形成更强大的细胞杀伤，特别是在CAR NK-92细胞之后进行oHSV-1处理的群组中（第5行，图21）。值得注意的是，与51Cr释放测试（图13C）和萤光素酶数据（图16B）相一致，显微镜分析证明，MDA-MB-231细胞对于由NK-92-EV细胞形成的杀伤是有抗性的。
细胞联合oHSV-1在颅内模型中更有效地杀死MDA-MB-231肿瘤细胞
为了进一步支持EGFR-CAR NK-92细胞、单独的oHSV-1、或两者的组合的潜在的治疗应用，申请人检查了它们的体内抗肿瘤活性。申请人通过将MDA-MB-231-CBRluc-EGFP细胞植入进NSG小鼠的大脑，建立了乳腺癌的颅内模型。细胞中的甲虫红色荧光素酶的表达，使得我们能够通过体内生物发光成像监控肿瘤生长。为了使潜在的全身毒性最小化，申请人在肿瘤细胞植入后第10天，颅内注射未辐射的EGFR-CAR NK-92细胞或oHSV-1，并且对于EGFR-CAR NK-92联合oHSV-1的群组，在第15天注射oHSV-1。如在图17A和图22中所示，与注射有模拟转导的NK-92-EV或载体（HBSS）的相比，接受EGFR-CAR NK-92、oHSV-1或其组合的小鼠具有显著降低的肿瘤生长。重要的是，与使用单独的EGFR-CAR NK-92或单独的oHSV-1处理的相比，在使用EGFR-CAR NK-92联合oHSV-1处理的小鼠中肿瘤生长的下降更明显。与这些数据相一致，与使用单独的oHSV-1 (P < 0.01)、模拟转导的NK-92-EV (P < 0.001)、或HBSS (P < 0.001)处理的相比，使用EGFR-CAR NK-92加上oHSV-1处理的小鼠存活显著更长的时间，同时在EGFR-CAR NK-92加上oHSV-1和单独的EGFR-CAR NK-92的群组之间的差异显示了相同的趋势，并且在显著性阈值的边界(P = 0.0757)。EGFR-CAR NK-92联合oHSV-1、EGFR-CAR NK-92、oHSV-1、NK-92-EV 和HBSS五个群组的中位生存时间分别是80、61、55、43和42天（图17B）。
讨论
这些数据证明，EGFR-CAR NK-92细胞、oHSV-1、或两者的组合瘤内注射进预先接种了MDA-MB-231细胞的小鼠，引起抗肿瘤效应，并且它们的组合形成肿瘤生长的更有效的抑制并且显著地延长了携带肿瘤的小鼠的生存期。
申请人相信，该组合是有效的靶定癌症的方法。不被理论束缚地，申请人怀疑，该联合方法的靶标是癌症干细胞（CSC），这是负责大部分（如果不是全部）癌症中的复发、治疗抵抗和转移的细胞群体。进一步地，申请人断定，本文公开的方法可以适应异质肿瘤种群。
也就是说，（考虑到上述公开的乳腺癌的例子）表达EGFR的细胞被EGFR-CAR NK细胞靶定，但是oHSV-1也能够杀死EGFR阴性的肿瘤细胞。乳腺癌对于EGFR、PR和HER2表达来说是异质性的。虽然在我们的实验中使用的乳腺癌细胞系表达野生型EGFR，但是每个都表达至不同的程度。同时，它们具有不同的基因表达谱[MDA-MB-231和MDA-MB-468: ER–, PR–, HER2– (三重阴性); MCF-7: ER+, PR+/–, HER2–]和不同的生物行为。三重阴性的乳腺癌（TNBC）与侵袭性的自然史以及增加的转移易感性相关。与其他类型的乳腺癌相比，患有TNBC的患者缺少“传统的”治疗靶标并且具有较差的预后。事实上，TNBC的中位生存期仅为4.9个月。以上描述的组合性方法应该靶定非TNBC和TNBC的BCBM，因为oHSV对于一般的BCBM群体是有效的，同时EGFR-CAR NK细胞更有效地靶定EGFR+群体。这样的结论进一步可概括至基本上所有类型的癌症。
这些数据进一步显示，EGFR-CAR NK-92细胞能够快速地靶定并攻击乳腺癌细胞，而oHSV-1能够缓慢地但不断地感染并破坏癌症细胞。EGFR-CAR NK-92细胞通常能够在数小时内识别并攻击靶细胞，但是它们仅能存活数天，因为它们必须被辐射，因为该细胞系最初是从患有非霍奇金淋巴瘤的患者中建立的。1000 cGy的辐射剂量已经被最优化来抑制NK-92细胞的增殖并同时保持完全的细胞毒活性至辐射后最大48小时。相反，oHSV进入靶细胞、复制并破坏肿瘤细胞需要大约4天，即使其效果能够持续较长时间。此外，CAR修饰的NK细胞可以破坏肿瘤组织结构并减小肿瘤细胞之间的连接，增加了癌细胞膜的通透性，并因此在与oHSV-1联合的时候增强了癌症细胞中的病毒分布和复制。
等效物
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