本发明涉及了一种基于胶原及胶原纤维的复合支架材料，属于生物医用材料制备领域。
背景技术：
组织工程支架是组织工程化组织的最基本构架，为细胞和组织生长提供适宜的环境，并随着组织的构建而逐渐降解和消失，从而将新的空间提供给组织和细胞。该结构是细胞获取营养、气体交换、废物排泄和生长代谢的场所，是形成新的具有一定形态和功能的组织、器官的基础。数十年来，人们一直通过一个“两步法”制造活性组织。第一步是使用某种生物可降解材料设计组织的支架。为了使用传统方法制造设计的支架，研究人员需要为它建模、雕刻出来，或使用化学品蚀刻出一个多孔的形状。第二步是利用活细胞培育出一个支架。大量研究证明，这些技术存在许多弊端，比如大量使用高毒性的有机溶剂，制造周期长，劳动密集型流程，无法完全除去聚合物基体中的残留物，可重复性差，孔隙呈现不规则形状，孔隙间无法充分连接，结构偏薄等等。此外，这些方法多数无法控制形状。
与这种方法相比，3D打印可精确地打印出所需组织的形状和结构。3D打印的骨植入物、牙冠、隐形眼镜与助听器等无生命修复形式已经存在于世界各地成千上万人的体内。目前，3D打印身体部位采用单一的材料，如金属、陶瓷或塑料。它们具有商业意义，因为它们的市场价值来自它们能够与一个形状特殊的身体紧密贴合。然而，这些材料也仅仅能成为无生命的替换部位，真正的3D生物打印应为创造活性组织。生物打印，即“活墨”的使用，内部悬浮着活细胞的可打印凝胶。将活细胞与“间隙填充物”（如胶原，以暂时填充空间直到与其他细胞融合）打印出人体组织许多特殊且精密的形状，活细胞分泌出物质进入水凝胶，从而最终形成一个支撑母体。随着细胞的生长，母体发展为活性组织。
胶原及胶原纤维，具有良好的生物相容性和生物可降解性，以及促进细胞生长与粘附的性能，且具有pH和温度敏感性，利于成型，已被应用于3D打印活性组织领域。然而，纯胶原或胶原纤维的3D打印活性组织在力学性能上还不足以支撑起一定形状的组织，因此添加其它生物材料或是微量的交联剂成为3D打印过程中必要的元素。
因此本专利所获得的一种基于胶原及胶原纤维的复合支架材料的方法在3D打印活性组织领域具有广阔的应用前景。
技术实现要素：
本发明的目的是针对现有相关技术的不足而提供了一种基于胶原及胶原纤维的复合支架材料。该支架材料细胞相容性优异，非常有利于细胞的生长、增殖及迁移，细胞能够较好地长入支架内部，又具有一定的抗炎、抗氧化、抗菌等功效，生物活性好，可用作组织工程支架。
本发明的目的可以由以下制备技术来实现，其制备方法步骤如下：
（1）基于氧化多糖和氧化石墨烯的胶原-胶原纤维复合溶胀液的制备：将按质量比为1～9∶9～1的1～2重量份的胶原及胶原纤维混合，4～10℃下搅拌将其溶胀于pH为4.0的醋酸-醋酸钠缓冲体系中，得到浓度为1～2wt%的胶原-胶原纤维复合溶胀液；接着向上述复合溶胀液中加入0.05～0.4重量份的氧化多糖，4～10℃下避光反应10～24h，待反应完成后，再向复合溶胀液加入0.01～0.2重量份的氧化石墨烯，4～10℃下继续反应24～48h，得到基于氧化多糖和氧化石墨烯的胶原-胶原纤维复合溶胀液；
（2）基于胶原及胶原纤维的复合支架材料的原液的制备：将0.5～1.5重量份的壳聚糖加入到上述胶原-胶原纤维复合溶胀液，4～10℃下搅拌至全部溶解，得到混合液A；在40～80℃下将6～12重量份的聚乙烯醇溶解在去离子水中，得到浓度为6～12wt%的聚乙烯醇水溶液；将按体积比为1～10∶0.01～2的混合A液与聚乙烯醇水溶液混合，4～10℃下搅拌至充分共溶，得到基于胶原及胶原纤维的复合支架材料的原液；
（3）基于胶原及胶原纤维的复合支架材料的制备：根据所需支架形态、结构采用计算机辅助设计软件编制出控制平台移动的程序，将上述基于胶原及胶原纤维的复合支架材料的原液注入3D生物打印机，3D打印成型得到胶原-胶原纤维复合支架，并将复合支架转移至微波干燥机上成膜；随后接着将1～2重量份胶原溶液在0.05～0.5M的醋酸溶液中，配制成浓度为1～2wt%的胶原溶液胶原，使用静电喷涂机将上述胶原溶液喷涂在胶原-胶原纤维复合支架正反两面，最终经冷冻干燥、剂量为 6～30KGy/h60Co所产生的γ射线消毒灭菌，成型包装，得到基于胶原及胶原纤维的复合支架材料的最终成品。
在上述的制备方法中，步骤（1）中使用氧化多糖为将羧甲基纤维素、透明质酸、壳聚糖、葡聚糖等经高碘酸钠氧化所得，具体制备方法参照本课题组前期公开专利[但卫华，刘新华，但年华，等. 具有抗菌/抑菌功效的胶原集合体复合型医用纤维. 中国发明专利. 201510127304.9；但年华，但卫华，刘新华，等. 氧化壳寡糖及其制备方法. 专利授权号：CN 104004112 A；但卫华，刘新华，但年华，等. 氧化壳聚糖接枝改性猪真皮胶原微纳纤维膜及其制备方法.专利授权号：CN 104013995 A]；步骤（1）中所述的氧化石墨烯、聚乙烯醇、壳聚糖均为医用级；步骤（1）中胶原及胶原纤维的复合支架材料的3D打印程序需根据具体支架用途、形态、精细结构而定。
本发明有以下优点：
（1）与已有大多报道的胶原类支架材料不同，本发明采用了胶原与胶原纤维，其中胶原纤维为胶原的聚集体，其结构更为复杂，更能仿生活性组织体内胶原的存在结构形态，研究表明其理化性能、生物活性、组织诱导再生修复能力均显著较强；
（2）本发明采用氧化多糖与氧化石墨烯为胶原的改性剂，一方面氧化多糖能与胶原发生席夫碱键结合达到有效交联的效果，且多糖经氧化后仍能保持其本体的功能性，非常有利于功能化胶原的制备；另一方面是氧化石墨烯能够在不影响胶原生物活性的同时，可显著增强胶原的理化性能，且能赋予胶原一定的抗菌/抑菌性；
（3）采用3D打印技术能够对支架的形态、微观结构等进行仿生生物设计，通过调控支架的微观结构、形貌以实现对细胞的长入、生长的控制。
具体实施方式
下面通过实施对本发明进行具体的描述，有必要在此指出的是本实施例只用于对本发明做进一步说明，而不能理解为对本发明保护范围的限制，该领域的技术熟练人员可以根据上述发明的内容作出非本质的改进和调整。
实施例1
（1）基于氧化多糖和氧化石墨烯的胶原-胶原纤维复合溶胀液的制备：将按质量比为1∶9的1重量份的胶原及胶原纤维混合，4℃下搅拌将其溶胀于pH为4.0的醋酸-醋酸钠缓冲体系中，得到浓度为1wt%的胶原-胶原纤维复合溶胀液；接着向上述复合溶胀液中加入0.05重量份的氧化多糖，4℃下避光反应24h，待反应完成后，再向复合溶胀液中加入0.2重量份的氧化石墨烯，4℃下继续反应48h，得到基于氧化多糖和氧化石墨烯的胶原-胶原纤维复合溶胀液；
（2）基于胶原及胶原纤维的复合支架材料原液的制备：将0.5重量份的壳聚糖加入到上述胶原-胶原纤维复合溶胀液中，4℃下搅拌至全部溶解，得到混合液A；在40℃下将6重量份的聚乙烯醇溶解在去离子水中，得到浓度为6wt%的聚乙烯醇水溶液；将按体积比为1∶2的混合A液与聚乙烯醇水溶液混合，4℃下搅拌至充分共溶，得到基于胶原及胶原纤维的复合支架材料的原液；
（3）基于胶原及胶原纤维的复合支架材料的制备：根据所需支架形态、结构采用计算机辅助设计软件编制出控制平台移动的程序，将上述基于胶原及胶原纤维的复合支架材料的原液注入3D生物打印机，3D打印成型得到胶原-胶原纤维复合支架，并将复合支架转移至在微波干燥机上成膜；随后接着将1重量份胶原溶液在0.05M的醋酸溶液中，配制成浓度为1wt%的胶原溶液胶原，使用静电喷涂机将上述胶原溶液喷涂在胶原-胶原纤维复合支架正反两面，最终经冷冻干燥、剂量为 6KGy/h60Co所产生的γ射线消毒灭菌，成型包装，得到基于胶原及胶原纤维的复合支架材料的最终成品。
实施例2
（1）基于氧化多糖和氧化石墨烯的胶原-胶原纤维复合溶胀液的制备：将按质量比为3∶7的1.5重量份的胶原及胶原纤维混合，5℃下搅拌将其溶胀于pH为4.0的醋酸-醋酸钠缓冲体系中，得到浓度为1.5wt%的胶原-胶原纤维复合溶胀液；接着向上述复合溶胀液中加入0.2重量份的氧化多糖，5℃下避光反应15h，待反应完成后，再向复合溶胀液加入0.1重量份的氧化石墨烯，5℃下继续反应24～48h，得到基于氧化多糖和氧化石墨烯的胶原-胶原纤维复合溶胀液；
（2）基于胶原及胶原纤维的复合支架材料的原液的制备：将1重量份的壳聚糖加入到上述胶原-胶原纤维复合溶胀液，5℃下搅拌至全部溶解，得到混合液A；在60℃下将8重量份的聚乙烯醇溶解在去离子水中，得到浓度为8wt%的聚乙烯醇水溶液；将按体积比为5∶1的混合A液与聚乙烯醇水溶液混合，5℃下搅拌至充分共溶，得到基于胶原及胶原纤维的复合支架材料的原液；
（3）基于胶原及胶原纤维的复合支架材料的制备：根据所需支架形态、结构采用计算机辅助设计软件编制出控制平台移动的程序，将上述基于胶原及胶原纤维的复合支架材料的原液注入3D生物打印机，3D打印成型得到胶原-胶原纤维复合支架，并将复合支架转移至在微波干燥机上成膜；随后接着将1.5重量份胶原溶液在0.1M的醋酸溶液中，配制成浓度为1.5wt%的胶原溶液胶原，使用静电喷涂机将上述胶原溶液喷涂在胶原-胶原纤维复合支架正反两面，最终经冷冻干燥、剂量为 15KGy/h60Co所产生的γ射线消毒灭菌，成型包装，得到基于胶原及胶原纤维的复合支架材料的最终成品。
实施例3
（1）基于氧化多糖和氧化石墨烯的胶原-胶原纤维复合溶胀液的制备：将按质量比为9∶1的2重量份的胶原及胶原纤维混合， 10℃下搅拌将其溶胀于pH为4.0的醋酸-醋酸钠缓冲体系中，得到浓度为2wt%的胶原-胶原纤维复合溶胀液；接着向上述复合溶胀液中加入0.4重量份的氧化多糖， 10℃下避光反应10h，待反应完成后，再向复合溶胀液加入0.01重量份的氧化石墨烯，4～10℃下继续反应24h，得到基于氧化多糖和氧化石墨烯的胶原-胶原纤维复合溶胀液；
（2）基于胶原及胶原纤维的复合支架材料的原液的制备：将1.5重量份的壳聚糖加入到上述胶原-胶原纤维复合溶胀液， 10℃下搅拌至全部溶解，得到混合液A；在80℃下将6～12重量份的聚乙烯醇溶解在去离子水中，得到浓度为12wt%的聚乙烯醇水溶液；将按体积比为10∶0.01的混合A液与聚乙烯醇水溶液混合，10℃下搅拌至充分共溶，得到基于胶原及胶原纤维的复合支架材料的原液；
（3）基于胶原及胶原纤维的复合支架材料的制备：根据所需支架形态、结构采用计算机辅助设计软件编制出控制平台移动的程序，将上述基于胶原及胶原纤维的复合支架材料的原液注入3D生物打印机，3D打印成型得到胶原-胶原纤维复合支架，并将复合支架转移至在微波干燥机上成膜；随后接着将2重量份胶原溶液在0.5M的醋酸溶液中，配制成浓度为2wt%的胶原溶液胶原，使用静电喷涂机将上述胶原溶液喷涂在胶原-胶原纤维复合支架正反两面，最终经冷冻干燥、剂量为 30KGy/h60Co所产生的γ射线消毒灭菌，成型包装，得到基于胶原及胶原纤维的复合支架材料的最终成品。