一种水杨酸类化合物在制备神经退行性疾病药物中的用途的制作方法

本发明属于医药技术领域，具体涉及一种水杨酸类化合物在制备神经退行性疾病药物中的用途，尤其是在制备阿尔茨海默症药物中的用途。

背景技术：

阿尔茨海默氏症(Alzheimer’s disease,AD,老年痴呆症)是一种以进行性认知障碍和记忆力损害为主的中枢神经系统退行性疾病，随着全球人口的急速老龄化，老年人群的健康问题已经成为当前迫切需要解决的社会重大问题。阿尔茨海默症(Alzheimer’s disease,AD)是老年人中发病率和致死率最高的疾病之一。阿尔茨海默症国际协会(Alzheimer’s disease International,ADI)发布的《2015全球阿尔茨海默症报告》指出，2015年全球已有超过4600万人患上痴呆症，据预测，到2050年，全球将有1.315亿人口受到痴呆的困扰，其中中国痴呆症患者的发病率已达到6.61％。随着人均生存年龄的延长，本病已发展为社会和医疗保健系统的主要负担，并且为社会、患者及家属带来了沉重的精神和经济压力。目前已批准用于治疗轻/中度AD的药物有乙酰胆碱酯酶(AChE)抑制剂，以及用于重度AD治疗的N-甲基-D-天冬氨酸(NMDA)受体拮抗剂，但临床使用表明，这些药物可通过提高患者体内乙酰胆碱水平或者抑制兴奋性氨基酸的兴奋毒性来缓解AD症状，但不能有效阻止或逆转病程，而且还会引起幻觉、意识混沌、头晕、头痛、恶心、肝脏毒性、食欲不振以及大便频繁等严重毒副作用，因而长期疗效不甚理想。因此，临床上迫切需要研发具有新型作用机制的AD治疗药物。

近年来，随着对AD致病机理的不断阐明，发现AD的发生和发展具有多机制、多因素作用的特点，不同机制之间又相互关联相互影响，构成了AD发生和发展过程中复杂的网络调控系统。基于上述结果，针对单一确切靶点的药物产生的临床疗效并不适合与AD的复杂本质，研究人员提出“多靶点导向药物”(Multitarget-directed Ligands，MTDLs)策略被认为是研发抗神经退行性疾病药物的一种有效方法。该“多靶点导向药物”是指单一化学实体同时作用于疾病网络中的多个靶点，对各靶点的作用可产生协同效应，使总效应大于各单效应之和，此类药也称为“Multifunctional”或“Multipotential”药物。到目前为止，尽管多靶点的优势是清晰的，但多个靶点功能如何在同一个分子中组合，及最合适治疗靶点的选择仍然是一个关键点。

随着AD的进程的发展，乙酰胆碱酯酶(AChE)水平逐渐减低，而丁酰胆碱酯酶(BuChE)活性增加到了正常值的165％。在AD的中重度阶段，BuChE取代AChE来水解乙酰胆碱(ACh)，BuChE的抑制可能在AD治疗中是更有效的。另外，氧化应激存在于AD患者脑内，严重影响了生物大分子如蛋白质、核酸和脂质，也是导致AD的主要原因；金属离子同样在体内起着重要的生理作用，体内过度的生物金属离子也会诱发氧化应激，进一步加剧AD的症状。因此，发现具有抑制丁酰胆碱酯酶、抗氧化和金属离子络合的神经保护剂可能为AD，尤其是中重度AD带来曙光。

中国专利CN102786414B公开了一类水杨酸类化合物及其药学上可接受的盐的药物组合物。本发明的化合物可加入药剂学允许的赋形剂制成药学上可接受的各种药物制剂。本发明所公开的化合物经研究证实，对过氧化氢诱导的体外培养神经细胞损伤具有保护作用，可剂量依赖性改善老年痴呆及血管性痴呆的学习记忆能力及神经病理学改变，能有效用于治疗和/或预防神经退行性相关疾病。中国专利CN104151242B公开了一个二氢异喹啉类化合物及其治疗情绪相关的精神类疾病，尤其是抑郁症的用途。本发明的二氢异喹啉类化合物在体外实验中对皮质酮诱导损伤的PC12细胞具有较好的保护活性，暗示该化合物具有保护神经细胞的功能，进一步实验证明该化合物可以有效上调神经细胞胞内BNDF的水平，同时可以有效的增强神经细胞的抗氧化能力，并促进其生长，该药物对神经细胞的这种修复和保护作用使其具有治疗精神类疾病的潜力，优选于治疗情感及认知障碍的精神类疾病，如抑郁症、老年痴呆症、焦虑症、强迫症、精神分裂症等，最优于抑郁症的治疗。在体内实验中，包括强迫游泳和旷场实验中，该化合物均表现出较明显的改善实验动物抑郁状态的作用。但是，上述专利主要针对氧化应激引起的神经细胞损伤来进行研究，氧化应激是AD发展过程中的一个中间环节，可能有过度金属离子紊乱或β-淀粉样蛋白沉积等因素引起，AD患者脑内发现过度的金属离子，金属离子紊乱也是导致AD的一个因素，而研究表明AD患者脑内乙酰胆碱水平的缺失才是AD患者记忆力减退的主要原因，这是由于水解乙酰胆碱的酶主要包括乙酰胆碱酯酶和丁酰胆碱酯酶，随着AD的进程的发展，乙酰胆碱酯酶(AChE)水平逐渐减低，而丁酰胆碱酯酶(BuChE)活性增加到了正常值的165％，而上述专利对丁酰胆碱没有抑制活性。

技术实现要素：

为克服上述缺陷，本发明的目的在于提供一种水杨酸类化合物在制备神经退行性疾病药物中的用途。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种水杨酸类化合物在制备治疗神经退行性疾病药物中的用途，所述的水杨酸类化合物的化学结构式如(Ⅰ)所示：

优选地，所述的神经性退行性疾病为阿尔茨海默症。

优选地，所述水杨酸类化合物由水杨酸和1,2,3,4-四氢异喹啉制备而成。

其化学反应通式为：

一种上述的水杨酸类化合物的衍生物，所述的衍生物为水杨酸类化合物中的羟基被氨基甲酸酯所取代，如下:

衍生物自身具有较弱的活性或甚至没有活性，但是在给药后，在生理条件下(例如通过代谢、溶剂分解或另外的方式)被转化成相应的生物活性形式。

一种上述的水杨酸类化合物的药学上可接受的水合物。

优选地，所述的药学上可接受的水合物为二水合化合物、一水化合物或者五水化合物。

一种药物组合物，由上述的水杨酸类化合物添加药学上可以接受的辅助性成分制备而成的。

优选地，所述的辅助性成分为液体填充剂、固体填充剂、稀释剂、赋形剂、溶剂或者包囊物质。

优选地，所述药物组合物的剂型为口腔速崩片、口腔复方制剂、口服缓释制剂、口服控释制剂、储库型长效注射剂或者透皮释药系统。

本发明的积极有益效果：

1.本发明水杨酸类化合物对丁酰胆碱酯酶(eqBuChE)的抑制活性为4.79±0.12μM，与阳性对照多奈哌齐抑制活性相近，说明本发明水杨酸类化合物具有较强的选择性丁酰胆碱酯酶抑制活性；本发明水杨酸类化合物的抗氧化活性为1.2±0.02eq，阳性对照组染料木素为10.8±0.32eq，说明本发明水杨酸类化合物具有较强的抗氧化活性；本发明水杨酸类化合物对金属离子具有强的络合作用，减少过度的金属离子，对AD具有一定的防治作用；并对过氧化氢诱导的PC12细胞损伤具有明显的神经保护功能，进一步在体内实验中展现出较好的治疗阿尔茨海默症的作用，且毒性较低，具备很好的临床应用前景。

2.本发明水杨酸类化合物结构简单，成本低廉。

附图说明

图1为本发明水杨酸类化合物对PC12细胞的细胞毒性测定结果图；

图2为本发明水杨酸类化合物对H2O2诱导的PC12细胞损伤的神经保护作用测定结果图；

图3为本发明水杨酸类化合物对东莨菪碱所致小鼠记忆获得障碍的实验结果图。

具体实施方式

下面结合一些具体实施例对本发明进一步说明。

实施例1

一种水杨酸类化合物在制备治疗阿尔茨海默症药物中的用途，所述的水杨酸类化合物的化学结构式如(Ⅰ)所示：

上述水杨酸类化合物的制备方法包括以下步骤：

将0.724mol水杨酸(1)、EDCI、HOBT及4mL无水二氯甲烷加入10mL圆底烧瓶中，室温下搅拌30min，再加入0.483mol 1，2，3，4-四氢异喹啉(2)(化合物(1)与(2)的摩尔比为1.5:1)，TLC检测反应，室温反应15h，反应结束后，向反应液中加30mL二氯甲烷，用饱和NaHCO3水溶液(20mL×3)洗涤，再用饱和氯化钠溶液20mL洗涤，有机层用无水硫酸钠干燥，过滤，减压蒸干溶剂，所得粗品经硅胶柱层析(洗脱剂:V(二氯甲烷)：V(丙酮)＝20:1)纯化，得目标产物N-(1,2,3,4-四氢异喹啉基)-2-羟基苯甲酰胺(I)，无色油状物，收率为49％。¹H NMR(400MHz,CDCl3)δ9.87(brs,1H),7.40-7.36(m,2H),7.25-7.21(m,3H),7.14(d,J＝3.6Hz,1H),7.04(d,J＝8Hz,1H),6.92(t,J＝7.6Hz,1H),4.88(s,2H),3.95(t,J＝6.0Hz,2H),3.02(t,J＝6.0Hz,2H)，MS(ESI)m/z:254.1[M+H]⁺。

生物活性试验

1.乙酰胆碱酯酶和丁酰胆碱酯酶抑制活性

向96孔板中依次加入1.0mmol/L碘化硫代乙酰胆碱或硫代丁酰胆碱(均购自Sigma公司)30μL，pH＝8.0的PBS缓冲液40μL，待测化合物溶液20μL(DMSO含量小于1％)和10μL乙酰胆碱酯酶(EeAChE)或丁酰胆碱酯酶(eqBuChE)(0.045U，均购自Sigma公司)，加毕混匀后，37℃孵育15min，向各孔中加入质量分数为0.2％的5,5'-二硫代-双(2-硝基)苯甲酸(DTNB，购自Sigma公司)溶液30μL显色，用酶标仪测定405nm处各孔的光密度(OD值)，与不加待测样品的空白孔比较，计算化合物对酶的抑制率[酶抑制率＝(1－样品组OD值/空白组OD值)×100％]；选择化合物的五至六个浓度，测定其酶抑制率，并以该化合物摩尔浓度的负对数与酶的抑制率线性回归，求得50％抑制率时的摩尔浓度即为该化合物的IC50，并以多奈哌齐作为阳性对照，实验结果详见表1。

结果表明：本发明水杨酸类化合物N-(1,2,3,4-四氢异喹啉基)-2-羟基苯甲酰胺(I)具有较强的选择性丁酰胆碱酯酶抑制活性。

表1 N-(1,2,3,4-四氢异喹啉基)-2-羟基苯甲酰胺(I)的胆碱酯酶抑制活性

2.抗氧化活性测定(ORAC-FL法)

试剂与仪器：6-羟基-2,5,7,8-四甲基色烷-2-羧酸(trolox，购自梯希爱(上海)化成工业发展有限公司)用75mM的PBS缓冲液(pH7.4)配成10-80μmol/L的溶液；荧光素(fluorescein，购自梯希爱(上海)化成工业发展有限公司)用75mM的PBS缓冲液(pH7.4)配成250nmol/L的溶液；2,2’-偶氮二异丁基脒二盐酸盐(AAPH，购自韶远化学科技(上海)有限公司)在使用前用75mM的PBS缓冲液(pH7.4)配成40mmol/L的溶液；酶标仪为Varioskan Flash Multimode Reader(Thermo Scientific)。

测定实验方法：向黑色96孔板中加入10μmol/L的化合物溶液20μL和荧光素溶液120μL，混匀，37℃孵育15min，加入AAPH溶液60μL，使每孔总体积为200μL，混匀，立即置于Varioskan Flash Multimode Reader仪器中，在485nm激发波长和535nm发射波长下每分钟测定一次荧光值，连续测定90min，通过仪器自动计算出荧光衰减曲线下面积AUC。其中以1-8μmol/L的trolox作为标准，以不加待测样品为空白。化合物的抗氧化活性结果表达为trolox的当量，计算公式为：[样品的曲线下面积(AUC Sample)-空白的曲线下面积(AUC blank)/(阳性对照Trolox的曲线下面积(AUC Trolox)-空白的曲线下面积(AUC blank)]×[(阳性对照Trolox的浓度/化合物的浓度)]。每个化合物每次测定3个复孔，每组实验独立重复三次，以染料木素作为阳性对照，实验结果详见表2。

结果表明：本发明水杨酸类化合物N-(1,2,3,4-四氢异喹啉基)-2-羟基苯甲酰胺(I)具有较强的抗氧化活性。

表2本发明N-(1,2,3,4-四氢异喹啉基)-2-羟基苯甲酰胺(I)的抗氧化活性测定

3.金属离子络合能力测定

用甲醇溶解CuCl2·2H2O、ZnCl2、FeSO4·7H2O、AlCl3及化合物(I)，配成75μmol/L的溶液，向石英96孔板中加入100μL待测化合物溶液和100μL金属离子溶液，混匀，室温静置30min，在varioskan Flash Multimodo Reader仪上记录混合物在200-600nm范围内的紫外吸收曲线，并以100μL待测化合物溶液和100μL甲醇混合液为对照，观察金属离子与待测化合物混合液的最大吸收峰的红移现象及最大吸收峰的强度。

测试结果表明，本发明水杨酸类化合物N-(1,2,3,4-四氢异喹啉基)-2-羟基苯甲酰胺(I)表现出对金属离子有强络合作用，对AD具有一定的防治作用。

4.对PC12细胞的细胞毒性测定

PC12细胞用含10％胎牛血清的DMEM培养液，以密度为4×10⁴个/ml接种于96孔培养板上，接种体积为100μl/孔，随后放入含5％CO2的37℃恒温培养箱内培养。PC12细胞培养24小时后，给药组中加入不同浓度的化合物(I)(终浓度为100μM,10μM,1μM)10μL/孔，恒温培养24h后，各组中加入5mg/mL的3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯基四氮唑溴盐(MTT)100μL/孔，进行活细胞染色。待3小时后，各组中加入100％DMSO终止液100μL/孔，充分溶解混匀。在590nm的波长下测定各组的OD值。各化合物分别以100μM、10μM、1μM测试3次结果，用Duncan’s test方法统计，以对照组为100％，给药组值以对照组的百分比表示。抑制率＝(对照-化合物)/对照*100％。测定结果详见图1。

结果表明：化合物浓度在1-10μM时，细胞存活率为100％，当化合物浓度达到100μM时，细胞存活率降到了86％，说明化合物(I)具有较低的细胞毒性，说明本发明化合物(I)具有较低的细胞毒性，拥有一个安全的治疗范围。

5.化合物对H2O2诱导的PC12细胞损伤的保护作用测定

PC12细胞用含10％小牛血清的DMEM培养液，以1×10⁵个/mL密度接种于96孔培养板上，接种体积为100mL/孔，随后放入含5％CO2的37℃恒温培养箱内培养。培养24小时后，给药组中加相应浓度的化合物(终浓度分别为10^-5mol/L和10^-6mol/L)10mL/孔，预孵育2小时(对照组与损伤组分别加10μL/孔PBS，使其体积保持相等)。PC12细胞孵育2小时后，在给药组与损伤组中分别加入100μΜH2O2损伤剂10μL/孔(对照组加10μL/孔PBS)，30分钟后，将各组的培养液均换成无小牛血清的培养液继续放入恒温培养箱内培养24小时，培养液体积认为100μL/孔。继续培养24小时后，各组加入5mg/mL，MTT 100μL/孔，进行活细胞染色。待3小时后，各组中加入100％DMSO终止液100μL/孔，充分溶解混匀。在490nm的波长下测定各组的OD值，测试结果重复3次，用Duncan’s test方法统计，各组数值表示为均数±S.E.M.，以对照组为100％，给药组及损伤组值以对照组的百分比表示，测定结果详见图2。

结果表明：本发明水杨酸类化合物N-(1,2,3,4-四氢异喹啉基)-2-羟基苯甲酰胺(I)对H2O2诱导的PC12细胞损伤具有显著的神经保护作用。

6.急性毒性试验

试验材料：实验动物为SPF级昆明种小鼠，由四川省中医药科学院提供，生产合格证号SCXK(川)2008-19。动物饲养于四川省中医药科学院药理毒理研究所SPF屏障系统中。室内温度20～22℃，相对湿度40％-70％左右，照明12小时明亮，12小时黑暗，自由饮水。全营养颗粒饲料由四川省中医药科学院实验动物中心提供。

实验方法：动物随机分组：取SPF级18～22g的小鼠40只，雌雄各半，适应性喂养两天后，按体重随机分为4组。禁食不禁水15h后，分别灌胃本发明化合物(I)1000mg/kg、500mg/kg、250mg/kg、100mg/kg四个剂量组，取给药体积为0.4mL/10g，各组给药一次，连续14天观察并记录各动物的死亡情况，采用Bliss统计软件进行分析。发现各组小鼠未出现毛竖起、行动迟缓、闭眼和呼吸加速以及死亡现象。

测定结果表明：SPF级昆明种小鼠经N-(1,2,3,4-四氢异喹啉基)-2-羟基苯甲酰胺(I)处理后，未出现急毒和死亡率，也未出现毛竖起、行动迟缓、闭眼和呼吸加速等现象，表明了化合物是无毒的，且最大耐受量为1000mg/kg。

7.动物实验(跳台被动回避实验)

试剂与仪器：多奈哌齐购自Eisai China Inc.；东莨菪碱购自J&K Scientific；18-22g的昆明鼠购自四川中医药科学院实验动物中心(合格证号：SCXK-Sichuan2008-19)；动物饲养于四川省中医药科学院药理毒理研究所SPF屏障系统中。饲养环境12h光照/12h黑暗交替，环境温度控制于20-22℃，湿度控制于50-60％。全营养颗粒饲料由四川省中医药科学院实验动物中心提供。小鼠跳台仪(型号ZXC-5Q)由山东省医学科学院设备维修供应站生产

实验方法：60只小鼠，18～22g，雌雄各半，按体重随机分为6个组，即空白对照组、模型对照组、多奈哌齐组(5mg·kg^-1)、化合物(I)高剂量组(10.0mg·kg^-1)、化合物(I)中剂量组(5.0mg·kg^-1)、化合物(I)低剂量组(2.5mg·kg^-1)。每组小鼠按给药剂量分上下午给药，连续给药3次，末次给药后50min进行造模，除空白对照组以外其他各组腹腔注射东莨菪碱3mg·kg^-1，连续给药24天。造模后20min进行跳台法训练，将动物放入反应箱内适应3min，然后立即通以36V交流电，训练5min，并记录每次小鼠受到电击的次数(错误次数)，并由此作为学习成绩。24h后进行测试，每只小鼠测定5min，记录受到电击的动物数及第一次跳下平台的潜伏期以及5min内的错误次数，结果进行统计学分析，所有数据均用均值±标准误差(Stand error，S.E.)表示。采用SPSS11.5软件分析，方差齐的选择单因素方差分析(One-way ANOVA)。计量资料比较采用单因素方差分析，各组均数的比较采用t检验，结果见图3。

实验结果表明：本发明水杨酸类化合物N-(1,2,3,4-四氢异喹啉基)-2-羟基苯甲酰胺对东莨菪碱所致小鼠记忆再现功能障碍均具有明显改善作用。

最后说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，本领域普通技术人员对本发明的技术方案所做的其他修改或者等同替换，只要不脱离本发明技术方案的精神和范围，均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。