本发明涉及一种黄酮类化合物，特别是涉及一种从海芦笋中总黄酮的提取制备方法。
背景技术：
海芦笋是藜科盐角草属的、无叶、茎枝肉质化的盐生植物，在我国沿海地区有广泛分布。作为碱性作物，海芦笋可利用天然海水灌溉且不易患病生虫，是具有较好发展前景的一种新型、绿色、无公害的海水蔬菜。海芦笋不仅含有普通蔬菜所含的氨基酸、维生素、膳食纤维等各类营养成分，而且具有多种生物活性成分。因此，海芦笋除了可作为蔬菜还具有较高的保健价值以及药用价值。其中，黄酮类化合物作为重要的植物次生代谢产物，是海芦笋中含有的一类重要抗氧化活性物质。已有的研究表明，黄酮类物质具有抗氧化、抗疲劳、抗衰老、保护肝脏等多种多样的生物活性，临床应用广泛，是有效的抗氧化剂、金属螯合剂、自由基清除剂等。因此，海芦笋中的黄酮类化合物在食品添加剂、保健食品、化妆品等多个领域具有良好前景。
目前关于从海芦笋中制备黄酮类化合物的方法分为两个方面，一是粗黄酮的提取方法，主要包括乙醇浸提法以及微波辅助浸提法，通过这两种方法得到的黄酮粗品，纯度较低，无法满足黄酮在各方面应用的要求；二是粗黄酮的分离纯化方法，包括硅胶柱层析、凝胶柱层析、液液萃取等，这些方法适用于实验室但都不便应用于工业化生产的，传统上黄酮工业纯化方法一般选用大孔吸附树脂纯化法，大孔树脂对黄酮类化合物的吸附主要是物理吸附，根据其表面的空穴结构及极性不同吸附目标产物，而聚酰胺树脂作为由酰胺聚合而成的一类高分子物质，其黄酮类化合物的吸附机理为“氢键吸附”其选择性与强度要强于物理吸附，是一种黄酮的理想吸附剂，其分子中既含有酰胺基，又含有非极性的脂肪链，因而具有良好的亲水性与亲脂性。黄酮类化合物所含有的酚羟基可以与聚酰胺中的酰胺基作用形成氢键，因此对黄酮具有较强的吸附性能，而且聚酰胺树脂可再生后多次使用，但目前对此方法应用于海芦笋黄酮纯化的研究鲜有报道。
因此本发明以聚酰胺树脂与大孔树脂对海芦笋黄酮进行联合纯化，根据吸附性能的不同对海芦笋黄酮进行选择性吸附后，再根据洗脱剂浓度的区别控制洗脱剂极性，从而控制所得产物，以此得到具有较高纯度、适用于多种要求的海芦笋总黄酮。
技术实现要素：
本发明的目的是提供一种从海芦笋中总黄酮的制备方法，实现低成本大量制备具有较高纯度的海芦笋总黄酮，从而弥补现有技术的空白与不足。
为达到上述目的，本发明采取的具体技术方案为：
一种海芦笋中总黄酮的制备方法，包括以下步骤：
1)首先清洗海芦笋，烘干、粉碎并过筛，然后加入乙醇溶液中进行搅拌浸提；浸提结束后，将浸提液离心取上清液；并将残渣再次加入乙醇溶液浸提，浸提后离心取上清；
2)将步骤1)中得到的上清液合并后进行减压蒸发，除尽乙醇得到海芦笋总黄酮的粗品溶液；
3)聚酰胺树脂的活化预处理；
4)预处理过的聚酰胺树脂按1:5～1:8的径高比湿法装柱后，将步骤2)制备的粗黄酮溶液过聚酰胺树脂柱进行吸附，上样结束后，静置，使黄酮与聚酰胺树脂充分接触后，先用3～5个柱体积的蒸馏水对聚酰胺树脂柱进行洗脱，除去残留在柱上的多糖等水溶性杂质后，再通过乙醇溶液进行洗脱；
5)将洗脱液浓缩后，再按步骤4)进行吸附洗脱，最后将洗脱液浓缩、离心取上清后，水洗沉淀超声波促溶再次离心取上清合并、低温干燥后得到纯度较高的海芦笋总黄酮。
进一步的，上述制备方法还包括第6)步，将D101型与HPD600型大孔树脂按照0:1～2:3的比例混合均匀后湿法装柱，将上述步骤5)得到的海芦笋总黄酮配制成一定浓度、调节pH为4～7后上样吸附，水洗杂质后，以乙醇溶液洗脱得到海芦笋总黄酮。
进一步的，上述步骤1)中海芦笋粉末于20～80℃，用料液比为1：30～1：70的乙醇溶液搅拌浸提，乙醇溶液的体积分数为60％。
优选的，上述步骤1)中乙醇溶液浸提温度为35℃。
进一步的，上述步骤3)预处理具体为：将40～100目的聚酰胺树脂浸泡在95％的乙醇溶液中，搅拌除去气泡后湿法装柱，以3～5个柱体积的95％乙醇溶液淋洗后，用蒸馏水洗至流出液没有醇味，再依次用2～3个柱体积的5％的NaOH溶液，2～3个柱体积的蒸馏水，2～3个柱体积的10％醋酸溶液淋洗，最后用蒸馏水淋洗至中性。
进一步的，上述步骤4)中将粗黄酮溶液通过聚酰胺树脂柱进行吸附时，将粗黄酮溶液调节至pH＝3。
以往对聚酰胺树脂的研究中，多采用粗黄酮原液与聚酰胺树脂混合后吸附，但本发明研究结果表明当海芦笋黄酮上样液pH为3时与聚酰胺树脂柱结合效果最佳。原理分析：聚酰胺树脂主要通过自身的酰胺键与黄酮的酚羟基结合形成氢键从而完成吸附过程，pH＝3时，溶液呈酸性，此时黄酮类化合物在溶液中以分子状态存在，更易与聚酰胺形成氢键，从而有利于吸附。
上述步骤4)中采用90％的乙醇溶液进行洗脱。
本发明的有益效果：本发明制备步骤简单，所使用的聚酰胺树脂和大孔树脂，价格低廉，可再生多次重复使用。经本发明研究，当海芦笋粗黄酮溶液pH＝3时，在聚酰胺树脂柱上的吸附效果最佳，吸附效率高达86％；在解吸过程，以90％的乙醇溶液作为黄酮洗脱剂时，洗脱率最高，达到77％。利用本发明制备得到海芦笋黄酮纯度达到80％以上，得率较高，原料和提取材料易得价廉，产品呈淡黄色，质量好，易溶于水，能够满足在功能性食品、食品添加剂、化妆品等领域的推广应用，为海芦笋的开发利用提供了新思路。
具体实施方式
以下通过具体实施例对本发明进一步解释和说明。
实施例1：海芦笋总黄酮粗品提取
取10g的粉碎海芦笋，用200ml～700ml的、体积分数分别为40％、50％、60％、70％、80％、90％的乙醇溶液在30～50℃分别恒温水浴振荡提取2.5个小时，离心，残渣用料液比1：10～1：40的乙醇溶液浸提，离心后合并上清液，上清液经过低温减压浓缩，得到的海芦笋总黄酮粗品溶液。
以海芦笋黄酮的提取率为考察指标，分析可得，当乙醇溶液的体积分数为60％时，提取效果最佳，提取率为6.7％，小于60％或者大于60％都会使海芦笋总黄酮的提取率降低。
实施例2：海芦笋总黄酮粗品提取
取10g海芦笋粉末，用200ml～700ml的、体积分数分别为60％、的乙醇溶液在25℃、35℃、45℃、55℃、65℃、75℃下分别恒温水浴振荡提取2.5个小时，离心，残渣用料液比1：10～1：40的60％乙醇溶液浸提，离心后合并上清液，上清液经过低温减压浓缩，得到的海芦笋总黄酮粗品溶液。
以海芦笋黄酮的提取率为考察指标，温度对提取率结果的影响，由结果可知，浸提温度为35℃时，提取率显著优于其他温度，继续升高温度其他杂质的溶出会相继增多，与黄酮争夺溶剂，且温度升高会造成溶剂浓度的改变从而造成海芦笋总黄酮的提取率降低。
实施例3：通过聚酰胺树脂对海芦笋黄酮进行吸附
室温下，将预处理过的聚酰胺树脂以蒸馏水为装柱液湿法上柱，取50～100mL的粗黄酮溶液，利用盐酸溶液调节其分别为pH＝3、pH＝4、pH＝5、pH＝6、pH＝7，以流速为30～150mL/h进行吸附。
通过对海芦笋总黄酮在聚酰胺树脂上的吸附率的分析表明，当粗黄酮溶液pH＝3时，聚酰胺树脂的吸附效果最佳，pH>3时，黄酮的吸附效果随着pH升高，吸附率降低，损失增加。
实施例4：对聚酰胺树脂吸附的黄酮进行洗脱
取50～100mL的、pH调为3的粗黄酮溶液，在室温通过上聚酰胺树脂柱吸附后，以3～5倍柱体积的蒸馏水洗去残留的多糖类水溶性杂质后，分别用体积为5～10倍柱体积的、体积分数为40％、50％、60％、70％、80％、90％的乙醇溶液洗脱，流速30～180mL/h。洗脱液旋转蒸发后，低温干燥得到海芦笋总黄酮。
通过对海芦笋总黄酮的洗脱率的分析表明，当洗脱剂浓度为90％时，洗脱效果最好，洗脱率达77％，黄酮回收率为67％，随着乙醇溶液浓度的降低，黄酮的洗脱率降低，而黄酮回收率也随之降低。
实施例5：对海芦笋粗黄酮进行聚酰胺-聚酰胺-混合大孔树脂三次联合纯化
取50～100mL的、经盐酸溶液调pH为3的粗黄酮溶液，以30～150mL/h的流速通过聚酰胺树脂柱吸附后，以3～5倍柱体积的蒸馏水洗去残留的多糖类水溶性杂质后，再用5～10倍柱体积的、体积分数为90％的乙醇溶液洗脱，流速30～180mL/h。洗脱液旋转蒸发浓缩后，6000rm/min离心，将沉淀加适量水超声波促溶混匀，再次离心后，合并上清液；将所得黄酮溶液调节浓度与pH后，按照上述步骤再次过聚酰胺树脂柱纯化，经90％洗脱得到的洗脱液经旋转蒸发浓缩后离心，离心所得沉淀加水混匀后再次离心后、合并上清液；所得黄酮溶液调节至一定浓度后，用盐酸溶液调节pH为5～7，以30～120mL/h的流速过混合大孔树脂柱纯化，以3～5倍柱体积的蒸馏水洗去杂质后，以6～12倍柱体积的乙醇溶液洗脱得到洗脱液并旋转蒸发浓缩后，低温干燥得到具有较高纯度的海芦笋总黄酮。
采用NaNO2-Al(NO3)3-NaOH比色法，以芦丁为标准品对制备的海芦笋总黄酮进行测定，测出经三次联合纯化的海芦笋总黄酮纯度达80％以上。
本发明的提取方法及确定的最佳纯化工艺条件，可以低成本的大量制备海芦笋总黄酮，所制备的海芦笋总黄酮可在功能性食品、食品添加剂、化妆品等多方面应用。