可溶性微针贴片及其制备方法与流程

本发明涉及护肤品领域
技术领域：
，特别是涉及一种可溶性微针贴片及其制备方法。
背景技术：
：微针作为一种新型的经皮给药技术，具有显著的优势。传统的经皮给药以皮下注射为主，这种给药方式的优点是突破了角质层屏障，直接将药物输送到皮肤深层，准确有效地给药，缺点是常常引起疼痛、皮肤感染、组织损伤等问题，降低了患者用药的顺应性；传统的透皮给药如药物涂覆、膏药贴片等，其优点是使用方便，无痛，可以随时停止给药，绕过了肝脏的第一道代谢，缺点是透皮给药受限于皮肤角质层形成的屏障，药物吸收效果不理想，不能输送大分子药物，尤其是肽类药物和蛋白质药物。微针经皮给药作为一种传统的经皮给药与透皮给药技术相结合的新型给药方式，既结合了透皮贴剂和皮下注射的优点，具有传输速度快，能够实现精确给药等特点，又消除了普通的注射器容易引起皮肤损伤、痛疼及感染等副作用，克服了传统的透皮给药贴片难以实现大分子药物输送的缺点。微针给药不仅可以提高给药精度和效率，同时还具有无痛和微量的特点，微针技术不仅在生物医学领域得到了广泛的应用，在美容领域更是受到了前所未有的热捧，微针美容已在欧美、日本、韩国等地广泛使用。微针在美容领域的用途十分广泛，它既可以用于美体塑形，也可以用于美容美肤，对治疗脱发、修复泡痕等也有很好的效果；总的来说，可以将微针在美容美体方面的应用概括为以下几个方面：对抗皮肤衰老、预防和治疗脱发、减轻体重、治疗痤疮、去除死皮组织、减少脂肪的局部堆积、皮肤干癖等。微针之所以能够发挥卓越的美容护肤功效，并在美容领域备受关注，其原理可以归结为以下两点：(1)局灶性损伤效应：采用微针阵列处理皮肤，可以瞬间在皮肤表面创造成千上万个微小的创口，在外界刺激下，机体会进行修复，引起一些积极效应。(2)微孔道渗透效应：采用微针阵列对皮肤进行预处理，可以短时间内在皮肤表面创造成千上万的微小通道，从而使美容护肤用品或者药物活性成分透过角质层障碍直接到达皮肤深层，将护肤用品或者药物活性成分准确定位、精确定量的输送到需要修复、改善或治疗的部位，充分发挥药物功效。基于以上原理，可以根据修复部位、皮肤状况的不同，选用化妆品活性成分以及微针的尺寸，提高微针的灵活性和适用性，高效、准确的实现治疗和保养的目的。然而，近年来流行的美容微针多是采用生物不可降解的实心微针，例如微针滚轮、微针美塑，纳米微针等，均给消费者带来一些不利因素，诸如：第一，高成本高价格。目前微针的制造大多采用的是激光雕刻方法或者采用高价格材料制造，导致制造难度大，制造成本或材料成本费高，致使美容微针价格极高，很难实现大面积推广。第二，安全性。目前市场出现了金属微针，或单晶硅微针，但是由于微针本身细小的特点，相比之下强度降低，易断裂在皮肤内部，造成皮肤下层发炎损伤，且金属材质造成有很明显的疼痛感，或者有的采用其他材料制造，对人体造成伤害，频繁使用会造成毛孔增大、色素沉着；医疗机构微针滚轮如果共用，工具就有机会残留他人血液，易导致艾滋病、肝炎等得传播。第三，实用性。目前大多数美容微针产品只能实现在美容机构或医院由专业人员或者专业人员指导下使用，或者由于技术原因造成使用的安全性无法保证，导致微针的操作难度大，便利性较低。而可溶性微针的面世恰恰弥补了目前微针美容的缺陷，透明质酸微针就是其中一种。以透明质酸为基质制备微针，当其刺入人体皮肤后，透明质酸在体液作用下溶解滞留于皮肤内，不仅可以起到美容作用，而且由于透明质酸是人体内源性物质，不会引起炎性反应。但是，现有的透明质酸微针存在硬度不够，或者强度欠佳，不足以刺穿皮肤，易造成针体断裂，或者粘度过高不利于制备成型等缺陷。技术实现要素：基于此，本发明提供了一种可溶性微针贴片。该可溶性微针贴片具有良好的溶解性，并且具有良好的硬度和机械强度。具体技术方案如下：一种可溶性微针贴片，包括针尖和基底，所述针尖由以下重量份的原料制备而成：透明质酸或其盐7-14份功能活性成分0.05-0.2份赋形材料6-11份；所述透明质酸或其盐为小分子量的透明质酸或其盐和大分子量的透明质酸或其盐的混合物，所述小分子量的透明质酸或其盐的分子量不大于10kda，所述大分子量的透明质酸或其盐的分子量不小于1800kda；所述功能活性成分选自寡肽-1、寡肽-3、水解胶原以及透明质酸或其盐中的至少一种；所述赋形材料选自聚乙烯醇(pva)及其衍生物、聚乙烯吡咯烷酮(pvp)及其衍生物、乳糖、山梨糖醇、葡聚糖(dex)、海藻糖和蔗糖中的至少一种。在其中一些实施例中，所述针尖由以下重量份的原料制备而成：透明质酸或其盐9-12份功能活性成分0.08-0.15份赋形材料8-10份。在其中一些实施例中，所述小分子量的透明质酸或其盐的分子量为5k-10kda，所述大分量的透明质酸或其盐的分子量为1800k-3000kda。在其中一些实施例中，所述小分子量的透明质酸或其盐和所述大分子量的透明质酸或其盐的质量比为100-600：1。在其中一些实施例中，所述小分子量的透明质酸或其盐和所述大分子量的透明质酸或其盐的质量比为198-499:1。在其中一些实施例中，所述小分子量的透明质酸或其盐和所述大分子量的透明质酸或其盐的质量比为198-199:1。在其中一些实施例中，所述功能活性成分为寡肽-1和/或寡肽-3。在其中一些实施例中，所述功能活性成分为质量比为1:1-4的寡肽-1和寡肽-3的组合物。在其中一些实施例中，所述赋形材料选自聚乙烯吡咯烷酮和葡聚糖。在其中一些实施例中，所述赋形材料为质量比为1:7-9的聚乙烯吡咯烷酮k30和葡聚糖70的组合物。在其中一些实施例中，所述基底由基底材料制备而成，所述基底材料选自聚乙烯醇及其衍生物、聚乙烯吡咯烷酮及其衍生物、透明质酸或其盐、乳糖、山梨糖醇、葡聚糖、海藻糖和蔗糖中的至少一种。在其中一些实施例中，所述基底材料为透明质酸或其盐或者乳糖与透明质酸或其盐的组合物。在其中一些实施例中，所述乳糖与透明质酸或其盐的组合物中乳糖与透明质酸或其盐的质量比为1:4-9。本发明还提供了上述可溶性微针贴片的制备方法。具体技术方案如下：一种上述的可溶性微针贴片的制备方法，包括以下步骤：将赋形材料溶于水中，加入透明质酸或其盐，搅拌均匀，加入功能活性成分，搅拌均匀，脱气泡，得针尖液；将基底材料溶于水中，得基底液；将针尖液注入微针模具中，再将基底液平铺在针尖液上，干燥除水，剥离模具，即得。本发明的发明人通过深入研究发现，现有的透明质酸微针之所以存在硬度不够，或者强度欠佳，或者粘度过高不利于制备成型等缺陷，是因为选用的透明质酸的分子量过高或者过低造成的。透明质酸是线性大分子，在水中溶解较低浓度的透明质酸时，水溶液粘度就急剧增加，并且是随透明质酸分子量增加而增大的。例如，水中溶解5％的分子量1500kda的透明质酸时，溶液几乎成半固体状态。因此，透明质酸的这种性质不利于微注模法生产微针贴片，且制造出来的针体固含量不足，导致针体虽不易断裂，但硬度不足。而分子量较低的透明质酸的水溶液在较高浓度时(例如10％)，粘度比高分子量的透明质酸低，但是分子量太低的透明质酸制备的微针阵列，针体硬度足够，但强度欠佳，不足以刺穿皮肤，易造成针体断裂。发明人在其大量的实验过程中意外的发现当将分子量不大于10kda的透明质酸或其盐以及分子量不小于1800kda的透明质酸或其盐以一定比例复配后，再通过加入特定种类的赋形材料，制备得到的微针可有效解决现有透明质酸微针存在的硬度不够，机械强度欠佳，或者粘度过高不利于制备成型等缺陷。因此，本发明的可溶性微针贴片及其制备方法具有以下优点和有益效果：本发明的可溶性微针贴片针体固含量大，具有良好的机械强度、具有足够的硬度、利于刺入皮肤，同时不易折断，制备过程中具有合适的粘度，有利于微针成型。本发明的可溶性微针贴片能够迅速在皮肤内溶解并被人体快速吸收，减少对皮肤的刺激性，生物相容性及安全性好，且含有多种功能活性成分，具有抚平细纹、美白、保湿、抗皱、祛斑、防晒的功效等护肤效果。本发明的可溶性微针贴片，其微针基底膜具有良好的柔韧性，能够与皮肤紧密接触无异物感。基底膜材料可进一步优选为具有活性的透明质酸钠，能够短时间在皮肤上溶解，作用于皮肤，可进一步增强可溶性透明质酸微针贴片的护肤效果。附图说明图1为实施例2中的处方1的微针经过质构仪探头作用力后的显微镜图。图2为实施例2中的处方2的微针经过质构仪探头作用力后的显微镜图。图3为实施例2中的处方3的微针经过质构仪探头作用力后的显微镜图。图4为实施例2中的处方4的微针经过质构仪探头作用力后的显微镜图。图5为实施例2中的处方5的微针经过质构仪探头作用力后的显微镜图。图6为实施例2中的处方6的微针经过质构仪探头作用力后的显微镜图。图7为实施例2中的处方7的微针经过质构仪探头作用力后的显微镜图。图8为实施例2中的处方8的微针经过质构仪探头作用力后的显微镜图。图9为实施例2中的处方9的微针经过质构仪探头作用力后的显微镜图。图10为实施例2中的处方10的微针经过质构仪探头作用力后的显微镜图。图11为实施例2中的处方11的微针经过质构仪探头作用力后的显微镜图。图12为实施例4中的处方1的微针电镜扫描图。图13为实施例4中的处方2的微针电镜扫描图。图14为实施例4中的处方3的微针电镜扫描图。图15为实施例4中的处方4的微针电镜扫描图。图16为实施例4中的处方5的微针电镜扫描图。图17为实施例4中的处方6的微针电镜扫描图。图18为实施例4中的处方7的微针电镜扫描图。图19为实施例4中的处方8的微针电镜扫描图。图20为实施例4中的处方9的微针电镜扫描图。图21为实施例4中的处方10的微针电镜扫描图。图22为实施例4中的处方11的微针电镜扫描图。具体实施方式以下结合具体实施例对本发明的可溶性微针贴片及其制备方法做进一步详细的说明。实施例1微针贴片基底膜的溶解速度以及揭膜完整度测试按照表1的处方制备基底液，其中，ha-thm是指高分子透明质酸钠(其分子量为1800k～3000kda)，tl100是指透明质酸弹性体(ha通过交联反应得到的超高分子量聚合物)，pva是指聚乙烯醇。将平铺的基底液用刮器刮平并调整至相应的厚度，得到所需厚度的基底膜，常温干燥设备中干燥24小时，取出，即得微针贴片的基底膜样品。表1揭膜完整率是指揭膜后最完整的那块膜重与所有膜重的比值，按下式计算:fi＝m1/(m1+m2)×100％式中，fi为揭膜完整率(％)；m1为最完整膜重；m2为小块膜重。称取1g的基底膜放入60℃、100ml水中，快速搅拌至溶液中无碎片为止，记录溶解单位质量的基底膜所需的时间，以表示溶解速度(min/g)。结果如表2所示。表2由实验结果显示，处方f3、f4、f5制备的基底具有良好的柔韧性以及揭膜完整性，且无异物感，效果较好。另外，随着低分子辅料的不断添加，微针基底膜的柔软度上升，溶解速度上升，但韧性和揭膜完整性会下降。实施例2用不同配方材料制备的透明质酸钠微针贴片的硬度和延展性将赋形材料与透明质酸钠(ha，分子量5k～10kda)和高分子透明质酸钠(ha-thm，分子量1800k～3000kda)按照表3的比例于30℃搅拌条件下溶于50g注射用水，溶解完全后得针尖液。将上述针尖液倒入含有大量圆锥微孔的微针模具中，抽真空后回收多余针尖液，圆锥孔底边直径200μm，深400μm，再将基底液(ha-thm:水＝1:40)平铺在针尖液上，最后将微针模具置于真空干燥箱中，30℃加热下抽真空干燥48h。剥离微针模具即得含有寡肽-1和寡肽-3活性成分的可溶性透明质酸钠微针贴片。所得微针长400μm。表3将以上制备得到的微针贴片的针尖向上放置于水平的测试平台上，应用质构仪测试不同配方的微针硬度和延展性。通过p/6型平头不锈钢圆柱探头，以稳定的0.1mm/sec的速度进行测试，激发力为0.05n，施加轴向垂直力，设定测定参数如表4。分析仪记录探头接触针尖直到达到预设高度(微针高度400μm)期间的力学变化。表4测试完成后，取出测试平台上已测试过的微针样品，用显微镜观察经过质构仪探头作用力后的微针局部形态变化。应用质构仪测试不同配方的微针硬度、延展性结果见表5，采用数字显微镜观测微针测试完后的外观形态图片如图1-图11所示。表5不同配方的微针硬度和延展性结果分析：微针在被施压的过程中力量的变化呈缓慢递增，表示微针处于缓慢的形变过程，没有突然的断裂使压力波动说明该配方所制备的微针的延展性良好(最佳范围为0.95～1.35mm之间)，即该配方拥有良好的针体强度，但如果延展性过大则表明针体的形变耐受值过大，反而不利于针体刺进皮肤。而硬度(最佳范围为大于22n)与延展距离的比值表示单位延展距离内的硬度值，比值越大表明针体更易刺进皮肤(最佳范围为大于18n/mm)。实验结果从显微镜图与表5中发现f1～f8处方的微针具备明显刚性与硬度，硬度依序为f1>f3>f2>f4>f9>f6>f5>f7>f10>f8>f11。而f9～f11的样品如图9～图11所示则出现断裂，表明其延展性差，强度差。而未断裂样品(f1～f8)相对于前三个样品(f9～f11)显示具备较强延展性，即表明样品具有较好的强度。这主要是由于低分子量的透明质酸钠与高分子量的透明质酸钠在分子量上具有良好的协同作用，再配合赋形材料(如葡聚糖、pvp、乳糖等)使得所制备的微针样品兼备强度和硬度。在硬度和延展距离的比值上，处方f1～f4相对更大，说明处方f1～f4制备的微针更有可能插入皮肤，其中f1号处方在硬度、延展性以及硬度延展性的比值均优于其他处方，即通过调节ha与ha-thm的配比以及赋形材料的用量和种类，可产生良好的协同作用，使制备得到的微针样品同时具有的良好的硬度以及延展性，且硬度和延展距离的比值也符合使用要求，使微针针体更容易刺进皮肤。可见，处方f1-f8制备的微针的综合效果远好于处方f9～f11，这是高分子透明质酸钠(分子量大于1800kda)以及低分子透明质酸钠(分子量小于10kda)以及赋形材料共同配合的结果。其中，处方f1制备的微针的综合效果最好，具有最好的硬度以及延展性，同时具备最佳的硬度延展性比值，这表明该处方制备的样品最利于刺进人体的皮肤。由于f9只用了低分子透明质酸钠，f10没有添加赋形材料，f11所用透明质酸钠的分子量不合适，导致f9-f11所制备的微针硬度或者延展性上效果不佳，甚至出现断裂，不利于实际临床应用。实施例3可溶性透明质酸钠微针贴片的溶解度测定精密称量不同质量的明胶，纯化水，蔗糖按表6比例配制，置于50ml离心管中，90℃水浴锅中过夜溶解，离心，脱气，快速转移至透明的培养皿中，冷却，凝固成不同含水量的明胶蔗糖凝胶体。表6明胶凝胶体成分组成将实施例2中制备的可溶性微针贴片沿着培养皿边缘插入凝胶体表面，从侧面用电子显微镜在不同时间点观察，采图，记录不同时间点的溶解情况，观察至无明显可见微针体作为溶解终点，取出微针在显微镜下进一步观察确认溶解时间点。可溶性微针在不同含水量明胶中的溶解性见表7，由于皮肤的生理架构，皮肤的分层层次是以角质层为最外层，含水量最低约20％，依次向内有透明层、颗粒层、棘细胞层、基底层，各层占比在皮肤表层比例不同，并且越向内部水分越高越接近人体组织含水量大约70％左右，所以将不同层占比根据皮肤表皮层解剖结构比列为：角质层：透明层：颗粒层：棘细胞层：基底层＝2:1.5:2.5:3:1，规定不同溶解时间与不同层数的百分比相乘之和作为综合溶解时间，能综合的评价体外溶解时间和预测微针在体内的溶解时间。即综合评价溶解时间＝t30×20％+t40×15％+t50×25％+t60×30％+t60×10％。表7不同配方材料的可溶性微针插入明胶的溶解性结果分析：不同处方的综合溶解时间大小:f11>f9>f10>f6>f1>f4>f2>f5>f8>f3>f7，通过对比发现处方f1-f8的微针体外综合溶解时间都基本控制在10min以内，溶解速度较快，与其它配方比较溶解相对较快，且各处方差异不大，均满足微针贴片作为化妆品的使用要求。从处方组成发现，f11使用分子量为100kda以及1500kda的透明质酸钠制备的可溶性微针溶解速度最慢，为12.48min。f1到f7进行比较，含有k30,dex40的微针(f7)溶解性较含有k90，dex70的微针(f1)的溶解性好，原因主要是在于dex70，k90的分子量分别大于dex40和k30，而导致制备出来的微针样品溶解性能的下降；而在f1到f5的比较中发现，在其他配比相同的情况下，随着ha含量的上升以及ha-thm的下降，所制备出的微针样品溶解性能有所上升，这主要是由于低分子量的ha比例的上升以及高分子量ha-thm比例的下降影响了微针样品的溶解能力，表明低分子量物质含量上升或者高分子物质含量下降有利于溶解速度的上升。而将k90以及dex70替换成pva以及乳糖后，由于材料在明胶中吸水性质以及分子量的变化，导致制备出的微针样品的溶解速度也有所提升。另外，在其他配比相同的情况下，把透明质酸钠的分子量替换为100kda以及1500kda后，微针的溶解速度大幅度下降，表明该分子量下的透明质酸钠组合的溶解性能差，这主要与不同分子量的材料在明胶中的吸水能力以及溶解能力有关。而f9与f10中，高分子透明质酸钠以及其他高分子辅料的去除也降低了微针样品的溶解速度，这可能与不同高分子材料之间的性质互补，以及各种材料在明胶中的吸水能力以及溶解能力有关。实施例4冷场扫描电镜法观察评价可溶性透明质酸钠微针贴片的外观形态将实施例2制备的12组可溶性透明质酸钠微针样品，用剪刀裁剪呈适当大小的规格，针尖朝上用导电胶布固定在金属板上，在不同微针样品与金属板之间用导电胶搭建导电桥，放在离子溅射仪上喷金后，通过jfc-1600自动喷金仪用铂金进行包被，在20ma电流下作用30s以产生5nm厚度金属层。将微针样品在5kv电压下，采集图像。利用冷场电子扫描显微镜采集到的不同处方的微针电镜图片如图12-图22所示。结果分析：不同处方对应的圆锥状的微针表面有类似螺纹或等高线一样的纹理，部分配方制备的微针有多处暗斑，推测可能是由于局部有较大面积的缺损而形成的凹槽或缺口，其中以配方f9、f10、f11表面暗斑较多，配方f1、f2、f3、f4、f5、f6、f7、f8表面纹理相对致密。微针表面螺纹的致密度直观的表征了针体表面的形态，螺纹越密，则表面趋于越光滑，不连续性暗斑则表示此处可能存在较大幅度的升降或局部存在不规则的孔隙等，这可能与高分子材料的种类与配比的不同在干燥过程所显现的性质不同有关。实施例5可溶性透明质酸钠微针贴片安全性考察对实施例2处方1制备的可溶性透明质酸钠微针贴片进行安全性考察。一、取6只大鼠，试验前24小时对给药区进行脱毛处理。在大鼠背部左右两侧各选取两块对称区域，去毛范围为2cm×2cm(给药前应检查去毛皮肤是否因去毛而受损伤，有损伤的皮肤不宜进行试验)。6只大鼠背部皮肤选择两块区域分别设为刺激后72h组，刺激后48h组、刺激后24h组，刺激后1h组，连续多次刺激组，空白对照组。空白对照组仅去毛，不给药；刺激后72h组用于考察微针材料对大鼠皮肤刺激后72h的变化；刺激后48h组用于考察微针材料对大鼠皮肤刺激后48h的变化；刺激后24h组用于考察微针材料对大鼠皮肤刺激后24h的变化；刺激后1h组用于考察微针材料对大鼠皮肤刺激后1h的变化；连续多次刺激组用于考察连续5d对大鼠皮肤刺激的变化。刺激后72h组：取待测微针直接按压于已去毛的左右背部皮肤上，按压2min，然后用无刺激性胶布加以固定，固定时间2h。2h后除去背部微针。待除去微针后72h，对左右背部皮肤进行刺激性评分。刺激后48h组：取待测微针直接按压于已去毛的左右背部皮肤上，按压2min，然后用无刺激性胶布加以固定，固定时间2h。2h后除去背部微针。待除去微针后48h，对左右背部皮肤进行刺激性评分。刺激后24h组：取待测微针直接按压于已去毛的左右背部皮肤上，按压2min，然后用无刺激性胶布加以固定，固定时间2h。2h后除去背部微针。待除去微针后24h，对左右背部皮肤进行刺激性评分。刺激后1h组：取待测微针直接按压于已去毛的左右背部皮肤上，按压2min，然后用无刺激性胶布加以固定，固定时间2h。2h后除去背部微针。待除去微针后1h，对左右背部皮肤进行刺激性评分。连续多次刺激组：取待测微针直接按压于已去毛的左右背部皮肤上，按压2min，然后用无刺激性胶布加以固定，固定时间2h。2h后除去背部微针。24h后重复上述过程，连续5d，在第5d对左右背部皮肤进行刺激性评分。去除药物后在全光谱灯光下肉眼观察5组大鼠给药部位的皮肤反应，并记录给药部位有无红斑和水肿等情况，按皮肤刺激性的评分标准对皮肤红斑和水肿进行评分和刺激性评价。皮肤刺激性评分标准和评价标准如表8和表9所示。表8皮肤刺激性评分标准表9皮肤刺激强度评价标准注：刺激分值＝(红斑反应总分+水肿反应总分)/动物数实验结果如表10-表14所示。表10多次刺激性结果(左边背部/右边背部)红斑水肿总分刺激性程度1d0/00/00极小2d0/20/01轻度3d0/00/00极小4d0/00/00极小5d0/00/00极小表11单次72h组的结果(左边背部/右边背部)红斑水肿总分刺激性程度1h0/00/00极小24h0/00/00极小48h0/00/00极小72h0/00/00极小表12单次48h组的结果(左边背部/右边背部)表13单次24h组的结果(左边背部/右边背部)红斑水肿总分刺激性程度1h2/20/02极小24h0/00/00极小表14单次1h组的结果(左边背部/右边背部)红斑水肿总分刺激性程度1h0/00/00极小二、将皮肤刺激性评分完毕后的5组大鼠及空白大鼠处死并在给药部位取皮，应用免疫组织化学方法研究取下的各组皮肤中il-6、tnf-a在皮肤刺激实验后各实验点表达的差异；用福尔马林固定石蜡包埋的组织，切片厚3-4微米，置60±5℃的烤箱中烤干(约2小时)。脱蜡，将已烤干的切片依次置于二甲苯i、ii中脱蜡，每次5分钟，移至无水乙醇i、ii中各浸泡4分钟，移至95％酒精中浸泡4分钟，移至85％酒精中浸泡4分钟，再移至70％酒精中浸泡4分钟，流水冲洗2分钟。抗原修复，将已冲洗干净的组织切片放入高压锅内，加入约3000ml左右的citrate抗原修复液(ph6.0)，盖好高压检查安全筏，用高火加热煮沸后调至低火保持沸腾喷气3分钟，关掉正在工作中的电磁炉开关。两分钟后将高压锅移至冷水中冷却。待高压锅内抗原修复液完全冷却后，打开高压锅将组织切片用流水冲洗干净移至蒸馏水中浸泡2分钟。阻断，再将组织切片在3％h2o2中浸泡8分钟，流水冲洗，蒸馏水冲洗。取出切片，擦干组织周围的水，用dako画圈笔在组织块周围画一圆圈注意圈接头要接好，防止抗体跑出圈外造成假阴性。再用pbs缓冲液冲洗。滴加抗体(一抗)，甩去待测组织切片上多余的pbs，滴加一抗。放置在孵育盒内4℃冰箱中过夜孵育约12小时。滴加抗体(二抗)，将孵育盒从冰箱取出，恢复至室温后取出切片，插回玻片架中，用pbs洗3次，每次5分钟。滴加dakochemmateenvisionhrp试剂盒中的试剂a，试剂应充分覆盖组织。将切片放入孵育湿盒中，盖上盖子，连孵育盒一起放入37℃恒温箱中孵育30分钟。显色、衬染、封片，dab显色液的配制：取5ml塑料试管一支，分别加入dakochemmateenvision试剂盒中的试剂b2ml和dakochemmateenvision试剂盒中的试剂c10μl，混匀，备用。取出切片，擦掉组织周围的多余的pbs，加入配好的dab显色液中显色5分钟，在显微镜下控制染色的强度。待强度适中后将切片置自来水中终止显色，再用流水冲洗5-10分钟，苏木素染液复染1分钟，0.5％盐酸酒精分化3秒钟，流水冲洗5-10分钟，脱水、透明、封片、镜检。结果判读：对全片多个区域均染色强度较低的病例，随机选取五个视野进行评分，对全片染色强度较高的病例，则随机选取一个视野进行评分。要求显微下每个20倍视野至少有200个可用于评价的细胞。分析每个视野中阳性细胞数的平均数作为该切片的阳性细胞百分比进行积分：6％～25％为1分，26％～50％为2分，51％～75％为3分，＞75％为4分；染色强度以多数阳性细胞呈现的染色特征为标准计分：无染色为0分，淡黄色为1分，棕黄色为2分，棕褐色为3分。二者相加，0～1分为阴性(-)，2～3分为弱阳性(+)，4～5分为中等阳性(++)，6～7分为强阳性(+++),其中(-)和(+)记为低表达组，(++)和(+++)记为高表达组。染色强度：弱染色：在40x物镜视野才能看到细胞染色。强染色：在4x或10x物镜视野能看到的细胞染色。检测结果如表15-表24所示：表15表16表17表18表19表20表21表22表23表24结果分析：在皮肤刺激性评分中，微针对各实验组的大鼠背部皮肤无刺激性或仅有极小刺激性，表现出良好的安全性。而在各实验组的大鼠背部皮肤中炎症因子il-6、tnf-a的表达，表皮基底层、棘层、颗粒层、透明层、角质层未见明显异常，多见于真皮的毛囊及汗腺、皮脂腺。综上所述，本发明的透明质酸钠可溶性微针贴片对各实验组的大鼠背部皮肤无刺激性或仅有极小刺激性。实施例6可溶性透明质酸钠微针贴片护肤效果考察测试实施例2处方1制备的可溶性透明质酸钠微针贴片的护肤效果。测试方法：受试者8人，眼角均有鱼尾状细纹。将上述微针贴片按压刺入受试者右眼下部，半小时后揭除，左眼不予贴敷，作为空白对照。每周使用两次。测试结果：使用一周后8人都有明显祛皱效果，使用3周后，8人右眼鱼尾纹均显著改善。以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。当前第1页12