一种纤维增韧的组织工程半月板复合支架及其制备方法与流程

本发明涉及生物医用材料与组织工程技术领域，具体为一种复合有纤维材料的组织工程半月板支架的制备方法。

背景技术：

半月板是位于膝关节股骨和胫骨之间的由纤维软骨组成的器官，内外各一，分别为内侧半月板和外侧半月板，是膝关节内的重要器官。其作用为营养关节软骨，润滑关节，增加关节接触面积，使关节内应力重新分布以保护关节软骨，增强关节的稳定性。不当运动或退行性病变引发的半月板损伤将使半月板丧失对关节软骨的保护作用，从而诱发骨关节炎。进行半月板部分或全部切除短期内可以缓解疼痛，但由于半月板不具备再生能力，因此该手术将加重骨关节炎并引发关节软骨退化。

组织工程的发展为半月板再生修复提供了新的治疗模式，其中组织工程支架作为细胞和生长因子等活性物质的载体，有着至关重要的作用。目前用于半月板组织工程支架制备的材料可以分为天然材料和人工合成材料两种。其中天然材料如胶原等具有很好的生物活性，降解产物无毒性，有利于细胞的生长和活性因子的负载。但其降解速率过快、力学强度较差。人工合成可降解高分子材料如聚己内酯(PCL)、聚乳酸(PLA)等制备的半月板支架具有较好的力学性能，易于生产加工，且价格低廉。但其也有不可避免的缺点，如细胞相容性较差、降解产物无法被及时代谢，造成局部微环境改变加重骨关节炎或关节退化。

单纯利用单一的方法(冷冻干燥、静电纺丝、3D打印等)和单一材料(天然材料或合成高分子材料)制备半月板支架难以同时具备良好力学性能和生物相容性。复合材料制备半月板支架，将不同结构和性质的材料加工组合，可以显著提高半月板的力学性能和生物活性。静电纺丝是一种利用电场作为驱动力，将黏流性溶液加工成微米或纳米尺度纤维丝的方法。用静电纺丝制备的纤维丝可以很好地模拟半月板细胞外基质中有序胶原束的结构，具有良好的力学性能。冷冻干燥可以制备多孔结构支架，支架孔隙联通，孔径可调，有利于细胞的长入和增殖。将静电纺丝制备的纤维丝和冷冻干燥制备的多控支架结合，可以得到既有良好力学强度，同时兼具多孔结构的半月板支架。得到的支架力学强度及孔隙率均可调可控，且支架在环向的弹性模量大于径向弹性模量，与天然半月板力学特点相似，为各向异性支架材料，可以满足部分半月板缺损及半月板全缺损的修复需求。

技术实现要素：

本发明的目的是解决患者膝关节半月板受损修复问题，提供一种纤维增韧的组织工程半月板复合支架的制备方法，为组织工程修复部分半月板缺损或半月板全缺损提供新方法。

本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：一种纤维增韧的组织工程半月板复合支架的制备方法，包括以下步骤：

1)用有机溶剂配制含3～5wt％胶原和3～5wt％可降解高分子材料的溶液，然后利用该溶液通过静电纺丝的方法制成纤维丝膜；

2)将胶原溶于水制成质量百分比浓度为5～50％的溶液；

3)将步骤1)制备的纤维丝膜和步骤2)配制的胶原水溶液通过层叠的方式进行交替叠加，然后进行冷冻干燥，得到冻干复合支架；

4)将冻干复合支架进行交联、灭菌，获得纤维增韧的组织工程半月板复合支架。

上述步骤1)中，所述可降解高分子材料可以选自下列材料中的一种或多种：聚己内酯(PCL)、聚乳酸(PLLA)、聚乳酸-羟基乙酸共聚物(PLGA)等。所述可降解高分子的重均分子量为50000-100000。

所述有机溶剂可以是下列溶剂中的一种或多种的混合溶剂：六氟异丙醇(HFPI)、四氢呋喃(THF)和氮氮二甲基甲酰胺(DMF)。优选为六氟异丙醇，或者是四氢呋喃和氮氮二甲基甲酰胺的混合溶剂。

步骤1)制备的纤维丝膜的厚度优选为100～200μm。静电纺丝的方法具体可以是：将所述溶液装入注射器中，注射器装在静电纺丝机上，在压差为10～18kV、推注速率为0.01～0.1mL/min的条件下制备纤维丝膜。

步骤2)配制的胶原水溶液的浓度优选为25～35％。

在步骤3)中，纤维丝膜和胶原泡沫层交替层叠，夹在两层纤维丝膜之间的胶原泡沫层的厚度通常在0.5～2.5mm左右。

步骤4)可以采用化学方法、辐照方法或干热方法进行交联，其中化学方法可以利用碳化二亚胺(EDAC)、戊二醛或京尼平等化学交联剂进行化学交联。

步骤4)中的灭菌方法可以是钴60辐照灭菌或环氧乙烷灭菌。

本发明方法制备的纤维增韧的组织工程半月板复合支架无固定的外形和尺寸大小，厚度通常在3～30mm，可根据实际用处需要进行定型制备或制备完成后进行裁剪。

将骨髓间充质干细胞接种至所述的纤维增韧的组织工程半月板复合支架上培养3-14天，即可用于部分半月板缺损及半月板全缺损的修复。

本发明还提供一种纤维增韧的组织工程半月板复合支架，其采用如上所述的纤维增韧的组织工程半月板复合支架制备方法制得。

通过本发明方法制备的纤维增韧的组织工程半月板复合支架的拉伸弹性模量为0.5～100MPa，压缩弹性模量为0.05～10MPa。一种典型的纤维增韧的组织工程半月板复合支架具有下述结构：半圆环形三维结构，具有五层结构，其中三层为所述胶原和可降解高分子材料混合材料制备的纤维丝膜，两层为胶原冷冻干燥后得到的多孔结构，参见图1。该纤维增韧的组织工程半月板复合支架的半环形外径为20～35mm，半环形内径为3～10mm，厚度3～30mm，如图2所示。

本发明提供的纤维增韧的组织工程半月板复合支架的制备方法，具有以下有益效果：本发明通过结合静电纺丝、冷冻干燥的方法，制备出具有合适可修剪外形、合适孔隙率、合适力学强度的纤维增韧的组织工程半月板支架，有效地提高了天然材料制备半月板支架的力学强度，更适用于作部分半月板缺损和完全半月板缺损的移植替代，并且其中的胶原等天然材料具有良好的生物相容性和细胞活性，其孔隙结构有利于提高接种细胞和植入后自体细胞的生存、增殖和向纤维软骨细胞分化的能力，从而最终形成形态、结构、力学性能和功能良好的新生半月板。

附图说明

图1为本发明制备的纤维增韧的组织工程半月板复合支架的结构示意图，其中：1为纤维丝膜，2为多孔胶原。

图2为本发明制备的一个纤维增韧的组织工程半月板复合支架的实物图。

图3为本发明制备的纤维增韧的组织工程半月板复合支架的纵截面电镜图，其中：1为纤维丝膜，2为多孔胶原；

图4为实施例5制备的纤维增韧的组织工程半月板复合支架的拉伸试验和压缩试验结果，其中a为拉伸测试时的应力-应变曲线，b为压缩测试时的应力-应变曲线。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。

实施例1

1、将重均分子量为80000的PCL溶于HFPI中，制成浓度为8％的溶液；将胶原溶于HFPI中，制成8％的溶液。

2、将PCL溶液和胶原溶液以1:1的比例(体积比)混合后吸取5mL至配有钝头针的注射器中；将注射器安装于静电纺丝机上，针头端接正极，接收器端接负极或接地，压差为15kV，用微量泵控制注射器以0.03mL/min的速率推注，接收器为转速可调的金属圆筒，接收器表面线速度为9m/min，在接收器端接收由胶原和可降解高分子材料混合材料制备的纤维丝膜。

3、配制浓度为10％的胶原水溶液。

4、将纤维丝膜与胶原水溶液通过图1所示的层叠方式进行叠加，而后放入冷冻干燥机中进行冷冻干燥，得到冻干复合支架。

5、将冻干复合支架浸入1mol/L的EDAC溶液中交联，得到纤维增韧的组织工程半月板复合支架。将其裁剪为半圆环形，圆环外径为30mm，内径为10mm，厚度为8mm。

6、用钴60辐照对纤维增韧的组织工程半月板复合支架进行灭菌处理。

实施例2

1、将重均分子量为80000的PCL溶于THF和DMF混合液中；制成浓度为8％的溶液。将胶原溶于THF和DMF混合液中，制成8％的溶液。

2、将PCL溶液和胶原溶液以1:1的比例(体积比)混合后吸取5mL至配有钝头针的注射器中。将注射器安装于静电纺丝机上，针头端接正极，接收器端接负极或接地，压差为13kV，用微量泵控制注射器以0.025mL/min的速率推注，接收器为转速可调的金属圆筒，接收器表面线速度为9m/min，在接收器端接收由胶原和可降解高分子材料混合材料制备的纤维丝膜。

3、配制浓度为10％的胶原水溶液。

4、将纤维丝膜与胶原水溶液通过图1所示的层叠方式进行叠加，而后放入冷冻干燥机中进行冷冻干燥，得到冻干复合支架。

5、将冻干复合支架浸入0.1mol/L的京尼平溶液中交联，得到纤维增韧的组织工程半月板复合支架。将其裁剪为半圆环形，圆环外径为35mm，内径为12mm，厚度10mm。

6、用钴60辐照对纤维增韧的组织工程半月板复合支架进行灭菌处理。

实施例3

1、将重均分子量为80000的PLLA溶于HFPI中，制成浓度为8％的溶液；将胶原溶于HFPI中，制成8％的溶液。

2、将PCL溶液和胶原溶液以1:1的比例(体积比)混合后吸取5mL至配有钝头针的注射器中。将注射器安装于静电纺丝机上，针头端接正极，接收器端接负极或接地，压差为15kV，用微量泵控制注射器以0.03mL/min的速率推注，接收器为转速可调的金属圆筒，接收器表面线速度为9m/min，在接收器端接收由胶原和可降解高分子材料混合材料制备的纤维丝膜。

3、配制浓度为10％的胶原水溶液。

4、将纤维丝膜与胶原水溶液通过图1所示的层叠方式进行叠加，而后放入冷冻干燥机中进行冷冻干燥，得到冻干复合支架。

5、将冻干复合支架浸入0.25％的戊二醛水溶液中交联，得到纤维增韧的组织工程半月板复合支架。将其裁剪为半圆环形，圆环外径为20mm，内径为50mm，厚度为5mm。

6、用钴60辐照对纤维增韧的组织工程半月板复合支架进行灭菌处理。

实施例4

1、将重均分子量为80000的PCL和PLGA混合(质量比1:1)溶于HFPI中，制成浓度为8％的溶液；将胶原溶于HFPI中，制成8％的溶液。

2、将PCL溶液和胶原溶液以1:1的比例(体积比)混合后吸取5mL至配有钝头针的注射器中。将注射器安装于静电纺丝机上，针头端接正极，接收器端接负极或接地，压差为14kV，用微量泵控制注射器以0.03mL/min的速率推注，接收器为转速可调的金属圆筒，接收器表面线速度为9m/min，在接收器端接收由胶原和可降解高分子材料混合材料制备的纤维丝膜。

3、配制浓度为10％的胶原水溶液。

4、将纤维丝膜与胶原水溶液通过图1所示的层叠方式进行叠加，而后放入冷冻干燥机中进行冷冻干燥，得到冻干复合支架。

5、将冻干复合支架浸入1mol/L的EDAC溶液中交联，得到纤维增韧的组织工程半月板复合支架。将其裁剪为半圆环形，圆环外径为30mm，内径为10mm，厚度为8mm。

6、用钴60辐照对纤维增韧的组织工程半月板复合支架进行灭菌处理。

实施例5

1、将重均分子量为60000的PCL溶于HFPI中，制成浓度为10％的溶液；将胶原溶于HFPI中，制成8％的溶液。

2、将PCL溶液和胶原溶液以2:3的比例(体积比)混合后吸取7.5mL至配有钝头针的注射器中。将注射器安装于静电纺丝机上，针头端接正极，接收器端接负极或接地，压差为15kV，用微量泵控制注射器以0.03mL/min的速率推注，接收器为转速可调的金属圆筒，接收器表面线速度为900m/min，在接收器端接收由胶原和可降解高分子材料混合材料制备的纤维丝膜。

3、配制浓度为30％的胶原水溶液。

4、将纤维丝膜与胶原水溶液通过图1所示的层叠方式进行叠加，而后放入冷冻干燥机中进行冷冻干燥，得到冻干复合支架。

5、将冻干复合支架浸入1mol/L的EDAC平溶液中交联，得到纤维增韧的组织工程半月板复合支架。将其裁剪为半圆环形，圆环外径为30mm，内径为10mm，厚度为7mm。

6、用环氧乙烷对纤维增韧的组织工程半月板复合支架进行灭菌处理。

本发明对上述实施例1-5的纤维增韧的组织工程半月板复合支架进行了力学性能分析，实验结果表明实施例1-5均能得到具有多孔结构的、力学强度适用于半月板移植的组织工程支架，尤其实施例5的纤维增韧的组织工程半月板复合支架的力学性能最佳。

将骨髓间充质干细胞接种到纤维增韧的组织工程半月板复合支架上复合培养7天，并且在手术时根据半月板缺损部位的形状及大小裁剪，进行缝合即可实现部分半月板缺损和完全半月板缺损的移植替代。

下面将详细介绍实施例5的纤维增韧的组织工程半月板复合支架的相关测试结果。

(1)拉伸试验：将实施例5制备得到的纤维增韧的组织工程半月板复合支架用生理盐水浸泡3h后，裁剪为宽10mm，有效长度15mm，厚度7mm的长方形试样，用力学试验机夹具夹住固定，以5mm/min的拉伸速率对样品进行拉伸直至样品断裂，根据得到的拉伸应力和拉伸应变绘制曲线，如图4中a所示，从应力-应变曲线中取线弹性段计算拉伸弹性模量，为11.47MPa。

(2)压缩试验：将实施例5制备得到的纤维增韧的组织工程半月板复合支架用生理盐水浸泡3h后，裁剪为边长10mm，厚度7mm的正方形试样，置于力学试验机两压盘之间，以5mm/min的压缩速率对样品进行压缩至30％应变，根据得到的压缩应力和压缩应变绘制曲线，如图4中b所示，从应力-应变曲线中取线弹性段计算压缩弹性模量，为0.17MPa。

(3)动物缺损修复试验：将兔麻醉后打开膝关节，切除半月板，将实施例5制备得到的纤维增韧的组织工程半月板复合支架用缝合于缺损半月板处，而后依次缝合肌肉、筋膜、皮肤，关上膝关节。术后一个月处死动物，打开膝关节，植入出无感染、溃烂情况发生。半月板支架部分降解，仍有残余。已降解的半月板支架处形成类半月板组织，对关节软骨起到了有效的保护作用。

应该理解的是，上述实施例并非是对本发明的限制，本领域的技术人员应该明白在不脱离本发明的范畴下，可进行各种变化和等同替换。此外，为适应本发明技术的特定场合或材料，可对本发明进行诸多修改而不脱离其保护范围。因此，本发明并不限于在此公开的特定实施例，而包括所有落入到权利要求保护范围之内的实施行为。