局部用水飞蓟宾制剂及其用途的制作方法

本发明是在美国国立卫生研究院(nih)授予的资助号r01ca140368和u54es-015678下由美国政府支持完成的。美国政府对本发明享有一定的权利。本发明描述了用于对受试者局部施用的组合物。具体地，本发明涉及包含具有增强的皮肤渗透的水飞蓟宾(silibinin)的组合物。本发明还涉及制备和使用所述组合物预防和治疗多种皮肤病症的方法。
背景技术：
：水飞蓟(milkthistle)属于菊科(asteraceae或compositae)，其包括雏菊(daisy)、蓟(thistle)和洋蓟(artichoke)。水飞蓟素(silymarin)(casno.65666-07-1)是一种多酚类黄酮混合物，属于黄烷醇木脂素类，可从水飞蓟(milkthistle、silybummarianum(l.)gaertn)中分离。水飞蓟素主要由三种异构体组成：水飞蓟宁(silidianin)、水飞蓟亭(silichristin)和水飞蓟宾(silibinin)。水飞蓟素的生物活性主要与水飞蓟宾有关(am.j.healthsyst.pharm.56:1195-1197(1999)；biochem.pharmacol.48:753-759(1994))。水飞蓟宾(也称为silybin、silibirin、silibinine、silibinina、filybine或flavobin)((casno.22888-70-6)；c25h22o10；2r,3r-3,5,7-三羟基-2[(2r,3r)-2-(4-羟基-3-甲氧基苯基)-3-(羟基甲基)-2,3-二氢-1,4-苯并二氧杂环己烯-7-基]-2,3-二氢色烯-4-酮)，作为两种非对映异构体水飞蓟宾a和水飞蓟宾b的混合物存在。过去三十年来，含有水飞蓟宾的水飞蓟提取物已被用于治疗各种肝病。水飞蓟宾是一种强抗氧化剂，通过清除自由基，防止氧化剂引起的脂质过氧化，从而预防由许多有毒化合物(包括乙醇、苯并芘、四氯化碳和细菌内毒素)引起的肝损伤或使之减到最小。水飞蓟宾还是一种有效的抗癌和抗血管生成剂，已被证明可与许多增殖性细胞信号传导途径相互作用，抑制增殖并刺激细胞凋亡。此外，水飞蓟宾具有广泛的治疗窗口，在人i期和ii期临床研究中，每天超过13克的剂量显示安全(flaig,t.w.,etal.,investnewdrugs,25(2):139-46,2007；flaig,t.w.,etal.,prostate,70(8):848-55,2010)。动物实验显示水飞蓟宾与增殖细胞信号传导途径相互作用，抑制酪氨酸激酶抑制剂(tki)相关的增殖并刺激凋亡途径。已经发现水飞蓟宾具有多种生物学活性，包括肝保护(saliou,c,et.al.,febsletters,440:8-12,1998)和抑制乳腺(zi,x.l,etal.,clinicalcancerresearch,4:1055-1064,1998)、前列腺(zi,x.l,etal.,cancerresearch,58:1920-1929,1998；和singh,r.p.,etal.,clin.cancerres.,14(23):7773-80,2008)、结肠(kaur,m.,etal.,mol.cancerther.,8(8):2366-74,2009)和皮肤(lahiri-chatterjee,m.,etal.,cancerresearch59:622-632,1999)肿瘤发展、生长和进展。此外，喂食水飞蓟宾10周的小鼠显示肺肿瘤生长的抑制和已建立的肺腺癌的消退。在这些研究中，肿瘤数目和肿瘤大小都随着微血管大小和抗血管生成活性而降低(tyagi,a.,etal.,cancerprev.res.,2(1):74-83,2009)。先前关于水飞蓟宾和/或水飞蓟素对皮肤的作用的研究已经证实抑制光致癌作用(katiyar,s.k.,etal.,jnci89(8):556-566,1997)、抑制炎症(zi,x.l,etal.,molcarcinogenesis,26:321-333,1999)、逆转皮肤老化(美国专利4,749,573；4,997,649；4,895,839)以及有效治疗皮肤疾病诸如牛皮癣和皮炎(ep专利0552439)。还已证明水飞蓟宾是小鼠皮肤癌模型中有效的化学预防剂。例如，显示水飞蓟素引起肿瘤生长抑制和sencar小鼠中建立的皮肤乳头状瘤的消退(singh,r.p.,etal.,carcinogenesis,23(3):499-510,2002)。在uv辐射之前或之后立即局部施用水飞蓟宾加速skh-1小鼠表皮中胸腺嘧啶二聚体的去除，表明不同于防晒效果或除防晒效果之外的机制(dhanalakshmi,s.,etal.,carcinogenesis,25(8):1459-65,2004)。在uv辐射之前或之后立即局部用或饮食施用水飞蓟宾，防止skh-1无毛小鼠中的光致癌作用(mallikarjuna,g.,etal.,cancerres,64(17):6349-56,2004)。在辐射之前或之后立即局部施用或通过膳食补充剂施用的水飞蓟宾在skh-1小鼠皮肤中抑制uv-b诱导的促有丝分裂和存活信号传导(gu,m.,etal.,carcinogenesis,26(8):1404-13,2005)。在skh-1小鼠中膳食水飞蓟宾导致与表皮中的肿瘤增殖、dna损伤和凋亡的晒伤细胞有关的标志物显著降低(gu,m.,etal.,cancerepidemiolbiomarkersprev,14(5):1344-9,2005)。在长期暴露于uvb辐射的skh-1小鼠中，水飞蓟宾差异地影响皮肤和诱导肿瘤中的与细胞生长相关的分子标志物、信号传导和凋亡(gu,m.,etal.,molcancerther.,5(8):2121-9,2006)。如通过肿瘤多样性、肿瘤体积和肿瘤形成延迟所测量，局部用和膳食水飞蓟宾均可保护暴露于uvb辐射的skh-1小鼠免遭光致癌作用(gu,m.,etal.,cancerres,67(7):3483-91,2007)。不幸的是，水飞蓟宾不易溶于水相或亲脂相。此外，吸收后，水飞蓟宾代谢成葡糖苷酸和硫酸盐缀合物，并迅速在尿液中清除。这些化学和药代动力学性质导致水飞蓟宾的生物利用度差和半衰期短，这限制了口服施用后的有效性。这导致寻找有效手段来实现皮肤中水飞蓟宾浓度的升高。先前研究的方法包括将水飞蓟宾转化为与磷脂的亲脂性络合物(美国专利4,764,508)或化学修饰水飞蓟宾以形成更可溶的盐，诸如水飞蓟宾的3,11-二琥珀酸盐(美国专利5,196,448)。已知吸收到皮肤中取决于分子大小，因此络合作用限制了吸收，因为它增加了必须渗入表皮的分子大小。因此，需要更有效的局部用水飞蓟宾制剂以实现水飞蓟宾治疗皮肤疾病、病症和损伤的有效用途。为此，需要这样的制剂，其(i)成功地将有效浓度的水飞蓟宾递送至表皮和真皮中，(ii)稳定水飞蓟宾的活性形式，和(iii)在各种赋形剂存在情况下保持水飞蓟宾活性和皮肤渗透性质，所述赋形剂可增强水飞蓟宾治疗效果和/或添加提供额外益处，诸如遮光剂。技术实现要素：本发明提供了局部用制剂中抗氧化剂、抗炎剂、抗癌剂和抗血管生成剂水飞蓟宾的组合物，其增强水飞蓟宾向真皮中的渗透。本发明的局部用水飞蓟宾制剂包含这样的制剂组分：增强水飞蓟宾向真皮中的渗透，同时允许溶解治疗上足够浓度的众所周知的不溶性水飞蓟宾，同时保持整个制剂的稳定性。例如，ph调节剂可包含在本发明的局部用制剂中。广谱uv(uva和/或uvb)遮光剂可包含在本发明的局部用组合物中。这些局部用制剂还可包含一种或多种保湿剂、稳定增强剂、乳化剂、维生素、表面活性剂、芦荟植物组分、芳香剂和防腐剂。这些水飞蓟宾的局部用制剂提供紫外线和电离辐射防护，并逆转或减缓皮肤病症(包括皮肤癌)的进展。本发明的制剂还可用于治疗因太阳或治疗辐射而遭受皮肤损伤的受试者，由免疫抑制导致的处于皮肤癌高风险的器官移植患者，或患有与皮肤癌的风险增加有关的病症诸如共济失调-毛细血管扩张和着色性干皮病的患者。这种治疗可包括部分或完全逆转与皮肤癌发展有关的恶变前变化。这些局部用制剂预防和治疗由细胞毒性和发疱性化学战剂诸如芥子气、硫芥和氮芥引起的化学诱导的皮肤损伤。这些局部用制剂预防和治疗环境诱导的皮肤损伤，诸如uva和uvb诱导的皮肤损伤，诸如晒伤/晒黑/皮肤增厚。这些局部用制剂预防和治疗环境诱导的皮肤损伤，诸如与放疗相关的放射性皮炎/纤维化。用含有制剂媒介物的本发明组合物实现了水飞蓟宾向皮肤层中的增强渗透性，所述制剂媒介物贮存稳定且对添加赋形剂和治疗剂耐受，并且不需要络合水飞蓟宾。附图说明图1显示暴露于本发明的几种含水飞蓟宾的组合物的经辐照的小鼠皮肤细胞中的dna损伤减少。图2显示与来自对照制剂的渗透相比，来自本发明组合物的水飞蓟宾出人意料地高渗透至小鼠皮肤中。图3a和3b显示在施用本发明的局部用水飞蓟宾组合物后由小鼠皮肤的uvb辐射引起的胸腺嘧啶二聚体形成的减少。这些图显示局部用水飞蓟宾明显减少表示dna损伤的胸腺嘧啶二聚体染色(图3a中的黑色)(图3b)。图4显示实施例4中描述的五种含有另外的遮光化合物浓度的本发明的水飞蓟宾制剂的体外皮肤渗透测试。图5是描述skh-1无毛小鼠背部皮肤的体内硫芥暴露和水飞蓟宾处理方案的时间线。图6a显示在图5中阐述的体内测试方案中收集的小鼠皮肤样品中的微发疱(表皮-真皮分离或微发疱)。微发疱的定量百分比(图6b)表明与sm对照(黑条)相比微发疱减少的量。水飞蓟宾无论是在丙酮还是制剂中都能改善对单独载体制剂(fb)的保护。所呈现的数据是平均值±sem。*，与sm暴露组相比p<0.05。sm，硫芥；sb/ace，水飞蓟宾(在丙酮中)；sb-1％f，水飞蓟宾制剂1％；sb-2％f，水飞蓟宾制剂2％；fb，制剂基质。箭头，微发疱(表皮-真皮分离)。图7a显示在图5中阐述的体内测试方案中收集的小鼠皮肤样品中的髓过氧化物酶(mpo)水平。倍数变化的定量百分比(图7b)表明与sm对照(黑条)相比mpo减少的量。水飞蓟宾无论是在丙酮还是制剂中都能改善单独对载体制剂(fb)的保护。所呈现的数据是平均值±sem。缩写与图6相同。图8显示在图5中阐述的体内测试方案中收集的小鼠皮肤样品中的环加氧酶-2(cox-2)水平。所呈现的数据是平均值±sem。*，与sm暴露组相比p<0.05。缩写与图6相同。图9a显示三色染色，其显示在图5中阐述的体内测试方案中收集的小鼠皮肤样品中的胶原变化。通过含有水飞蓟宾的制剂增强胶原形成(愈合的标志物)。仅本发明的制剂增加胶原蛋白形成。定量数据中的百分比(图9b)是与硫芥(sm)对照相比胶原染色增加的量。*表示显著更多的胶原染色(p<0.05)。所呈现的数据是平均值±sem。*，与sm暴露组(n＝4-8)相比p<0.05。缩写与图6相同。图10a和10b证明水飞蓟宾处理通过mtt测定防止和逆转2-氯乙基乙基硫醚(cees)诱导的皮肤表皮细胞和成纤维细胞的活力降低。图10a显示对小鼠表皮jb6细胞的细胞活力的影响，并且图10b显示在原代皮肤成纤维细胞中的作用。所呈现的数据是平均值±sem(n＝3-5)。*，与0.35mmcees处理组相比p<0.05。对照，媒介物(dmso)对照；sb，水飞蓟宾。cees处理：24小时。图11a和11b证明水飞蓟宾处理通过brdu测定防止和逆转cees诱导的皮肤表皮细胞和成纤维细胞中dna合成的减少。图11a显示对小鼠表皮jb6细胞中dna合成的影响，并且图11b显示在原代皮肤成纤维细胞中的作用。所呈现的数据是平均值±sem(n＝3-4)。*，与0.5mmcees处理组相比p<0.05。对照，媒介物(dmso)对照；sb，水飞蓟宾。cees处理：24小时。图12a、12b和12c证明水飞蓟宾处理通过彗星测定(cometassay)防止和逆转皮肤表皮细胞和成纤维细胞中cees诱导的dna损伤。图12a显示在指示的药物、制剂或媒介物处理后的原代皮肤成纤维细胞的显微照片。图12b显示在特定处理后的小鼠表皮jb6细胞中的尾长矩(tailextentmoment)。图12c显示在特定治疗后的原代皮肤成纤维细胞中的尾长矩。所呈现的数据是平均值±sem(n＝3)。*，与0.5mmcees处理组相比p<0.05。uc，未经处理的对照；vc，媒介物(dmso)对照；sb，水飞蓟宾。cees处理：1.5小时。图13a、13b和13c证明水飞蓟宾处理防止和逆转皮肤表皮细胞中cees诱导的dna损伤。图13a显示在指定的时间和处理下小鼠表皮细胞中的h2a.xser139和p53ser15磷酸化。图13b显示在指定时间和处理下h2a.xser139磷酸化的凝胶染色的积分密度。图13c显示在指定的时间和处理下p53ser15磷酸化的凝胶染色的积分密度。未处理的对照；vc，媒介物(丙酮)对照。cees治疗；cees治疗：4小时。具体实施方式本发明提供了用于局部施用治疗有效量的水飞蓟宾至皮肤内的层以改善皮肤病症的组合物和方法。因此，本发明提供适用于局部施用水飞蓟宾的组合物，以及使用这种包含水飞蓟宾的局部用组合物的方法。本发明提供的方法包括局部用递送用于局部递送的稳定形式的水飞蓟宾以产生治疗有效水平的水飞蓟宾至真皮和表皮，其中递送至皮肤的水飞蓟宾剂量具有治疗效果。术语“生理学上可接受的”物质是指该物质在对受试者施用时不会引起对健康显著不利的影响。优选地，“生理学上可接受的”物质会引起很小的过敏性响应或不引起过敏性响应，并且适用于与人皮肤接触而没有过度的毒性、不相容性和不稳定性。“光敏性皮肤病”是由紫外线辐射引起的疾病。可考虑介导的(对阳光的毒性或过敏反应)和特发性(日光性荨麻疹、多形性皮炎、光化性类网状细胞增多)光敏性皮肤病，以及那些容易被阳光加重的疾病(糙皮病、红斑狼疮、红斑性天疱疮，着色性干皮病、皮肌炎)作为暴露于光的一些罕见的后果。相反，直接光敏性皮肤病更为频繁。光敏性皮肤病可表现为红斑/水疱性水肿反应(急性损伤)、光老化和光致癌(慢性损伤)。“放射性皮炎”是与长期暴露于辐射有关的皮肤疾病。这包括经受放射治疗(“radiationtherapy”(北美)或“radiotherapy”(英国和澳大利亚))的患者，也被称为放射肿瘤学，有时缩写为“xrt”，作为电离辐射的医疗用途，通常作为控制恶性细胞的肿瘤治疗的一部分。局部用组合物水飞蓟属于菊科(asteraceae或compositae)，其包括雏菊、蓟和洋蓟。水飞蓟素(casno.65666-07-1)是一种多酚类黄酮混合物，属于黄烷醇木脂素类，可从水飞蓟中分离。水飞蓟素主要由三种异构体组成：水飞蓟宁、水飞蓟亭和水飞蓟宾。水飞蓟素的生物活性主要与水飞蓟宾有关(am.j.healthsyst.pharm.56:1195-1197(1999)；biochem.pharmacol.48:753-759(1994))。水飞蓟宾(casno.22888-70-6)也称为"silybin"，作为两种非对映异构体水飞蓟宾a和水飞蓟宾b的混合物存在，它们以约1:1的比例存在于水飞蓟素提取物中。在本发明全文中使用的术语“水飞蓟宾”包括单独的水飞蓟宾a、单独的水飞蓟宾b及其混合物，包括水飞蓟宾a和水飞蓟宾b的1:1混合物。水飞蓟宾可商购自例如sigmatm(目录号s0417)。因此，本发明的局部用制剂可配制成主要含有水飞蓟宾非对映异构体a，或主要含有水飞蓟宾非对映异构体b，或比例为约1:1的水飞蓟宾非对映异构体a和b的混合物。除水飞蓟宾含量外，本发明的局部用组合物还可基本上不含或完全不含其他木脂素化合物。本文使用的术语“基本上不含”意指含有小于0.5％的所述成分的组合物，该成分可被视为杂质。本文使用的术语“完全不含”意指含有不可检测量的所述成分的组合物，该成分也可被视为杂质。例如，本发明的局部用组合物可基本上不含或完全不含一种或多种选自以下的木脂素：水飞蓟宁、水飞蓟亭、异水飞蓟宾(isosilybin)、sauriol、里卡灵(licarin)、三白脂素(saucernetin)、三白草醇、珠子草素(niranthin)、叶下珠脂素(phyllanthin)、manassantins、罗汉松脂素(matairesinol)、羟基罗汉松脂素(hydroxymatairesinol)、氧代罗汉松脂素(oxomatairesinol)、saminol、americanin、牛蒡苷(arctiin)、牛蒡苷元(arctigenin)、落叶松脂素(lariciresinol)、异落叶松脂素(isolariciresinol)、开环异落叶松脂素(secoisolariciresinol)、开环异落叶松脂素二糖苷(secoisolariciresinoldiglycoside)、rubrisandrin、齐墩果醇(egonol)、masutakeside、styraxlignolide、拉帕酚(lappaol)、二牛蒡苷元(diarctigenin)、内南五味子酯、五味子醇(schisandrol)、五味子素(schisandrin)、芝麻素(sesamin)、芝麻素酚(sesaminol)、表芝麻素(episesamin)、表芝麻素酚(episesaminol)、芝麻酚林(sesamolin)、毛蕊花苷(verbascoside)、四氢姜黄素(tetrahydrocurcumin)、迷迭香酸(rosmarinicacid)、绿原酸(chlorogenicacid)、愈创木酸(guaiareticacid)、二氢愈创木酸(dihydroguiareticacid)、去甲二氢愈创木酸(nor-dihydroguiareticacid)、α-铁杉脂素(alpha-conidendrin)、liovil、picearesinol、丁香脂素(syringaresinol)和去甲络石苷元(nortrachelogenin)。先前的制剂和研究已使用水飞蓟素提取物。但在这些研究中使用提取物产生许多问题。例如，提取物的组成通常不完全确定，导致各种化学组分与其生物活性之间的关系不确定。此外，提取物中存在的未鉴定组分可能会引起不良作用。因此，本发明的局部用组合物可基本不含或完全不含除水飞蓟宾以外的水飞蓟素提取物中存在的木脂素。本发明的局部用组合物在局部用媒介物中含有水飞蓟宾，所述媒介物可增强水飞蓟宾向皮肤的真皮层中的渗透。本发明的局部用组合物的有效性需要水飞蓟宾至真皮的经皮吸收和生物利用度。因此，本发明组合物和方法需要水飞蓟宾渗透通过角质层进入皮肤或头皮的表皮和真皮层，或渗透至毛发或指甲的表面，以及足够的分布至靶向药理学作用的靶位点。基于组合物，本发明的优选组合物包含浓度在0.001重量％至15重量％之间，优选浓度在0.1重量％至10重量％之间，更优选浓度在0.2重量％至5重量％之间的水飞蓟宾。优选地，水飞蓟宾以约1重量％至约5重量％的浓度存在于组合物中。更优选地，其以约2.0重量％的浓度存在于组合物中。为了促进水飞蓟宾的经皮吸收，本发明的局部用组合物可包含化学品或制剂组分或制剂ph调节剂，其增强水飞蓟宾向这些真皮层和/或表面的渗透，同时保持水飞蓟宾在制剂中的溶解性并维持整个制剂的稳定性。这可包含具体包含至少一种“渗透增强剂”。本文使用的短语“渗透增强剂”意指增强水飞蓟宾向皮肤、头皮、毛发或指甲中渗透的任何试剂。局部用制剂通常具有中性或弱碱性ph，而本发明的局部用组合物优选具有低于ph7的ph。在该ph，水飞蓟宾是亲脂性的并且更容易被吸收至皮肤中。本发明的局部用组合物可能需要最终制剂的ph调节，以便增强水飞蓟宾的亲脂性并增强水飞蓟宾从本发明的局部用组合物渗透至皮肤中。可将这些组合物的ph调节至小于ph7.0，或小于约ph6.5，或小于约ph6.0，或小于约ph5.5的ph。组合物的ph也可调节至约ph1至约ph6.5之间的ph。组合物的ph也可调节至约ph2至约ph5.5之间的ph。组合物的ph也可调节至约ph4.0至约ph6.5之间的ph。组合物的ph也可以调节至约ph4.5至约ph6.5之间的ph。组合物的ph也可调节至约ph5.0至约ph6.0之间的ph。组合物的ph可调节至约ph4.5的ph，或约ph5.0的ph，或约ph5.5的ph，或约ph6.0的ph。在该酸性ph范围内，水飞蓟宾渗透至皮肤可进一步增强。如果需要，可用碱或酸调节本发明组合物的最终ph值。为了改善水飞蓟宾进入或渗透至需要保护或损伤和需要治疗的皮肤、毛发、头皮、指甲或嘴唇中，在本发明组合物中采用改善水飞蓟宾渗透通过皮肤外层的媒介物。可改善本发明组合物的渗透或预防或治疗效果的媒介物成分包括但不限于：甲基肉桂酸辛酯(octylmethylcinnamate)、水杨酸辛酯(octylsalicylate)、奥西诺酯(octinoxate)、辛水杨酯(octisalate)、阿伏苯宗(avobenzone)、奥克立林(octocrylene)、聚山梨醇酯诸如聚山梨醇酯80(tween80tm)、二甘醇醚诸如二甘醇单乙基醚、氮酮(1-十一烷基氮杂环庚-2-酮)、油酸、亚油酸、丙二醇、高渗浓度甘油、乳酸、乙醇酸、柠檬酸、和苹果酸、脲、c2-c4醇(诸如乙醇和异丙醇)、聚乙二醇-3-月桂酰胺、二甲基月桂酰胺、山梨醇酐三油酸酯、脂肪酸、具有约10至约20个碳原子的脂肪酸酯、甘油单酯或单酯含量为至少51％的脂肪酸的甘油单酯的混合物(其中单酯是具有10至20个碳原子的那些)，以及脂肪酸的甘油单酯、二酯和三酯的混合物。合适的脂肪酸包括但不限于月桂酸、肉豆蔻酸、硬脂酸、油酸、亚油酸和棕榈酸。单酸甘油酯渗透增强剂包括甘油单油酸酯、甘油单月桂酸酯和甘油单亚油酸酯。可用于本发明的方法的渗透增强剂的实例还包括但不限于以下美国专利中所述的那些：3,472,931；3,527,864；3,896,238；3,903,256；3,952,099；3,989,816；4,046,886；4,130,643；4,130,667；4,299,826；4,335,115；4,343,798；4,379,454；4,405,616；4,746,515；4,316,893；4,405,616；4,060,084；4,379,454；4,560,553；4,863,952；4,863,970；4,879,275；4,940,586；4,960,771；5,066,648；5,164,406；5,227,169；5,229,130；5,238,933；5,308,625；5,378,730；5,420,106；5,641,504；5,716,638；5,750,137；5,785,991；5,837,289；5,834,468；5,882,676；5,912,009；5,952,000；6,004,578；其公开内容通过引用并入本文。本发明组合物可包含至少一种遮光剂(sunscreeningagent或sunfilteringagent)，其足以表现对抗uva光、uvb光或两者的有用保护，用于防止uv光对皮肤的损害。uv辐射(uva和uvb)在诸如皮肤过早老化、眼睛损伤(包括白内障)和皮肤癌等疾病中起着重要作用。这种辐射还抑制免疫系统，降低对抗皮肤病的能力。uvb范围从290到320nm，并且是皮肤变红和晒伤的主要原因，并且损害皮肤的更浅的表皮层。uvb在皮肤癌的发展中起着关键作用，并且在晒黑和光老化中起辅助作用。uva被分成两个波段，测量340-400nm的uvai和从320-400nm延伸的uvaii。uva是主要的晒黑光线。棕褐色是由皮肤dna受伤造成的，皮肤变黑是为了防止进一步dna损伤的不完美尝试，并且dna损伤或突变可导致皮肤癌。已显示晒黑造成的皮肤损伤随着时间的推移而累积。本文使用的“遮光剂”包括遮光剂(sunscreenagent)和物理遮光剂(physicalsunblock)。遮光剂在室温为液体或结晶物质，其能够吸收紫外辐射并以较长波长辐射的形式发射所得能量，例如作为热量。uv-a和uv-b遮光剂可单独使用，以及混合使用。本发明的局部用组合物可利用uv-a和uv-b剂的混合物。合适的遮光剂可为有机的或无机的、亲水的或亲脂的。可用于本发明组合物中的无机遮光剂包括金属氧化物诸如二氧化钛、氧化锌、氧化锆、氧化铁及其混合物。可用于本发明的有机遮光剂选自二苯甲酰甲烷的衍生物、肉桂酸酯、二苯基丙烯酸酯、二苯甲酮、樟脑、对氨基苯甲酸酯、邻氨基苯甲酸酯、水杨酸酯、苯并咪唑类、对称或不对称取代的1,3,5-三嗪类、单体和低聚4,4-二芳基丁二烯羧酸酯和羧酸酰胺、酮三环(5.2.1.0)癸烷、亚苄基丙二酸酯以及所述组分的任何混合物。这些有机遮光剂可为油溶性或水溶性的。特别优选的油溶性遮光剂为1-(4-叔丁基苯基)-3-(4'-甲氧基苯基)丙-1,3-二酮(parsoltm1789)、1-苯基-3-(4'-异丙基苯基)-丙-1,3-二酮、3-(4'-甲基亚苄基)-d,l-樟脑、4-(二甲基氨基)-苯甲酸2-乙基己酯、4-(二甲基氨基)苯甲酸2-辛酯、4-(二甲基氨基)-苯甲酸戊酯、4-甲氧基肉桂酸2-乙基己酯、4-甲氧基肉桂酸丙酯、4-甲氧基肉桂酸异戊酯、2-氰基-3,3-苯基肉桂酸2-乙基己酯(奥克立林)、水杨酸2-乙基己酯、水杨酸4-异丙基苄酯、水杨酸全甲酯(3,3,5-三甲基-环己基水杨酸酯(3,3,5-tirmethyl-cyclohexylsalicylate))、2-羟基-4-甲氧基二苯甲酮、2-羟基-4-甲氧基-4'-甲基二苯甲酮、2,2'-二羟基-4-甲氧基二苯甲酮、4-甲氧基苯并丙二酸二-2-乙基己酯(4-methyoxybenzmalonicaciddi-2-ethylhexylester)、2,4,6-三苯胺基-(对-碳-2'-乙基-1'-己基氧基)-1,3,5-三嗪(2,4,6-trianilino-(p-carbo-2’-ethyl-1’-hexyloxy)-1,3,5-triazine)、二甲基二十二烷基苯甲醛丙二酸酯(dimethicodiethylbenzalmalonate)、二辛基丁酰氨基三嗪酮、2,4-二-[5-1(二甲基丙基)苯并噁唑-2-基-(4-苯基)-亚氨基]-6-(2-乙基己基)-亚氨基-1,3,5-三嗪以及所述组分的任何混合物。水溶性遮光剂可包括2-苯基苯并咪唑-5-磺酸、亚苯基-1,4-二-(2-苯并咪唑基)-3,3’,5,5’-四磺酸及其碱金属盐、碱土金属盐、铵盐、烷基铵盐、链烷醇铵盐和葡糖铵盐；二苯甲酮的磺酸衍生物，优选2-羟基-4-甲氧基二苯甲酮-5-磺酸及其盐；3-亚苄基樟脑的磺酸衍生物，诸如4-(2-氧代-3-亚冰片基甲基)苯磺酸和2-甲基-5-(2-氧代-3-亚冰片基)磺酸及其盐。本发明的组合物将以液体、固体或半固体的合适制剂形式局部施用。局部用组合物可配制在不同的局部用产品中，包括但不限于洗剂、乳状物(milk)、摩丝、血清、喷雾、气雾剂、泡沫、棒状物、笔状物(pencil)、唇膏、凝胶、乳剂、乳膏和软膏。组合物还可经由织造或非织造合成和/或天然纤维织物(即擦拭巾(wipe)或小毛巾(towelette))施用。本发明组合物通常通过制备用于局部施用的组合物领域中已知的常规方法来制备。这样的方法通常涉及在一个或多个步骤中将成分混合至相对均匀的状态，伴随或不伴随加热、冷却、施加真空及其他方法。例如，水飞蓟宾可分散在局部用制剂的疏水或无水组分中。然后可将所有其他制剂成分(除香料外)添加酯所得水飞蓟宾分散体中。所得混合物可在添加其他制剂成分期间或之后加热。混合物的温度可升高到约70℃以获得液体混悬液。可涡旋液体混悬液以分散所有制剂成分。另外或可选地，制剂成分可用顶置混合器或均化器混合。当制剂在混合期间冷却时，当制剂达到约50℃时，可添加一种或多种香料，同时混合。当接近室温时，制剂可能变粘稠。通过添加ph调节剂，可在任何制备步骤期间或在成分混合完成后将制剂的ph调节至ph1至ph7。用本发明的复合颗粒配制的化妆品组合物可含有多种任选组分以增强组合物的低变应原性，并改善组合物的物理性质、性能和美学。良好美学的实例可包括奢华的面霜(cream)和露(lotion)，它们轻盈而不油腻，具有爽滑的感觉，容易铺开和/或快速吸收。良好美学的其他实例包括具有消费者可接受的外观(即，没有令人不愉快的气味或存在变色)并且提供良好的皮肤感觉的组合物。美学剂(aestheticagent)可为香料、色素、着色剂、精油、皮肤感觉剂和收敛剂中的任何一种。合适的精油的实例为橄榄油、玫瑰油、棕榈油、薰衣草油、杏仁油、月见草(夜来香)油、丁香油、桉树油、薄荷油和绿薄荷油。合适的美学剂包括丁香油、薄荷醇、樟脑、桉树油、丁香酚、乳酸甲酯、没药醇、金缕梅和绿茶提取物。本发明组合物可具有额外的期望性质，包括稳定性、长保质期和不存在显著的皮肤刺激。为了实现这样的附加益处，本发明组合物可包含促进组合物稳定性、减少皮肤刺激和/或增强组合物的美学吸引力的试剂，诸如抗氧化剂。包含水飞蓟宾的本发明的局部用组合物还可包含常规的化妆品辅料和添加剂，包括一种或多种防腐剂(诸如山梨酸钾)、有机溶剂、褐变剂、抗氧化剂、稳定剂(诸如山梨醇)、润滑剂(诸如硅酮、二甲基硅油)、润肤剂、21-α-羟基酸、缓和剂、消泡剂、保湿剂(诸如鲸蜡醇)、维生素(诸如烟酰胺和/或生育酚)、芳香剂(诸如薰衣草油)、离子型或非离子型增稠剂、表面活性剂(诸如聚山梨酯80)、填充剂、螯合剂、聚合物、抛射剂、碱化或酸化剂、遮光剂、脂肪化合物(例如油、蜡、醇、酯、脂肪酸)、着色剂或其混合物，或常规用于化妆品或防晒组合物中的任何其它成分。该任选组分在掺入化妆品组合物中时应适合用于与人皮肤接触，而没有过度的毒性、不相容性、不稳定性、过敏性响应等。《国际化妆品成分词典和手册》(thepersonalcosmeticingredientdictionaryandhandbook)(thepersonalcareproductscouncil；第13版(2010年1月1日))描述了常用于护肤行业的各种非限制性化妆品和药物成分，其适用于本发明的组合物。这些类别的实例包括：研磨剂、吸收剂、美学组分诸如芳香剂、颜料、上色剂/着色剂、精油、皮肤感觉剂、收敛剂等(例如丁香油、薄荷醇、樟脑、桉树油、丁香酚、乳酸薄荷酯、金缕梅馏出物)、抗痤疮剂、防结块剂、消泡剂、抗微生物剂、抗氧化剂、生物添加剂、缓冲剂、填充剂、螯合剂(chelatingagent)、化学添加剂、着色剂、化妆品收敛剂、化妆品杀生物剂、变性剂、药物收敛剂、局部用止痛剂、成膜聚合物、润滑剂、遮光剂、ph调节剂、抛射剂、还原剂、螯合剂(sequestrant)、皮肤漂白和增亮剂、皮肤调理剂、皮肤舒缓剂和/或愈合剂和衍生物、皮肤处理剂、增稠剂和维生素及其衍生物。除水飞蓟宾外，本发明组合物还可含有一种或多种护肤剂。可掺入本发明的局部用组合物中的其他试剂包括局部麻醉剂(诸如苯佐卡因(benzocaine)、利多卡因(lidocaine)和苯甲醇)、芦荟汁(aloevera)、芦荟提取物、库拉索芦荟叶汁、维甲酸(retinoid)、dna修复酶、抗菌剂(诸如季铵化合物、杆菌肽(bacitracin)、新霉素(neomycin)、多粘菌素(polymyxin))、锌盐和黄嘌呤。更一般地说，与本发明的一种或多种局部用制剂组分相容的已知活性成分可用于本发明的局部用组合物中，所述活性成分在治疗或减轻皮肤损伤或不适的各个方面具有一定效用。润肤剂是软化和舒缓皮肤的物质。当在本发明组合物中施用于皮肤时，润肤剂提供防止皮肤干燥的保护作用。可用于本发明组合物的润肤剂可包括一种或多种以下物质：透明质酸、透明质酸钠、雾冰草脂(illipebutter)、牛油树脂(sheabutter)，shora籽脂、ceraphyl847tm(辛基十二烷基硬脂酰硬脂酸酯)、苯甲酸c12-15烷基酯、四异硬脂酸季戊四醇酯和/或己二酸二异丙酯。合适的表面活性剂/乳化剂包括甘油硬脂酸酯、鲸蜡硬脂醇聚醚(ceteareth)，鲸蜡醇聚醚(ceteth)、羊毛脂醇聚醚(laneth)、月桂醇聚醚(laureth)、异硬脂醇聚醚(isoseareth)、硬脂醇聚醚(steareth)、鲸蜡醇(cetylalcohol)、癸醇聚醚(deceth)、十二烷基苯酚聚醚(dodoxynol)、甘油棕榈酸酯、羊毛脂醇聚醚(laneth)、肉豆蔻醇聚醚(myreth)、壬苯聚醇(nonoxynol)、辛苯聚醇(octoxynols)、油醇聚醚(oleth)、peg-蓖麻油，泊洛沙姆(poloxamer)(例如，泊洛沙姆407)、泊洛沙胺(poloxamine)、聚山梨酯(包括聚山梨酯80)、月桂酸钠、月桂醇聚醚硫酸铵、月桂醇聚醚硫酸钠、月桂酰肌氨酸钠、月桂酰牛磺酸钠、月桂基硫酸钠、甲基椰油酰基牛磺酸钠、甲基油酰基牛磺酸钠、壬苯聚醇硫酸钠、鲸蜡基硫酸钠、鲸蜡硬脂醇硫酸钠、椰油酸钠、椰油基羟乙基磺酸钠和椰油基肌氨酸钠。其他合适的表面活性剂/乳化剂列于《国际化妆品成分词典和手册》(thepersonalcosmeticingredientdictionaryandhandbook),thepersonalcareproductscouncil；第13版(2010年1月1日))。这些化合物还可起到增强水飞蓟宾向皮肤渗透的作用。适用于本发明组合物的防腐剂的实例包括山梨酸酯及其盐(诸如山梨酸钾)、咪唑烷基脲、二偶氮烷基脲、苯氧乙醇、对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸乙酯、对羟基苯甲酸丙酯、苯氧乙醇、辛甘醇、乙基己基甘油、己二醇，以及这些防腐剂的组合。适用于本发明组合物的增稠剂的实例包括肉豆蔻酸异丙酯、棕榈酸异丙酯、新戊酸异癸酯、角鲨烯、矿物油、苯甲酸c12-c15酯和氢化聚异丁烯。本发明组合物的另外的实施方案可包括上述各种成分的排列。因此，包括本文公开的成分的这种排列的局部用制剂明确地在本发明的范围内。本发明还包括用于治疗或预防皮肤损伤的药物，以及制备此类药物的方法。此类方法涉及使有效量(或组合有效量)的水飞蓟宾与一种或多种上述药剂与可用于局部施用的载体组合。本发明组合物对本文公开的成分和药物的存在或各种排列具有鲁棒性，同时维持水飞蓟宾的生物活性和增强上述水飞蓟宾的皮肤渗透。施用本发明组合物的方法使用这些组合物的方法包括将治疗有效量的本发明组合物局部施用于受试者的局部区域，以治疗、预防和/或降低多种皮肤病症状以及皮肤老化的风险，包括但不限于，与痤疮酒渣鼻和皮肤老化有关的面部发红/红斑；干燥症/皮肤干燥；色素沉着异常；创伤性瘀伤/手术后瘀伤/老年性紫癜；皮肤伤口；由细胞毒性和发疱性化学战剂诸如芥子气或硫芥和氮芥引起的化学诱导的皮肤损伤；化学诱导的皮肤损伤诸如接触性皮炎、刺激性皮炎和皮炎/特应性(dermatitis/atop)、皮肤炎症诸如牛皮癣、尿布皮炎、特应性皮炎(atopicdermatitis)；皮肤光老化诸如紫外线辐射引起的皱纹和色素沉着异常，光致癌诸如光化性角化病/非黑素瘤皮肤癌，环境诱导的皮肤损伤诸如uva和uvb诱导的皮肤损伤诸如晒伤/晒黑/皮肤增厚/皱纹；皮肤氧化损伤；环境诱导的皮肤损伤，诸如与放疗有关的放射性皮炎/纤维化。这些方法包括使受试者的皮肤、头皮、毛发、嘴唇或指甲或其他靶位点与上述本发明组合物接触。在本发明中，术语“受试者”意指哺乳动物，优选人。受试者可为人消费者或患者。术语“治疗有效量”意指在治疗、预防或管理一种或多种皮肤病症中提供治疗益处的组合物的量。本发明组合物也可用于调节皮肤病症，包括皮肤老化的迹象。皮肤病症的调节包括改善皮肤外观和/或感觉，并且可包括延缓、最小化、预防和/或改善皮肤老化的迹象。这可包括治疗或最小化由于皮肤老化引起的所有外表可见和触觉表现，包括但不限于，皱纹、皮肤纹、皮肤斑点、皮肤变色、皮肤粗糙和皮肤坚实度和/或弹性的丧失。这些迹象可能是由固有或外在因素引起或诱导的，例如时序老化和/或环境损害，包括但不限于日光、uv辐射、烟雾、臭氧和污染物。水飞蓟宾对皮肤具有抗氧化、抗炎和抗衰老作用。因此，本发明的局部用水飞蓟宾组合物可用于预防或治疗对皮肤的氧化损伤以及由紫外线辐射引起的光老化。水飞蓟宾对皮肤具有抗癌和抗炎作用。因此，本发明的局部用水飞蓟宾组合物可用于预防或治疗皮肤炎症、光致癌(诸如光化性角化病/非黑素瘤皮肤癌)、化学诱导的皮肤损伤(诸如接触性皮炎)、刺激性皮炎、皮炎/特应性，以及与痤疮酒渣鼻和皮肤老化有关的面部发红/红斑。水飞蓟宾促进皮肤中的dna修复和伤口愈合。因此，本发明的局部用水飞蓟宾组合物可用于预防或治疗皮肤伤口、环境诱导的皮肤损伤(诸如uva和uvb诱导的皮肤损伤，包括晒伤/晒黑/皮肤增厚)、由细胞毒性和发疱性化学战剂(诸如芥子气或硫芥类和氮芥类)引起的化学诱导的皮肤损伤、环境诱发的皮肤损伤(诸如与放疗有关的放射性皮炎/纤维化)以及创伤性瘀伤/手术后瘀伤/老年性紫癜。水飞蓟宾还能湿润和美白和增亮皮肤。因此，本发明的局部用水飞蓟宾组合物可用于预防或治疗干燥症、皮肤干燥以及皮肤色素沉着异常。本发明的组合物可用于局部施用，即在身体的外表面上，特别是在皮肤、毛发、头皮、嘴唇和指甲上。本发明提供了通过向易受此类损伤或持续此类损伤的受试者施用治疗有效量的本发明组合物治疗或预防可能由年龄或暴露于损害皮肤的病症或药剂引起的皮肤损伤的方法。组合物可在个体暴露于皮肤损伤剂或条件(诸如uv光)之后施用。组合物优选以覆盖待处理或保护区域的皮肤上的薄层施用。可摩擦组合物直至组合物在皮肤或其他靶区域的表面上不再可见。这可增强水飞蓟宾向表皮或真皮中的渗透。本发明还提供了通过向患者施用治疗有效量的本发明组合物同时基本上避免刺激皮肤、头皮、毛发或指甲治疗、预防或管理皮肤病状况的方法。组合物也可以对长时间保持与皮肤接触的产品安全和有效的浓度施用。组合物也可以用于施用的高浓度进行施用，此后立即除去。当然，本发明组合物的治疗有效量将取决于所治疗的皮肤损伤的严重程度或皮肤受到保护的预期损害以及受试者的体重和一般状态。典型地，体外使用的剂量可提供可用于原位施用药物组合物的量的指导，并且动物模型可用于确定治疗特定病症的有效剂量。通过施用本发明组合物治疗对受试者的皮肤损伤的方法可包括向需要所述治疗的受试者施用每平方英寸皮肤每天约15mg至约6,000mg水飞蓟宾。通过施用本发明组合物防止对受试者的皮肤损伤的方法可包括向需要这种预防性治疗的受试者每平方英寸皮肤每天施用约0.001mg至约1.8g水飞蓟宾。在通过施用本发明组合物预防皮肤损伤的方法的一个实施方案中，使用本发明组合物，向受试者每平方英寸皮肤每天施用约0.010mg至约30mg水飞蓟宾。在通过施用本发明组合物预防皮肤损伤的方法的一个实施方案中，使用本发明组合物，向受试者每平方英寸皮肤每天施用至少约0.03mg水飞蓟宾。在通过施用本发明组合物预防皮肤损伤的方法的一个实施方案中，使用本发明组合物，向受试者每平方英寸皮肤每天施用约0.1mg水飞蓟宾。在通过施用本发明组合物预防皮肤损伤的方法的一个实施方案中，使用本发明组合物，向受试者每平方英寸皮肤每天施用约1mg水飞蓟宾。在本发明组合物用于预防皮肤损伤或保护皮肤免遭损伤的方法和用途中，在暴露于损害皮肤的状况或药剂诸如uv光或其他辐射源之前，可将组合物施用于需要这种保护的受试者。在受试者暴露于皮肤损伤剂或状况之前，组合物可施用12小时或更少，或5小时或更少，或更优选2小时或更少。在本发明的用于治疗皮肤损伤的方法和用途中，在受试者暴露于皮肤损伤剂或状况后，本发明组合物可施用于需要所述治疗的受试者。暴露于皮肤损伤剂后，可尽快施用该组合物。当注意到皮肤损伤的有害症状时，治疗通常更晚实施。本发明组合物的局部施用可多于约每周一次、两次、三次、四次、五次、六次或七次，或者如果需要，甚至多于每天一次、两次、三次、四次、五次、六次或七次。本发明的用于通过局部施用有效量的本发明组合物治疗受试者的皮肤的方法可包括平均每天一次施用组合物；或平均每天两次；或平均每天三次；或多于约每天三次。组合物可平均每天约两次，在早晨起床时和傍晚休息前施用。组合物可施用并留在皮肤上。或者，可例如通过洗涤皮肤施用和去除组合物。该组合物还可通过点涂施用，例如直接施用于需要的区域，或者可通常施用以覆盖整个皮肤区域。本发明组合物将以液体(诸如凝胶、洗剂、乳状物、乳剂、血清、泡沫等)和固体或半固体(诸如乳膏、软膏、唇膏等)的合适制剂形式施用。本发明组合物也可直接整合到包装绷带中以方便施用。本发明的绷带附带预先施用的本发明组合物以允许容易施用于受试者。如上所述和制药领域技术人员已知的，这些制剂将用合适的赋形剂诸如润肤剂、保湿剂、增稠剂、乳化剂、染料、香料等制备。试剂盒在又一方面，本发明提供用于治疗或预防皮肤或产生期望的美容效果的试剂盒。这些试剂盒在容纳在合适包装中的一个或多个容器中包含本文所述的组合物。这些试剂盒可进一步包含根据下面描述的各种方法教导使用试剂盒组分的说明书。这种试剂盒还可包括指示或建立组合物的活性和/或优点和/或施用本发明局部用制剂的推荐方法的信息，诸如科学文献参考、包装说明书材料、美容试验结果和/或这些的阐述等。这种信息可基于各种研究的结果，例如，使用涉及体内模型的实验动物的研究和基于人类化妆品或临床试验的研究。本文所述的试剂盒可提供、销售和/或促销给健康护理提供者(例如皮肤科医师和其他医师)、皮肤护理外观护理提供者(包括美容师、发型师等)。化妆品用试剂盒也可直接提供、销售和/或直接提供给消费者。尽管已经参考多个实施方案具体示出和描述本发明，但是本领域技术人员应该理解，可在不脱离本发明的精神和范围的情况下对本文公开的各种实施方案进行形式和细节上的变化并且本文公开的各种实施方案不意图作为对权利要求范围的限制。本文引用的所有参考文献都通过引用整体并入。现在描述的本发明可通过参考以下实施例更容易地理解，所述实施例仅被包括用于说明本发明的实施方案的某些方面。如本领域技术人员从以上教导和以下实施例将认识到的，其他技术和方法可满足权利要求并且可在不脱离所要求保护的发明的范围的情况下使用，这些实施例并不意图限制本发明。实施例实施例1：说明本发明一种含水飞蓟宾制剂的制备。制备局部用制剂，其包含：该组合物形成局部用水包油乳剂，混合后将ph调节至ph5至ph6之间的最终ph。该制剂显示水飞蓟宾向皮肤中的高渗透并针对辐射诱导的皮肤损伤提供优异的保护。实施例2：说明局部用水飞蓟宾组合物在动物(小鼠)模型中的功效。通过磷酸h2axser139测量的dna损伤通常用作dna损伤的量度。在小鼠中局部施用水飞蓟宾/防晒制剂减少了由uvb辐射引起的dna损伤。在180mj/cm2的不同局部用治疗和单次uvb暴露后，处死小鼠并收集皮肤组织样品，然后进行免疫组织化学染色以用于凋亡细胞的磷酸-h2a.x和tunel染色。图1显示几种不同的含水飞蓟宾的化合物显著(>2x)降低了经辐射的小鼠皮肤细胞(sb＝水飞蓟宾)中的dna损伤。虽然对照动物在uvb辐射后显示约55％的阳性细胞，但本发明的水飞蓟宾制剂提供的保护导致阳性细胞显著降低至约22％阳性细胞。这些数据表明，将本发明的水飞蓟宾制剂局部施用于小鼠减少了由uvb辐射引起的dna损伤。a.来自本发明局部用组合物的水飞蓟宾渗透至小鼠皮肤中。本发明的局部用水飞蓟宾组合物在小鼠皮肤中具有优异的渗透性。通过将单独的水飞蓟宾(不亲脂的)、单独的uvb阻断剂或水飞蓟宾+紫外线阻断剂局部施用于小鼠(4只小鼠/组)证明了这一点。8小时后，分离真皮和表皮，并通过hplc分析水飞蓟宾水平。如图2所示，本发明制剂中含有水飞蓟宾+uv阻断剂的制剂在皮肤中显示出令人惊讶的高水平渗透：平均为单独施用的局部用水飞蓟宾的7倍。b.本发明的水飞蓟宾组合物局部施用于小鼠减少了由uvb辐射引起的胸腺嘧啶二聚体形成。使用来自上述用于皮肤渗透研究的相同小鼠的皮肤样品证明了这一点。分析收获的皮肤的胸腺嘧啶二聚体形成，一种与皮肤光损伤相关的快速光反应。图3a和3b显示uvb照射的小鼠皮肤的两个放大图像(放大400倍)。图3a是不含水飞蓟宾并且没有uv保护剂的uvb辐射照射的小鼠皮肤。图3b是在施用包含水飞蓟宾和uv保护剂的本发明组合物后用uvb辐射照射的小鼠皮肤。如图3a和3b所示，使用红色生色素3-氨基-9-乙基咔唑(aec)对皮肤进行免疫组织化学染色显示胸腺嘧啶二聚体存在的显著降低，可能是由于皮肤暴露于本发明的局部用水飞蓟宾组合物后胸腺嘧啶二聚体去除率增加。c.在存在或不存在uva/uvb遮光剂的情况下，动物研究中水飞蓟宾渗透至表皮和真皮中的实验优化。小鼠分成如下5组：1-对照(仅dmso，阴性对照)，2-(在dmso中的水飞蓟宾，水飞蓟宾渗透的阳性对照，虽然不适合人类施用)，3-不含水飞蓟宾的制剂基质，4-制剂基质+水飞蓟宾，和5-制剂基质+水飞蓟宾+uv遮光剂)；如所示，将10只小鼠/组(5只小鼠/组/时间点)进行局部用治疗。随后，在治疗后8小时或16小时，收集剃刮的皮肤组织，擦拭数次以从皮肤上除去任何剩余的制剂，然后分离成表皮和真皮。简言之，将剃刮的皮肤干燥5分钟，置于0.25％胰蛋白酶上，真皮侧向下，并在4℃漂浮过夜。第二天从胰蛋白酶剥离皮肤，剥去真皮层，留下表皮；两层都快速冻结。然后评估皮肤层中的水飞蓟宾水平。由于表皮是光化性角化病(ak)和鳞状细胞癌(scc)开始的地方，并且真皮是胶原蛋白及其他蛋白质的氧化损伤的位点，所以最佳的局部用组合物具有增强的对真皮和表皮皮肤层两者的渗透。d.使用优化的水飞蓟宾/遮光剂组合物的ii期人临床试验包括测试变态反应、防晒因子(spf)、紫外线a和b(uva和uvb)保护以及产生ak和/或scc的临床相关生物标志物。正常的成人受试者(n＝30)暴露3周的时间间隔，使用finn室贴剂测试：a)基质局部用制剂媒介物，b)4％水飞蓟宾基质媒介物，c)含宽带uv遮光剂的基质媒介物中的4％水飞蓟宾，和d)阳性刺激性对照(月桂基硫酸钠)。在诱导阶段期间移除贴片30分钟后和在挑战施用后48、72和96小时(接触致敏潜力)及第2至22天(累积刺激潜力)，使用从0(无反应)到4(严重红斑反应)的分级量表对施用部位可能的皮肤红斑反应评分。正常成人受试者(n＝30)将在未暴露于阳光的皮肤(右臀部)上暴露于分级宽带uvb以确定med。med用于确定每个标准方案的spf。遵循关于uva保护的四星评级系统的fda指导原则；与测量uvb光保护的spf方法类似，体内持久性颜料变暗(persistentpigmentdarkening)(ppd)方法将用于测量uva保护。正常成人受试者将在uv治疗之前进行局部用治疗。随后，在8小时或16小时(n＝5)，收集刮剃的皮肤组织，擦拭数次以从皮肤上除去任何剩余的制剂，分离成表皮和真皮，并且处理用于相关生物标志物的免疫组织化学染色：环丁烷嘧啶二聚体(cpd，包括胸腺嘧啶二聚体)和水飞蓟宾水平。实施例3：稳定性测试对实施例1中描述的本发明的水飞蓟宾制剂进行稳定性测试。2％水飞蓟宾制剂的等分试样(载药量约为2.0±0.1％)在室温和40℃储存两个月。每个等分试样在两个月期间内取样四次，通过hplc/uv分析确定水飞蓟宾的相对浓度。采样和测试方案包括将四个各自约200mg的样品引入单独玻璃瓶中。这些样品用5.0ml甲醇稀释，涡旋混合成溶液。将这些溶液混合并将100μl等分试样添加至4900μlmeoh(稀释液1)中。此后，将500μl稀释液1与4500μlmeoh(稀释液2)混合。经由lc/ms-ms分析分析这些稀释液。对于hplc/uv分析，用1900μlmeoh稀释最初的甲醇溶液样品(100μl)，并通过hplc/uv(290nm)分析50μl进样。hplc在长18c柱，5％溶剂a(水、乙酸铵(10mm)和甲酸(0.1％)上进行分钟，在19分钟时上升到95％溶剂b(meoh:乙腈)，在95％保持13.5分钟，然后在36分钟时回至5％，并在5％保持4分钟；总运行时间40分钟。在使用分配泵包装于3盎司白色管中，储存在5℃、25℃和40℃的受控温度室中的制剂上进行附加的稳定性测试。等分试样的物理测试包括评价颜色、气味、外观、ph和粘度。等分试样的微生物学测试包括测试总需氧计数和总酵母及霉菌。防腐功效测试包括对抗微生物效力测试的评价。a.水飞蓟宾浓度与任何等分样品中的室温样品或在任何时间点相比，保持在40℃的样品都没有表现出水飞蓟宾含量的统计学差异。这些数据表明，本发明的水飞蓟宾制剂在室温和升高的温度保持完全的水飞蓟宾含量达至少两个月，没有统计学沉降、析出或水飞蓟宾含量的其他损失。b.物理稳定性在三次冷冻/解冻循环之后，受试制剂显示成分分离。在40℃三个月后，制剂在表面及其壁周围也显示出变黑/变褐。在所有测试的等分试样中，ph值保持在规定的范围内，5℃时的粘度从23,950厘泊(cps)的初始读数增加至45,250cps。在25℃的粘度从23,950cps的初始读数下降至17,000cps。在40℃的粘度从23,950cps的初始读数增加至33,250cps。在保持在5℃、25℃或40℃的任何样品中未观察到成分分离。c.微生物学稳定性这些制剂全部通过在40℃在3个月的微生物学测试。d.防腐功效测试显示防腐剂在发挥抗微生物效力和保持产品的无菌性方面是有效的。来自样品在5℃、25℃和40℃保持3个月的这些数据表明本发明制剂在物理、化学和微生物学是稳定的。基于该标准，加速稳定性测试，预计2年的制剂稳定性，可指定2年的有效期。制剂包装中应包括避免反复冻融的建议。实施例4：皮肤渗透按照下表的组分和量配制各自含有1％水飞蓟宾的五种制剂(值为20g总制剂重量中的mg含量)：12345维生素e2020202020鲸蜡醇736736736736736甘油单硬脂酸酯304304304304304二甲硅油384384384384384吐温80200200200200200奥西诺酯15007503751500辛水杨酯10005002501000水飞蓟宾200200200200200sds160160160160160对羟基苯甲酸甲酯2020202020对羟基苯甲酸丙酯1010101010水适量适量适量适量适量1mhcl120120120120120山梨醇10001000100010001000在这些制剂中，遮光剂的水平各不相同：制剂#1具有7.5％奥西诺酯和5％辛水杨酯；制剂#2具有3.75％奥西诺酯和2.5％辛水杨酯；制剂#3具有1.875％奥西诺酯和1.25％辛水杨酯；制剂#4具有0.75％奥西诺酯和0.5％辛水杨酯；制剂#5具有0％奥西诺酯和0％辛水杨酯。用五种制剂中的每一种处理安装在franz细胞上的猪耳(缓冲液在下面流动以模拟血流)。分离真皮和表皮并在各个时间点评价水飞蓟宾含量。两个样本在每个时间点运行。在每个时间点，通过质谱法定量真皮、表皮和溶液(用于模拟血流的缓冲液)中的水飞蓟宾水平。图4中显示5种制剂中的每一种在0至180分钟之间时间点的表皮、真皮和溶液中的水飞蓟宾浓度。数据显示，在表皮和真皮中30分钟后水飞蓟宾的一致累积。在较晚的时间点，与真皮相比，在表皮中检测到约3倍多的水飞蓟宾，并观察到真皮中水飞蓟宾增加的趋势。令人惊讶的是，在最初3小时，在溶液中几乎没有检测到水飞蓟宾，表明水飞蓟宾在该体外动物皮肤模型中极少水飞蓟宾被吸收并转移至“血液”，表明水飞蓟宾停留在我们想要的皮肤里。另一个令人惊讶的发现是，在该体外动物皮肤模型中，这些测试制剂中遮光剂的水平对皮肤层中水飞蓟宾渗透水平没有影响，表明它是允许向皮肤渗透的制剂。最后，在这些测试中在30分钟至3小时之间在皮肤中检测到水飞蓟宾浓度，在稍后的时间点观察到水飞蓟宾在真皮中增加(随后在表皮中减少)的趋势。实施例5：水飞蓟宾功效测试-硫芥模型测试实施例1中描述的本发明制剂在治疗暴露于硫芥(sm)或对照(c)的小鼠中对皮肤的损伤中的功效。skh-1无毛小鼠的背侧皮肤上的sm暴露是皮肤损伤的模型，其导致强烈的皮肤毒性，包括水肿、炎症和水疱。使用蒸汽杯将小鼠皮肤暴露于净sm蒸气6分钟(图5中阐述的暴露和治疗方案)。sm暴露后1小时开始治疗，并且此后每24小时开始治疗，持续28天。治疗包括：1.对照(假的，没有硫芥暴露)2.单独制剂基质(fb)3.1％水飞蓟宾/丙酮(sb/ace)4.实施例1的1％水飞蓟宾制剂(sb-1％f)5.实施例1的2％水飞蓟宾制剂(sb-2％f)在暴露后1、3、7、21和28天，使小鼠安乐死，收集来自所有研究组的对照和暴露部位的背部皮肤组织冲孔，并且：1)使用液氮速冻，2)在10％磷酸盐缓冲的福尔马林中固定，或3)在bouin溶液中固定。处理固定的皮肤组织样品并对皮肤切片进行染色，并将冷冻组织进行裂解物制备和蛋白质分离用于western印迹分析。评价组织的损伤终点，包括发疱、髓过氧化物酶和cox-2水平及胶原变化。a.微发疱sm暴露引起小鼠皮肤中的炎症相关的组织病理学改变和微发疱。图6a显示对照、硫芥(sm)、水飞蓟宾/丙酮(sb/ace)、1％水飞蓟宾制剂(sb-1％)和2％水飞蓟宾制剂(sb-2％)的代表性染色皮肤切片；箭头指示在*400放大倍数下指示微发疱的真皮/表皮分离。图6b显示皮肤切片中记录的微发疱百分比。每条上方显示的百分比表示治疗后sm诱导的微发疱的百分比降低。这些数据显示1％水飞蓟宾/丙酮提供暴露于sm的皮肤的最佳治疗；本发明的1％和2％水飞蓟宾制剂连着均有效治疗小鼠皮肤组织中的sm诱导的微发疱。在sm暴露的小鼠皮肤中的微发疱治疗中，单独的制剂基质提供弱和非显著(小于30％)的效果。b.髓过氧化物酶水平组织髓过氧化物酶(mpo)活性/水平是嗜中性粒细胞浸润的指标，是小鼠模型中sm诱导的皮肤毒性的生物标志物。我们使用western印迹分析评价皮肤组织中的mpo水平。sm暴露后mpo水平急剧增加(图7a)。在用水飞蓟宾/丙酮及1％和2％水飞蓟宾制剂处理的皮肤中mpo水平降低。在制剂对照中看到mpo水平略微降低。基于在代表性western印迹中观察到的倍数变化，这些结果图示于图7b中；条形图上的百分比表示硫芥暴露和指示的水飞蓟宾(或制剂对照)处理后mpo水平的百分比降低。c.cox-2水平同样，在这些皮肤样品中也确定了另一种炎症标志物cox-2。来自无毛小鼠的皮肤切片显示sm暴露后cox-2水平的强烈增加(图8)。在用1％水飞蓟宾/丙酮处理和在2％水飞蓟宾制剂中处理后，观察到sm诱导的cox-2水平增加的强烈降低。d.胶原变化在这些皮肤样品中使用胶原纤维的三色染色还确定了sm暴露后的胶原变化，其使用阳性(强度)评分进行定量。sm暴露后观察到胶原降解和片段化(更浅的三色染色)。如通过更深的胶原染色可见(图9a)，(本发明)水飞蓟宾制剂处理逆转了这些效果。与sm暴露相比，条形图上的百分比表示胶原蛋白回收百分比。这些数据表明，用本发明水飞蓟宾制剂以1％和2％的浓度进行处理有效逆转(>40％)硫芥(sm)诱导的微发疱、髓过氧化物酶和cox-2水平及胶原蛋白降解。实施例6：化学战剂硫芥造成延迟起泡和失能的皮肤损伤。为了鉴定针对hd诱导的皮肤损伤的有效对策，在皮肤细胞中使用硫芥类似物2-氯乙基乙基硫醚(cees)诱导的损伤生物标志物进行功效研究。数据表明水飞蓟宾在减弱cees诱导的皮肤损伤和氧化应激方面具有强治疗功效。在皮肤细胞中，cees暴露前30分钟、暴露后30分钟、暴露前60分钟、暴露后60分钟水飞蓟宾处理引起cees诱导的细胞活力降低、凋亡和坏死细胞死亡、dna损伤和氧化应激增加的显著预防或逆转。a.用于皮肤表皮细胞和成纤维细胞的活力的mtt测定在期望的暴露和细胞处理后24或48小时进行细胞活力的mtt测定(用1mg/ml的mtt；sigma-aldrich)。简言之，在期望的时间点除去培养基，在无血清培养基中于37℃将mtt添加至细胞4小时。然后除去mtt溶液并在添加100mldmso后在540nm处读取吸光度。hoechst-碘化丙啶(pi)染色是在上述暴露和处理24小时后通过用10mlpi(1mg/ml)和hoechst33342(1mg/ml；sigma)以3:1的比例染色细胞进行的。在每个处理时间结束时，收集漂浮物和附着的细胞，用16pbs洗涤两次，保持在冰上并用hoechst-pi染料以3:1的比例染色。对于hoechst33342，激发波长是350nm并且发射波长是461nm；对于pi，激发波长是535nm并且发射波长是617nm。细胞的定量一式三份进行每次处理，并且在不同的领域(每个样品至少10个随机场)中计数每个样品200个细胞以使用荧光显微镜评分活细胞、凋亡和坏死细胞的百分比。在cees暴露24小时之前和之后30分钟和60分钟，10μm浓度的水飞蓟宾处理导致预防或逆转小鼠表皮jb6细胞和原代皮肤成纤维细胞中cees诱导的细胞活力降低(分别为图10a和10b)。b.用于皮肤表皮细胞和成纤维细胞中dna合成的brdu测定在胸腺嘧啶核苷类似物brdu(5-溴-2'-脱氧尿苷)掺入新合成的dna并随后用抗brdu抗体进行检测后，用brdu测量细胞增殖。将细胞在适于显微镜检查的容器中培养，从培养基中取出并用brdu标记溶液代替培养基用brdu储备溶液标记。孵育后，除去标记溶液并用pbs洗涤。然后将细胞固定、透化并酸洗。通过除去溶液并添加1ml抗体染色缓冲液检测掺入的brdu。加入抗brdu一抗，将细胞孵育，用x-100透化缓冲液洗涤，添加荧光标记的二抗，并在成像前再次孵育细胞。在cees暴露24小时之前和之后30分钟和60分钟，10μμ浓度的水飞蓟宾处理导致预防或逆转小鼠表皮jb6细胞和原代皮肤成纤维细胞中cees诱导的dna合成的减少(分别为图11a和11b)。c.用于皮肤表皮细胞和成纤维细胞中dna损伤的彗星测定使用单细胞凝胶电泳(scge)或碱性彗星试验(ph大于或等于13)和用3mg/ml的pi染色测量dna损伤。简言之，1小时后将来自暴露组和处理组的细胞混悬液(300ml)与1％低熔点琼脂糖混合，并添加预先用1％正常熔点琼脂糖包被的载玻片中。然后将这些载玻片在4℃在溶胞溶液中孵育过夜，洗涤，放置用于dna解旋并在22v和200ma电泳20分钟。接下来，在500mmtris-hcl,ph8.0中和玻片，用h2o洗涤并在用3mg/ml的pi染色后干燥过夜。使用尼康倒置显微镜在6200倍放大率对在dna损伤情况下观察到的细胞和彗星中dna的荧光进行评分，并使用附属的coolsnapesccd相机捕获图像。捕获150个细胞，在一式三份的载玻片上每份50个，并使用komet5.5软件(andortechnology)对尾长矩(tem；尾长和尾dna百分比的乘积)进行评分。在jb6细胞和成纤维细胞两者中，cees的细胞毒性效应与其dna损伤性质相关，并且本发明人以增加的tem的形式显示cees诱导的dna损伤，表明细胞中的受损dna(彗星测定)、h2a.xser139和p53ser15磷酸化。因此，采用这些已建立的生物标志物，水飞蓟宾对cees诱导的dna损伤的预防和挽救功效导致dna彗星的代表性荧光显微照片(图12a)及其定量，水飞蓟宾前处理和后处理在jb6细胞(图12b)和成纤维细胞(图12c)两者中均引起cees诱导tem的减少或逆转。类似地，如免疫印迹(图13a)及其定量(图13b和13c)所示，水飞蓟宾还引起cees诱导的h2a.x(图13b)和p53磷酸化(图13c)的减少和逆转。总之，这些研究结果表明，cees的化学性质与硫芥相似，并且cees，如硫芥，诱导发疱并且是烷化剂，尽管cees具有单官能烷基化性质，因此与硫芥相比毒性较低。最后，这些研究显示，本发明的水飞蓟宾制剂具有强的抗氧化、抗炎、抗血管生成、抗转移和dna修复性质，其既可预防又可治疗皮肤来自氧化应激、炎症和通过本实施例中研究的皮肤损伤的发疱模型产生的蛋白酶的活化的皮肤损伤。为了说明和描述的目的，已经呈现了前述实施例。此外，该描述不旨在将本发明限制于本文公开的形式。因此，与上述教导相称的变化和修改以及相关领域的技术或知识都在本发明的范围内。上文描述的实施方案还旨在解释用于实践本发明的已知的最佳模式，并且使本领域的其他技术人员能够在这些或其他实施方案及本发明的特定施用或用途所需的各种修改中利用本公开内容。旨在将所附权利要求解释为以现有技术允许的程度包括替代实施方案。当前第1页12