基于响应面分析法对从乌饭树叶中提取总黄酮的超声提取工艺参数的优化方法与流程

本发明涉及生物工程技术领域，尤其涉及一种基于响应面分析法对从乌饭树叶中提取总黄酮的超声提取工艺参数的优化方法。

背景技术：

乌饭树(Vaccinium bracteatum Thunb.)为杜鹃花科越桔属常绿灌木，古称南烛、染菽、牛筋草、青精草、草木之王等。作为一种传统的中药及保健食品，乌饭树叶具有益肠胃，养肝肾，治疗须发早白等功效。

类黄酮化合物是乌饭树叶中的主要药用成分之一。为此，研究乌饭树叶中总黄酮的提取方法及提取工艺，对开发利用乌饭树这一宝贵资源具有重要意义。

目前，主要采用正交试验设计或响应面法对植物天然成分进行提取工艺优化，但响应面法可以实现应用较少的试验数据在给定的范围内找到因素与响应值之间明确的函数表达式，从而得出最佳因素组合及最优响应值，因而更具明显优势。余清等(2008年)采用响应面分析法对显著影响乌饭树叶总黄酮提取工艺的2个因素——乙醇浓度和提取温度进行了试验设计，得到乌饭树叶总黄酮的最佳提取工艺为：提取前浸泡60min，液料比50∶1，乙醇浓度87％，提取温度61℃，提取时间2h，在此条件下一次提取率可达68.12％，提取量为7.00052mg/g。本发明在采用超声提取法的前提下，利用响应面分析法对显著影响乌饭树叶总黄酮超声提取工艺的4个因素即乙醇浓度、液料比、超声时间及超声温度进行了组合试验，从而得出最佳因素组合以及在此因素组合下的最佳黄酮提取量。本发明与目前响应面法优化黄酮提取工艺研究的不同点还在于考虑了实际情况，没有绝对地将单因素试验结果的最高点作为响应面法试验设计的中心点。比如单因素试验筛选出的最佳提取溶剂为90％乙醇，但考虑到90％乙醇作为提取溶剂时，叶绿素、脂溶性物质、糖类等杂质大量析出，提取液呈现绿色(其他均为黄色)且出现明显的沉淀，增加了对总黄酮进行纯化处理的难度和成本。因此从生产效益的角度考虑，选择中心点提取溶剂为70％乙醇。

因此，本发明以乌饭树叶中总黄酮提取量为指标，采用响应面法优化乌饭树叶中总黄酮的超声提取工艺，为其进一步研究提供了科学的理论基础。

技术实现要素：

发明目的：为了克服现有技术中存在的不足，本发明提供一种从乌饭树叶中提取总黄酮的超声提取方法，以乌饭树叶为原料，利用超声波提取，可高效地获得较高含量的乌饭树叶黄酮类物质。

技术方案：为解决上述技术问题，本发明的一种从乌饭树叶中提取总黄酮的超声提取方法，包括以下步骤：

1)称取乌饭树叶干燥粉末；

2)加入提取溶剂；

3)超声提取；

4)抽滤。

具体为；称取乌饭树叶干燥粉末，按照设定的提取溶剂、液料比、超声时间、超声温度等条件分别提取总黄酮，然后抽滤，洗涤滤渣，合并滤液并用50％乙醇定容至50mL，即得。

优选地，所述的提取溶剂为体积百分比为30-100％乙醇和纯水，优选为75％乙醇。

优选地，液料比为20∶1mL/g到80∶1mL/g之间，优选为65∶1mL/g。“液料比”，指浸提液的体积与固态材料的质量之比，采用单位为mL/g。

优选地，超声时间为30-110min，优选为80min。

优选地，超声温度为45-75℃，优选为65℃。

本发明通过对上述步骤最佳工艺参数提供了一种优化方法，具体为：1)供试品和对照品溶液的制备：实验材料准备：乌饭树叶供试品，烘干后粉碎，密封保存；槲皮素对照品；六水合三氯化铝、醋酸钠、无水乙醇；超纯水；分别制备供试品溶液和对照品溶液；然后绘制标准曲线；

2)单因素试验及结果分析：选取提取溶剂、液料比、超声时间、超声温度4个因素进行单因素试验，得到各因素与总黄酮提取量的关系；

3)响应面法分析超声提取效果的影响因素。

超声波作为一种物理辅助提取手段对乌饭树叶进行处理，更有利于乌饭树叶中总黄酮的提取。一方面，能通过空穴作用产生极大的压力，造成被破碎物的细胞壁甚至整个生物体破裂而使胞内物质释放、溶出；另一方面，适宜强度的超声波能够使黄酮分子的构象发生正向转化，从而提高总黄酮的生物活性。

有益效果：本发明的优点在于同时采用了超声提取与响应面分析法，可以应用较少的试验数据快速筛选出最优提取工艺，且相比于余清等(2008年)优化得到的乌饭树叶总黄酮提取最佳工艺下的提取量——7.00052mg/g，本研究得到的优化提取工艺可以有效提高乌饭树叶中总黄酮的提取量到23.41mg/g。提高的原因有两点：首先是采用了超声辅助提取，可以有效提高黄酮的浸出量；其次前者的乙醇体积浓度为87％，远远高于本研究最佳工艺中的乙醇浓度75％，本研究过程中发现当乙醇浓度接近90％时的提取液为亮绿色，而黄酮提取液一般为淡黄色，过高的乙醇浓度会产生较多的杂质从而降低黄酮的提取量。

附图说明

图1为槲皮素标准曲线。

图2为提取溶剂对提取量的曲线。

图3为液料比对提取量的影响曲线。

图4是超声时间对提取量的影响曲线。

图5是超声温度对提取量的影响曲线。

图6是两因素交互影响总黄酮提取量的响应面图及等高线图。

具体实施方式

下面结合附图对本发明作更进一步的说明。

实施例1.从乌饭树叶中提取总黄酮的方法

1.1实验材料准备

乌饭树叶，采自江苏溧阳，烘干后粉碎过60目筛，密封保存；槲皮素标准品(含量≥98％)；六水合三氯化铝、醋酸钠、无水乙醇(均为国产分析纯)；超纯水。

1.2实验具体方法

1.2.1供试品溶液的制备

称取乌饭树叶干燥粉末0.500g，按照设定的提取溶剂、液料比、超声时间、超声温度等条件分别提取总黄酮，然后抽滤，洗涤滤渣3次，合并滤液并用50％乙醇定容至50mL，即得。

1.2.2对照品溶液的制备

精密称量槲皮素标准品10mg，用50％乙醇溶解，定容到50mL的量瓶中，摇匀即得浓度为0.2mg/mL的槲皮素标准液。

1.2.3标准曲线的绘制

精确量取0.2mg/mL槲皮素标准液0，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0，1.2mL分别置于0～7号容量瓶中，加入1％AlCl3溶液5mL以及10％的醋酸钠溶液1mL，再用50％乙醇定容至25mL，摇匀，以0号试管作空白参比，静置10min后于390nm处测其吸光度。如图1所示，以吸光度(Y)对总黄酮含量(X，mg)进行线性回归，得回归方程Y＝2.7193X-0.0013，R2＝0.9997。

实施例2.单因素试验及结果分析

选取提取溶剂、液料比、超声时间、超声温度4个因素进行单因素试验，得到各因素与总黄酮提取量的关系。

2.1提取溶剂对乌饭树叶中总黄酮提取量的影响

精密称取乌饭树叶干燥粉末0.500g，以液料比40∶1mL/g、超声时间30min、超声温度55℃，分别在提取溶剂为水、30％乙醇、50％乙醇、70％乙醇、90％乙醇、100％乙醇的条件下进行超声提取，然后抽滤，洗涤滤渣3次，合并滤液并用50％乙醇定容至50mL。如图2所示，按照实施例1下的方法测其吸光度，并计算提取量。

由于甲醇和丙酮等有机溶剂成本较高，且一般具有毒性，因此选择水及不同浓度(v/v)的乙醇作为提取溶剂。由图2可知，水作为提取溶剂下的总黄酮提取量最小。在乙醇浓度为30％～90％范围内，随着乙醇浓度的增加，总黄酮提取量也相应增加，当乙醇浓度为100％时，总黄酮提取量随之降低。但是在提取过程中发现，90％、100％乙醇作为提取溶剂时，叶绿素、脂溶性物质、糖类等杂质大量析出，提取液呈现绿色(其他均为黄色)且出现明显的沉淀，增加了对总黄酮进行纯化处理的难度和成本。因此从生产效益的角度考虑，选择提取溶剂为70％乙醇。

2.2液料比对乌饭树叶中总黄酮提取量的影响

精密称取乌饭树叶干燥粉末0.500g，以70％乙醇、超声时间30min、超声温度55℃，分别在液料比20∶1mL/g、40∶1mL/g、60∶1mL/g、80∶1mL/g的条件下进行超声提取，然后抽滤，洗涤滤渣3次，合并滤液并用50％乙醇定容至50mL。按照实施例1下的方法测其吸光度，并计算提取量。结果见图3。

由图3可以看出，当液料比在20∶1mL/g～60∶1mL/g之间时，黄酮提取量随液料比的增加而增加，当液料比超过60∶1mL/g时，黄酮提取量有下降趋势。原因可能是随着溶剂体积的增加，溶剂与物料可以充分接触，黄酮提取量增加，但当溶剂量超过一定值时，其他物质随之渗出，影响黄酮的提取。因此选择液料比为60∶1mL/g。

2.3超声时间对乌饭树叶中总黄酮提取量的影响

精密称取乌饭树叶干燥粉末0.500g，以70％乙醇、液料比60∶1mL/g、超声温度55℃，分别在超声时间30min、50min、70min、90min、110min的条件下进行超声提取，然后抽滤，洗涤滤渣3次，合并滤液并用50％乙醇定容至50mL。按照实施例1下的方法测其吸光度，并计算提取量。结果见图4。

由图4可知，随着超声时间的延长，总黄酮提取量呈现出“M”型变化趋势，即“增长-下降-再增长-再下降”，并在90min时达到最大值。说明超声90min时，细胞内外的类黄酮化合物充分溶出，超声时间超过90min后，部分类黄酮物质被超声波所分解。因此选择超声时间为90min。

2.4超声温度对乌饭树叶中总黄酮提取量的影响

精密称取乌饭树叶干燥粉末0.500g，以70％乙醇、液料比60∶1mL/g、超声时间90min，分别在超声温度45℃、55℃、65℃、75℃的条件下进行超声提取，然后抽滤，洗涤滤渣3次，合并滤液并用50％乙醇定容至50mL。按照实施例1下的方法测其吸光度，并计算提取量。结果见图5。

由图5可知，随着浸提温度的升高，黄酮提取量先增后降，65℃时达到最大值。当浸提温度在45～65℃之间时，随着温度的升高，分子运动速率加快，类黄酮物质的渗透和扩散速率加快，黄酮提取量增加。但是当温度超过65℃时，部分类黄酮物质的结构发生变化，导致总黄酮提取量有所降低。因此选择超声温度为65℃。

实施例3响应面法分析超声提取效果的影响因素

3.1响应面优化工艺

在单因素试验的基础上，利用Design Expert 8.0.5软件，根据Box-behnken中心组合试验设计原理，设置对乌饭树叶总黄酮超声提取工艺影响显著的4个因素即乙醇浓度(A)、液料比(B)、超声时间(C)及超声温度(D)作为自变量，以总黄酮提取量为响应值设计三水平的响应面试验，见表1。

表1响应面分析因素与水平

3.2对乌饭树叶中总黄酮提取工艺进行响应面分析，自变量的试验水平分别以-1、0、1进行编码，共设计29个试验点，其中24个为析因点，5个零点用以估计试验误差。具体试验方案及试验结果见下表。

表2Box-Beknhen试验设计及结果

3.3利用Design Expert 8.0.5软件对表2中的数据进行多元回归拟合分析，得到响应回归方程：

Y＝+22.85+0.88A+0.26B+0.30C+0.35D-0.20AB-0.54AC+0.33AD+4.67BC+0.33BD-0.31CD-0.52A²-0.25B²-0.13C²-1.58D²

式中，Y为乌饭树叶中总黄酮含量的预测值，A、B、C、D分别为乙醇浓度、液料比、超声时间、超声温度。

3.4对响应面多元回归模型进行方差分析和显著性检验，结果如表3所示。

表3回归方差分析

注：决定系数R²＝0.9388；校正系数R²_Adj＝0.8776；*：p＜0.05，显著；**：p＜0.01，极显著。

由方差分析结果可知，该模型高度显著(p＜0.0001)，失拟项不显著(p＝0.3028＞0.05)，决定系数R²＝0.9388，校正系数R²_Adj＝0.8776，表明响应值的变化有93.88％是由所考察的四个因素引起的，即此模型对于乌饭树叶中总黄酮提取量实际值与预测值之间具有较好的拟合度，可运用该模型对乌饭树叶总黄酮提取工艺进行优化。由显著性检验结果可知，一次项A和D，二次项A²和D²均在0.01水平内显著(极显著)，一次项B和C在0.05水平内显著，表明在乌饭树叶总黄酮超声提取工艺过程中，影响总黄酮提取量的因素主次为乙醇浓度(A)＞超声温度(D)＞超声时间(C)＞液料比(B)。交互项AC在0.05水平内显著，表明乙醇浓度和超声时间的交互作用对总黄酮的提取有显著影响，其他交互项对总黄酮提取量的影响均不显著。

3.5响应面分析和优化结果

图6是基于多元回归模型所绘制的各因素之间两两交互作用对乌饭叶总黄酮提取量的影响响应面图。响应曲面三维图和等高线二维图从一定程度上可以直观反映两因素对响应值的交互影响强弱。响应曲面越陡峭，说明响应值受所考察因素的交互影响越大，反之，则影响越小。等高线越趋于椭圆形，说明响应值受所考察因素的交互影响越大，越趋于圆形，则影响越小。由图6可以看出，从a到f，响应曲面陡峭程度依次增大，等高线也由圆形向椭圆形逐渐过渡(f除外)，表明所考察因素间的交互影响作用由小到大顺序依次为BC＜AB＜CD＜BD＜AD＜AC，与表3中的显著性检验结果相吻合。

3.6最佳提取工艺的确定及验证

利用Design Expert 8.0.5软件的optimization功能，对总黄酮提取量最大值进行工艺预测，得出最佳提取工艺条件为：乙醇浓度75％，液料比63.47∶1mL/g，超声时间80min，水浴温度66.05℃，总黄酮提取量预测值为23.50mg/g。考虑实际操作过程的方便性，选择乙醇浓度75％，液料比65∶1mL/g，超声时间80min，超声温度65℃，在该工艺下进行五次平行实验所得的总黄酮提取量平均值为23.41mg/g，与预测值仅相差0.09mg/g，表明用响应面法对乌饭树叶中总黄酮超声提取的各因素进行优化研究是合理可行的。

乌饭树叶含有丰富的类黄酮化合物，在食品与医药领域均具有广阔的开发利用前景。本研究以乌饭树叶干燥粉末为原料，采用超声波辅助提取技术，在单因素试验基础上，进行了四因素三水平的响应面试验。结合实际操作得到最优工艺条件为：以75％乙醇为提取溶剂，液料比65∶1mL/g，超声时间80min，超声温度65℃。相比于余清等(2008年)优化得到的乌饭树叶总黄酮提取最佳工艺下的提取量—－7.00052mg/g，本研究得到的优化提取工艺可以有效提高乌饭树叶中总黄酮的提取量到23.41mg/g。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出：对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。