本申请要求2015年10月26日提交的美国临时专利申请第62/285,352号的权益和优先权，其全部内容通过引用并入本文。关于联邦政府资助的研究或开发的声明本发明是由美国国家科学基金会教师早期职业发展(career)计划准许的美国政府支持项目(bbbe1254608)以及通过向j.oakey提供的nih资助的怀俄明州生物医学研究卓越计划idea网络(p20rr016474和p20gm103432)所获得。美国政府对本发明享有一定的权利。
背景技术：
：：基于peg的水凝胶已经被广泛用作给药和组织支架材料。形成peg水凝胶的聚合物中常见的是聚乙二醇二丙烯酸酯(pegda)形式的可光聚合的丙烯酸酯。近来，微流体和微加工技术使得可以微型化pegda结构，从而使得纳米和微米结构的水凝胶的诸多可能的应用成为可能。然而，氧的存在显著抑制了pegda的光聚合，这进一步阻碍了持续高氧浓度环境中的水凝胶形成。使用采用聚二甲基硅氧烷(pdms)微流体装置封装在氟油中的pegda，我们发现聚合完全被抑制在临界液滴直径以下。通过开发结合反应动力学和氧扩散的综合模型，我们证明临界液滴尺寸主要取决于由连续油相的氧饱和浓度表示的氧气输送速率。为了克服这一基本限制，我们提出了一种氮微夹套(micro-jacketed)微流体装置，该装置建立了氧降低的环境，该氧降低的环境使得微米级pegda乳胶液滴稳定、快速的芯片光聚合成为可能。光聚合在诸多工业和研究应用中也发挥着重要作用，包括用于细胞包封和递送的生物材料。用于细胞包封的水凝胶材料的常见设计是使用二丙烯酸化的大分子单体。已知氧气的存在会抑制pegda的光聚合，但不需要在宏观尺度反应上的缓和(mitigation)，并且最值得注意的是，氧气的存在限制了在透气性聚二甲基硅氧烷(pdms)微流体装置中进行的聚合。在这一示例中，我们提出了一种创新的氮微夹套微流体装置，该装置可以在pdms中建立氧受控的环境，以实现芯片上的稳定颗粒光聚合。反向胶体晶体(icc)是失蜡制造法的产物，其中胶体颗粒在存在液体连续相的情况下集合成有序基质。在连续相固化后，取走颗粒，留下结构化的孔隙网络。icc已被开发用于多种科学和技术应用，但其实用性仍然受限于溶解颗粒以形成孔隙框架所需的苛刻加工条件。在这一示例中，我们提出了基于可光降解聚乙二醇二丙烯酸酯颗粒合成的icc构建的新方法。由于颗粒相的降解仅需要光照，颗粒集合体可以在严格限制的微通道中被侵蚀，从而产生微流体整合的icc。使用这种方法，可光降解颗粒集合体用于形成多孔聚乙二醇水凝胶网络结构和互连结构。可光降解peg颗粒的非侵入性的、温和的侵蚀允许第二物体嵌入icc的孔中。这种方法同样容易实现、温和且具有细胞相容性，表明该方法具有构建功能性生物材料的巨大潜力。技术实现要素：本文提供了利用微流体用于受控地生成具有受控颗粒尺寸和尺寸分布的微粒和水凝胶的方法，以及来自于所提供的方法的产物。所包括的方法通过在氧受控的环境中聚合分散非水连续相中的水溶液来生成微粒。该过程允许控制水滴尺寸的大小，并由此控制可以用于生物应用的所生成的微粒的尺寸。选择微粒尺寸的能力有益于多种应用，包括药物筛选、药物递送、移植研究、组织工程以及干细胞治疗。所提供的方法具有多种用途，并且可以利用多种聚合物体系和引发剂。例如，所提供的方法可以根据所需功能利用光聚合或化学聚合。控制存在于系统中的氧气量的能力在聚合过程中是有利的。例如，过量的氧气可以化学方式干扰引发剂，抑制聚合。此外，在聚合反应期间存在的氧气可产生含氧物质，该含氧物质可能对随后引入到微球体的生物材料有害或有毒。因此，调节非水相和水相两者中的氧气量的能力对于聚合化学和生物相容性是有利的。在一个方面中，提供一种在氧受控的环境中在微流体装置中制备多个微粒的方法，包括以下步骤：(a)提供包含非水性液体的连续相和包含水溶液的分散相，其中该水溶液包含单体或大分子单体、和引发剂；(b)形成包含水相的微滴以及非水性液体的组合物；(c)用无氧气体净化包含微滴和非水性液体的组合物；以及(d)聚合微滴中的单体或大分子单体以形成微粒。在一个实施方案中，例如，所述无氧气体是氮气。在实施方案中，无氧气体以选自0.1atm至10atm、大于或等于1atm、或可选地大于或等于2atm的压力提供。在实施方案中，微滴的表面积与体积之比小于或等于3/微滴半径、大于或等于3/微滴半径、或可选地选自1/微滴半径至5/微滴半径的范围。在一个实施方案中，引发剂是化学引发剂或光引发剂。在一个实施方案中，例如，引发剂是光引发剂，并且聚合单体或大分子单体的步骤在紫外光下进行。在一个实施方案中，光引发剂是苯基-2,4,6-三甲基苯甲酰基次膦酸锂(lap)或irgacure1173。在实施方案中，非水性流体的氧溶解度选自0.01mol/m3至4mol/m3的范围、大于或等于0.5mol/m3、或可选地大于或等于1mol/m3。在一个实施方案中，其中非水性液体包括氟油，例如分离的氢氟醚。在一个实施方案中，非水性液体是分离的氢氟醚，例如novec7500、fluoroinertfc40、fluoroinertfc70或fluoroinertfc77。在实施方案中，非水性液体还包含表面活性剂，例如含聚六氟氧丙化烯的聚合物。在一个实施方案中，表面活性剂以选自0.1％至4％的范围、大于或等于1％、或可选地大于或等于2％的浓度提供。在一个实施方案中，例如，含聚六氟氧丙化烯的聚合物是dolomitefluoropeg表面活性剂、ranbiotechnologiesfluoropeg表面活性剂或krytoxfsl157。所提供的方法可用于生成水凝胶，包括具有可光降解微粒的水凝胶。在一个实施方案中，例如，所述微粒是水凝胶微粒。在一个实施方案中，微粒、单体和/或大分子单体是可光降解的。在一个实施方案中，所述水溶液包含大分子单体，并且该大分子单体是基于聚乙二醇(peg)的大分子单体。在一个实施方案中，基于peg的可光降解的大分子单体具有选自200至20000道尔顿的范围的分子量。在一个实施方案中，例如，基于peg的大分子单体是peg-二丙烯酸酯(pegda)大分子单体或peg-降冰片烯(pegnb)大分子单体。所提供的方法和产物可用于生成微米或纳米尺寸的微粒和水凝胶。颗粒的受控尺寸和/或尺寸分布可以允许有与单个细胞的直径相对应的颗粒，从而允许将细胞包封或包裹在水凝胶或支架内。在一个实施方案中，微粒的平均直径为小于或等于1000μm、小于或等于500μm、小于或等于100μm、小于或等于60μm、或例如小于大于或等于50μm。在一个实施方案中，净化组合物的步骤将组合物中的氧气量降低选自1％至90％的范围。在实施方案中，净化组合物的步骤将组合物中的氧气量降低选自5％至50％、多于或等于25％、或例如多于或等于50％的范围。在一个实施例中，净化组合物的步骤将非水性液体中的氧气量降低选自1％至90％的范围。在实施方案中，净化组合物的步骤将非水性液体中的氧气量降低选自5％至50％、多于或等于25％、或例如多于或等于50％的范围。在一个实施方案中，例如，净化步骤提供与组合物接触持续选自1μs至10s的范围的无氧气体。在实施方案中，例如，净化步骤提供与组合物接触持续大于或等于1s的无氧气体。在一个实施方案中，净化组合物的步骤还包括在组合物和无氧气体之间提供膜。在一个实施方案中，所述膜具有选自10μm至500μm范围的厚度。在一个实施方案中，例如，所述膜是聚二甲基硅氧烷膜。在实施方案中，所提供的方法进一步包括以下步骤：(e)至少部分地包封微粒在不可光降解的聚合物内，其中微粒是可光降解的；以及(f)光降解可光降解的微粒以产生复合多孔水凝胶。在实施方案中，所提供的方法还包括以下步骤：(g)使复合多孔水凝胶与生物材料接触，由此将生物材料分布至复合多孔水凝胶的孔中。在一个实施方案中，例如，生物材料是有生物活力的材料。在一个实施方案中，例如，有生物活力的材料包括细胞。在实施方案中，复合多孔水凝胶的孔具有接收单个细胞的侧向尺寸。在实施方案中，所述有生物活力的材料选自由以下组成的组：间充质干细胞、β细胞、肌卫星细胞、蛋白质、治疗性小分子、成像分子、第二纳米颗粒及其任何组合。在实施方案中，组合物是油包水乳液，例如微乳液或纳米乳液。在一个方面中，提供通过以下方法制备的多个微粒：(a)提供包含非水性液体的连续相和包含水溶液的分散相，其中该水溶液包含单体或大分子单体、和引发剂；(b)形成包含水相的微滴和非水性液体的组合物；(c)用无氧气体净化包含微滴和非水性液体的组合物；以及(d)聚合微滴中的单体或大分子单体以形成微粒。在实施方案中，制备多个微粒的方法包括本文中所述的参数(例如氧降低、微粒尺寸、压力等)、材料(例如非水性液体、表面活性剂、单体、大分子单体、生物材料等)和/或额外的方法步骤(例如部分包封微粒、光降解微粒、与生物材料接触等)。在一个方面中，提供一种制备具有生物材料的复合水凝胶的方法，包括以下步骤：(a)提供包含非水性液体的连续相和包含水溶液的分散相，其中该水溶液包含可光降解的单体或可光降解的大分子单体、和引发剂；(b)形成包含水相的微滴和非水性液体的组合物；(c)用无氧气体净化包含微滴和非水性液体的组合物；(d)聚合微滴中的可光降解的单体或可光降解的大分子单体以形成可光降解的微粒；(e)至少部分地包封可光降解的微粒在不可光降解的聚合物内；(f)光降解可光降解的微粒以产生复合多孔水凝胶；以及(g)使复合多孔水凝胶与生物材料接触，由此将一部分生物材料捕获在复合多孔水凝胶中。在实施方案中，制备具有生物材料的复合水凝胶的方法包括本文中所述的参数(例如氧降低、微粒尺寸、压力等)、材料(例如非水性液体、表面活性剂、单体、大分子单体、生物材料等)和/或额外的方法步骤(例如部分包封微粒、光降解微粒、与生物材料接触等)。在一个实施方案中，例如，生物材料是具有活力的。在实施方案中，生物材料是多个活细胞。在一个实施方案中，例如，复合水凝胶具有多个孔，每个孔的大小为可以接受单个细胞，并且接触复合多孔水凝胶的步骤导致一部分所述多个细胞中的每一个被包封在复合多孔水凝胶的孔中。在一个方面中，提供一种将生物材料包封在微粒中的方法，包括以下步骤：(a)提供包含非水性液体的连续相和包含水溶液的分散相，其中该水溶液包含单体或大分子单体、和引发剂；(b)形成包含水相的微滴和非水性液体的组合物；(c)用无氧气体净化包含微滴和非水性液体的组合物；(d)聚合微滴中的单体或大分子单体以形成包含生物材料的微粒。在实施方案中，将生物材料包封在微粒中的方法包括本文中所述的参数(例如氧降低、微粒尺寸、压力等)、材料(例如非水性液体、表面活性剂、单体、大分子单体、生物材料等)和/或额外的方法步骤(例如部分包封微粒、光降解微粒、与生物材料接触等)。在一个实施方案中，生物材料是有活力的生物材料。在一个实施方案中，例如，生物材料包含单个细胞。在实施方案中，单个细胞是指每个微滴仅具有一个单个细胞的各微滴。在一个实施方案中，多个微滴各自包含一个所述细胞。在一个实施方案中，例如，微粒是可光降解的；并且所提供的方法还包括以下步骤：(e)至少部分地包封微粒在不可光降解的聚合物内；以及(f)光降解可光降解的微粒以产生具有多个包含生物材料的孔的复合多孔水凝胶。在一个方面中，提供一种制备包含生物材料的反向胶体晶体的方法，包括以下步骤：(a)提供包含非水性液体的连续相和包含水溶液的分散相，其中该水溶液包含可光降解的单体或可光降解的大分子单体、所述生物材料、以及引发剂；(b)形成包含水相的微滴和非水性液体的组合物；(c)用无氧气体净化包含微滴和非水性液体的组合物；(d)聚合微滴中的单体或大分子单体以形成包含生物材料的可光降解的微粒；以及(e)至少部分地包封可光降解的微粒在不可光降解的聚合物内，并且光降解可光降解的微粒以产生具有多个包含生物材料的孔的反向胶体晶体。在实施方案中，制备包含生物材料的反向胶体晶体的方法包括本文中所述的参数(例如氧降低、微粒尺寸、压力等)、材料(例如非水性液体、表面活性剂、单体、大分子单体、生物材料等)和/或额外的方法步骤(例如部分包封微粒、光降解微粒、与生物材料接触等)。在一个实施方案中，例如，所述生物材料是活细胞，并且多个所述微滴每一个均包含单个活细胞。在实施方案中，不可光降解的聚合物以液相的形式提供，并且光降解的步骤同时将不可光降解的聚合物光固化。虽然可能在本文中讨论与本文所公开的装置和方法相关的基本原理的观点或理解，但不希望受到任何特定理论的约束。应当认识到，无论任何机制解释或假设的最终正确性如何，本发明的实施方案仍然可以是可操作的和有用的。附图说明图1示出了经由微流体乳化、氮气净化和光聚合的水凝胶微粒的制造；图2提供了在环境大气下氧气对微流体多相液滴中pegda光聚合的影响的分析；图3示出了氧扩散率设定了在多相微滴装置中液滴聚合的下限阈值；图4提供的曲线图示出了针对模型液滴(r＝30μm)所示的随暴露时间和强度而变的聚合的pegda部分；图5提供了示出部分和完全聚合的颗粒的图表和sem图像；图6阐述了示出通过多种方法包封细胞的示意图；图7提供了随分别使用矿物油和novec7500在微流体装置中包封细胞涉及到的不同参数而变化的细胞活力研究；图8示出了使用氮夹套双层微流体装置的细胞包封；图9提供了在不同lap和氮浓度下的包封后的细胞活力；图10提供了过氧化物自由基随时间的累积浓度；图11提供了示出在微流体通道中的多孔支架制造过程的示意图；图12示出了在微流体通道中的流动辅助平面(二维)水凝胶颗粒集合，产生排序由通道尺寸决定的紧密堆积结构；图13示出了同时、快速和非侵入性的反蛋白石形成(inverseopalformation)；图14提供了由可光降解的水凝胶颗粒(a、b)在微流体装置中组装和产生的多孔水凝胶支架和蜜蜂蜂巢(c)的表面扫描激光共聚焦显微镜图像；图15示出了微粒网络的温和侵蚀，允许第二颗粒嵌入多孔反蛋白石架构中；图16提供了在实施例4中使用的装置的示意图。图(a)是用于评估对流体流速的细胞响应的微流体装置的示意图。图(b)是用于评估uv暴露强度和时间对细胞活力影响的微流体装置的示意图，其中在掩模上的透明尺寸用于调节uv暴露时间；图17示出了在微流体装置中针对流速和停留时间的细胞响应。图(a)示出了流速对细胞活力的影响。图(b)示出了细胞在装置中移动的停留时间对细胞活力的影响，其中总流速为5μl/min且氮气净化压力为7psi；图18示出了氮气净化压力对细胞活力的影响，其中微滴暴露于120mw/cm2的uv光中1.1s；图19提供(a)绘制了uv辐照时间对细胞活力的影响，其中uv强度不变。图(b)示出了uv强度对细胞活力的影响，其中uv辐照时间不变；图20示出了(a)在恒定uv强度下随uv暴露时间而变化的过氧化物自由基的累积浓度。图(b)示出了在相同uv暴露时间下随uv强度而变化的过氧化物游离基的累积浓度；图21提供了通过在交叉流动微流体通道中(a)或通过涡旋(b)乳化、随后暴露于紫外辐射形成的pegnb水凝胶微球体的示意图；图22示出了通过在交叉流动微流体装置中(a)或通过涡旋(b)乳化形成的pegnb水凝胶微球体的粒度分布以及图像；图23示出了通过涡旋或微流体乳化包封在pegnb微粒中的a549细胞的活力(a)。在涡旋和微流体方法中，在形成水凝胶的溶液中的细胞停留时间分别是1分钟和10分钟。(b)通过每种方法制造的载有细胞的水凝胶微球体的图像(比例尺＝100μm)。通过活/死细胞染色鉴定来表明细胞活力(活细胞和死细胞分别对应于绿色和红色)；图24示出了研究影响包封后细胞活力的因素。(a)示出了在注射器内培养基中维持的细胞随时间而变的活力。(b)培养基中泵送通过装置的细胞的活力，其中形成有或未形成有乳液液滴。细胞和油的流速分别为2μl/min和10μl/min。(c)保持在注射器内的形成水凝胶的溶液内的细胞活力。(d)通过微流体乳化包封在pegnb微球体中、收集在小瓶中并且暴露于uv光以下的特定培养时间的细胞活力。细胞活力测量30天。图25提供了通过微流体乳化包封在pegnb和pegda微球体中的实测细胞活力的对比。(a)包封在10wt％pegnb和pegda本体水凝胶(bulkhydrogels)中的细胞的图像。将细胞与形成peg水凝胶的溶液混合，随后暴露于uv光下以使得载有细胞的本体结构聚合。(b)在本体水凝胶中包封后，定量细胞活力30天。(c)用于将细胞包封在pegda水凝胶微球体中的氮夹套微流体装置的示意图。(d)pegnb和rgds修饰的pegda水凝胶微球体中的细胞的包封后活力的定量。比例尺＝100μm。具体实施方式通常地，在本文中所使用的术语和短语具有其在本领域公认的含义，这些含义可以通过参考本领域技术人员已知的标准文本、期刊文献和上下文找到。提供以下定义以阐明这些术语和短语在本发明上下文中的具体用途。如本文中所使用的，术语“聚合物”是指由通过共价化学键连接的重复结构单元构成的分子，其通常以大量重复单元(例如等于或大于3个重复单元，可选地，在一些实施方案中等于或大于10个重复单元，在一些实施例中大于或等于30个重复单元)和高分子量(例如大于或等于20000da，在一些实施方案中大于或等于50000da或大于或等于100000da)为特征。聚合物通常是一种或多种单体或大分子单体前体的聚合产物。术语“聚合物”包括均聚物或主要由单一重复单体子单元组成的聚合物。术语“聚合物”还包括当两种或更多种不同类型的单体连接在同一聚合物中时形成的共聚物。有利的聚合物包括可以是无定形、半无定形、结晶或半结晶状态的有机聚合物或无机聚合物。“单体”和/或“大分子单体”各自是指可在适当条件下进行聚合的试剂。单体或大分子单体试剂包含至少一种单体或大分子单体分子，其中单体或大分子单体分子是可以进行聚合的分子，从而为聚合物或低聚物的结构提供结构单元。在一个实施方案中，单体或大分子单体试剂可以由通常或主要化学结构表示，并且包含具有该化学结构的单体分子，但也可以含有具有其他化学结构的组分。例如，单体或大分子单体试剂可以包含具有不同于该试剂的通常或主要结构的化学结构的杂质。大分子单体可以指聚合的试剂，例如具有多个重复单元但可以进一步发生聚合反应以形成大分子单体重复单元的聚合物。在实施方案中，例如，大分子单体是指具有高分子量(例如大于或等于200da，在一些实施方案中大于或等于1000da或大于或等于10000da)的试剂。“不可光降解的聚合物”是指在选定的暴露条件下不可光降解的聚合物，选定的暴露条件例如选定的波长范围、强度、功率或其组合。在一个实施方案中，例如，不可光降解的聚合物是指在如本文所述的呈现为降解可光降解的聚合物的条件下不降解的聚合物。“微粒”是指包括聚合物的颗粒，具有相对较小的包括直径、半径、高度、宽度、深度等在内的尺寸。在实施方案中，例如，微粒是指具有小于或等于1mm的侧向尺寸(例如直径)的颗粒。在一些实施方案中，微粒是指平均直径小于或等于500μm、小于或等于100μm或小于或等于50μm的颗粒。在一些实施方案中，微粒是微球体。在一些实施方案中，微粒指具有选自10nm至1000μm范围的侧向尺寸的颗粒，对于一些实施方案，优选为具有选自10nm至100μm范围的侧向尺寸的颗粒。“微滴”是指液相微粒。例如，在一些实施方案中，微滴是指平均直径小于或等于500μm、小于或等于100μm、或小于或等于50μm的液滴。在实施方案中，微滴是指悬浮液中的液体，例如乳液中的液体。在一个实施方案中，微滴是指悬浮在非水性液体中的水相液体。在一些实施方案中，微滴是指具有选自10nm至1000μm范围的侧向尺寸的颗粒，对于一些实施方案，优选为具有选自10nm至100μm范围的侧向尺寸的颗粒。“无氧气体”是指基本上不含氧的任何气相流体。在实施方案中，例如，无氧气体是指具有小于10％的氧气、小于1％的氧气、小于0.1％的氧气的气体。在一些实施方案中，例如，无氧气体是指氧分压或浓度小于0.01％的气体。“氧受控的环境”是指下述的容器或微流体装置，其中存在于该装置内或与该试剂连通的氧气量可被改变和/或预先选择。在实施方案中，氧受控的环境是指氧气含量可被减少(例如通过使用无氧气体净化或置换氧气)的微流体装置。“水凝胶”是指具有高吸水性的至少部分亲水的物质。在实施方案中，水凝胶包含至少部分亲水的聚合物、高吸水性聚合物或生物大分子，例如为网络构造。水凝胶可以表征为吸水膨胀但不溶解的物质。在实施方案中，例如，水凝胶可以吸收大于或等于水凝胶重量的10倍的水、大于或等于水凝胶重量的50倍的水、或者可选地大于或等于水凝胶重量的100倍的水。图1提供了(a)经由微流体乳化、氮气净化和光聚合的片上“一锅法”(onepot)水凝胶微粒制造的示意图。(b)完全聚合的水凝胶颗粒(r～50μm)。(c)运行中的整合微流体装置的照片。可以观察到在装置右手侧的液滴传输蛇形带的uv暴露。(d)流动通过由氮微夹套(紫色)包围的蛇形带(象牙色)的单分散颗粒的显微照片。(e)在～10分钟后达到的pdms中氮气(蓝色)置换空气(红色)的comsol模拟的横截面扩散分布。图2提供了在环境大气下氧气对微流体多相液滴中pegda光聚合的影响的分析。左图为在多相微流体液滴生成装置中每个兴趣区域的标称氧气扩散率和平衡浓度的汇总。数值概括自多个文献来源(参考文献1.10、1.43-1.47)。还示出了氧气从空气输送到pdms、通过氟油并且进入微滴(不按比例绘制)的示意图。鉴于没有扩散障碍，在未净化装置中的氧气浓度在氧气抵达微滴前不会受到限制。中图为阐明聚合反应和竞争性引发剂清除机制的反应示意图。用氧扩散和反应的comsol1-d辐射模型评估液滴中的氧气浓度。具有1-d浓度叠加表面的网络象限提供了代表性的氧浓度分布。右图为在聚合过程中半径为r＝30μm的微粒中的典型的时间依赖性氧浓度分布。该模型预测，尽管光引发剂自由基迅速耗尽液滴中最初存在的氧气，但通过自油相连续扩散的氧气快速地建立了平衡。在uv强度为10mw/cm2时，仅在～2秒后在液滴中获得半稳态氧气分布。图3示出了氧气扩散率设定了在多相微流体装置中液滴聚合的下限阈值。(a)微滴(r＝30μm)中的聚合pegda部分(表示为绿色)在很大程度上依赖于扩散的氧气浓度(红色)。由于溶解氧会阻碍聚合反应，因此只有部分液滴的径向体积发生聚合(～0.38)，其余部分(～0.38-1)仍为液体低聚物(蓝色)。灰色区域代表观察单体溶液凝胶化所需的最小聚合部分值(参考文献1.48、1.53)。(b)根据颗粒半径在r＝10-50μm范围的一组拟合曲线绘制的三维表面图，示出了在r<20μm处的液滴聚合的阈值。右图示出了部分聚合的40％pegda-700颗粒(a：r～30μm、b：r～50μm、c：r～60μm)的显微镜明场图像。图像被颜色部分叠加以辅助观察明显的聚合和未聚合部分。图4提供的曲线图示出了针对模型液滴(r＝30μm)所示的随暴露时间和强度而变的聚合的pegda部分。随着强度的增加，所有聚合部分曲线向右移动，因此部分聚合的液滴半径增加。另外，随着uv强度的增加，这些浓度-时间曲线随着单体双键转化相对于氧扩散速率的加速而向上移动。图b：部分聚合的乳液液滴的聚合核心在流动下是明显的。图c：在流动停止时，聚合的液滴核心停留在液滴界面处。图d：从部分聚合的乳液中被动地去除油，会驱动六边形基质的自组装，通过界面处存在的表面活性剂来稳定。图e和图f：通过改变以下变量：引发剂浓度、初始大分子单体浓度和uv强度，还可以通过实验观察到未聚合的部分的变化。图5是对比部分地和完全地聚合的颗粒的分别在图a和b中显示的图表和sem图像。在从油中取出颗粒时，难以去除薄的未聚合的液体部分，并且该液体部分通常围绕水凝胶球体，并将颗粒保持在一起(a2)。完全聚合的颗粒不示出未聚合的液体层(b2)。还制备了用罗丹明丙烯酸酯标记的完全聚合的水凝胶颗粒，并用共聚焦显微镜对其成像以验证颗粒内的聚合均匀性。图像c1和c2分别示出了聚合颗粒的三维堆叠图像和横截面图像。这种特殊的成像技术确定了罗丹明在通过共聚作用形成的颗粒内的定位，并由此由此确定了颗粒聚合。图6阐述了示出通过多种方法包封细胞的示意图。图(a)为本体细胞包封。图(b)为微流体装置细胞包封。图(c)为使用不同聚合方法的水凝胶微粒的尺寸分布。图(d)为使用不同聚合方法的水凝胶微粒的均匀性。图(e)为使用不同的方法(本体和装置，分别使用矿物油和novec7500)包封的细胞的包封后活力。图7提供随在分别使用矿物油和novec7500在微流体装置中的细胞包封所涉及的不同参数而变的细胞活力研究。图8示出了使用氮夹套双层微流体装置的细胞包封。图(a)为双层氮夹套微流体装置的示意图。将引发剂、细胞悬液和单体混合物在装置中充分混合，随后与氟油合并，以在装置第一层的喷嘴处产生含有细胞的液滴。流体流动通道的每侧由平面内的氮通道界定。通过暴露于装置的第二层中的uv光中，使形成的乳液液滴光聚合成水凝胶。图(b)为从系统中清除氧气的示意图。增加的氮气压力降低氧溶解度，导致氧气从液滴和油中扩散到pdms基质中。图9提供了(a)在不同的氮气压力下聚合所需的最小lap浓度。(b)在氮气预净化的微流体装置中在恒定的氮气压力下(psi＝7)具有不同lap浓度的细胞的包封后活力。(c)通过活/死细胞染色鉴定细胞的包封后活力，其中活细胞为绿色，死细胞为红色。图10提供了(a)在液滴或水凝胶微粒中隨时间而变的过氧化物自由基和自由基的累积浓度。(b)在液滴或水凝胶微粒中随时间而变的过氧化物游离基的累积浓度。(c)过氧化物自由基在时间等于0.35s时的累积量以及在水凝胶微粒中的细胞的相应的包封后活力。图11是示出了微流体通道内多孔支架制造过程的示意图。单分散pegdipda微粒在t形接头微流体装置中被大量生产并用作制备icc的致孔剂(1,a)。pegdipda颗粒通过层流在狭缝过滤器微流体装置中被堆积。(2)向集合的颗粒基质中注入peg-da大分子单体溶液，并且颗粒结构通过第二uv(405+nm)光聚合锁定。(3,b)一旦连续相被聚合，使用365nmuv光实现模板颗粒的光降解。图像4示出了在微流体装置内制造的peg-da水凝胶icc的示意图，并且图像c示出了所制得的大孔隙icc的共聚焦图像。图12示出了在微流体通道中的流动辅助平面(二维)水凝胶颗粒集合形成了紧密堆积的结构，其排序由通道尺寸决定。最左边的图表示出了颗粒组织的大体趋势以及随相邻颗粒间邻角变化的颗粒堆积率。在右图中，显然地，狭缝通道中的二维排序由边界控制，其将堆积密度降低至～0.4。图13示出了同时、快速和非侵入性的反蛋白石的形成。暴露于365nm光中的pegdipda水凝胶颗粒在～80秒内降解。图a-f追踪颗粒降解的时间过程，其中(左栏是对应的明场显微镜快照图像)不可降解的大分子单体(40％pegda-700)同时交联。聚合反应仅在～12秒内发生(中栏中的明场显微镜快照图像)，并产生二维多孔支架。右栏中示出了由可光降解的颗粒制造的多孔支架的扫描电子显微镜图像。图14a、b示出了由可光降解的水凝胶颗粒在微流体装置中集合并生产的多孔水凝胶支架的表面扫描激光共焦显微镜图像。流动引起的堆积使水凝胶颗粒彼此紧密接触，然而进行第二步聚合时，我们还观察到球形孔到六边形孔的变形(b)。我们所获得的六边形水凝胶孔结构(b)类似于蜜蜂蜂巢(c)。据推测，这种现象出现的原因与蜜蜂蜂巢中的原因类似，主要是由于在连续相制备聚合物经历聚合(参考文献3.11)时张力牵拉三个壁的连接处。图15示出了颗粒网络的温和侵蚀使得第二颗粒能够被接种在多孔反蛋白石结构内。作为该概念的一个示例，在图a中，＝5μm的聚苯乙烯微珠被包封在液滴内，该液滴随后聚合形成载有微珠的水凝胶颗粒(如小图所示)。图b和图c示出了使用聚苯乙烯微球接种的多孔水凝胶反蛋白石。一个分离的微孔突出显示了预接种的证据。实施例1：在微流体装置中通过氧受控的光聚合形成单分散聚乙二醇二丙烯酸水凝胶微球体简介基于丙烯酸酯的聚合物由于其透明度、颜色变化、坚固的机械性能、和弹性而广受关注(参考文献1.1)。丙烯酸酯很容易以工业规模光聚合，并在化学应用中广泛用作粘合剂、密封剂复合材料和保护涂料(参考文献1.1、1.2)。与其他合成单体相比，丙烯酸酯由于其生物相容性和化学多功能性而通常是被优选的，以允许使用一系列单功能或多功能基团进行修饰(参考文献1.3-1.4)。低聚丙烯酸酯可用于通过光聚合方法生产高度交联的网络(参考文献1.5)。基于这些特征，已经围绕丙烯酸酯聚合化学开发了一类可光聚合的基于聚乙二醇(peg)的水凝胶(参考文献1.6-1.8)。光聚合是一种方便的且具有细胞相容性的替代基于溶剂固化或热固化的方法，并且可以在活体外和活体内进行(参考文献1.9)。丙烯酸酯的光引发自由基聚合通常在光引发剂存在下进行，所述光引发剂在暴露于紫外光时产生自由基。然而，丙烯酸酯自由基聚合受到通过氧清除自由基的强烈抑制(参考文献1.10-1.12)。溶解氧通常存在于本体pegda溶液中，但会被迅速消耗，从而使得聚合继续进行。如果溶液与诸如空气界面或具有足够高的氧溶解度和渗透率的表面的氧气源接触，则会发生长时间的氧清除。在微观尺度上，由于表面积与体积之比的增加，对光聚合反应的抑制加剧。由于pegda具有类似组织的物理特性，因此pegda作为细胞包封剂和组织支架是具有吸引力的，并且pegda可以进行特制以精确地模拟细胞外基质、细胞相容性和合成多功能性。在一定的聚合物组成范围内，高度水膨胀性的pegda水凝胶网络已被证明是许多细胞类型的具有细胞相容性的包封剂，所述细胞类型包括成纤维细胞(参考文献1.13)、软骨细胞(参考文献1.14)、血管平滑肌细胞(smc)(1.15)、内皮细胞(ec)(参考文献1.16)、成骨细胞(参考文献1.17)、神经细胞(参考文献1.18)和干细胞(参考文献1.19)。pegda大分子结构和化学的合成定制提供了多种性质，使其成为天然水凝胶的具有吸引力的替代选择。pegda水凝胶网络可以用细胞粘附肽基团进行修饰，该肽基团允许形成促进细胞粘附、扩散和组织加工的具有生物活性的水凝胶(参考文献1.20)。对peg交联剂的变性可以提供通过水解(参考文献1.6)、蛋白水解(参考文献1.7)或光学降解(参考文献1.21)在空间上和时间上重塑水凝胶的能力。定向网络重塑已被广泛用作在时间上调节水凝胶性质的策略。由于颗粒内扩散、温和的抗体或寡核苷酸缀合、以及在活体内应用的潜力，微米级pegda水凝胶颗粒或“微凝胶”对于感测(参考文献1.22)、药物和组织工程(参考文献1.23)领域来说是新兴且重要的。peg微凝胶已通过截流光刻成功制造，截流光刻是一种单相微流体步进式光聚合技术。聚(二甲基硅氧烷)(pdms)微流体装置中的截流光刻利用弹性体的高氧渗透率和氧输送速率，以保持由于氧气抑制而在通道表面附近的薄的未聚合区域(参考文献1.23-1.24)。这些未聚合的薄膜可以防止聚合结构与通道表面的粘附，从而使其可以作为颗粒被自由采集。其他应用包括复杂形状颗粒(参考文献1.23、1.25)的制造、细胞包封(参考文献1.23)和复杂颗粒条码技术(参考文献1.26、1.27)。截流光刻允许产生具有由光掩模所定义的任意且精确的二维形状的颗粒，并且不完全聚合产生具有由氧自颗粒边缘扩散引起的交联密度的侧向梯度的颗粒(参考文献1.28)。尽管这种技术用途广泛，但其所需的环境氧气的存在限制了颗粒的制造速率，并且显著限制了同时确定颗粒尺寸和聚合物组成的能力(参考文献1.23)。peg微球体可以通过乳化两相油-水悬浮液，以比截流光刻高得多的速率制造。微粒通常通过经由超声处理、涡旋或均质化的本体水相乳化或通过微流体逐滴乳化来制备。在乳化之后，悬浮在不混溶油中的稳定化颗粒通过照射进行光聚合(参考文献1.29、1.30)。通过本体或微流体乳化制成的水凝胶颗粒在广泛的具有前途的医学研究应用中具有潜在的用途，包括靶向药物递送(参考文献1.31)、细胞包封(参考文献1.7)、复杂支架框架的组装(参考文献1.32)和生物材料包封(参考文献1.33)。通常使用较大体积的溶液进行本体乳化，并且在较宽的尺寸分布上产生较大的微粒(>100μm)。本体乳化中的光聚合过程与本体同质peg大分子单体溶液中的光聚合过程类似，其中由于周围油相中的氧被快速耗尽，因此氧抑制被迅速地克服。另一方面，微流体乳化是精确且可重复的过程，该过程可以产生均匀大小的颗粒并对其各自的组成进行出色的控制。为了保持尺寸的均匀性，在液滴形成后立即在装置上光聚合该液滴是可取的。这是可能实现的，并且已经在大液滴(参考文献1.34)或具有高peg或引发剂浓度的液滴(参考文献1.36)上进行了证明。相反地，连续光聚合尚未在具有较低的细胞相容性的peg-引发剂组合物的较小液滴中得到证明。在这两种情况下，自由基聚合的氧抑制由氟油和pdms装置放大，阻止了光聚合。因此，尽管认为单分散的、小尺寸的(<40μm)、具有细胞相容性的peg水凝胶微球体的微流体制造具有巨大的潜力，但尚未可靠地实现peg水凝胶微球体的连续制造。为了能够实现在微米级乳液液滴内的丙烯酸酯聚合，已经提出了在自由基聚合期间消除氧气的多种技术，例如基于真空的脱气(参考文献1.37)、氮气净化(参考文献1.38)、pdms扩散障碍(参考文献1.39)以及在密封的惰性气体环境下进行光聚合(参考文献1.40)。实施这些氧气屏蔽技术大多是具有挑战性或昂贵的。将整个微流体处理设备(包括泵、注射器、管道、装置以及显微镜)与氧气隔离是不切实际的。对于脱氧的pdms装置，实验运行时间暂时限制在整个装置补充氧气之前的数分钟内。为了解决聚合期间的氧气抑制问题并实现稳定的、长期的微流体微粒合成，我们公开了一种独特的氮微夹套pdms微流体装置设计(图1)。n2微夹套装置的性能通过实验来表征并辅以耦合的o2反应扩散有限元数值模型。该方法克服了其他液滴光聚合装置的局限性，提供了独立地指定聚合粒径和颗粒成分的能力，同时提供了一系列此前不可获得的具有细胞相容性的组合物。材料和方法图1a示出了微流体装置设计，该设计包括用于流体流动的pdms微通道，两侧具有输送氮气的通道。这一构造足以提高局部氮浓度、耗尽pmds中的氧气并防止氧气扩散通过并与流体相互作用。我们探讨了pegda微粒聚合期间pdms使微通道区域充满氮气(图1)的气体渗透性和膜样特性。装置构造pdms微流体装置由单层光刻母版采用标准pdms光刻技术(参考文献1.41、1.42)制造，并粘合到2”×3”载玻片上。如示意图和光学显微照片图像(分别为图1b和图1c)所示，pdms装置由100μm厚的液滴生成和传输通道组成，该通道由100μm厚的氮夹套通道包覆。平行的流体通道和氮气通道之间的pdms壁厚为100μm，足以使装置入口处高达5psi时保持pdms-玻璃键合完整(+10psi的压力要求通道壁之间的壁厚增加至高达250μm)。流体控制氮夹套的pdms颗粒光聚合装置的流体入口孔和出口孔分别通过微内径管(.01"idx.03"od，nd-100-80，美国塑料公司)连接到流体源和收集容器上。通过微内径特氟龙(teflon)管以～5psig的正渗透压将氮气引入到装置中。氮气流速由压力调节器控制，该压力调节器允许在装置入口处指定给定的压力。未使用开放式气体出口，并且发现如果出口保持关闭并且通道加压，则n2净化更加有效(如图1d所示，由于氮气压力下的膨胀，因此气体通道略有变宽)。将操作流体(油和水凝胶大分子单体溶液)装入一次性塑料注射器(1-10ml，bectondickinson)中，并且用注射泵(nemesys注射泵，cetoni，德国)独立地控制每种组分的流速。装置操作使用t形接头(参考文献1.41)微流体通道构造将大分子单体溶液乳化进入氟油novectm7500,3m(+2％wt.krytoxfsl157作为表面活性剂，dupont)。氟油因其低粘度和蒸汽压力、容易以最小剩余残留油除去颗粒相并且相对于其他常用油具有高的两相稳定性而被选择。所产生的液滴在长蛇形通道中向下游传播，停留时间为数秒。液滴含有在水中浓度为10-40％的pegda-700(v/v)(cas编号为26570-48-9，sigmaaldrich)和浓度为1-6％的irgacure1173引发剂(v/v)(cas编号为7473-98-5，sigmaaldrich)的单体溶液。液滴组成发生变化以改变反应动力学以验证建模。通过改变连续和分散的流体的流速，所产生的液滴尺寸也在t形接头处被控制在r＝5-50μm的范围。在蛇形通道中，液滴暴露于uv光(5-15mw/cm2)下。使用荧光照明系统(priorlumen-200)和带有dapi滤光立方体和2-4x物镜的倒置显微镜(ix71，olympus)进行照明。使用手持型固化位点辐射计(powerpuckii，uvicure)测量uv光强度。将产生的微粒收集在微量离心管(eppendorf)中或直接收集在用于使用明场显微镜进行成像的盖玻片上。部分聚合的颗粒从油相回收到水性介质的实现通过氟油蒸发或基于过滤的排放、随后在去离子水中进行～10分钟的多步超声洗涤(洗涤液被连续排出并且更换3-4次)。超声洗涤有效地从聚合的液滴芯中去除任何未聚合的液体部分和表面活性剂。相反地，完全聚合的颗粒保留其表面活性剂，产生防止分散到水相中的疏水面。因此，通过在过滤和洗涤之前引入第二水基表面活性剂实现了完全聚合的颗粒在水中的再悬浮。聚合和抑制的数值模型在氧存在下创建自由基水凝胶光聚合的一维模型以描述peg-da在油包水(wo)乳液液滴内的空间和时间状态。该模型满足了量化供氧pdms微流体装置内聚合与氧气抑制之间的竞争的需要。该模型使用下文描述的假设和参数在comsolmultiphysics软件包中构建。为了将模型输出可视化，我们提出了建立在四分之一圆上的二维浓度分布图，表示从中心到外壁的微滴横截面的四分之一(图2)。在四分之一圆的区域内进行有限元分析，该区域被划分为～10000个四边形单元网格。时间依赖性研究使用稀释物质传输comsol物理模块进行。在整个研究中使用10秒的总模拟时间，其中各时间步长为0.1-1秒，但被调整为实现溶液收敛(solutionconvergence)。结果和讨论理论和模拟pegda光聚合开始于引发剂的光激活，其中引发剂分子(i)吸收uv光(hv)，分解并转化成自由基物质(radicalspecies)(r)。随后，自由基物质自由地与单体(m)反应以引发链形成并使其增长，或通过氧气反应自行终止(图2中的反应示意图)。由于在氟油和pdms中分别具有高的氧溶解度和扩散性，所以围绕液滴的区域可以被实际认为是取之不尽的氧源。因此，假定液滴边界处的氧浓度永久饱和。在一个水性微滴中，氧气的标称平衡溶解度(co2)为～1mol/m3，并且氧气清除速率最初比聚合物增长速率高五个数量级，因此直到氧气耗尽才会进行聚合反应。由于抑制性反应的速率比聚合反应的速率快得多(ko2[o2]＞＞kp[m])，因此自由基被氧气迅速消耗。仅当氧气抑制和聚合反应各自的速率相等或者为ko2[o2]～kp[m]时，聚合才会继续(参考文献1.10)。表a总结了在我们的模型中实施的并通常用于描述自由基聚合的反应步骤顺序(参考文献1.10、1.48、1.49)。在步骤1中，形成自由基物质，步骤2以自由基物质引发聚合物链形成，步骤3是发生聚合的增长步骤。步骤4和5均被视为终止步骤，其中自由基通过低聚物链反应或氧气抑制终止。表a丙烯酸酯单体聚合的反应机理在表b中，给出了用于颗粒聚合模型的参数值。表b用于对氧自由基清除建模的参数在该comsol模型研究中，使用表c中给出的常微分方程并同时求解：表c微分方程方程组描述了乳液液滴中pegda光聚合的以下物理和化学基础。方程1描述了在速率常数kd下的光引发剂的分解，该速率常数kd取决于uv强度[i]、和样品深度。由于目标颗粒的深度小于100μm，所以光相对未衰减地通过颗粒，因此我们在该模型中不考虑能量-深度关系。使用辐射计直接测量入射强度[i]。方程2通过自由基物质的形成和终止速率提供了自由基物质的摩尔平衡。自由基的终止以多种方式发生，涉及在引发和增长步骤中形成的活性物质的所有可能的组合(表a，步骤2-3)。在我们的模型中，我们忽略了包括自由基捕获的复杂的多物质终止机制。因此，所有自由基物质(r*、rm*、rm*n+1)被整合成单个自由基数量[x]，其中[x]通过预先建立的速率常数kt的二阶反应终止。由氧气引起的自由基物质消耗也被考虑在内，其中每个氧分子以速率常数ko2与单个自由基物质反应。在平衡[pi]和[r*]中，对流运输被忽略，因为[pi]暴露并均匀地在整个液滴上转化成自由基并且[r*]的消耗速率比其运输速率快得多。虽然已经清楚地确定再循环三维流动确实在当微滴流过微通道时在微滴中形成(参考文献1.51、1.52)，但是仍假定这些内部流动随着聚合而减少，并且我们的实验结果验证了这种假设。氧物质平衡方程(方程3)表述了两个事件：氧自由基清除和扩散性氧进入液滴。方程4说明了单体物质[m]消耗或驱动聚合的低聚物双键转化。在计算低聚物转化率时，由于大分子的大尺寸和不动性，我们忽略了扩散，该大分子的大尺寸和不动性随聚合进行而加剧。最后，ξ被定义为转化的低聚物的总分数(方程5)，从而可以在液滴内评估聚集凝胶条件。已经通过实验确定，对于多官能低聚物(例如peg-da)，凝胶可以在约2％的双键转化率下发生(参考文献1.48、1.53)。其他研究已经提出，对于凝胶，转化率要求高达10％(参考文献1.48)。在我们的分析中，我们提出了不考虑分数截止要求的完整的标准化的转化率曲线。凝胶要求往往是偶然的，因为我们的聚合部分曲线显示出特征性的逐步分布，并且液滴的聚合区域和未聚合区域之间有明显的区别(图3a)。我们的模型的初始条件为，在t＝0时，在液滴区域中各处的溶解氧饱和。对于我们的边界条件，氧流动仅在液滴壳表面发生并由饱和限驱动，并且在液滴中心不具有径向通量。试验为了检验我们的反应扩散模型的有效性并且建立针对液滴聚合行为的基线期望，pegda液滴在未净化(环境氧气)的微流体通道内聚合。得到的部分聚合的颗粒由两个不同的部分组成(图3c、图3d和图3e)：聚合的内核(由人工的绿色阴影表示)和未反应的单体溶液的均匀外壳(蓝色阴影)。该观察到的比例匹配模型结果，该结果预测了距离液滴边界固定距离处的聚合阈值。在该阈值，离散的聚合部分与剩余液体部分之间出现清晰的边界。从模型结果来看，这些离散的部分之间的边界可以通过聚合部分的曲线的陡峭的阶梯状分布来预测(图3a)。将我们的聚合标准设定在10％双键转化率的上限(参考文献1.48、1.53)，聚合部分保持相对不变：对于30μm的液滴，为0.38±0.01(图3a，灰色区域)，对应于液滴界面处的～20μm厚的未聚合的壳体。尽管相对的交联部分随液滴尺寸变化，但未聚合区域的绝对厚度是恒定的，表明其直接归因于从界面到液滴中的径向氧扩散(图3b，红黄色曲面)。这表明对于装置和油的该特定组合，在液滴中未观察到聚合的液滴低临界直径为40μm。该结果表明在氧饱和材料存在的情况下对聚合粒径的控制。只要液滴粒径大于40μm，即可以以有限的长度尺度通过使核心光聚合制造水凝胶颗粒。如果希望产生在颗粒表面上没有残余表面活性剂的颗粒，部分聚合的颗粒可能是有用的。完全聚合的颗粒保留含氟表面活性剂层，使其具有疏水性，并对将其再悬浮于水溶液中带来挑战。对于部分聚合的颗粒，我们能够完全避免表面活性剂污染。在对部分聚合的颗粒进行水超声波清洗2-3次后，可以将含有表面活性剂的液体低聚物膜完全清洗掉，产生看起来与完全聚合的颗粒相同的清洁颗粒。在氟油中制备部分聚合的颗粒，并将该溶液沉淀在盖玻片上，以在挥发性连续油相的整个蒸发过程中可视化。随着氟油蒸发，围绕颗粒的未聚合的低聚物的膜凝聚，驱使液滴自组装成有序的六边形紧密填充的结构(图4d)。如果颗粒的液体低聚物部分在第一次聚合后具有足够的引发剂，则第二次暴露可以将这些颗粒锁定在有序的二维结构中。图4e和图4f示出了用uv聚光灯(blak-rayb-100)对部分聚合的颗粒进行两轮聚合的图像。液滴的直接和完全聚合提供了控制颗粒形态和颗粒内的内容物分布的优良途径。使用微夹套微流体装置，我们聚合了多种不同尺寸和组成的peg-da水凝胶微粒。通过原位氮气净化来减少氧气能够实现在peg含量、引发剂浓度和uv剂量显著降低下的光聚合。使用氮夹套装置，我们在氟油中制备了peg-da颗粒，其中单体组分低至10％，且颗粒半径小于10μm。强度和引发剂浓度在微滴的光聚合中均扮演着重要作用，并且发现这两个变量在加速微粒聚合速率方面是同等地有效的。从自由基物质方程(方程2)来看，强度和引发剂浓度似乎成反比。这似乎是合理的，因为光引发剂物质显著过量，并且在uv暴露期间，这些物质以非常缓慢的速率被转化和消耗。在整个聚合期间仅消耗几个百分点(1-2％)。聚合完成后，高浓度的光引发剂保留在颗粒中。从功能性生物材料的角度来看，这对于存在细胞的应用来说是不可取的，因为引发剂的细胞毒性可能在聚合完成后持续很长时间。在一些方法中，可能优选增加光强度，同时降低引发剂浓度。在图4中，示出从10mw/cm2增加到50mw/cm2的uv强度的效果，其中时间间隔分别为2、4、6、8和10秒。该结果表明，随着uv强度的增加，聚合部分在颗粒内增加并且总体凝胶时间减少。当补充的氧气被清除并防止到达液滴时，可以实现完全聚合，并完全避免未聚合的区域(图5b1和图5b2)。在图5中，将部分聚合的颗粒与完全聚合的颗粒进行比较。模型结果意味着在氮夹套装置内并且在不具有氧梯度的情况下，聚合均匀地在颗粒上进行。结论在该实施例中，我们已经表征了微米级乳液液滴内的形成水凝胶的溶液的光聚合。氧对微滴光聚合作用的抑制作用已经用采用comsolmultiphysics软件建立的简单扩散/反应有限元模型进行了探究。氧抑制引入了取决于系统的长度尺度阈值，低于该阈值时，聚合被完全阻止。为了克服该限制，并且实现在片上连续生产peg-da微凝胶，开发了用于原位氧气清除的氮夹套微流体装置。该平台有利于大量制造peg-da微粒。成功地使用了温和的聚合条件和具有细胞相容性的液滴组成，证明该方法可以扩展到功能性生物材料的生产中。本文描述的装置和预测模型可以用于定义液滴光聚合的条件，从而为peg-da液滴的部分或完全聚合做准备。实施例2：降低氮微夹套微流体装置中的氧浓度的方法简介在该实施例中，通过添加用于novec7500的预净化通道来修改氮微夹套微流体装置，以进一步降低装置中的氧浓度至更低水平。当氮气压力增加时，聚合需要较少的光引发剂(lap)，并且相应地获得细胞的较高的包封后活力。这种新方法可以用于生产尺寸可控的微凝胶，该微凝胶与市面上的在包封后提供高水平的细胞活力的流式细胞术方法相容。材料和方法细胞培养将人类肺腺癌上皮细胞(a549)用于该研究并维持在补充有10％胎牛血清(lifetechnologies，美国)、1％pen/strep和0.2％二性霉素b(sigma-aldrich，美国)的低葡萄糖dulbecco改良eagles培养基(dmem；lifetechnologies，美国)中。全部细胞都在37℃的5％co2湿润培养器中培养。细胞活力将细胞包封在微球水凝胶中以测定活力。在将细胞悬浮到pbs中之后，使用用于哺乳动物细胞的活/死细胞活力/毒性试剂盒(lifetechnologies，usa)(2μm钙黄绿素am、4μm的乙啡啶均二聚体-1(ethidiumhomodimer))，针对活力对细胞染色，其中活细胞染成绿色，死细胞的dna染成红色。使用倒置荧光显微镜ix-71(olympus，美国)计数活细胞和死细胞的数量并计算细胞的相应的活力。双层pdms装置制造微流体装置的第一层在4英寸硅晶片上使用标准光刻法(siliconinc.，美国)制造，其中以su-82015光刻胶(microchem，马萨诸塞州，usa)以1045rpm的速度旋转以形成厚度为30μm的涂层。在使用autocad设计并使用激光打印机(cad/artservices，俄勒冈州)打印的光掩模的遮盖下暴露于uv光(omnicures2000，美国)中，从而形成特征性结构。使用相同的方法制造微流体装置的第二层，不同的是由su-8100制造的涂层通过以3000rpm的速度旋转以获得100μm的厚度。用硅晶片铸造聚二甲基硅氧烷(pdms，dowcorning，密歇根州)装置，具有入口孔和出口孔的经固化的装置使用20g点胶针(mcmaster-carr)制造并在氧等离子体处理后粘合到载玻片上。为了产生用于生成液滴的疏水表面，在实验之前短暂地将aquapel(ppgindustries)注入装置中并用氮气冲洗掉。预聚物前体溶液通过使用0.05％胰蛋白酶/乙二胺四乙酸从培养表面分离，并分离成单个细胞，随后以重dmem中3×107细胞/ml的有效细胞密度再悬浮来制备细胞悬液，重dmem通过optiprep密度培养基(sigma-aldrich，美国)调节为具有1.06g/ml的比重。单体混合物包含在磷酸盐缓冲盐水(pbs，ph7.4，sigma-aldrich，美国)中的45总wt％的大分子单体，由以下成分组成：75mol％聚(乙二醇)单丙烯酸酯(pegma，mn≈400da；monomer-polymeranddajaclabs)和25mol％聚(乙二醇)二丙烯酸酯(pegda，mn≈3400da；alfaaesar，马萨诸塞州)(参考文献2.1)。将来自melissapope博士实验室的苯基-2,4,6-三甲基苯甲酰基次膦酸锂(lap)溶解在pbs中并用作本研究中的光引发剂。预聚物前体溶液在1.5ml离心管中或在装置中混合，以获得单体混合物的达到15总wt％的最终浓度和1×107细胞/ml的细胞密度，以及根据实验达到的一定的lap浓度。微流体细胞包封对于微流体包封，将三种组分，即单体混合物、细胞悬液和lap分别装入注射器中并以0.33μl/min注入到装置中，并在装置中充分混合。同时，含有2wt％pico-surf(dolomite，美国)的氟油即novec7500，也被注入到装置中作为油相，对于装置的第一层和第二层，分别为2μl/min和7μl/min。在装置的第一层中的产生液滴的喷嘴处，水相预聚物前体在油中被分成直径为40μm的液滴并进入装置的第二层中，液滴在离开装置之前在装置的第二层中通过暴露于uv光(352-402nm，100mw/cm2，0.025s；lumen100s)中在通道上连续聚合。将从装置收集的微球体水凝胶与油分离，并使用含有0.1wt％pluronicf-127(sigma-aldrich，美国)的pbs在35μm细胞过滤器上洗涤以去除任何未聚合的组分，随后再悬浮于具有0.1wt％pluronicf-127的细胞培养基中并在24孔板中培养。对于每种条件，所有实验都一式四孔地进行。本体细胞包封混合细胞悬液、单体混合物和lap以获得预聚物前体溶液。将100μl预聚物前体溶液加入含有2％pico-surf的novec7500中或含有2％span80(sigma-aldrich，美国)的轻质矿物油中，随后涡旋10秒以获得液滴，液滴通过暴露在uv光下2秒聚合。使用相同的方法将水凝胶与油分离并洗涤。comsol模型描述建立自由基光聚合模型以检验和确定过氧化物自由基对水凝胶颗粒中细胞活力的影响。使用以下概述的参数和设置在comsolmultiphysics软件中创建有限元数值模型。在一维轴对称空间维度中绘制的线被设置为表示从液滴中心到一侧的距离。稀释物质时间依赖地传输通过该线的研究被选择用于如下所示的具有特征性质量传输方程的模型基础：在我们的液滴聚合模型中，主要的反应物质是：聚合物、引发剂、自由基和氧气。首先，引发剂物质被转化为自由基，亦即光聚合的第一步——引发剂光解。随后，允许自由基物质以三种不同的途径反应：(1)单体链引发/增长、(2)自由基自行终止以及(3)过氧化物自由基形成。此外，氧气被设定为自由扩散到液滴中，并与存在的自由基反应。根据对氮夹套有效性的实验观察，假定液滴在氧浓度(0.01mol/m3)中显著稀释。自由基氧化的反应常数为2.5-6.8×107m-1s-1(参考文献2.2-2.6)。lap在365nm处具有显著的吸光度(摩尔消光系数(吸收率)为365，ε＝218m-1cm-1)(参考文献2.7)。结果和讨论微球体水凝胶的尺寸分布和均匀性有多种方法将细胞包封在微球体水凝胶中，例如使用不同油相的本体包封(参考文献2.8)或在微流体装置中包封(参考文献2.9)。在本研究中，分别使用含有2％span80的矿物油和含有2％pico-surf的novec7500将细胞本体(图6a)或在微流体装置中(图6b)包封在微球体水凝胶中。在所有上述实验中使用lap作为光引发剂，并且所有lap的最终浓度均为1wt％。微球水凝胶与油相分离并再悬浮于含有0.1％pluronicf-127的pbs中，随后使用imagej测量这些水凝胶的直径，基于该直径计算并绘制出尺寸分布(图6c)和均匀性(图6d)的图。对使用不同方法和油包封的细胞进行包封后细胞活力测定。考虑到使用不同方法得到的水凝胶的尺寸分布和均匀性的结果，在微流体装置中使用具有2％pico-surf的novec7500对于细胞包封是有利的。然而，相应的包封后细胞活力测定显示使用novec7500进行的细胞的包封后活力非常差，其中所有细胞均死亡(图6e)。单一因素对细胞包封后活力的影响为了鉴定哪个因素或步骤杀死了所有细胞，分别使用矿物油和novec7500进行了一系列对照以测试因素对细胞的包封后活力的影响。将细胞、uv、单体和lap按顺序加入到细胞包封系统中，并测定相应的细胞活力。结果显示novec7500的包封后细胞活力为零，而矿物油中的细胞活力为85％(图7)。比较这两个油相的特征，我们发现在矿物油和氟化油中的氧溶解度之间存在巨大差异，分别为0.134mol/m3(参考文献2.10)和12mol/m3(参考文献2.11)。随后我们提出了一个假设，即由于novec7500中的高氧溶解度，在聚合过程中产生了足够的过氧化物自由基，这使得所有的细胞均死亡。使用氮夹套双层pdms装置进行细胞包封如前所述，通过氧清除自由基的过程是在细胞包封过程中杀死所有细胞的潜在因素。为了验证这一假设，设计了一个氮夹套双层装置，在装置中的所有通道都被夹套，并且油相被氮气预净化。通过使用这一新的装置，预聚物前体混合物中的氧浓度可以通过改变氮夹套的压力来控制。如图8所示，通过操作各组分的流速，我们可以容易地控制在喷嘴处产生的液滴的尺寸以及每个液滴的细胞数量。为了检验预聚物混合物中氧浓度对聚合反应的影响，测试了在不同氮夹套压力下聚合所需的最少lap，如图9a所示，随着氮气压力从0增加到9psi，所需的lap浓度降低。该结果表明，通过使用氮夹套双层装置，可以通过改变氮气的压力来控制液滴中的氧浓度。为了测试在通过氧清除自由基过程中产生的中间体是否为杀死细胞的因素，在恒定的氮气压力(7psi)下和在0.1％至0.8％范围的不同lap浓度下进行了一系列实验。如图9b中所示的结果，随着液滴中lap浓度的增加，细胞的包封后活力降低。研究表明，过氧化物自由基对细胞有一定的有害作用，包括dna损伤(参考2.12)、脂质过氧化(参考文献2.13)、蛋白质中氨基酸的氧化(参考文献2.14)以及由辅酶因子的氧化造成的特定酶的失活(参考文献2.15-2.17)。以上结果表明，当自由基被氧清除后，产生了一些中间产物，这些中间产物的浓度与细胞的包封后活力相关。使用comsol预测过氧化物自由基数量使用基于可用已知参数的comsol预测过氧化物自由基和常规自由基的累积量。结果表明，当我们增加lap浓度时，产生了更多的自由基和过氧化物自由基(图10a和图10b)。并绘制出了过氧化物自由基的数量与包封后细胞活力之间的关系(图10c)。比较图9b和图10c两幅图，我们可以确定在聚合过程中产生的过氧化物自由基的数量是显著影响包封后细胞活力的因素。结论我们示出了一种生产经包封的细胞的新方法，其结合并使用了通过改变预聚物前体溶液中组分的组成来控制微球体水凝胶生产的方法。该方法将有助于在各种微环境中对包封细胞进行高通量筛选。我们示出了氮微夹套微流体装置使得我们能够通过改变氮气预净化时间和压力来控制预聚物前体溶液中的氧浓度，从而允许在不同等级的lap浓度下将微滴聚合为微球体水凝胶，且没有用于生产微球体水凝胶的其他方法中所观察到的尺寸局限性。利用氮微夹套微流体装置，可以生产直径约40μm的微球体水凝胶。装置中光引发聚合所需的最小lap浓度通过操纵预净化氮气的压力来确定，表明在较高的预净化压力下，需要较低的lap用于聚合。通过在恒定的预净化压力下改变lap浓度并在溶液中具有恒定的氧浓度来表明预聚物前体溶液中的氧浓度与细胞的包封后活力之间的关系。结果表明，在使用氧清除自由基的过程中，产生了一些包括过氧化物自由基在内的活性中间体，该活性中间体对包封后细胞的活力具有影响。使用comsol对恒定氧浓度和不同lap浓度下的过氧化物自由基浓度进行建模，表明过氧化物自由基的浓度似乎对包封后的细胞活力有影响。实施例3：使用可光降解微粒对水凝胶反蛋白石结构建模反向胶体晶体(icc)是失蜡制造方法的产物，其中胶体颗粒在液体连续相存在的情况下集合成有序基质。在连续相固化之后取走颗粒，留下结构化的孔隙网络。icc已经被开发用于各种科技应用，但其实用性仍然受限于溶解颗粒以形成孔隙骨架所需的苛刻加工条件。在该实施例中，我们示出了一种生产icc的新方法，其基于涉及可光降解的聚乙二醇二丙烯酸酯颗粒合成的方法。由于颗粒相的降解仅需要光学照明，颗粒集合可以在严格限制的微通道内被侵蚀，从而创建了微流体整合的icc。使用可光降解的颗粒集合来产生包含聚乙二醇水凝胶网络和相互连接的物体和空隙的图案化的多孔结构。使用温和的非侵入性的方法侵蚀结构集合中的可光降解peg颗粒也可以使第二物体嵌入icc的孔中。这些方法也是具有细胞相容性的，促进了功能性生物材料的生产。简介聚乙二醇(peg)水凝胶已经成为组织工程学中广泛采用的支架材料，主要因为该材料具有相容的机械性能、水基组成和可调的化学结构。诸如单体长度的化学结构特征控制了聚合物交联密度，并允许控制支架中的基本质量输送和机械性能(参考文献3.1)。通过在制造过程中引入内相微模板或特征(即颗粒、纤维、网孔、气泡)，微尺寸内含物已经被成功地整合入水凝胶内。有据可查的方法包括相分离、气体发泡、三维印刷、乳液建模或球体建模以及粒子滤出(参考文献3.2、3.3)。在该实施例中，我们示出了可光降解peg颗粒的制造和原位集合，以在微通道内制造icc。微通道用作引导网络和icc结构内颗粒的定向。由于颗粒的侵蚀是被动的，因此其他功能对象也可以永久性地被接种到icc网络中。实验软光刻可光降解的peg合成可光降解的大分子单体由含有对光不稳定的邻硝基苄基醚基团的聚丙烯酸化的peg链合成。其他文献已经描述了完整的合成方案(参考文献3.5)。水凝胶颗粒制造与icc网络制造通过含有水性微粒的聚合物的动态光聚合，在微流体装置中产生了可光降解的水凝胶微粒(图11)。微滴在经典t形接头通道微流体装置中通过折断力学原理形成(参考文献3.4)。在该实施例中，我们使用～100μm厚的pdms微流体装置进行颗粒生产和过滤。连续相与分散相的流速比的方法允许我们控制液滴尺寸，并允许我们控制在微流体蛇形带通道中光聚合液滴所需的停留时间。我们使用氟油(novec7500+2％krytox表面活性剂)作为连续相，并制备包含基于聚乙二醇二丙烯酸酯(pegda)的可光降解的大分子单体的聚合物水溶液作为分散相。液滴的光聚合在蛇形带通道中进行，在此通过pegdipda交联分子的氧化还原引发的丙烯酸酯自由基链uv光聚合形成水凝胶颗粒。使用浓度为～0.5重量％的苯基-2,4,6-三甲基苯甲酰基次膦酸锂(lap)作为引发剂。与其他引发剂相比，lap在水中具有良好的溶解性，相对具有细胞相容性，并且在更长的uv波长(包括lp405)下具有改善的吸收光谱(参考文献3.6)。使用离心机分离悬浮在氟油中的聚合的颗粒，然后将所述颗粒在去离子水中再悬浮。颗粒-油分离也可以直接在微流体过滤装置中实现。使用基于过滤器的微流体装置对生成的颗粒进行流动堆积操作(图12)。对在微流体片上的堆积的颗粒集合注入不可降解的聚乙烯二丙烯酸酯(pegda，mw-700，sigmaaldrich)水基溶液(作为引发剂的3重量％的2-羟基-2-甲基苯丙酮(sigmaaldrich))，并在lp-405显微镜滤波器下进一步uv聚合(图13)。通过使用365nm的dapi显微镜滤波器进行第二uv暴露来实现第一水凝胶颗粒的后续降解(图14)。光不稳定的基团即4-(4-(1-羟乙基)-2-甲氧基-5-硝基苯氧基)丁酸乙酯负责颗粒的光降解。表征使用标准显微镜技术观察和验证多孔水凝胶结构，所述标准显微镜技术包括扫描电子显微镜技术、激光共焦显微镜技术和明场显微镜技术。结果和讨论微流体通道中的堆积流动诱导的微流体堆积是用于被动地将微球体排列成有序的集合的有效方法(参考文献3.7、3.8)。为了促进基于颗粒的复合材料的生产，重要的是要认识到，孔隙率和颗粒堆积的空间排列模式是确定最终复合材料集合的结构和整体机械性能的关键要素。在微流体装置中进行的实验使我们能够实时观察和监测颗粒流动模式和堆积现象。在图12(左图)中，示出了二维的有序的紧密堆积结构，示出了两个相邻水凝胶微粒之间角度的函数。在我们的实验中，在一个“无边界”的平面上，我们观察到落在两种堆积极限之间的堆积结构：立方晶格堆积和六边形紧密堆积。立方晶格堆积产生密度最小的结构，堆积密度为0.5236(π/6)，其中两个相邻颗粒之间的角度为90°(参考文献3.9)。在二维和三维中，颗粒分别与4个和6个(亦称作配位数)相邻颗粒相接触。当使用诱导的流动条件时，很少发生立方晶格的形成，并且难以复制。立方晶格形成仅在二维中靠近装置壁的隔离区域中观察到，或者在使原始结构变形的无意污染物周围观察到。每次最多可以找到三排颗粒的立方体晶格。几乎在我们进行的每个堆积实验中，二维平面中的流动诱导堆积都产生紧密堆积的六边形排列。在导致连续胶体生长的条件下，变形的堆积排布总是“自我修复的”，并且最终(在～5排颗粒内)返回到六边形紧密堆积结构。已经表明六边形的球体堆积是可获得的最密集的堆积形式，其二维平面堆积密度为0.6046(π/3√3)，三维堆积密度为0.74048(π/3√2)(参考文献3.10)。二维中的六边形堆积的相邻颗粒数为6，但在三维环境中为12(参考文献3.10)。补充的二维颗粒堆积实验也在具有不同宽度的狭窄通道中进行(图12，右图)。我们发现在狭窄的微通道中的颗粒基于单向的载体流体流线(flowstreamlines)以可预测的周期性结构晶格形式被动地集合，这与kumacheva和vanapalli此前的观察是一致的。由于在微通道中的流动是层流，颗粒随流动流线移动，并被动地落在流线汇聚的位置，并被动态捕获。在流体动力阻力场中的颗粒能量大于颗粒能量kt(其中kt是玻尔兹曼常数k和温度t的乘积)。由此前沉积的颗粒所创建的晶格间隙(参考文献3.7、3.8)是流体流线的焦点，因此这些间隙可以用作定位后续颗粒的位置模板。在图12(右图)中，我们示出了堆积密度和相邻颗粒角度之间的关系。颗粒侵蚀在图13中，我们阐明了用于水凝胶颗粒完全侵蚀(20重量％pegdipda，0-80秒)以及连续相完全聚合(40％pegda-700,0-12秒)的两个相对的时间尺度。在过滤器微流体装置(其中轻微地引导从左至右流动)中进行悬浮在乙醇溶液中的颗粒的光降解。从延时图像中，我们观察到颗粒均匀降解，并在乙醇中有效地溶解并被携带走。对于连续相的聚合，我们观察到通过色调颜色变化和颗粒周围明显的边界固化表明的强烈的聚合物凝胶化。在聚合过程中的大多数情况下，我们注意到可降解颗粒孔间相的不可逆变形。对于紧密堆积的结构，我们观察到颗粒圆形边界转化为六边形。如果颗粒松散地间隔开的(如在图3的sem图像中所看到的)，则孔隙空间的变形被避免，并且孔保持为圆形。原始形状变形的原因可能是由于聚合/降解过程中聚合物或颗粒体积变化引起的。通过imagej分析，测量的颗粒面积没有显著变化，表明连续相水凝胶经受蜜蜂蜂巢中观察到的类似张力。如karihaloo等人所描述的，蜂巢最初由横截面为圆形的小室制成，并且像数层球形颗粒一样堆积在一起。获得蜂巢蜡结构(由蜜蜂身体的热来软化)的堆积，并通过在三个连接壁相接处的接合点的表面张力将蜡拉成六边形小室(参考文献311)。类似的力可能是我们在微观环境中聚合微粒的过程中观察到的效应的原因(图14)。微流体辅助支架集合也为调整复合材料的结构和机械性能提供了许多开放策略。我们的单一尺寸可降解颗粒结构的堆积密度是0.61(二维)和0.74(三维)。在涉及连续聚合物相注入/聚合以及随后的模板颗粒侵蚀的实验中，我们的支架材料的等效孔隙率分别为0.61和0.74。这些支架不必局限于这些单一的孔隙率值。这些值是我们的单一尺寸颗粒的理论孔隙率上限，并且通过分步地添加不可降解颗粒并将之与可降解颗粒混合，我们能够控制和获得具有全范围(0-0.74)孔隙率的支架。通过添加不可降解的颗粒或降解非常缓慢的颗粒，我们能够控制和设计具有适合用于身体特定组织的孔隙率和机械性能的结构。图ex3-5示出了包封在较大的pegdipda可降解颗粒内的聚苯乙烯微球体(fluoro-max，thermoscientific，d＝5μm，浅绿色阴影)。可以在pegdipda模板颗粒降解后获得所形成的多孔支架的孔内的必需成分的被动内容物。结论示出了由可光降解的颗粒生产复合多孔水凝胶的新技术。尽管已经详细阐明和描述了本发明的优选实施方案，但是本领域技术人员应当理解，在不脱离本发明的精神和范围的情况下可以进行多种变化。因此，所公开的特定设置仅旨在说明而非限制本发明的范围，本发明的范围由所附权利要求及其任何等同物的全部范围给出。实施例4：在微流体乳液液滴中对水凝胶光聚合的细胞响应将细胞包封在生物相容性材料内是组织工程和基于细胞的疗法的具有前景的策略。最近出现了对于通过基于pegda微粒的光聚合的使用微流体进行细胞包封的广泛关注。在微流体装置内进行细胞包封允许了对密封剂材料的物理性质和细胞的微环境条件的精确控制。在透气性聚二甲硅氧烷(pdms)微流体装置内的pegda的光聚合可以使用最近开发的氮夹套装置成功地进行，在该装置中自由基链聚合的氧抑制已经被减轻。与在凝胶过程中细胞悬浮于静态的形成水凝胶的溶液中的本体聚合相比，通过微流体处理的包封细胞使细胞暴露于诸多可能有害的应力下，例如流体剪切、瞬时氧耗竭、升高的压力和uv辐射暴露。在该实施例中，我们检验了这些因素对由微流体乳化和光聚合作用所包封的细胞活力的影响。发现微滴形成期间的流体剪切速率在达到阈值水平之前对细胞活力没有明显影响。然而，uv暴露时间和强度对细胞的影响更为复杂，因为其对与细胞活力直接相关的过氧自由基的累积速率有不同的贡献。建立反应-扩散模型以计算在不同uv光强度和暴露时间下过氧自由基的累积产生量，其与实验结果一致。在本研究中获得的结果为进一步减少在经由微流体处理的包封过程中对细胞造成的物理损伤提供了指导，并扩展了所建立的平台的应用范围。简介在合成水凝胶内的包封是固定细胞和保护细胞免于机械应力及诸如巨噬细胞和抗体的有害大分子的具有前景且广泛使用的方法，并同时允许营养物和废物的双向扩散。包封的细胞可以用于组织工程和基于细胞的治疗中，其方法是将细胞定位在损伤部位或对某些慢性疾病连续递送治疗剂，并且还可以进行异种移植。在过去的几十年中，细胞包封已被探究并用作i型糖尿病、骨分化、血管分化和软骨形成的基于细胞的疗法。已经探索了多种天然和合成聚合物水凝胶用于细胞包封，所述聚合物水凝胶包括透明质酸琼脂糖、葡聚糖和藻酸聚赖氨酸(alginatepolykysine)。由于基于聚(乙二醇)(peg)的单体具有良好的生物相容性、力学性能、可调节和易于修饰的网络，针对细胞包封，其已被广泛应用和表征。并且丙烯酸酯端基的并入显著扩大了基于peg的水凝胶在细胞包封上的应用，其中形成水凝胶的溶液的胶凝可以通过uv光暴露来实现，从而允许对水凝胶性质进行精确的时间和空间上的控制。最近，在100μm到500μm范围的水凝胶内的微包封细胞已经成为在治疗、材料合成和药物研发中具有广泛应用的具有强烈研究兴趣的领域，其中由于较大的表面积与体积之比，敏感强度和信号强度可以被提高至两倍于传统方法的数量级。微流体技术的先进发展有望在细胞微包封和细胞高通量处理方面有突破性的应用，其中高度单分散的表面活性剂稳定的水性微滴形成于微流体通道的接头处或同轴毛细管中。由于基于聚二甲硅氧烷(pdms)的微流体装置的高气体渗透性和输送速率以及其可以由光刻母版通过复制模塑而快速且廉价地制造，因此引入该微流体装置扩大了微流体装置在与生物工程相关的研究中的应用。此前的研究表明，pegda的自由基链聚合由系统中和空气中的氧气强烈抑制，特别是当在使用富氧氟化油作为连续相的气体可渗透的基于pdms的微流体装置中进行实验时。氧抑制使微流体装置中的细胞包封更加困难，原因在于在氧清除过程中产生的过氧自由基，其将给细胞带来有害的影响，例如脂质过氧化、氨基酸氧化、特定酶的失活和dna损伤。使用本文所述的氮净化微流体装置，通过将氧清除出系统以减轻胶凝的氧抑制，已经成功地通过光聚合获得了完全聚合的基于pegda的颗粒。这种氮气净化装置得到进一步开发，我们最近开发了用于其中细胞活力显著改善的细胞包封的双层氮气净化微流体装置，通过调节氮气净化压力能够精确地控制流体中的氧浓度。惯性聚焦(inertialfocusing)的发展使得细胞能够不借助外力在明确定义的侧向和纵向位置上对齐，其中细胞被迫通过高长径比的微通道快速输送。该技术允许在微流体装置中将单细胞包封在微滴或微粒中，用于细胞应答或产物的高通量分析。在通过pegda的光聚合作用在微流体装置上的细胞包封过程中，细胞暴露于多种潜在的有害效应物。然而，对这些个体因素的细胞响应尚未被评估。在本研究中，我们评估了流体剪切速率、微流体装置中的细胞停留时间、氮气净化压力、uv暴露强度和时间对细胞活力的影响。与不断增加的uv照射强度相比，uv暴露时间的增加对细胞活力的有害影响更大。利用有限元反应-扩散模型计算uv暴露期间过氧自由基的累积浓度，结果显示其对过氧自由基的累积速率有不同的贡献，过氧自由基的累积速率与细胞活力直接相关，该累积速率由流体中的残余氧及其扩散速率决定。通过评估对这些因素的细胞响应，我们提供了在通过微流体处理的包封过程期间进一步提高包封后细胞活力的指导，并扩展了片上细胞包封平台的应用。材料和方法细胞培养使用补充有10％胎牛血清(sigma-aldrich，美国)、1％青霉素/链霉素和0.2％二性霉素b(lifetechnologies，美国)的低葡萄糖dulbecco改良eagles培养基(dmem；lifetechnologies，美国)在37℃下以及5％co2湿润培养器中常规培养人类肺腺癌上皮细胞(a549)。微流体装置制造在本研究中使用的微流体装置的母版铸模使用软光刻技术根据我们团队所开发的方案制造。对于仅具有单层特征的铸模，硅晶片(siliconinc.，美国)使用su-82015负性光刻胶(microchem，马萨诸塞州，美国)以30μm的厚度涂覆。将具有设计特征的光掩模(cad/artservices，俄勒冈州)放置到晶片上，然后暴露于经校准的uv光(omnicures2000，美国)，以实现聚合特征，其中使用显影剂(丙二醇单甲醚乙酸酯，sigma-aldrich，美国)去除未固化的光刻胶。对于双层氮净化微流体装置的铸模的制造，首先使用前述方法制造第一层(30μm)的特征，随后使用相同的方法使用su-8100(microchem，马萨诸塞州，美国)以100μm的厚度在此前制造的晶片上进行第二平面流动网络图案化。通过将聚二甲硅氧烷(pdms，dowcorning，密歇根州)倾倒在图案化的硅晶片上铸造微流体装置，并且将固化的弹性体从晶片上剥离并且通过锐化的20g点胶针穿刺聚二甲硅氧烷(bricomedicalsupplies,inc.，美国)，以形成入口孔和出口孔。使用氧等离子体将pdms复制品结合到载玻片上。在进行实验之前，将aquapel(ppgindustries)短暂地注射入装置中并用氮气冲洗以获得用于产生水性液滴的疏水表面。大分子合成与水凝胶光聚合根据前述方案使a549细胞生长至80至90％细胞融合。使用0.05％胰蛋白酶/乙二胺四乙酸(lifetechnologies，美国)对融合的细胞进行胰蛋白酶化、沉淀，并随后再悬浮于重磷酸盐缓冲盐水(pbs，sigma-aldrich，美国)(～3×107细胞/ml)中，使用optiprep密度培养基(aldrich，美国)调节重磷酸盐缓冲盐水使其具有1.05g/ml的比重。在由75mol％聚乙二醇单丙烯酸酯(pegma，mn≈400da；monomer-polymeranddajaclabs)和25mol％聚(乙二醇)二丙烯酸酯(pegda，mn≈3400da；jenkemtechnology，北京，中国)组成的pbs中制备45总wt％的大分子单体混合物{weber:2008wm}。通过如前所述的方法合成uv引发剂苯基-2,4,6-三甲基苯甲酰基次膦酸锂(lap){fairbanks:2009kz}并将其以0.3wt％的浓度溶于pbs中。将重pbs中的细胞、uv引发剂和大分子单体溶液分别注入微流体装置中，在装置中将他们充分混合以形成由1×107细胞/ml、0.1wt％的lap和15总wt％的大分子单体组成的形成水凝胶的聚合物溶液。细胞活力评估将包封在微滴或微水凝胶中的细胞从油中分离，并使用含有0.1wt％pluronicf-127的pbs在5μm细胞粗滤器(pluriselect，美国)上洗涤并再悬浮于pbs中。使用用于哺乳动物细胞的活/死细胞活力/细胞毒性试剂盒(lifetechnologies，美国)测定细胞活力，其中添加染色溶液(2μm的钙黄绿素am和4μm的乙啡啶均二聚体)并且在室温下培养15分钟。使用pbs洗涤染色的水凝胶，使用倒置荧光显微镜ix-71(olympus，美国)对活细胞和死细胞的数量计数，并计算相应的细胞活力。流速和停留时间将细胞和形成水凝胶的大分子单体溶液在装置中混合，然后用连续相即包含2wt％pico-surf(dolomite，美国)的novec7500挤压，以在微流体装置的喷嘴区域形成微滴。通过调节分散相和连续相的流速来改变剪切力，然后通过测定相应的细胞活力来评估对于应力变化的细胞响应。在恒定的流体流速和氮气净化压力(pn2＝7psi)下，通过改变出口位置来改变微流体装置中细胞的停留时间，其中示出了停留对细胞活力的影响。氮气净化压力另外通过改变净化压力来评估对氮气净化压力的细胞响应，并由此评估相应的细胞活力。当氮气净化压力低于某一值时，无法实现完全聚合的基于pegda的微粒，其中我们使用前述方案从油中将细胞分离，而不是将微粒分离，并随后测定细胞活力。uv辐射强度和时间在本研究中，uv辐射对细胞活力的影响被分解为辐射时间和辐射强度，并分别进行评估。将具有特定透明区域的掩模放置在微流体装置上以控制uv辐射时间，并且使用omnicures2000来调节uv辐射强度，其中辐射时间基于流体总流速和通道的几何结构计算。uv辐射时间对细胞活力的影响通过使用120w/cm2的恒定uv辐射强度并将辐射时间从1.1s变化至9.9s来评估。通过测定对应于恒定暴露时间1.1s、范围在60至600w/cm2的不同uv强度暴露的细胞活力来评估对于uv强度的细胞响应。光聚合建模构建自由基光聚合的反应-扩散模型并将其用于量化过氧自由基的积累并进一步解释uv暴露对细胞活力的影响，其中过氧自由基在生产后被假定为惰性的。在comsolmultiphysics软件中使用参数创建了有限元数值模型，其设置可以在补充信息中找到。在一维轴对称空间中绘制的线被设置为表示从液滴中心到液滴界面的距离。对被稀释物质的研究的时间依赖性输送使用流动微分方程在作为模型基础的线当中进行选择，其中同时解这些方程。表d流动微分方程在我们的液滴光聚合模型中，主要反应物质是：大分子单体、引发剂、自由基和氧气。所有用于该模型的反应参数都是从文献中获得的。基于对氮夹套有效性的实验观察值，假定经净化的微通道内的液滴中的氧气浓度被显著稀释。使用在该实验中的数据和在我们的实验室中创建的comsol模型计算出压力依赖的氧浓度，即0.01mol/m3。结果和讨论对于流体剪切和停留时间的细胞响应在形成水凝胶的大分子单体溶液中的细胞被连续相即包含2wt％pico-surf的novec7500挤压，以在微流体装置的喷嘴处形成微滴(图16a)。已经证明流体流速对细菌的行为和功能有影响，并且流体流速也与流体中的细胞旋转速率和施加到细胞上的应力相关，这可能对细胞造成物理损伤。形成水凝胶的溶液和油相两者的流速如表e所示被改变。收集微滴并使用前述方法将细胞从油相中分离。绘制出流体流速对细胞活力的影响(图17a)，其中随着流速的增加，细胞活力在直到流速达到16μl/min之前均没有明显改变。之后，随着流体流速进一步增加，细胞活力急剧下降。结果表明，油和形成水凝胶的溶液的相对较低的流速对细胞活力没有影响，但是当达到阈值时，流速对细胞有害并在细胞中造成物理损伤。表e：油相和形成水凝胶的大分子单体的流速油(μl/min)4681010121520大分子单体(μl/min)12334444通过改变装置上的出口位置来调节装置中细胞的停留时间，并且使用流体的总流速和微流体装置的几何结构来计算装置中的细胞的输送时间。评估了对于具有氮气净化(pn2＝7psi)的不同停留时间的细胞响应，如图17b所示，其中当停留时间从2.4s增加到14.4s时细胞活力均未发生改变。实验数据表明，无论停留时间还是高的氮气净化压力都不会对细胞产生有害影响，这允许通过氮气净化压力精确控制流体中的氧浓度，以实现以相对高的细胞活力在微流体装置中将细胞包封在完全聚合的基于pegda的微粒中。对于氮气净化压力的细胞响应氮气净化微流体装置已被成功证明可以减轻自由链聚合的氧抑制并且可以用于使用pegda通过光聚合在微流体中实现微粒的完全聚合。通过将氮气压力从0变化至7psi来评估对于氮气净化压力的细胞响应，其中形成水凝胶的溶液和油相的流速分别为1μl/min及2μl/min(对于第一层)和7μl/min(对于第二层)。当具有细胞的微滴输送经过装置上的uv暴露区域时，微滴暴露于120mw/cm2的uv光中1.1秒。实验结果表明，随着氮气净化压力从0变化到7psi，细胞活力从20％增加到90％(图18)。由于细胞活力已经显示与自由基氧化过程中产生的过氧自由基的量直接相关，因此表明氮净化压力与流体中残余氧浓度相关。对于uv暴露时间和强度的细胞反应细胞在装置中被包封在微滴内，当微滴穿过uv暴露区域时，微滴通过光聚合变成微粒。我们团队最近提出的氮气净化微流体装置能够实现在装置中将细胞包封在完全聚合的基于pegda的微粒内，并通过显著降低流体中的残余氧气浓度来改善细胞活力；然而，尚未清晰地阐明uv辐射对细胞活力的影响。在此我们将uv辐射分成uv暴露时间和强度，并分别绘制出其对细胞活力的影响。设计了一系列具有特定透明区域的掩膜，并将其放置在微流体装置的顶部以控制uv暴露时间，如图16b所示。在图19a中绘制了uv暴露时间对细胞活力的影响，其中随着uv暴露时间从1.1s增加到9.9s，细胞活力从90％下降到20％。结果表明，在恒定强度的情况下，uv暴露时间的增加对细胞有不良影响。随后在保持uv暴露时间恒定(1.1s)的情况下，通过改变uv强度来评估uv强度对细胞活力的影响。绘制了细胞对uv强度变化的响应，如图19b所示，其中细胞活力在uv强度从60mw/cm2增加到600mw/cm2时没有明显变化。这些实验结果表明，不同于uv暴露时间，uv强度的变化对细胞活力没有强烈影响。比较以上实验结果，细胞活力具有很大的差异(图19a和图19b)，这表明uv光暴露时间和强度可能对细胞活力的降低有不同的贡献。使用comsol计算累积过氧自由基数量当uv暴露时间为5.5s和1.1s且uv强度为120mw/cm2和600mw/cm2时，uv辐射剂量是相同的；然而，细胞活力具有显著差异，分别为60％和85％。为了进一步解释为何相同的uv辐射剂量对细胞活力的影响不同，我们使用comsol模型计算了uv暴露过程中形成的累积过氧自由基数量，在上文中已经显示了其与细胞活力直接相关。从comsol模型得到的结果来看，即使上述两种条件下的uv辐射剂量是相同的，累积的过氧化自由基数量是不同的，其中uv暴露时间较短的条件下产生较少的过氧化自由基，也导致更高的细胞活力。实验结果表明，在一定的uv辐射剂量下，较长的uv暴露时间要比较高的uv暴露强度对细胞的不良影响更大。结论在该实施例中，我们已经评估了对微流体装置中通过pegda的光聚合的细胞包封中所涉及的各个因素的细胞响应。停留时间和相对低的流速不会对细胞产生不良影响，并且可以获得高细胞活力。然而，氮气净化压力对细胞活力具有关键影响，为了获得高的包封后细胞活力，氮气净化压力应该至少高于5psi。对uv暴露的细胞响应表明，uv暴露时间和强度对细胞包封期间过氧自由基的形成有不同的贡献，其中对于特定的uv辐射剂量，应采用较短的暴露时间，而不是较低的uv强度。在活力方面，对这些各个因素的细胞响应提供了在微流体装置中通过光聚合将细胞包封到微粒内的标准，其中应该在相对低的流速下使用相对高的氮气净化压力和较短的uv暴露时间以实现良好的包封后细胞活力。补充信息表f：pegda聚合反应步骤在上表中，m表示未转化的双键；m*表示自由基物质；x代表所有的自由基物质(m*和r*)。表g：对过氧自由基数量预测进行建模所涉及的参数实施例5：在光聚合的pegnb水凝胶微球体中实现较高的长期细胞活力的基于微流体的细胞包封平台光引发的基于聚乙二醇(peg)的水凝胶支架内的细胞包封已被证明是细胞输送、组织工程、再生医学和开发体外平台以研究细胞行为和命运的有效的策略。近年来，对peg水凝胶机械性能的空间和时间特征、化学功能化和细胞相容性的控制已经得到大大改进。最近的微流体技术使得实现了peg水凝胶小型化，从而使得制造小型化的载有细胞的载体成为可能。然而，氧气的存在显著抑制聚乙二醇二丙烯酸酯(pegda)的链增长光聚合，因此限制了其在微流体学中的应用。另一种具有前景的基于peg的支架材料，即peg降冰片烯(pegnb)通过阶梯式生长光聚合形成，其不受氧气抑制。pegnb还比pegda更具有细胞相容性并且允许正交加成反应。然而，阶梯式增长动力学缓慢，因此对在微流体装置内生成完全聚合的微凝胶微滴提出了挑战。在此，我们描述一种始终生成单分散的载有细胞的油包水乳液的基于微流体的液滴制造平台。收集pegnb液滴并在uv暴露下进行本体光聚合。在本发明中，我们针对微凝胶大小、均匀性、包封后细胞活力和长期细胞活力，将这种基于微流体的细胞包封平台与基于涡旋的方法相比较。鉴别出了潜在影响包封后细胞活力的若干因素。最后，将该平台与使用pegda的类似细胞包封平台在长期细胞活力方面进行比较。我们证明这种pegnb微包封平台能够以较高速率产生载有细胞的水凝胶微球体，且具有良好控制的尺寸分布和较高的长期细胞活力。简介本体水凝胶(bulkhydrogel)广泛用于包封各种应用中的活细胞。在组织工程中，将细胞包封和组织在三维水凝胶支架内可通过呈现特定信号线索引导所需组织的形成(参考文献5.1-5.2)。最近，载有细胞的水凝胶支架的移植已经发展成为在活体内的受控的、可持续的生长因子的输送的替代且具有吸引力的方法(参考文献5.3)，其中水凝胶支架充当隔离植入细胞与免疫系统的屏障，防止免疫排斥反应(参考文献5.4)，同时允许氧气、营养物质以及细胞产物和废料的双向扩散(参考文献5.5)。在水凝胶支架开发方面的进展促进了细胞包封，这是i型糖尿病(参考文献5.6)、软骨(参考文献5.7)和骨再生(参考文献5.8)、骨关节炎(参考文献5.9)、帕金森症(参考文献5.10)和癌症(参考文献5.11)的具有潜力的疗法。已经研究了各种细胞包封剂，包括琼脂糖、藻酸盐、胶原和透明质酸(参考文献5.12-5.15)。近年来，基于peg的自由基光聚合的水凝胶得到了广泛研究，并且由于其合成多功能性和在空间和时间上控制水凝胶网络特性的能力而被开发为细胞包封剂(参考文献5.16-5.18)。此外，peg水凝胶对包括间充质干细胞(msc)、β细胞、成纤维细胞和神经细胞在内的多种细胞类型表现出优异的细胞相容性，使其成为细胞包封的具有吸引力的支架材料(参考文献5.19-5.22)。自由基光聚合策略通常包括分别允许链增长或阶梯式增长胶凝机理的丙烯酸酯或硫醇-烯化学成分(参考文献5.23-5.25)。然而，链增长聚合(pegda)几乎完全被氧气的存在所抑制，因为氧淬灭自由基的速率比链引发和增长的速率快得多(参考文献5.26-5.28)。自由基清除的产物包括活性氧(ros)的积累，其可以在细胞内诱导细胞内氧化应激，从而导致对诸如dna、蛋白质和脂质的生物大分子的损伤(参考文献5.29-5.30)。相反地，在硫醇和乙烯基之间发生的pegnb的阶梯式增长聚合不会被氧气剧烈地抑制。在光引发后，pegnb可以形成更均匀的聚合物网络，且结构中的收缩减少，因此比pegda诱导的细胞应激更小(参考文献5.31)。或许最重要的是，对某些细胞类型，pegnb已被证明支持相对于pegda增加的包封后活力，表明pegnb作为细胞包封剂具有很强的实用性(参考文献5.32)。虽然pegnb的细胞相容性增加的起源尚不确定，但研究表明pegnb聚合可通过ros增长，从而消耗ros(参考文献5.33-5.34)。对于对ros特别敏感的细胞类型，减少光聚合的这些有害的副产物可能是所观察到的细胞活力的增加的一个影响因素。通过微加工或微流体的小型化peg水凝胶已成为生物传感、组织工程、药物递送和高通量筛选的具有前途和多用途的平台(参考文献5.35-5.39)。细胞包封已经通过截流光刻技术(sfl)示出，截流光刻技术是一种用于peg微凝胶制造的单相微流体技术，具有低通量，但可以对微凝胶的形状和大小进行精确控制(参考文献5.40)。sfl与可水解的水凝胶网络结合可产生具有可调特性和降解特性的细胞或药物递送支架(参考文献5.41)。微流体乳化技术是一种能够在连续油相中产生单分散水性液滴的双相微流体技术，该技术将微凝胶制造频率提高到khz(参考文献5.38)，从而为高通量单细胞包封或筛选提供了一种潜在的工具(参考文献5.42-5.44)。光包封后持续的细胞活力是一个重要的需要考虑的参数，特别是在需要从包封细胞分泌生长因子的应用中。然而，尽管在将细胞包封在pegda水凝胶微球体中之后可以实现较高的初始包封后细胞活力(参考文献5.28、5.45)，但在更长的时间段内观察到细胞活力显著降低。在该实施例中，我们利用交叉流动的微流体装置将细胞包封在pegnb液滴内，然后将该液滴收集并暴露于本体溶液中的uv光下，用于光聚合。利用这个平台，我们已经能够通过以较高速率生产均匀的载有细胞的水凝胶微球体来利用微流体的益处。通过本体聚合，我们克服了pegnb的缓慢聚合动力学，并实现了在更长的时间内较高的包封后细胞活力。已经对该平台和基于涡旋的细胞包封之间的水凝胶微球体均匀性和包封后细胞活力进行了比较。研究了几种可能影响细胞活力的因素，目的是增加包封后细胞活力。与pegda相比，我们已经表明这种基于微流体的细胞包封平台能够产生具有显著增加的包封后细胞活力的载有细胞的pegnb水凝胶微球体。材料和方法引发剂和大分子单体合成根据已经建立的方案进行光引发剂酰基次膦酸锂盐(lap)的合成(参考文献5.46)。简而言之，将2,4,6-三甲基苯甲酰氯滴加到含有等摩尔量的苯基亚膦酸二甲酯(均来自sigma-aldrich)的100ml圆底烧瓶中。用氮气持续净化烧瓶并在室温下过夜搅拌。将含有于80ml2-丁酮中的四倍(mol:mol)过量的libr(均来自sigma-aldrich)的溶液加入到来自前一步骤的michaelis-arbozov产物中，搅拌并加热至50℃直至观察到沉淀形成(10分钟)。然后将烧瓶冷却至室温并搅拌4小时。将产物在真空下干燥并用多份2-丁酮冲洗以除去未反应的libr。产物lap以>80％的产率被回收，并且通过h-nmr确认。大分子单体四臂聚(乙二醇)四降冰片烯(pegnb)的合成根据已经建立的方案进行(参考文献5.24、5.32、5.47)。简而言之，将12克20kda四臂peg(creativepegworks)加入到40ml闪烁瓶中的20ml二氯甲烷(mecl，sigmaaldrich)中，搅拌直至完全溶解，并置于一旁。向含有10mlmecl的50mlrb烧瓶中加入n,n-二环己基二酰亚胺，随后逐滴添加5-降冰片烯-2-羧酸(分别5和10摩尔过量于四臂peg；均来自sigmaaldrich)。将预先制备的四臂peg溶液加入到50mlrb烧瓶中，置于冰浴中，并在氮气下过夜搅拌。将冰冷的乙醚(sigmaaldrich)加入到含有产物的溶液中，将得到的沉淀物进行真空过滤、再结晶，并随后进行36小时索格利特萃取以除去不需要的杂质。白色的pegnb产物在真空下过夜干燥。产物以67％的产率被回收，并通过h-nmr确认。微流体装置制造使用标准pdms软光刻技术制造微流体交叉流动装置(参考文献5.48)。简而言之，将聚二甲基硅氧烷(pdms)倾倒到su-8微图案化的硅晶片上，抽真空以去除残留的空气，并在70℃烘箱中固化至少1小时。将pdms复制品切割并用20g针头(bricomedicalsupplies,inc.,美国)冲孔以形成入口和出口。用氧等离子体处理pdms片并将其贴合到载玻片上。为了促进液滴形成，通过使用aquapel(ppgindustries)将设备填充并用空气冲洗来创建疏水性微通道表面。为形成pegnb液滴，对于含有细胞的水相，通道尺寸(高×宽)为80μm×100μm，对于油相，通道尺寸(高×宽)为80μm×30μm。如前人所述(参考文献5.45)，制造用于pegda颗粒生产的双层氮夹套微流体装置。预聚物溶液将pegnb预聚物溶液混合为最终浓度为10wt％pegnb(mn≈20000da，具有四臂)、10mm二硫醇连接物(mn≈1500da，sigma-aldrich,美国)和0.1wt％苯基-2,4,6-三甲基苯甲酰基次膦酸锂(lap，光引发剂)。将pegda预聚物溶液混合为最终浓度为10wt％pegda(mn≈3400da，jenkemtechnology，美国)、0.1wt％lap和5mmrgds。细胞培养将人类肺腺癌上皮细胞(a549)在补充有10％胎牛血清(fbs；lifetechnologies，美国)、1％penstrep和0.2％二性霉素b(sigma-aldrich，美国)的低葡萄糖dulbecco改良eagle培养基(dmem；lifetechnologies，美国)中培养。a549在37℃的5％co2培养箱中培养，每3天更换培养基且每6天传代培养。在准备细胞包封时，用0.05％胰蛋白酶(lifetechnology，美国)将a549从培养瓶中分离、沉淀，并再悬浮至培养基中5×107细胞/ml的细胞密度。通过加入18.75％v/voptiprep(sigma-aldrich，美国)将培养基密度调节至1.06g/ml。微流体细胞包封在pegnb中进行细胞包封之前(图21a)，将a549悬浮在预聚物溶液中、混合，并通过注射器泵注入微流体装置。氟油(具有2wt％pico-surf(dolomite)作为表面活性剂的novec7500)和水相的流速保持恒定，分别为10μl/min和2μl/min。收集载有细胞的液滴，通过暴露于uv光下20秒(100mw/cm2，lumendynamicsgroupinc.，s2000-xla，加拿大)，将其本体聚合成水凝胶微球体。通过用pbs中的0.1wt％pluronicf-68(sigma-aldrich，美国)洗涤并在10μm过滤器(pluriselect，德国)上离心，从油中分离水凝胶微球体。将载有细胞的水凝胶微球体再悬浮于在低附着6孔板(corningincorporated，美国)中含有0.1wt％f-68的培养基中(参考文献5.28)。对于pegda包封(图25c)，a549、pegda、和lap及rgds装载到三个注射器中并在微流体装置内以0.33μl/min的恒定流速混合。将氟油注入微流体装置中，对于第一层和第二层，分别为2μl/min和7μl/min。夹套中的氮气压力保持为7psi的恒定压力。在离开装置之前，液滴通过装置的第二层中的蛇形通道，在该通道中液滴通过暴露于uv光(mecury-100w，chiutechnicalcorporation，美国)发生聚合，通过20x显微镜物镜(olympus)。如上所述，将载有细胞的pegda水凝胶微球体从油中分离并培养。涡旋细胞包封将a549和pegnb预聚物溶液通过旋涡混合器(～1000osc/min)(scientificindustriesinc.，美国)涡旋混合30s。随后将氟油加入到预聚物溶液中并涡旋1分钟以形成乳液，通过暴露于uv光20秒将其聚合成水凝胶微球体(图1b)。使用与前述方法相同的方法分离和培养水凝胶微球体。本体细胞包封将a549在pegnb或pegda预聚物溶液内混合并暴露于uv光20秒以形成载有细胞的水凝胶构造。将包封在本体水凝胶内的细胞在培养基中培养，每隔一天更换培养基。每个构造的近似体积为60μl，并且构造内的细胞密度保持恒定，为～5×107细胞/ml。细胞活力测量使用将活细胞染成绿色并将死细胞染成红色的膜完整性测定(live/deadviabilitykit，lifetechnologies，美国)测量包封细胞的活力。使用倒置荧光显微镜(ix-71，olympus，美国)对细胞活力进行成像，并计算细胞活力。结果和讨论由微流体装置和涡旋制备的水凝胶微球体的尺寸分布水凝胶微球体尺寸表征通过两种方法进行。首先将红色染料即0.01wt％硫醇化罗丹明b加入预聚物溶液中以标记网络。使用荧光显微镜对水凝胶微球体进行成像，并使用imagej测量水凝胶微球体的直径。水凝胶微球体的荧光图像和尺寸正态分布在图22中示出。如所预期的，由微流体装置产生的水凝胶微球体具有90至130μm范围的直径，显示出比通过涡旋产生的那些水凝胶微球体窄得多的尺寸分布，涡旋产生的那些水凝胶微球体具有30至140μm的直径范围。对于微流体制造方法和涡旋制造方法，微凝胶颗粒的多分散性均计算为颗粒直径的标准偏差除以平均直径。微流体产生具有6.22％多分散性的微凝胶，而涡旋产生具有23.62％平均多分散性的颗粒样品，表明微流体已大幅改善了微凝胶的单分散性。细胞微包封及对细胞活力的影响通过上述两种方法将a549包封在pegnb水凝胶微球体内并且在其中光聚合(图23b)。收集这些载有细胞的颗粒并分别在37℃、5％co2培养箱中培养，每隔一天更换培养基。在30天的过程中，通过使用2μm钙黄绿素am和4μm乙啡啶均二聚体-1染色载有细胞的颗粒进行细胞活力测定。通过涡旋和在微流体装置内包封的细胞在活力方面具有相似的趋势。在被包封进水凝胶微球体中后立即观察到高细胞活力(>90％)，随后细胞活力随时间逐渐降低但保持在相对较高的水平(图23a)。值得注意的是，在本研究中，制造了没有任何促进细胞附着或增殖的修饰的空白的pegnb水凝胶颗粒。然而，正如此前的文献所表明的，对水凝胶网络的蛋白质或肽修饰会改善细胞附着或水凝胶降解(参考文献5.49-5.50)。可以探索类似的网络修饰作为进一步增加在pegnb颗粒内包封的细胞的长期的包封后活力的途径。微流体细胞包封中涉及的因素对包封后细胞活力的影响为了鉴定微流体细胞包封期间与细胞损伤和活力损失相关的参数，使用细胞活力作为主要度量标准进行了一系列对照实验。为了再现包封的输送，在培养基中将a549转移到注射器中，并在室温下保持在注射器中2小时，每0.5小时测定细胞活力。在2小时的过程中观察到的细胞活力只有很小的降低(图24a)，表明在输送到装置之前在注射器中的长停留时间对细胞是无害的。为了研究细胞的微流体包封进入液滴的多个方面是否影响细胞活力，将培养基中的a549注射到微通道中，并使其通过油相或由油相挤压成液滴。在后一种情况下，水相和油相的流速分别为2μl/min和10μl/min。通过使用5μm细胞过滤器离心来破坏乳液。细胞穿过微流体装置仅使细胞活力下降约4％，而由油挤压并被包封到液滴中导致细胞活力再下降5％(图24b)。随后将a549混合入pegnb预聚物溶液中，并在室温下在不暴露于任何uv的情况下保持2小时。通过每30分钟对这些细胞进行染色，观察到细胞活力显著降低(图24c)，表明仅在形成peg水凝胶的溶液中长时间培养细胞代表了降低细胞活力的过程。还研究了细胞包封和水凝胶光聚合之间经过的时间对包封后细胞活力的影响。在不连续的时间段内收集了载有细胞的pegnb液滴，随后液滴通过暴露于uv线下聚合。随着收集时间的增加，细胞的活力显著下降(图24d)。由于细胞停留在形成水凝胶的溶液中而观察到的细胞活力的时间依赖性降低可以解释在通过涡旋包封后相对于通过微流体包封后细胞活力的少量增加(图23)。正如本体水凝胶结构的聚合一样，涡旋本质上是批处理过程，该过程在生成乳液和收集聚合的载有细胞的颗粒之间仅需要约两分钟。另一方面，微流体包封是一个连续过程，该过程可能需要在未聚合的形成水凝胶的溶液内长时间的培养。如上所述，虽未作出解释，但该停留时间对细胞是有害的。pegnb和pegda包封后细胞活力之间的比较pegda已被广泛证明是细胞包封的可行材料，并且最近已经被证明支持紧随微滴中的包封和光聚合之后的较高细胞活力(参考文献5.45)。为了评估在不同包封条件下，pegnb作为细胞包封剂相对于pegda的生物相容性，将a549包封在pegnb或pegda本体水凝胶和水凝胶微球体中。在本体包封之后，pegnb水凝胶中的细胞保持比pegda水凝胶中的细胞更高的活力(图25a和图25b)，这与此前报告的结果(参考文献5.32、5.51)一致。对于连续的细胞微包封，pdms微流体装置的高氧气渗透性以及这些研究中使用的氟油的高氧溶解度需要使用定制的微流体设计(参考文献5.28、5.52-5.53)。该装置是一种氮夹套双层装置(图25c)，该装置被引入以通过消除从pdms装置或油中到液滴中的氧气扩散来避免pegda的氧抑制(参考文献5.45)。在包封后立即在空白的pegnb和rgds修饰的pegda水凝胶微球体中达到高的细胞活力。然而，在培养8天后，在pegnb颗粒中维持了高的细胞活力，而在pegda颗粒中的细胞活力在第8天剧烈下降至0％(图25d)。这些结果反映了在本体水凝胶中观察到的趋势，并且进一步表明pegnb本身是比pegda更具有细胞相容性的细胞包封剂，并且支持更持久的细胞存活力。结论在该实施例中，我们引入了一种基于微流体的细胞包封平台，该平台允许将pegnb用作细胞密封剂。将该方法与基于涡旋的细胞包封进行了比较，并且发现在控制水凝胶微球体的尺寸和均匀性方面该方法优于基于涡旋的细胞包封。我们已经证明，可以高速地连续地生成平均直径为大约110μm的高度单分散、均匀的载有细胞的微凝胶。在本研究中被认为是主要参数的包封后细胞活力在30天的过程中可以维持在相对较高的水平。已经对若干实验参数进行了研究以调节微包封后的细胞活力。值得注意的是，确定了包封后细胞活力和液滴收集时间之间的相关性，表明细胞活力在进行光聚合前以时间依赖的方式下降。最后，在本体和微粒细胞包封条件下对pegnb与pegda的细胞相容性进行了比较。发现在pegnb内包封的细胞表现出了远比在pegda内包封的细胞优异的长期活力，尽管紧随包封后具有相当的活力。本文阐述的微流体方法使得pegnb能够形成为微粒，该微粒示出相同的已经在本体凝胶中观察到的相对于pegda的相对优势。关于援引加入和变化的声明本申请中的所有参考文献，例如，包括已颁布或授权的专利或等同物的专利文件、专利申请公布文本、和非专利文献资料或其他资料来源，均通过援引全文加入本申请，就如同单独地援引纳入一样，并且每份参考文献至少部分地与本申请中的公开内容一致(例如，除参考文献的部分不一致的部分外，该参考文献通过援引加入)。本文使用的术语和措辞为描述性术语而非限制性术语，并且不旨在使用这样的术语和措辞来排除所示出和描述的特征或其部分的任何等同物，但是应当认识到，在本发明要求保护的范围内可以进行各种修改。因此，应当理解，虽然本发明已经通过优选实施方案、示例性实施方案和可选特征具体公开，但是本领域技术人员可能采用本文所公开的概念的修改和变化，并且这样的修改和变化被认为是在由所附权利要求限定的本发明的范围内。在此提供的具体实施方案是本发明的有用实施方案的实施例，并且对于本领域技术人员显而易见的是，可以使用在本说明书中提出的装置、装置组件、方法步骤的多种变型实现本发明。对于本领域技术人员而言显而易见的是，对于本发明的方法有用的方法和装置可以包括大量可选的组成、处理元件和步骤。当本文中公开一组取代基时，应当理解，该组取代基的所有单个成分和所有亚组，包括该组成分的任何异构体，都是单独公开的。当在此使用markush分组或其他分组时，该组中的所有单个成员以及该组可能的所有组合和子组合都旨在单独包括于本公开中。当本文中对某个化合物的例如采用化学式或化学名称的描述使得没有具体指出该化合物的具体异构体、对映异构体或非对映异构体时，该描述旨在包括单独和组合描述的该化合物的每种异构体。另外，除非另外指明，否则本文所公开的化合物的所有同位素变体均旨在被本公开所涵盖。例如，应当理解，所公开的分子中的任何一个或多个氢可以被氘或氚替代。分子的同位素变体通常可用作分子测定中以及与分子或其用途相关的化学和生物学研究中的标准。制造这种同位素变体的方法在本领域中是已知的。化合物的具体名称是示例性的，因为众所周知，本领域技术人员可以以不同方式命名相同的化合物。诸多本文所公开的分子含有一个或多个可离子化基团(质子可以从其中除去(例如-cooh)或增加(例如胺)或被季铵化(例如胺)的基团)。此类分子及其盐的所有可能的离子形式旨在被单独包括在本文的公开内容中。关于本文中化合物的盐，本领域技术人员可以从多种可用的抗衡离子中选择适用于制备用于本发明的特定应用的盐的抗衡离子。在具体应用中，对于用于制备盐的特定阴离子或阳离子的选择可能导致该盐的溶解度增加或降低。除非另有说明，否则本文描述或示出的组分的每一配方或组合均可用于实施本发明。在本说明书给出某个范围时，例如温度范围、时间范围或组成或浓度范围，其所有中间范围和子范围以及所给范围中包括的所有单个值都旨在被包含在本公开中。应当理解，本说明书中包括的范围或子范围内的任何子范围或单个值可以从本发明的权利要求中排除。说明书中所提及的所有专利和出版物表明了本发明所属领域的技术人员的技术水平。在此引用的参考文献的全部内容通过引用并入本文以表明其公开或提交日期的现有技术的状态，并且如有需要，可以在本文中采用该信息以排除现有技术中的特定实施方案。例如，当要求保护物质组成时，应当理解，在本申请人的发明之前本领域已知和可获得的化合物，包括在本文引用的参考文献中提供的充分公开的公开内容，并不旨在被包括在本文的物质组成中。如在本文中所使用的，“包括”与“包含”、“含有”或“表征”是同义词，并且是包含性的或开放性的，并且不排除另外的未列举的元素或方法步骤。如在本文中所使用的，“由...组成”排除权利要求元素中未指定的任何元素、步骤或成分。如在本文中所使用的，“基本上由...组成”不排除不实质上影响权利要求的基本和新颖特征的材料或步骤。在本文的每种情况下，术语“包括”、“基本上由......组成”和“由......组成”中的任何一个均可以用另外两个术语中的任何一个来代替。本文中示例性描述的本发明可以在不存在本发明未特别公开的任何一个或多个元素或一个或多个限制的情况下实施。本领域技术人员应当认识到，除了那些具体示出的以外，其他起始材料、生物材料、试剂、合成方法、净化方法、分析方法、测定方法和生物学方法也可以用于实施本发明，而无需借助于过多的实验。任何此类材料和方法的所有本领域已知的功能等同物都旨在被包括在本发明中。已经使用的术语和措辞为描述性术语而非限制性术语，并且不旨在使用这样的术语和措辞来排除所示出和描述的特征或其部分的任何等同物，但是应当认识到，在本发明要求保护的范围内可以进行各种修改。因此，应当理解，虽然本发明已经通过优选实施方案和可选特征具体公开，但是本领域技术人员可采用本文所公开的概念的修改和变化，并且这样的修改和变化被认为是在由所附权利要求限定的本发明的范围内。参考文献1.1.mark,h.f.encyclopediaofpolymerscienceandtechnology,concise.(wiley,2013).1.2.saunders,k.j.inorganicpolymerchemistry125–148(springernetherlands,1988).doi:10.1007/978-94-009-1195-6_61.3.burkoth,a.k.&anseth,k.s.areviewofphotocrosslinkedpolyanhydrides:::insituformingdegradablenetworks.biomaterials21,2395–2404(2000).1.4.metters,a.t.,bowman,c.n.&anseth,k.s.astatisticalkineticmodelforthebulkdegradationofpla-b-peg-b-plahydrogelnetworks.j.phys.chem.b104,7043–7049(2000).1.5.yu,q.,nauman,s.,santerre,j.p.&zhu,s.photopolymerizationbehaviorofdi(meth)acrylateoligomers.journalofmaterialsscience36,3599–3605(2001).1.6.sawhney,a.s.,pathak,c.p.&hubbell,j.a.bioerodiblehydrogelsbasedonphotopolymerizedpoly(ethyleneglycol)-co-poly(.alpha.-hydroxyacid)diacrylatemacromers.macromolecules26,581–587(1993).1.7.nguyen,k.t.&west,j.l.photopolymerizablehydrogelsfortissueengineeringapplications.biomaterials23,4307–4314(2002).1.8.mequanint,a.p.a.k.hydrogelbiomaterials.1–22(2011).1.9.billiet,t.,vandenhaute,m.,schelfhout,j.,vanvlierberghe,s.&dubruel,p.areviewoftrendsandlimitationsinhydrogel-rapidprototypingfortissueengineering.biomaterials1–22(2012).doi:10.1016/j.biomaterials.2012.04.0501.10.decker,c.&jenkins,a.kineticapproach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