一种梯度组织工程支架制作方法与流程

本发明涉及生物组织工程领域，特别是涉及一种梯度组织工程支架制作方法。

背景技术：

组织工程是是一门以细胞生物学和材料科学相结合，进行体外或体内构建组织或器官的新兴学科。通过细胞、支架结构与生长因子的混合培养，制造适用于修复人体组织或器官缺损的移植材料，可以实现缺损部位结构的再生和功能的重建。用于人体内的组织工程技术对材料生物特性、物理化学特性等方面提出了较高的要求，其中骨和软骨组织的重建对力学强度的要求最高，也对微观组织形态提出了一定的要求。

骨和软骨是人体中较为重要的承力组织，具有力学强度高，结构非均质的特征。复杂的非均质结构，或称为梯度结构，提供了非均匀的力学强度，适于支撑人体的重量和运动导致的应力。软骨组织具有优秀的梯度、非线性、粘弹性的力学性能；骨组织则具备皮质骨-松质骨的二级结构，在减轻重量的基础上具有极高的力学强度。在骨和软骨的组织工程重建中，如修复材料力学强度过弱，则难以承受恢复过程中的体内应力，导致材料变形、修复效果变差；如力学强度过强，也可能出现应力遮挡效应，令修复材料以外的正常组织承担应力减弱，造成骨质疏松等负面影响。

因此，仿生的，非线性梯度化的力学强度，对于组织工程支架的设计制造提出了苛刻和重要而要求。此外，微观组织形态的仿生化，对于重建过程中的细胞长入具有积极意义，也具有优化设计的价值。

生物3D打印(又称增材制造、快速成形)是一种新兴、灵活的组织工程技术，可以在不产生明显分界面的前提下实现分级/梯度软骨支架的制造。3D打印技术的核心是，依据离散/堆积成形原理的数字化成形——即在计算机的控制管理下，根据零件的CAD模型，通过材料的精确堆积，制造原型或零件，在产品开发与设计、快速工具(Rapid Tooling)、三维复制和临床医学领域均有应用。

定向冷冻是一种控制流体解冻时的温度场实现定向结晶，以令冷冻产物具有定向微观结构的加工方法。与冷冻干燥技术结合，可以获得具有定向微观组织的生物支架。

软骨组织具有结构较为简单、组织内无血管等有利条件，在组织工程研究中发展较快，具有较早进入临床应用的前景。然而，常见的软骨支架多为均质或准均质结构，力学强度的仿生性不够。多篇论文及专利CN201410097482中介绍了具有梯度化结构的软骨支架，但其制作方法多为分层粘接、分层浇铸或多材料打印，具有工艺繁琐，粘接/浇铸界面强度较差，难以进行定量力学强度优化等问题。

技术实现要素：

本发明的主要目的在于针对现有技术的不足，提供一种梯度组织工程支架制作方法。

为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：

一种梯度组织工程支架制作方法，包括采用生物高分子材料和水凝胶，利用低温沉积3D打印机打印三种网格，形成分层结构，分别为对应于浅层切向纤维的切向型网格、对应于中层过渡纤维的均匀网格以及对应于底层法向纤维的法向型网格，形成网格支架，其在力学强度上具有抗压力从浅到深逐渐增加，抗剪力从浅到深逐渐降低的特征；打印完后对网格支架进行第一次冷冻干燥，之后在成形的网格支架孔隙内灌入dECM溶液，并进行第二次冷冻干燥，除去dECM中的溶剂成分，获得具有接近正常软骨定向微观组织的复合的梯度组织工程支架。

进一步地：

所述生物高分子材料为PLGA在1，4-二氧六环溶剂中的分散系，所述水凝胶为天然软骨脱细胞基质dECM在乙酸中的分散系、胶原、壳聚糖或明胶，优选地，PLGA的粘度1.7，浓度0.15g/ml；优选地，打印材料在-20℃下挤出，并进行8h的第一次冷冻干燥。

打印时，通过以下任一者或多者来改变网格的压缩和剪切力学强度：(1)提高或降低单层网格的疏密程度；(2)增加或降低单一方向连续打印的网格层数；(3)改变不同方向网格的层数比例。

打印使得所述切向型网格的剪切模量略高于真实软骨，法向型网格的压缩模量略高于真实软骨，其余各模量则与真实软骨相当或略低。

还包括力学测量确定各层的力学强度，其中针对正面承压的软骨或骨缺损修补的需求，对网格支架各层上下加载压缩或剪切载荷；针对侧面承压的软骨或骨缺损修补的需求，将网格支架绕水平轴旋转90度再进行相应压缩或剪切载荷的加载。

三种分层网格在组合时近似于等截面叠加。

将三种分层网格相互间进行固接约束，边界和加载条件为周边无约束，上下使用刚体压头的压缩或剪切，调节三种网格在厚度方向的分布比例，通过力学仿真的形变量，反比例换算复合支架力学强度。

对于正面承压复合支架，通过下式确定三层的分层比例：

对于侧面承压复合支架，通过下式确定三层的分层比例：

E＝aE₁+bE₂+cE₃

其中E为期望达到的真实软骨力学强度、E1、E2、E3为各分层的力学强度，a+b+c＝1。

第二次冷冻时，将灌入dECM的网格支架置放入定向冷冻匣进行定向冷冻，所述定向冷冻匣具有高热导率部分优选紫铜，和低热导率部分优选PLA，在外围具有用PLA隔开的隔热空气层。

在dECM和PLGA溶液中加入水溶性致孔剂，在加工完毕后，通过溶解除去致孔剂，以获得微观孔径，实现连通度高的分级孔隙结构；优选地，在dECM中加入特定营养物质，如诱导软骨形成的IGF-1蛋白等，以促进软骨组织的形成。

本发明的有益效果：

本发明的梯度组织工程支架制作方法，从力学强度和微观组织结构出发进行工艺设计，实现了梯度复合支架的一次性成形，并显著优化了仿生效果，可以很好地进行定量力学强度优化，本发明提出的具有梯度结构的组织工程支架制造工艺，能更好地促进组织再生，提供具有非均质梯度特征的组织工程支架，适用于临床应用和研究。

本发明通过3D打印和定向冷冻技术的结合，实现了一次性成形具有梯度结构的软骨支架，便于进行力学强度的仿生优化，且具有宏观网格和微观组织的二级仿生结构。推广地，这种工艺手段也可以用于制造其他具有力学强度要求的组织工程支架，包括但不限于骨组织和骨-软骨复合组织。

附图说明

图1为本发明实施例软骨打印的三种网格设计思想，提高或降低单层网格的疏密程度(101)；增加或降低单一方向连续打印的网格层数(102)；改变不同方向(通常为横纵两向)网格的层数比例(103)；

图2为真实软骨的梯度组织结构示意图；

图3为本发明实施例三种网格结构示意图，分别为强调切向的切向型网格(301)，均匀网格(302)和强调法向的法向型网格(303)；

图4为本发明实施例针对正面承压的软骨或骨缺损修补的需求，作为正面承压复合支架(401)，对网格各层上下加载压缩或剪切载荷，以及针对侧面承压的软骨或骨缺损修补的需求，作为侧面承压复合支架(402)，将网格支架绕水平轴旋转90度再进行相应压缩或剪切载荷的加载；

图5为本发明实施例将灌入dECM的网格置放入定向冷冻匣进行定向冷冻的示意图；

图6为本发明实施例制作的实际复合支架的切片SEM观察验证图。

具体实施方式

以下对本发明的实施方式作详细说明。应该强调的是，下述说明仅仅是示例性的，而不是为了限制本发明的范围及其应用。

参阅图1至图6，在一种实施例中，一种梯度组织工程支架制作方法，包括采用生物高分子材料和水凝胶，利用低温沉积3D打印机打印三种网格，形成分层结构，分别为对应于浅层切向纤维的切向型网格、对应于中层过渡纤维的均匀网格以及对应于底层法向纤维的法向型网格，形成网格支架，其在力学强度上具有抗压力从浅到深逐渐增加，抗剪力从浅到深逐渐降低的特征；打印完后对网格支架进行第一次冷冻干燥，之后在成形的网格支架孔隙内灌入dECM溶液，并进行第二次冷冻干燥，除去dECM中的溶剂成分，获得具有接近正常软骨定向微观组织的复合的梯度组织工程支架。

3D打印使用的材料为生物高分子材料和水凝胶，具有较好的生物活性，对进一步临床研究有积极意义。

在打印软骨的实施例中，材料优选为：所述生物高分子材料为粘度1.7，浓度0.15g/ml的PLGA溶质，在1，4-二氧六环溶剂中的分散系。此外，溶质也可选择PCL等其他生物高分子材料，溶剂也可选择三氯甲烷等其他常见有机溶剂。所述水凝胶为天然软骨脱细胞基质dECM在乙酸中的分散系。此外，水凝胶也可选择胶原、壳聚糖、明胶等其具有生物活性的材料。

在打印骨的实施例中，材料优选为：羟基磷灰石、磷酸三钙等钙磷陶瓷材料，与上述生物高分子材料的混合溶液，陶瓷与高分子材料的质量比为1～10:1。该配比参考自专利文献CN201210344908。水凝胶具体可采用前述材料。

打印骨软骨复合支架时，优选采取双喷头打印。

在制造软骨的实施例中，实现工艺路径如下：

利用低温沉积3D打印机打印三种网格，材料选取为适用于生物实验，且具备一定力学强度的PLGA和1，4-二氧六环溶液，-20℃下挤出，并进行8h冷冻干燥。获得的支架具有常温下的稳定性、与真实软骨数量级接近的力学强度和宏观/微观上的孔隙率，有利于细胞长入。之后，在成形的网格支架孔隙内灌入dECM溶液，并进行第二次冷冻干燥，获得生物性能改良的双材料支架。

优选地，在打印中，可以通过以下的路径编程设计来改变网格设计的压缩和剪切力学强度，以供优化使用，如图1：

提高或降低单层网格的疏密程度(101)；增加或降低单一方向连续打印的网格层数(102)；改变不同方向(通常为横纵两向)网格的层数比例(103)。

在进一步优选中，针对正面承压的软骨或骨缺损修补的需求，考虑到真实软骨具有如图2所示的梯度组织结构，包括浅层切向纤维201，中层过渡纤维202，底层法向纤维203，箭头定性表示纤维走向；力学强度上，具有抗压力从浅到深逐渐增加，抗剪力从浅到深逐渐降低的特征。故，设计如图3所示的三种网格结构，分别为强调切向的网格301(简称切向型网格)，均匀网格302和强调法向的网格303(简称法向型网格)，并通过路径编程打印复合的梯度支架304。对应于图3中，三种网格结构分别采用多横少纵周期交错的结构，横纵均匀长周期交错的结构，横纵均匀短周期交错的结构。

并为了进一步进行力学强度优化，通过分层打印和力学测量确定各层的关键力学强度E1、E2、E3，可以为抗压模量或剪切模量；并通过打印路径设计，规划各层的厚度占比a、b、c(a+b+c＝1)，如图4的401所示。进行力学设计和优化时，可直接上下加载压缩或剪切载荷。

在另一种优选方案中，针对侧面承压的软骨或骨缺损修补的需求，同样设计如图3所示的三种网格结构，并打印复合支架304，但在进行力学设计和优化时，将网格绕水平轴旋转90度再进行相应压缩或剪切载荷的加载，各层厚度占比转为宽度占比a、b、c，如图4的402。

优选地，对上述三种网格进行力学强度测量和局部优化设计，令网格301的剪切模量略高于真实软骨，网格303的压缩(杨氏)模量略高于真实软骨，其余各模量则与真实软骨相当或略低，以通过三种网格在复合支架中所占比例的调节，使复合支架的力学性能接近真实软骨。

如上所述的工艺流程，既可以单独打印特征固定的均质网格支架，如网格301；也可以通过路径编程，在一次打印中成形各部分分别具有301、302、303特征的复合梯度支架304，而无需其他附加工艺。

由此，实现了均质支架和非均质支架具有相同的制造流程，均可一次性制造成形，省去了多材料打印、分步粘接等工艺中的切换材料和粘接步骤。因此，可以改善分级界面性能，避免因粘接和分层铸造出现的力学强度缺陷或力学性能突变，对于力学强度的定量研究和定量优化具有积极意义。

对于骨和骨-软骨复合组织的制造而言，只需针对皮质骨和松质骨的特性，选用适宜的分层网格结构与打印材料。

力学优化工艺路径如下：

对用所述工艺获得的分层网格，分别测量其关键力学性能，主要为压缩模量，剪切模量和抗压强度。将获得的三种力学性能作为参数，计算并优化复合网格的力学强度。

优选地，三种分层网格在组合时近似于等截面叠加，组合支架抗压强度可用三种网格中的最低者代表。

优选地，压缩模量、剪切模量优化方案有以下两种，并通过实际复合网格的力学测试验证(两种方案也可以互为验证)：

1.利用计算机进行力学仿真。将三种分层网格作为均质材料，相互间进行固接约束，边界和加载条件为周边无约束，上下使用刚体压头的压缩或剪切。调节三种网格在厚度方向的分布比例，通过力学仿真的形变量，反比例换算复合支架力学强度。

2.近似为等截面叠加，通过简化公式计算。

对于401所示的正面承压复合支架，已知压缩/剪切模量等于相应条件下的应力除以应变。因此，等截面叠加下，应力与压/剪力为正比例关系，又压/剪力恒定，则压缩/剪切模量反比于厚度方向上的应变，即形变率。

此关系对单一分层和整体支架均成立，因此复合网格的压缩/剪切模量之倒数，等于各分层相应模量之倒数的加权平均，权重为分层厚度占比。

即：由比例a的分层1，比例b的分层2和比例c的分层3构成的复合网格(a+b+c＝1)，其模量

对压缩模量和剪切模量都成立。

又，对于402所示的侧面承压复合支架，可以近似为三种分层支架的等厚并联，容易推得压缩/剪切模量等于三种分层相应模量的加权平均，权重为分层宽度占比。

即：由比例a的分层1，比例b的分层2和比例c的分层3构成的复合网格(a+b+c＝1)，其模量

E＝aE₁+bE₂+cE₃

对压缩模量和剪切模量都成立。

因此，对于所述的两种承压形式的优化例，均可找出以E1、E2、E3为实测参数，a、b、c中的任意两个为可调参数的简化公式，为力学优化提供理论计算或理论参考。

根据如上所述的两种优化方案，可以看出：三级复合的网格结构，提供了厚度分布比例a、b、c中的任意两个作为一对独立参数。需要优化的主要参数有两个，为压缩模量和剪切模量；需要保证下限的次要参数有一个，为抗压强度。因此，在保证抗压强度满足要求的条件下，可以通过一对独立参数的调整，实现双自由度的参数优化，令压缩模量和剪切模量都符合真实力学强度。

因此，在分层网格力学强度互有差异，且与真实软骨相当的基础上，可以通过合理的优化，实现整体力学强度接近真实软骨，受压/剪复合应力时应力云仿生的复合支架，理想的优化结果如图2所示的204。

在一个正面承压的实施例中，测得真实软骨压缩力学强度E＝37MPa，分层1与分层3力学强度相等，为40MPa，分层2力学强度为35MPa。故有

又a+b+c＝1，算得

故分层2占复合支架比例为0.57。再代入剪力的测试公式，可解出a和c，获得优化的层数比例。

对于骨和骨-软骨复合组织的优化而言，目标优化数值需选取骨组织的相应模量和强度。

组织学优化工艺路径如下：

与PLGA相比，dECM的力学强度较低，同等条件下仅有真实软骨的10％左右，但由于为天然软骨提取物，具有优秀的生物活性和可降解性。同时，由于较弱的力学强度，对其单独进行组织梯度化处理对整体力学强度影响不大，却能够提供适合细胞长入的定向微观纤维结构。

设计如图5所示的定向冷冻匣，其中含有高热导率(紫铜)部分501，和低热导率(PLA)部分502，外围具有用PLA隔开的隔热空气层503，冷冻下温度场分布近似504。

其中，热导率为紫铜最高386.4w/(m.k)，支架本身次之，参考主体成分水为0.55w/(m.k)，PLA再次，为0.25w/(m.k)，隔热空气层最低，为0.023w/(m.k)。

将灌入dECM的网格置入此匣，并整体放于冷环境中，通过紫铜的高热导率，可令dECM由铜的表面开始结冻，生长表层切向、中层过渡、底层法向的定向晶体结构。隔热空气层对侧面PLA的传热起到限制，提高了冷冻温度场的形状精确度。

优选地，所设计的温度场和定向纤维结构通过温度场的计算机仿真进行优化设计，并通过实际复合支架的切片SEM观察验证，如图6。

之后，通过冷冻干燥，可以除去dECM中的溶剂成分，获得具有接近正常软骨定向微观组织的复合支架。

通过如上所述的两条优化路径，可完成梯度结构软骨的制造与优化。所制造的软骨支架，具有被dECM充填的宏观孔径，尺寸为500微米左右；及PLGA与dECM内部的微观孔径，尺寸在5～50微米。

优选地，在dECM和PLGA溶液中加入水溶性致孔剂，典型的如糖、盐等。在加工完毕后，通过溶解除去致孔剂，以获得更小的微观孔径，实现连通度高的分级孔隙结构，便于营养物质输送。

优选地，在dECM中加入特定营养物质，如诱导软骨形成的IGF-1蛋白等，以促进软骨组织的形成。

这样制造的支架具有近似于真实软骨的力学强度和微观定向组织，在植入人体后能够较好地维持机体功能，并促进软骨细胞长入和软骨再生，在临床上具有应用价值。

此外，通过一次性成形支架结构的打印路径设计，实现了适用于定量优化的简单工艺流程。能够通过计算机仿真或理论计算对力学强度、组织结构进行定量优化，以在植入后更贴近真实人体，能够支持机体、促进组织再生。

以上内容是结合具体/优选的实施方式对本发明所作的进一步详细说明，不能认定本发明的具体实施只局限于这些说明。对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，其还可以对这些已描述的实施方式做出若干替代或变型，而这些替代或变型方式都应当视为属于本发明的保护范围。